GAMETOGENESI

LE CELLULE DELLA LINEA GERMINALE

VANNO INCONTRO A

MITOSI(Proliferazione cellulare con

produzione di milioni di

precursori dei gameti)

MEIOSI(riduzione del corredo

cromosomico da diploide a

aploide e ricombinazione del

materiale genetico)

Una volta raggiunta la gonade

“L’essenza vera e propria del sesso è la ricombinazione meiotica” (Villeneuve & Hillers, 2001)

2 centrosomi ognuno

con una coppia di centrioli

membrana

plasmatica

involucro

nucleare

nucleolo

cromatina

Fine FASE G2

frammenti involucro

nucleareMT astrali

cinetocorepolo del fuso

Prometafase

fuso mitotico cromatidi

fratelli

nucleolo

scomparecromosoma

aster

Profase

Metafase

Fuso

mitotico

MT polareMT del

cinetocore

piastra

metafasica cromosomi figli

Anafase

solco di

clivaggio

formazione

involucro nucleare

si forma

nucleolo

cromosomi

decondensati

Telofase

MITOSI

INT

ER

FA

SE

ME

IOS

I I

ME

IOS

I II

• PROFASE

• METAFASE

• ANAFASE

• TELOFASE-CITODIERESI

MEIOSI

MEIOSI IPROFASE

Leptotene zigotene pachitene diplotene diacinesi

Appaiamento

degli omologhi,

formazione delle

sinapsi.

Si formano i

bivalenti

Leptotene

Cromosomi si

spiralizzano e

gli omologhi si

avvicinano

Zigotene

Zigotene tardiva

I bivalenti

sono detti

tetradi e

avviene il

crossing-over

Pachitene

Scompare

complesso

sinaptinemale

Diplotene

Bivalenti uniti

a livello dei

chiasmi

Diacinesi

Profase I - spermatociti di Locusta migratoria

T

A

P

P

E

P

R

O

F

A

S

E

M

E

I

O

S

I

I

Appaiamento dei cromosomi omologhi e crossing-over

Nella profase I i cromosomi

omologhi sono uniti da un complesso

sinaptinemale

Una tetrade meiotica con due chiasmi

Coppia di bivalenti mostra la

formazione di chiasmi tra i cromatidi di

ogni cromosoma omologo

La coesina permette la coesione dei cromatidi a livello del

centromero e a livello delle due braccia

La coppia di omologhi è mantenuta unita come bivalenti dai

chiasmi

All’anafase I la coesina che tiene uniti i bracci dei bivalenti è tagliata

permettendo la separazione degli omologhi

I 2 cromatidi sono uniti a livello del centromero dalla coesina

All’anafase II la coesina è tagliata e i 2 cromatidi fratelli si

separano

…….MEIOSI I CONTINUA

MEIOSI II

GAMETI APLOIDI

Movie MEIOSI

Set Completo di cromosomi (20) in oocita di topo in metafase I immunomarcati con Ab

contro coesina (magenta) e cinetocore (verde).

• 19 coppie di omologhi sono uniti a livello dei chiasmi e da coesina in punti distali.

Embrioni aneuploidi

Aborto spontaneo

Sindrome di Down

nell’uomo

•1 coppia di cromosomi è stata precocemente separata.

ERRORI

La meiosi è alla base della riproduzione sessuata

Questo tipo di riproduzione è molto dispendiosa (richiede la produzione di gameti, la ricerca del partner, il

nutrimento dell’embrione), ma premia decisamente la discendenza che, avendo caratteri nuovi avrà maggior

probabilità di adattarsi ai cambiamenti dell’ambiente.

Ma da dove viene questa maggior variabilità dei caratteri?

Ormai la risposta dovrebbe essere semplice: « dalla meiosi», ed in particolare:

- dall’assortimento indipendente dei cromosomi omologhi (è il caso che decide quale degli

omologhi finisca in una cellula o nell’altra con la meiosi I)

- Il crossing over durante la profase I

Questi processi sono naturalmente anche alla base della variabilità individuale nella nostra specie

Il cariotipo è il corredo cromosomico di un individuo

La cariotipizzazione si esegue su globuli bianchi isolati

dal sangue, trattati con colchicina per bloccare le

cellule in tarda profase – metafase e lisandole con

soluzione ipotonica.

