HBMD, Zagreb, 18. studenog 2015.

Pridruživajuće kartiranje sastavnica

eteričnog ulja ljekovite kadulje

Jerko Gunjača Sveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultet

e-mail: jgunjaca@agr.hr

(A) Analiza kvantitativnih svojstava

(B) Pridruživajuće kartiranje

(C) Studija slučaja: Ljekovita kadulja

Pridruživajuće kartiranje sastavnica eteričnog ulja ljekovite kadulje

(A) Analiza kvantitativnih svojstava

podrazumijeva, između ostalog, potragu za lokusima za

kvanitativna svojstva (QTL-ima)

uz pomoć molekularnih biljega izrađuju se genske karte na

temelju procjene učestalosti rekombinacijskih događaja

analizom povezanosti QTL-a s molekularnim biljezima

određuje se njihov smještaj na genskim kartama

(pridruživanje)

grah – 131 primka iz HBBG

boja cvijeta

širina liske

Kvalitativna i kvanitativna svojstva

kvalitativna svojstva – kontrolirana su malim brojem gena

velikog učinka zbog čega je lako razlikovati nositelje različitih

varijanti gena

kvantitativna svojstva – kontrolirana su velikim brojem gena

relativno malog učinka, čija je ekspresija također pod jakim

utjecajem različitih okolišnih faktora

Nasljeđivanje

RFLP

SSLP

AFLP

RAPD

RAD

Molekularni biljezi

odlomci molekule DNA za čiju se izolaciju i identifikaciju koriste

laboratorijske metode koje se mogu automatizirati

SNP

DArT

VNTR:

mini

micro

(SSR/STR)

razmjena dijelova DNA molekule između dvaju roditeljskih

kromosoma tijekom mejotičke diobe

Rekombinacija

udaljenosti između

biljega na genskim

kartama procjenjuju se

na temelju učestalosti

pojave rekombinacija

Potraga za QTL-ima

0

500

1000

1500

2000

2500

1 6

11

16

21

26

31

36

41

46

51

56

61

66

71

76

81

86

91

96

10

1

10

6

11

1

11

6

12

1

12

6

13

1

13

6

14

1

14

6

15

1

15

6

16

1

16

6

17

1

17

6

18

1

18

6

19

1

19

6

20

1

20

6

21

1

21

6

22

1

22

6

1/P

1/P adj

cilj: geni s relativno

velikim učinkom!

pridruživanje biljega: traženje biljega koji su smješteni u tolikoj

blizini gena, da je vjerojatnost pojave rekombinacije iznimno

mala

za izradu genskih karata nužan je razvoj specifičnih populacija

(biparentalna križanja)

slaba razlučivost uslijed premalog broja rekombinacijskih

događaja tijekom razvoja populacija, pa čak i dijelovi

kromosoma koji su međusobno vrlo udaljeni ostaju povezani, tj.

nasljeđuju se zajedno

Problemi

(B) Pridruživajuće kartiranje

primjena ovog pristupa omogućena je razvojem platformi za

sekvenciranje DNA visoke propusnosti

ne zahtjeva razvoj posebnih populacija za kartiranje

koristi se za:

analize pridruživanja na razini cjelokupnog genoma (GWAS)

precizno kartiranje odabranih regija kromosoma

genomsku selekciju

Preduvjeti

ne zahtjeva razvoj posebnih populacija za kartiranje

nužna visoka razina zasićenosti genoma molekularnim

biljezima, odnosno gustoće njihovog smještaja unutar genoma

potrebni intenzitet gustoće može se procijeniti prema stupnju

opadanja neravnoteže vezanosti

Neravnoteža vezanosti (LD)

nasljeđivanje

alela sa

različitih

lokusa koje

nije nezavisno

Lokus A

Lokus B P(A)=pA P(a)=qA

P(B)=pB P(AB)=pApB+D P(aB)=qApB-D

P(b)=qB P(Ab)=pAqB-D P(ab)=qAqB+D

Statistički model

krajnje pojednostavnjeno, fenotip je zbroj djelovanja genotipa i

okoline:

P = G + E

kod kvantitativnih svojstava, genotipski učinak je zbroj

djelovanja velikog broja gena malog pojedinačnog učinka

(QTL-a)

stoga se ukupni genotipski učinak može rastaviti na niz

učinaka pojedinačnih gena

Model jednog biljega

…je mješoviti model oblika:

Yi = Mki + Gi + eij

Mk je učinak pretpostavljenog QTL-a povezanog s

molekularnim biljegom (fiksni efekt)

