KeratinHeptadna ponovitev: 1. in 4. AK hidrofobni, 2. in 7. kisli (Tip I) ali bazični (Tip II)

KolagenGly-Pro-Met-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-ArgGly-Leu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp

desnosučna α-vijačnica levosučna (prolinska) vijačnica

kvartarna struktura - levosučni dvojni heliks stabilizirajo hidrofobne in -S-S- interakcije

kvartarna struktura -desnosučni trojni heliks stabilizirano Pro/Pro in OH-Pro povezave

Supramolekulske kompleksestabilizirajo hidrofobne interakcije

Supramolekulske komplekse stabilizirajo povezeve preko OH-ak

Strukturna funkcija: citoskelet (intermediarni filamenti), lasje, nohti, keratini v koži

Strukturna funkcija ekstracelularnega matriksa

Primerjava fibrilarnih proteinov keratina in kolagena

Gly

Bolezni povezane s keratini – preko 700 odkritih mutacij

• Epidermolysis bullosa simplex K5 K14• Bullous congenital ichthyosiform erythroderma K1 K10• Epidermolytic palmoplantar keratoderma K9 • Non-epidermolytic palmoplantar keratoderma K1 K16• Ichthyosis bullosa of Siemens K2e• Pachyonychia congenita type 1 K6a K16• Pachyonychia congenita type 2 K6b K17• Steatocystoma multiplex K17 • White sponge naevus K4 K13• Meesman’s corneal dystrophy K3 K12• Cryptogenic liver disease K8 K18• Pancreatitis K8 K18• Inflammatory Bowel Disorder K8 K19• Monilethrix hHb1 (K81)

hHb6 (K86)• Pseudofolliculitis barbae K6hf (K75)

Genske bolezni zaradi napak v keratinskih genih

Epidermolysis bulosa simplex(1/30 000 – 50 000) – avtosomna dominantnavzrok: točkovna mutacija

v genu za K5 ali K14posledica: strižne napetosti

ob mehanskem pritisku → celice niso čvrste → mehurji na koži

Epidermolitična hiperkeratoza (1 in 250,000)

(Bullous congenital ichthyosiform erythroderma)vzrok: točkovna mutacija

v genu za K1 in K10Ob rojstvu rdeča in občutljiva koža, mehurjiSimptomi se s časom izboljšajo, pojavi pa se pretirano deljenjekeratinocitov in

Genske bolezni zaradi napak v keratinskih genih

Journal of Investigative Dermatology, 2010 www.scalyskin.org/content.cfm?ContentID=97...

bolezen vzrok simptomi

osteogenesis imperfecta I Okvarjen en alel COL1A1, pacienti tvorijo le polovicopotrebnega kolagena tipa 1

Blaga oblika kostnih deformacij

osteogenesis imperfecta II, III, IV

Različni vzroki, od delecij delagena COL1A1, do točkovnihmutacijZamenjava Gly z večjimi AK

nenormalen nastanek kosti pri dojenčkih, krhke kosti, deformacija skeleta/smrt (tip II)

Ehlers-Danlos-ov sindrom(sindrom elastičnosti)

Manjka del COL1A1 gena, kikolagenskim vijačnicamomogoča, da se pritrdijo drugana drugo. Lahko tudi AK zamenjava Cys134Arg.

preobčutljiva lomljiva koža, hipermobilni sklepi, slabo celjenje ran

Genske bolezni zaradi napak v kolagenskih genih

Osteogenesis imperfecta

Zlomi kosti med fetalnim razvojem

Deformacije skeleta

www.netterimages.com/image/1871.htm

Ortopedski tretma

Ehlers-Danlos-ov sindrom (hiperelastičnost)

scicmulib09.wordpress.comcommons.wikimedia.org

Prizadeti so koža, mišice, ligamenti, krvne žile, kjer kolagen igra pomembno vlogo.

V odvisnosti od vrste mutacije so oblike od blage do smrtnih.

Zdravil ni, obstaja le podporna terapija.