Osservazione e fotografia del vetrino al MO.

Software di analisi di immagine appaiano omologhi e li

ordinano in base a lunghezza

Nella specie umana ci sono 46 cromosomi

44 autosomi (22 coppie)

2 cromosomi sessuali (una coppia)

Difetti nella meiosi possono

provocare malattie genetiche

Il numero cromosomico caratteristico della specie è rappresentato

dal set aploide di cromosomi (n)

Più comunemente ci si riferisce però all’assetto diploide (2n)

Gli individui portatori di un numero di cromosomi differente da quello

caratteristico sono detti eteroploidi

Eteroploidia

EuploidiaNumero cromosomico è variato per interi set

aploidi

AneuploidiaVariazione del numero dei cromosomi con

riferimento alla singola coppia. Tale fenomeno è

ristretto ad uno o pochi cromosomi.

Definizioni

Condizioni di euploidia

La poliploidia si origina in genere quando, durante la divisione

cellulare, alla cariocinesi non segue la citochinesi.

Nell’uomo non è compatibile con la vita. Tri- e tetraploidia

osservate in aborti spontanei, ma presenti in natura

Cariotipo di un individuo triploide

Condizioni di aneuploidia

Aneuploidia di solito si origina da fenomeni di non disgiunzione durante l’anafase della

meiosi I o II

Cariotipo di un individuo affetto da

sindrome di Down (trisomia del 21) – una

aneuploidia

Le conseguenze della non disgiunzione dei cromosomi in

meiosi

Questi gameti, se fecondati, daranno origine a

condizioni di trisomia o di monosomia

Alcune malattie genetiche causate da alterazioni della struttura e del numero di cromosomi

Come ricorderete …

Le aneuploidie

derivano da errori

nella meiosi

Non disgiunzione meiotica

Aneuploidie autosomiche

Come le poliploidie, le

aneuploidie sono in genere

non compatibili con la

sopravvivenza

dell’embrione/feto

… a parte rare eccezioni …

La sindrome di Down (trisomia del 21) è l’anomalia cromosomica più comune nell’uomo

(ca 1/800 neonati)

Le aneuploidie dei cromosomi sessuali sono meglio tollerate rispetto a quelle autosomiche…

… in parte grazie al fenomeno della compensazione del dosaggio

Aneuploidie sessuali

SINDROME DI KLINEFELTER (47 cromosomi, XXY)

SINDROME DI TURNER (45 cromosomi, X0)

- Apparato genitale poco sviluppato

- Sterilità

- Bassa statura

- Assenza di corpi di Barr

- Talvolta ritardo mentale

SINDROME DI JACOBS (47, XYY)

• Detti anche super maschi

• Altezza superiore alla media

• lieve ritardo mentale

• possono avere problemi

vascolari

• ipotizzata l'associazione

anche con difetti di

lateralizzazione

embriogenica

• i livelli di testosterone sono

normali.

• frequenza 1/1000 maschi.

Differenze tra meiosi maschile e femminile

Gametogenesi

Lo spermatozoo “è un nucleo

dotato di mobilità”

OOCITA: citoplasma concentrato in una

sola cellula per massimizzare le sostanze

nutritive per il futuro embrione

CITOPLASMA (enzimi, mRNA, organuli e

substrati metabolici) per avviare e mantenere il

metabolismo e lo sviluppo

3 globuli polari

Spermatogenesi Oogenesi

35

Nei mammiferi , meiosi maschile e femminile variano anche nel tempo

- nelle femmine la meiosi inizia nelle gonadi embrionali

- nei maschi inizia solo alla pubertà

Perché?

Nelle femmine la meiosi inizia nelle gonadi embrionali

Rene mesonefrico produce Acido retinoico (AR) che stimola

le cellule germinali a replicare DNA e iniziare meiosi

Nei maschi la meiosi inizia alla pubertà

Testicoli embrionali secernono CYP26b1 che degrada AR.

