1.1

BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE DEFINIIE. OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI

Biotehnologia este o tiin complex, ce se caracterizeaz prin utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei, biologiei celulare i a ingineriei genetice. (fig. 1.1).

agroalimentare: maturarea fructelor i legumelor, cerealelor i finurilor sau diferitelor produse alimentare pe baz de cereale germinate, maturarea brnzeturilor, maturarea crnii. Enzimele pot avea ns i rol deteriorativ cu implicaii n modificarea caracteristicilor senzoriale i a valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare pn la prelucrarea termic a acestora. De asemenea, rolul microorganismelor este hotrtor, unele dintre ele avnd aciune duntoare, altele avnd rol esenial n obinerea unor produse alimentare datorit aciunii lor fermentative: produse lactate acide, brnzeturi, bere, vin, spirt, pine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale i leguminoase. Microorganismele intervin i n fermentarea unor produse vegetale: varza, murturi, msline, castravei, cacao, etc.

Figura 1.1. Biotehnologia o tiin complex Denumirea de biotehnologie provine de la cuvintele greceti: -Bios care nseamn via, -Tehnikos care nseamn tehnici i -Logos care nsemn studiu al. Biotehnologia este aplicat in diverse domenii, cum ar fi: agricultur, industria alimentar, producie industrial, mediu i medicin. Biotehnologia alimentar se refer la prelucrarea industrial a diferitelor materii prime cu ajutorul microorganismelor i enzimelor proprii sau a unor ageni biologici (microorganime, enzime) adugai n scopul realizrii unor produse sau a ameliorrii unor procese tehnologice. Rolul biotehnologiei este covritor n industria alimentar. n fapt, industria alimentar este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice i prin urmare conservarea lor pn la consum, n stare proaspt (cazul fructelor i legumelor) sau pn la industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implic controlul activitii enzimatice proprii esuturilor vegetale i animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare. Enzimele proprii esuturilor vegetale i animale sunt eseniale n transformrile pe care le ofer produsele

Biotehnologiile n industria alimentar s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, crnii, sucurilor de fructe, zahrului, panificaiei, etc.) i a culturilor starter (industria berii, laptelui, crnii, panificaiei, etc.) La toate acestea trebuie s avem n vedere obinerea de metabolii secundari (alcool etilic, aceton, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de microorganisme precum i de biomas alimentar i furajer, etc. Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfeciona procesele de producie, se poate mbunti calitatea produselor alimentare i se poate mri gradul de diversificare a produciei alimentare.__________________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ ________________________________________________

1.2. PREPARATE ENZIMATICE 1.2.1. Aspecte generale Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine constituite din aminoacizi, iar din punct de vedere funcional acioneaz ca nite biocatalizatori biologici care au rolul de a permite realizarea unor reacii cu o vitez mrit. Enzimele sunt utilizate drept catalizatori n condiiile n care exist i catalizatori chimici, deoarece prezint urmtoarele avantaje: 1. Au capacitatea de a cataliza reaciile chimice n condiii blnde de temperatur, pH, presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie i nu necesit echipamente scumpe rezistente la coroziune. 2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc la obinerea de produi de reacie secundari nedorii. n aceste condiii nu sunt necesare cheltuieli mari privind rafinarea i purificarea produsului ce urmeaz a fi fabricat. 3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al mediului compui biodegradabili care nu necesit costuri semnificative de epurare. 4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la aciunea n mediul apos, putnd aciona i la interfaa dintre dou faze, ap: solvent organic sau ap:ulei etc. Totui exist i o serie de dezavantaje: au stabilitate limitat; de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singur dat.

2 5. Izomeraze ce catalizeaz rearanjarea structural a moleculelor; 6. Ligaze sau sintetaze care catalizeaz formarea de noi legturi te tip C-N, C-O, C-C, C-S, cu consumare de ATP.

Utilizri ale enzimelor n industrie: Principalele domenii n care enzimele i-au gsit utilizri sunt: Fabricarea unor produse prin transformarea enzimatic a amidonului; La fabricarea altor produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin, panificaie; n compoziia detergenilor; Industria textil, hrtiei i a furajelor pentru animale; Sinteza catalitic a unor substane chimice; Analiza terapie; alimentelor, diagnoz chimic i

Inginerie genetic;

Clasificarea enzimelor. Enzimele se clasific conform sistemului stabilit de Comisia de Enzime a Uniunii Internaionale de Biochimie (1979). Conform acestei clasificri exist 6 clase principale grupate conform cu reaciile pe care le catalizeaz astfel: 1. Oxidoreductaze care catalizeaz reacii de oxidoreducere, transfer de atomi de hidrogen, oxigen sau electroni; 2. Transferaze care catalizeaz transferul unei grupri de pe o molecul pe alta; 3. Hidrolaze ce catalizeaz scindarea hidrolitic (implic apa) a legturilor chimice covalente; 4. Liaze, care catalizeaz scindarea legrutilor chimice altfel dect prin hidroliz sau oxidare;

Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu de baz al biotehnologiei, avnd drept scop studierea tehnicilor de obinere a preparatelor enzimatice folosind materii prime de origine animal, vegetal i microbian, sub form liber sau imobilizat pentru a fi folosite ca ageni biologici n industria alimentar, industria furajelor, industria textil, detergenilor, farmaceutic, cosmetic, chimic, etc. Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiionale se transform n biotehnologii, devenind mai eficiente i mai puin poluante. n figura 1.2. este prezentat ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice n diferite ramuri.