Vrste sekundarne strukture in lastnosti fibrilarnih proteinov

sekundarna struktura značilnosti primerα-vijačnicapeptidne verige povezane s hidrofobnimi interakcijami, -S-S- mostički

čvrsta netopna struktura

•keratini•Intermediarni filamenticitoskeleta•lasje, nohti, •povrhnjica kože MEMBRANSKI CITOSKELET•spektrin v eritrocitih •distrofin v mišicah

β-konformacijapeptidne verige povezane s H-vezmi

mehka, upogljiva vlakna

fibroin svila

kolagenska vijačnica peptidne verige povezane s kovalentnnimi vezmi, hidrofobnimi in H-vezmi

čvrsta netopna struktura,visoka natezna moč, ni raztegljiv

kolagenkite, hrustanec, organski matriks kosti, koža, roženica

Proteini v membrani eritrocita

Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Eritrocit:življenjska doba 2-3 mesece,prepotuje ∼400 km

Spektrin v membrani eritrocita

-Spektrin je protein citoskeleta, ki je ob znotrajcelični strani plazemske membrane mnogihcelic.

-Je dimerni fibrilarni protein, dimeri se združujejo v tetramere in skupaj z aktinom tvorijoheksagonalne komplekse

-Stik z notranjim delom plazemske membrane imajo preko proteina ankirina.

-V eritrocitih spektrin tvori mrežo intermediarnih filamentov, ki daje eritrocitu značilno obliko.

- Mutacije v spektrinu vodijo v dedne bolezni.

StrukturaStruktura spektrinskegaspektrinskega dimeradimera

Biochemical Society Transactions www.biochemsoctrans.org

Biochem. Soc. Trans. (2009) 37, 796-803

- Antiparalelna orientacija verig alfa in beta spektrina

Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

Napake v membranskem ogrodju eritrocitov – hemolitične bolezni

Prečni prerez

Pogled od zgoraj

spektrin

Okvarjen pri ovalocitozi(podvrsta elipsocitoze)

Okvarjen pri elipsocitozi

www.wadsworth.org/.../

Elipsocitoza – oblika hemolitične anemije zaradi okvare membranskihproteinov citoskeleta v eritrocitu.

• soroden spektrinu v eritrocitih; povezujecitoskelet mišičnih vlaken z membrano

• 3684 ak – največji čoveški strukturni gen: 79 eksonov, 2,4 Mb dolg gen

• 2 antiparalelni verigi

• v vseh vrstah mišic (skeletni, srčni, gladki)

• v skeletni mišici 0,002%,

• če ni distrofina → Duchenne-ova mišična distrofija (pospešeno slabenje mišic, izguba mišične mase)

Membranski citoskelet miocita - distrofin

Intermediarni filamenti v miocitu - distrofin

Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

antiparalelni heterodimer

tanki filamenti

spektrinskaPonovitev(antiparalelni heterpdimer)

Duchennova mišična distrofija-Nastane zaradi odsotnosti distrofina (delecija dela gena), ki povezuje proteine ogrodjamišičnih vlaken z veznim tkivom, ki obdaja mišična vlakna.

-Distrofin ščiti mišice pred poškodbami med gibanjem (krčenje in relaksacija) – je kotneke vrste amortizer.

- Distrofin si lahko predstavljamo kot vrv, ki povezuje čoln s sidrom. Sidro lahko igravlogo le, kadar vrv ni pretrgana.

- Bolezen se prične po 1. letu, bolniki umrejo stari ~20 let (odpoved srca, oslabljenje dihalnih mišic)

: www.mda.org/publications/fa-

Funkcije proteinov

• Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb)• Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) • Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...)• Gibanje - Kontraktilni proteini:

- Mišična kontrakcija- Gibanje organelov znotraj celice- Gibanje migetalk in bičkov

• Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane

• Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...)• Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig)• Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

Gibanje

Princip – molekularni motorji

-Energija (hidroliza ATP) – kemična energija se pretvarja v kinetično-Encimi, ko gibanje omogočajo, so NTPaze s P zanko. - Konformacijske spremembe velikih molekulskih agregatov,

ki so strukturno zelo urejeni- Konformacijske spremembe se ciklično ponavljajo- Usmerjena sila