Meiosi impedita anche da sintesi successiva di Nanos2 da

parte di cellule germinali

Dopo giorno embrionale 13,5 espressione di CYP26b diminuisce

Nanos2 viene espressa

C) mRNA che codifica Aldh1a2 -

enzima necessario per sintesi AR

Mesonefri di embrioni di topo GE 12

D) mRNA che codifica enzima

CYP26b 1

che degrada AR

Migrazioni delle cellule germinali primordiali (PGC) nel topo (8° giorno)

In embrioni di sesso maschile, i gonociti sono incorporati nei cordoni sessuali

mesodermici che si originano dalle creste genitali.

Alla maturità sessuale, i cordoni si cavitano e si differenziano i tubuli seminiferi

Durante la vita embrio-fetale e prima della pubertà le cellule germinali e

cellule del Sertoli vanno incontro a processi replicativi e cambiamenti

morfologici

SVILUPPO DELLA GONADE MASCHILE (1)

Durante la vita embrio-fetale nei cordoni primitivi testicolari ci sono 3 tipi di

cellule:

• cellule germinali in proliferazione

• precursori delle cellule del Sertoli

• cellule peritubulari miodi

Inoltre si differenziano le cellule interstiziali precursori delle cellule del Leydig

Alla pubertà le cellule del Sertoli:

• cessano di dividersi, diventano cellule polarizzate

• formazione di giunzioni occludenti tra loro

• producono secreto fluido che canalizza i tubuli seminiferi

SVILUPPO DELLA GONADE MASCHILE (2)

Dopo la nascita:

• aumenta la lunghezza dei cordoni seminiferi per espansione delle cellule del

Sertoli

• aumenta il numero delle cellule germinali

42

Alla maturità l’epitelio dei tubuli si differenzia nelle cellule del Sertoli e i gonociti in

spermatogoni di tipo A (cellule staminali)

Segnale BMP coinvolto

nell’inizio della spermatogenesi

Spermatogoni hanno

recettori per

Wnt e BMP

Promuove

proliferazione

cellule staminali

Quando concentrazione BMP8b è

suff- inizio differenziamento

Promuove il

differenziamento

43

Chi sono Wnt e BMP?

Fattori paracrini che

innescano fenomeni di

trasduzione del segnale

Induttori

44

Principali famiglie di fattori paracrini (induttori)

- Fattori di crescita dei fibroblasti (FGF)

- Hedgehog

- Wnt

- Superfamiglia TGF-B

Superfamiglia TGF-B

glicoproteine ricche di cisteina

BMP

Bone morphogenetic protein

proteine con 7 cisteine

conservate nel polipeptide

maturo

LA GONADE MASCHILE DEI MAMMIFERI

La gonade maschile è

circondata dalla una

spessa tonaca albuginea

(connettivo fibroso) ed

internamente vi è una

tunica vascolarizzata

ricca di fibre muscolari lisce

Dalla tonaca si dipartono

setti connettivali che

suddividono il testicolo in

lobuli.

Ogni lobulo contiene da 1

a 4 tubuli seminiferi

Tra i tubuli c’è connettivo detto

tessuto interstiziale,

vascolarizzato in cui sono

presenti le cellule del Leydig

responsabili della produzione del

95% di testosterone ematico

T

U

B

U

L

I

S

E

M

I

N

I

F

E

R

I

47

Gli spermatidi vanno incontro a maturazione

morfologica per diventare spermatozoi

Acquisizione di motilità e capacità di

interazione con oocita II

Gli spermatidi situati verso il lume perdono

le connessioni citoplasmatiche e si

differenziano in spermatozoi

SPERMATOGENESI

L’attività mitotica a livello dell’epitelio

seminifero è intensa e continua per

l’intera vita sessuale.

Tubuli seminiferi:ïEsternamente: alcuni strati di

cellule mioidi

Internamente Epitelio

seminifero

TUBULO SEMINIFERO

La parete del tubulo seminifero è formato da:

epitelio pluristratificato formato da 2 tipi cellulari:

• cellule del Sertoli

• cellule della linea germinale

Figura 6.2 Sezione schematica di alcuni tubuliseminiferi. I tre compartimenti del testicolo(basale, adluminale e interstiziale) sono separatidalla barriera emato-testicolare e dalla paretedel tubulo.