Gi je učinak ostalih gena, odnosno genetsko zaleđe (slučajni

efekt)

modeliranje se provodi zasebno za svaki biljeg

Lažne asocijacije

genetski uzroci:

strukturiranost eksperimentalne populacije – razlike u alelnim

frekvencijama između subpopulacija

različiti stupanj srodnosti genotipova – različite

korelacije/kovarijance fenotipova

uklanjanje lažnih asocijacija – modifikacija modela daljnjim

raščlanjivanjem genotipskog učinka vodeći računa o strukturi i

srodnosti

Model jednog biljega + Q

…uključuje i (fiksni) efekt strukture populacije Q:

Yi = Mki + Qi + Gi + eij

struktura populacije Q može se definirati pomoću

molekularnih biljega:

Bayesovskim pristupom – program STRUCTURE (Pritchard i

sur. 2000)

analizom glavnih sastavnica (Price i sur. 2006)

Q + K model (Yu i sur. 2006)

…uključuje i matricu srodnosti K:

Yi = Mki + Qi + GiK + eij

K se koristi kao matrica varijanci-kovarijanci slučajnog

učinka genotipa i može se definirati:

pomoću molekularnih biljega:

izračunavanjem koeficijenta srodnosti (SpaGeDi – Hardy i

Vekemans, 2007)

izračunavanjem genetskih udaljenosti (Stich et al. 2008)

pomoću pedigrea

Korekcija za višestruke testove

1 biljeg = 1 model – provođenje velikog broja testova koji

nisu međusobno nezavisni

uklanjanje lažnih asocijacija:

Bonferronijeva korekcija

stopa lažnih otkrića (FDR):

Benjamini and Hochberg (1995)

Storey (2002)

MLMM (Segura i sur. 2012)

umjesto jednog u modelu se istovremeno može istražiti

učinak više lokusa (biljega)

primjenjuje se regresija „korak po korak” (stepwise); u

koracima unaprijed se dodaju, a u koracima unazad

izbacuju biljezi (jedan po jedan)

optimalno se rješenje odabire prema jednom od dva

kriterija (Bonferroni ili EBIC)

(C) Studija slučaja: Ljekovita kadulja

25

populacija

4/559 AFLP

8/161 SSR

62/8

komponente

ulja

Metode

Q+K model:

Q – na temelju SSR biljega uz pomoć programa STRUCTURE

K – na temelju SSR biljega pomoću programa SPAGEDI

pridruživanje pojedinačnih AFLP biljega uz pomoć

programa TASSEL

regresija „korak po korak” na temelju AFLP biljega uz

pomoć R paketa MLMM

Struktura populacije kadulja

P01

CROATIA

Hungary Slovenia

P02

P03 P04

P05

P06

P07

P08

P09

P10

P11

P12

P13

P14 P16

P15

P17

P18 P19

P20

P21

P22 P23

P24 P25

Bosnia and Herzegovina

A: North Adriatic

B: Middle Adriatic

C: South Adriatic

Cluster:

Kemotipovi

camphene

1,8-cineole

camphor

P01 P02

P04

P05

P06

P07

P08 P09

P10

P11

P12

P13

P14

P16

P17

P18

P19

P20

P21

P22

P23

P24

P25

b-pinen

cis-thujone

trans-thujone

borneol

bornyl acetate

P03

P15

-1.0

-0.5

0.5

1.0

1.5

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.5 1.0 1.5

PC1 (46.78%)

PC

2 (

18

.09

%)

A: cis-thujone

B: trans-thujone

C: camphor

Chemotype:

Optimalno rješenje za trans-tujon (MLMM)

3,88

Učinak lokusa (biljega)

pogreška

ostali genetski

učinci

učinak strukture

populacije

učinak odabranih

lokusa (biljega)

Povezanost biljega i lokusa za trans-tujon

Biljeg P(TASSEL) P(MLMM) korelacija

M132 5,89E-07 2,45E-08

M201 7,03E-06 -0,14 M131

M277 1,67E-05 0,43 M046

M131 3,05E-05 2,16E-05

M046 3,79E-05 6,36E-05

M097 2,39E-05

M322 1,02E-04

Trans i cis-tujon i kamfor

cis-tujon: 4 signifikantna biljega (MLMM)

kamfor: 6 signifikantnih biljega (MLMM)

M046 i M132 signifikantni za trans-tujon i kamfor (MLMM)

Što dalje?

istražiti

metaboličke

puteve?

odabrane

biljege koristiti

u selekciji

potpomognutoj

biljezima?

Pridružujuće kartiranje od Q do K:

Studija slučaja hrvatskih endemičnih kadulja

Zlatko Liber

Toni Nikolić

Ivana Rešetnik

Ivan Radosavljević

Vlatka Zoldoš

Vedrana Vičić

Marija Jug-Dujaković Zlatko Šatović

Klaudija Carović-Stanko

Martina Grdiša

Ivan Biruš

Jerko Gunjača

Sandro Bogdanović

Projektni tim

Projekt financira Hrvatska zaklada za znanosti