- Organizmi (kontrakcija mišic) - Celice (gibanje bičkov in migetalk)- Organeli (reorganizcija kromosomov med delitvijo celic) - Makromolekule (drsenje proteinov vzdolž DNA med transkripcijo)

ATPStryer

“Korakanje” vezikla po ogrodnem aktinu

“Korakanje” kroglice s pripetim miozinom po ogrodju aktina

Konformacijska sprememba enega proteina povzroči njegov premik ob drugem proteinu

Primeri gibanja na molekularni ravni

Gibanje omogočajo molekularni motorji

-miozini, kinezini, dineini – različna AK sestava in struktura,

- vsi vsebujejo NTPazno domeno s P zanko (P-loop NTPase),(ki je podobna domeni G proteinov).

miozin kinezin dinein

Vezava ATP (in hidroliza) povzroči spremembo v konformaciji in v vezavni afiniteti molekularnih motorjev

Prehodno stanje hidrolize ATP

-Po hidrolizi ATP se je ročica obrnila za skorajda 90 kotnih stopinj !!

-Po spremembi vezanega nukleotida se smer celotnega alfa heliksa obrne.

-Miozin: vezava ATP signifikantno zmanjša afiniteto miozina do aktina (miozinskih glav do aktinskih filamentov).

Struktura mišičnega vlakna progaste mišice

Mišični kontraktilni proteini- miozin - aktin - tropomiozin - troponin------------------------------ α-aktinin- dezmin- vimentin- nebulin- paramiozin- C-protein - M-protein- titin- distrofin

interakcija → kontrakcija

uravnavanje kontrakcije

Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Proteini progaste mišice

• Miozin, aktin (motorična proteina) – povezujeta se s šibkimi interakcijami

• Tropomiozin, troponin (uravnavanje kontrakcije)

• Z obroč tankih filamentov – α-aktinin, dezmin, vimentin

• Preko celotnega tankega vlakna – nebulin (7000 ak, α-vijačnica)

• M linija debelih vlaken – paramiozin, C-protein in M-protein

• Povezovanje debelih vlaken na Z obroč – titin (26 926 ak) določa dolžino sarkomere in preprečuje preobsežno raztegovanje mišice

• Distrofin

Miozin Aktin

Glavna mišična kontraktilna proteina sta miozin in aktin

-6 podenot, Mw 540 000 Da

-2 težki verigi (220 000 Da) (ovita vijačnica)

-4 lahke verige (pripete na “glavo”

-Tvori debele (široke?) filamente mišičnih vlaken

-Je molekularni motor, ki s hidrolizo ATP omogočigibanje

HidrolizaATP

-G aktin je globularni protein, Mw 42 000 Da

-Tvori polimere filamentoznega F aktina

- Tvori tanke filamente mišičnih vlaken

-Vsaka molekula G-aktiva veže 1 molekulo ATP

-Hidroliza ATP aktina vpliva na povezavo G aktinav F aktin, ne prispeva direktno h kontrakciji mišic

F-aktin

Miozin: 6 podenot (2 težki in 4 lahke verige)

•Miozin, Mr 540 000, •Težka veriga, Mr 220 000 •Lahka veriga, Mr 20 000

Razgradni produkti miozina

S1

Struktura miozina in debelih filamentov

več 100 molekul miozina

Elektronsko mikroskopska slika debelih filamentov

Model strukture debelih filamentov

Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Struktura aktina in tankih filamentov

•F-aktin je polimer globularnih G-aktinov•Mr 42 000•Za polimerizacijo v F-aktin je potrebna

energija (hidroliza 1 molekule ATP za 1 podenoto G-aktina)

•Na vsako podenoto F-aktina se specifičnoveže miozinska glava

Struktura tankih filamentovF-aktin (strukturni protein)tropomiozin in troponin (uravnavanje mišične kontrakcije)

TM – tropomiozonTN-C – veže Ca2+

TN-I – inhibira vezavo miozina na aktin

TN-T – veže se na tropomiozin

aktin

Interakcija miozinske glave z monomerno enoto(dimer G-aktina) aktina

miozinska glava

aktinski filament

Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

•Na vsako podenoto F-aktina se veže miozinska glava

Slika progaste mišice s svetlobnim faznokontrastnim mikroskopom

Prerez progaste mišice

Elektronsko-mikroskopska slika progaste mišice

relaksiranamišica

kontrahiranamišica

•I pas (Izotropni) – nizka elektronska gostota, A pas (Anizotropni) – visoka elektronskagostota