I compartimenti del testicolo e la barriera emato-testicolare

membrana basale

spermatogoni

spermatociti di 1° e 2°

ordine

spermatidi immaturi

spermatozoi

cellula del

Sertoli

giunzione

occludente barriera

emato-testicolare

Co

mp

art

imen

to

basale

Co

mp

art

imen

to

ad

lum

inale

BARRIERA EMATO-TESTICOLARE : BARRIERA IMMUNOLOGICA

• c. basale: accessibile al fluido interstiziale che origina dai vasi sanguigni

• c. adluminale: pervaso dal fluido tubulare secreto dalle cellule del Sertoli

Per dissociazione transitoria delle giunzioni occludenti tra le cellule del Sertoli,

gli spermatociti in transizione tra mitosi e meiosi, passano nel compartimento

adluminale

La citochina TNF-α (tumor necrosis factor) regola la dissociazione delle giunzioni

http://it.wikipedia.org/wiki/File:Germinal_epithelium_testicle.svg

Funzioni :

• Nutrono le cellule germinali e con esse instaurano contatti (presenza di N-caderine)

• Fagocitosi di cellule germinali in degenerazione

• Fagocitosi dei corpi citoplasmatici residui a fine spermiogenesi

• Secernono proteine in grado di legare il testosterone importante per la

spermatogenesi, e fattori di crescita

• Secrezione medium ricco di fruttosio, nutrimento e trasporto spermatozoi

• Cellule del Sertoli e cellule germinali comunicano tramite giunzioni gap

• Formano la barriera emato-testicolare

CELLULE DEL SERTOLI

SPERMATOGENESI

L’inizio della spermatogenesi alla pubertà è probabilmente regolata dalla

sintesi di fattori di crescita BMP8b da parte degli spermatogoni

La transizione da spermatogoni a spermatociti I sembra mediata dal GDNF

Bassi livelli di GDNF inducono differenziamento

Alti livelli determinano la duplicazione degli spermatogoni

Cellule del Sertoli secernono il fattore neurotrofico GDNF (glial-derived neurotrophic factor)

L’espressione di GDNF è incrementata da FSH secreto dall’ipofisi

Topi privi di BMP8b non iniziano spermatogenesi alla pubertà

CELLULE SERTOLI

FSHGDNF

SPERMATOGONI SPERMATOCITI I

PROLIFERAZIONE DIFFERENZIAMENTO

GDNF collega il sistema endocrino e le Cellule del Sertoli e fornisce

all’FSH un meccanismo per istruire il testicolo a produrre spermatozoi

Livelli bassi di GDNF

favoriscono il

differenziamento

Livelli alti di GDNF

favoriscono la

proliferazione

55

Controllo ormonale della spermatogenesi

Figura 6.10 Schema delle interazioni esistenti fra ipotalamo, ipofisi e testicolo.

Funzione endocrina del testicoli -

produzione di androgeni

(TESTOSTERONE)

Parte riversato nel sangue

Parte rimane nei testicoli e si riversa nel fluido

tubulare - ABP (androgen binding protein) su

cellule del Sertoli - conversione in diidrotestorone

(DHT) - potente effetto di mascolinizzazione su

componenti delle vie genitali

LH stimola le cellule del Leydig a

produrre testosterone

… ma non basta per portare a termine la

spermatogenesi…

FSH induce incremento attività cellule

del Sertoli, secrezione fluido tubulare e

sintesi proteica (ABP, inibina)

Regolazione feedback

negativo sull'ipofisi

SPERMATOGENESI

Durante le divisioni degli spermatogoni

la citodieresi non è completa: le

cellule formano un sincizio, per cui

ogni coorte matura in modo sincrono

Anche le meiosi sono coordinate da

ponti citoplasmatici per sincronizzare

il processo

LUME

M. BASALE

A1: Cellule germinale

A4. può autorinnovarsi, fare apoptosi

o differenziarsi nello spermatogonio

intermedio: 1° cellula staminale

preordinata a diventare spermatozoo

PONTI CITOPLASMATICI: MOLECOLE O IONI

PASSANO DA UNA CELLULA ALL’ALTRA

SPERMATIDI NUCLEO APLOIDE MA

FUNZIONALMENTE DIPLOIDI: PRODOTTI GENICI

POSSONO DIFFONDERE NEL CITOPLASMA DELLE

CELLULE VICINE

SPERMATOGENESI

Spermatogoni indifferenziati di tipo A : POTENZIALITA’

topi con spermatogenesi annullata per trattamento con composti tossici

sanno riattivare la spermatogenesi

Trasferimento di spermatogoni A : ripresa di spermatogenesi

Spermatogoni indifferenziati di tipo A risiedono in nicchie di cellule

staminali create da cellule del Sertoli e vasi sanguigni

CELLULE GERMINALI:

SINTESI DI RNA NELLA FASE PREMEIOTICA E POSTMEIOTICA

Sintesi di RNA non avviene nei cromosomi sessuali perchè sono eterocromatici

• mRNA viene tradotto durante il differenziamento di spermatidi in spermatozoi

(proteine indispensabili per il movimento e interazione con oocita)

• mRNA viene trascritto anche negli spermatociti II e spermatidi ( per tubulina, proteine

di membrana e protamine)

La sostituzione di istoni con

protamine determina la sospensione

della trascrizione

SPERMIOGENESI: DA SPERMATIDIO A SPERMATOZOO

• Fase del Golgi

– Sintesi di enzimi idrolitici, accumulati in Granuli pre-acrosomiali

– Si fondono a formare la Vescicola acrosomiale

– Stretto contatto con cisterna perinucleare, forma il polo anteriore dello

spermatozoo in formazione

SPERMIOGENESI

• Fase Acrosomiale

– Nucleo si condensa, cromosomi

condensano ed addensano riducendo il

volume totale

– Cellula assume forma allungata

– Microtubuli formano il manicotto

– Mitocondri si spostano e si localizzano

nella parte intermedia della coda

SPERMIOGENESI

• Fase di Maturazione

– Perdita del citoplasma

– Interruzione dei sincizi

citoplasmatici e liberazione degli

spermatozoi

– Residui citoplasmatici fagocitati da

Cellule del Sertoli

– Spermatozoi liberi nel tubulo

– Spermatozoi: cellule immobili

SPERMIOGENESI

MORFOLOGIA DELLO

SPERMATOZOO: FLAGELLO

DINEINA: attività ATPasica consente lo

scivolamento delle coppie di microtubuli

NEXINA: forma ponti proteici che trasformano lo

scivolamento in flessione

Nel topo lo sviluppo da cellula staminale a

spermatozoo richiede 34,5 giorni:

• stadi di spermatogonio durano 8 giorni

• meiosi dura 13 giorni

• spermiogenesi dura 13,5 giorni

Nell’uomo lo sviluppo dello spermatozoo

richiede 74 giorni; spermatogoni A1 sono

cellule staminali quindi spermatogenesi è

continua

MORFOLOGIA SPERMATOZOO

mitocondri

Acrosoma in spermatozoo di topo

DNA colorato con

DAPI

tubulina

La maturazione morfologica è seguita dalla disposizione nel

tubulo seminifero

68

ANOMALIE GAMETE MASCHILE

Negli ultimi decenni, in tutto il mondo industrializzato, si è assistito ad una riduzione

della conta spermatica (N spermatozoi/ml di sperma) e della qualità del seme

nell’uomo.

Da 100-120 milioni/ml negli anni ‘40 a 60-70 milioni negli anni ‘90.

Nello stesso periodo n. medio di spermatozoi normali è passato da ca 60 milioni a ca 20

milioni

Si ritiene che ci sia un contributo significativo degli interferenti endocrini rilasciati in

ambiente (diossine, PCB, plastiche, pesticidi e erbicidi) (Aitken et al., 2004)

Sindrome genetica Triade di Kartagener (discinesia ciliare primaria):

mancanza di dineina funzionante in tutte le cellule ciliate e con flagello

Maschi sono sterili perché spermatozoi immobili

infezioni bronchiali

50% individui hanno cuore a destra (situs inversus)

Importanza delle ciglia nella determinazione dell’asse dx-sx

OVERVIEW

COMPLETATO IL PROCESSO DI

SPERMIOISTOGENESI GLI

SPERMATOZOI SONO CAPACI DI

INTERAGIRE CON LA CELLULA UOVO?