•I pas – tanki filamenti •A pas – debeli filamenti in prekrivanje tankih in debelih filamentov•Z obroč – pripenjanje tankih filamentov (od Z do Z – sarkomera)•M linija – pripenjanje debelih filamentov

tanki filamentidebeli filamenti

sarkomera

Krčenje mišice– drsenje debelih vlaken miozina ob tankih vlaknih aktina

Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Sarkomera – kontraktilna enota progaste mišice, sestavljena iz tankih in debelih vlaken.

Titin in nebulin sta molekularni ravnili, ki določata dolžino tankih in debelih filamentov.

Sidrišče tankihfilamentov

Vsebuje tudi manjpogostemišičneproteine alfa-aktinin, desmin, vimentin

Mišična kontrakcija

Drsenje debelih ob tankih filamentih

Konformacijske spremembe miozinamed kontrakcijo

Glavamiozina

Mehanizem mišične kontrakcije

2. ATP hidrolizira, kar povzročikonformacijsko spremembo miozina

1. ATP se veže na miozin, špranja se odpre, aktin se odcepi

3. Naslednja konformacijskasprememba miozina zaprešpranjo in ojači vezavoAktina na miozin

4. Usmerjena sila (poteg), med katerose miozinske glave vrnejo v prvotno stanje-To povzroči spremembo orientacije in premikmiozinskega repa k Z disku. ADP se sprosti.

Mehanizem mišične kontrakcije

Celoten krog generira silo 3-4 pN → premik tankega filamenta ob debelem za 5-10 nmNelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

1.

Mehanizem mišične kontrakcije

miozin

Konformacijska sprememba enega proteina povzroči njegov premik ob drugem proteinu

“Korakanje” kroglice s pripetim miozinom po ogrodju aktina

“Korakanje” vezikla po ogrodnen aktinu

Interakcija miozina in aktina – usmerjena sila

In vitro dokazi:

Nemišični kontraktilni proteini

• V citoskeletu

- mikrofilamenti – Φ ~7 nm, najpomembnejši protein aktin; funkcija konsistenca citoplazme in gibanje v interakciji z nemišičnim miozinom

- mikrotubuli – Φ ~24 nm; najpomembnejši protein tubulin funkcija –vzdrževanje oblike celice in sodelovanje v znotrajceličnem transportu v interakciji s kinezinom

• Migetalke in bički

mikrotubuli (proteini tubulin A in tubulin B) in protein dinein –gibanje migetalk in bičkov

Citoskelet evkariontske celice

Mikrofilamenti: 2 zviti verigi proteina aktina;funkcija: oblika celice, gibanje citoplazme, gibanje organelov

Intermediarni filamenti: protein keratin funkcija: oblika celice, interakcija s sosednjimi celicami

Mikrotubuli: cevke, nastale iz dimernihpodenot tubulina; funkcija: gibanje organelov(gibanje bičkov in migetalk) gibanje kromosomov

Citoskelet: mreža proteinskih vlaken v citoplazmi, ki daje celici obliko, umešča in giblje organele ter sodeluje pri celičnem gibanju

Aktin v ne-mišičnih celicah

• Pri človeku 6 izoformnih oblik aktina• Hitra polimerizacija/depolimerizacija G-aktina→od stopnje polimerizacije je

odvisna konzistenca citoplazme• Gibanje makrofagov in nevtrofilcev• Fagocitoza• Kontrakcija črevesnih resic• Sodelovanje pri nastanku delitvenega vretena med mitozo• Sprememba oblike aktiviranih krvnih ploščic

-------------------• Strupi gliv:

- citokalazin B – inhibira polimerizacijo aktinskih filamentov (se usede na rastoči del filamenta)

- faloidin (prepreči depolarizacijo)

Mikrotubuli • Nastanejo s polimerizacijo globularnega proteina tubulina (2 podenoti: tubulin-α in tubulin-β);

polimerizacija poteka v spiralasti razvrstitvi 13 enot/zavoj, do nekaj tisoč molekul tubulina

• Dinamične strukture, asociacija/disociacija enot tubulina

• Mikrotubuli - v vseh celicah z jedri, pomembni za obliko celice

• Sodelujejo v transportnih procesih – med mitozo se kromosomi razmaknejo ob dveh polih mikrotubulov (vlakna mitotskega vretena), sodelujejo pri potovanju veziklov znotraj celice v sodelovanju proteinov z ATPazno aktivnostjo (kinezin)

• Žafranov strup kolhicin inhibira polimerizacijo tubulinov, je inhibitor mitoze - ne nastane delitveno vreteno

www.ceri.com/alz72.htm

Tublulin v mikrotubulih

α-tubulin

•Trdne votle stabilne cevke

•Zunanji premer 24 nm,notranji premer 14 nm

•Nastanejo s polimerizacijotubulina (alfa in beta podenoti)

•Vijačna ureditev, 13 enot/zavoj

•Dinamično ravnotežje nastajanja/razgradnje polimera

•Mikrotubule vsebujejo vse celice z jedri

•Sodelujejo pri znotrajceličnem gibanju organelov, pri mitozi

•Žafranov strup kolhicin preprečuje polimerizacijo tubulinoov.

Združevanje molekul tubulina v mikrotubule

-α- in β-tubulin sta majhna, 55 kDa globularna proteina

-α- in β-tubulin vežeta GTP in se pridružita (+) koncu mikrotubula, skupaj z vezanim GTP.

-Ko se dimer prikluči mikrotubulu, GTP na β-tubulinu hidrolizira.

-Tubulinski dimeri z vezanim GTP se združujejo v mikrotubule, dimeri z vezanim GDP pa razpadajo.

-Cikel GTP je esencialen za dinamiko tvorbe in razdruževanja mikrotubuilov.

Tvorba in razgradnja mikrotubulov

Joe Howard and Anthony A. Hyman Nature 422, 753-758(17 April 2003)

GTP dimer ima konformacijio, ki paše v steni mikrotubula. Hidroliza GTP induciraupogibanje, to pa ni v skladu s steričnimi zahtevami mreže mikrotubula.

Funkcija mikrotubulov: gibanje organelov znotraj celice

El. mikroskopski posnetekvezikla na mikrotubulu Struktura kinezina

Lubert Stryer, Biochemistry, 1995

ATPazna akivnost

Migetalke (cilia) in bički (flagella)

• Migetalke in bički so “priveski/podaljški” celic, obdani z membrani (nadaljevanje plazmaleme)

• Gibljejo se utripajoče, vrtinčasto

• Migetalke se nahajajo na mnogih epitelijskih celicah: v respiratornem traktu/sapniku, v nosnih sinusih ...

• Edini bički v človeškem telesu – celice spermijev (prokarionti/bakterije se gibljejo večinoma z bički)

• So stabilne strukture, sestavljene iz nespremenljivega števila podenot

Prerez evkariontske migetalke ali bička (9+2)

•Dinein vsebuje v “glavi” ATPazno aktivnost (analogija z miozinom v mišičnih celicah)

•Hidroliza ATP povzroči asociacijo dineina z vlaknom B mikrotubula

•Dineinska ročica koraka po sosednjem dubletu mikrotubula (analogija s premikanjemmiozinske glave po fibrilarnem aktinu)

micro.magnet.fsu.edu/

Pregled kontraktilnih proteinov

dineinmikrotubuli (razporeditev 9+2)

Mikrotubuli (migetalke, bički)gibanje celic

kinezinmikrotubuliMikrotubuli citoskeletagibanje organelov

miozin (nemišični)aktin - polimer globularnih aktinov

Mikrofilamenti citoskeletagibanje organelov, oblika celice, gibanje citoplazme

miozin (mišični)aktin - polimer globularnih aktinov

Mišica (progasta, gladka) mišično delo

strukturno ogrodje motorični proteinizvor in funkcija