PROCESSI MATURATIVI DURANTE IL PASSAGGIO NEI DOTTI

Dai tubuli seminiferi

passaggio lungo:

1) dotti intra-testicolari (rete

testis, dotti efferenti)

2) dotti extra-testicolari

(epididimo, dotto

deferente e dotto

eiaculatorio)

processi maturativi che li renderanno capaci di interagire con l’ovocita

RETE TESTIS E PRIMO

TRATTO EPIDIDIMO:

CONCENTRAZIONE DEGLI

SPERMATOZOI

ST

MB

Suddiviso tre regioni altamente specializzate: testa, corpo e coda.

Funzioni:

★ riassorbimento del fluido proveniente dai tubuli seminiferi

★ trasporto, maturazione degli spermatozoi,

★ eliminazione di quelli che presentano difetti

★ immagazzinamento degli spermatozoi nel tratto distale della coda

Immagazzinare gli spermatozoi: popolazione eterogenea e sufficientemente numerosa

di spermatozoi

Spermatozoi mantenuti in uno stato di quiescenza metabolica (vitali per più di 15 giorni)

EPIDIDIMO

I principali cambiamenti :

1) condensazione della cromatina nucleare

2) rimozione della goccia plasmatica

3) modificazione composizione fosfolipidi di membrana

4) arricchimento in molecole di colesterolo a livello della membrana plasmatica

(riduzione capacità fusogene della membrana per impedire la reazione acrosomiale)

5) aumento cariche negative superficiali di membrana e dei legami disolfuro

6) ri-localizzazione degli antigeni di superficie

7) dislocazione di proteine di membrana in punti diversi

8) rimozione o modificazione delle proteine di superficie

9) Tratto finale: spermatozoi immersi in un liquido viscoso detto liquido seminale

ricco di zuccheri, lipidi, proteine, ormoni, ioni per nutrire e proteggere i gameti

EPIDIDIMOAmbiente altamente regionalizzato: interazione tra spermatozoi e componenti del fluido

luminale

76

Vie genitali maschili e ghiandole sessuali accessorie

Fluido seminale (protezione e nutrizione dello sperma)

- prodotto da vescichette seminali, prostata e ghiandole bulbo-uretrali

- contiene fruttosio, inositolo, glicerilfosforilcolina, prostaglandine, enzimi

Il seme (o sperma) è composto da spermatozoi + fluido seminale

77

78

VARIABILITA’ MORFOLOGICA GAMETE MASCHILE

79

Riftia rilascia spermatozoi

raggruppati in fasci simili a mazzi

di fiori, aventi una parte a calice

formata dalle teste elicoidali degli

spermatozoi (blu) e i “gambi”

formati dalle code (verde).

Riftia pachyptila, conosciuto

anche come verme tubo gigante,

è un anellide policheta lungo

anche 2,4 metri ed è in grado di

sopportare temperature elevate

(400°C) e alti livelli di zolfo.

L’habitat è tipicamente abissale,

sulle sorgenti idrotermali,

nell'Oceano Pacifico e sul

Galapagos rift, a partire da più di

1500 metri di profondità,

80

Tubifex tubifex (Müller, 1774)

Oligocheta acquatico, Famiglia Tubificidae (circa 1000 specie)

Tubifex tubifex e le

forme affini

producono due tipi di

spermatozoi diversi:

gli euspermatozoi,

che sono in grado di

fecondare le uova e i

paraspermatozoi,

contenenti poco o

nullo DNA.

I paraspermatozoi si collegano strettamente gli uni con gli

altri e circondano gli eusparmatozoi formando complessi

ammassi detti spermatozeugmi. In questo modo i

paraspermatozoi “portano a spasso” gli euspermatozoi,

fino alla loro destinazione, l’uovo.

Spermiocladistica