Alte domenii; 6 Morarit, panificatie; 5 Sucuri, vinuri; 10 Bere; 4 Amidon; 30

Distilate; 5 Produse lactate; 5

Detergenti; 35

Figura 1.2. Poderea utilizrii preparatelor enzimatice Aa cum se observ din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are utilizarea n industria alimentar, urmat de industria detergenilor. n figura 1.3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse pe plan mondial. Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de amilaze.

3 Preparatele fabricate la scar industrial folosesc trei tipuri de surse: esuturi animale i vegetale sau microorganisme. Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria crnii (ficat, pancreas, inim, rinichi, creier, mucoas stomacal i intestinal). Utilizarea acestr surse este pe scar din ce n ce mai redus, fiind nlocuite de sursele microbiene, deoarece sursele animate prezint o serie de dezavantaje, cum ar fi: producia limitat, apariia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiform la bovine. Principalele enzime de origine animal care se obin sub form de preparate sunt chimozin (renina) care se extrage din stomacul de miel sau viei care se utilizeaz pentru coagularea laptelui la fabricarea brnzeturilor. O alt enzim este -amilaza pancreatic care are utilizri n industria farmaceutic. Sursele vegetale sunt reprezentate de semine(germinate sau negerminate), rdcini, fructe, sev, latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obinerea preparatelor enzimatice ridic o serie de probleme, cum ar fi: prezena unor substane potenial duntoare sntii omului (ex. Compuii fenolici) sau a unor compui toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face ca sursele de origine vegetal s fie destul de puin utilizate. Principalele enzime obinute din surse vegetale sunt. - papaina, proteaz obinut din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este utilizat pentru tenderiyarea crnii sau n industria berii; - ficina, proteaz obinut din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizat pentru degradarea proteinelor miofibrilare. - bromelina, proteaz obinut din sucul de ananas ( Ananas comosus ), folosit pentru hidroliya proteinelor colagenice.

Alte enzime; 4 Pectinaze; 10 Proteaze fungice; 4

Glucozizomeraze; 14 Amilaze fungice; 18

Amilaze bcteriene; 10 Proteaze bacteriene; 35 Proteaze de coagulare; 5

Figura 1.3. Principalele tipuri de preparate enzimatice. 1.2.2. Tipuri de preparate enzimatice. Preparatele enzimatice se comercializeaz sub diverse forme i grade de purificare: Preparate enzimatice solide: 1. Preparate enzimatice brute, sub form de pulbere, obinute prin uscarea i mcinarea mediului fermentat; 2. Preparate sub form cristalizat, enzime pure utilizate preponderent n chimia analitic i ingineria genetic; 3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate n amestec cu substane crioprotectoare, care sunt urcate n vacum la temperaturi de -20......-50C.

Preparate enzimatice lichide 1. Preparate enzimatice brute, form sub care se livreaz enzimele extracelulare (eliberate de ctre microorganisme n mediul de cultur n timpul fermentaiei). 2. Preparate parial purificate, n care se adaug conservani pentru a le mri stabilitatea n timp. In tabelul de mai jos sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice, sursele din care se obin i aplicaile n industria alimentar. 1.2.3. Surse de enzime

Alte enzime de origine vegetal sunt lipoxigenaza din soia i complexul enzimatic din mal ( amilaze, proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu sunt purificate, fiind sub form de fin de soia sau de mal. Microorganismele reprezint principala surs pentru obinerea de preparate enzimatice. Avantajele utilizrii microorganimelor constau n: - microorganismele se pot obine n cantiti mari (biomas) prin cultivare n instalaii speciale pe medii de

cultur ieftine (tr de gru, extract de porumb, melas, roturi de soia sau floarea soarelui, zer), - ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt fa de cel al plantelor sau animalelor; - producia de enzime de ctre microorganisme poate fi mrit prin selectarea i utilizarea de tulpini mutante, nalt performante (productive) i prin stabilirea condiiilor optime fizice i chimice pentru producerea de enzime; - proprietile enzimelor i specificitatea de aciune difer cu natura microorganismelor productoare, astfel industrial se pot obine preparate care corespund ntocmai scopului dorit.

4 - preparatele enzimatice obinute pot avea activiti diferite cu predominana unei activiti. 1.2.4. Tehnologii enzimatice de obinere a preparatelor

Schema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice este prezentat n figura Tehnologia de obinere a preparatelor enzimatice implic operaiile indicate n schema prezentat n fig. 1.4. din care rezult ca preparatele enzimatice pot fi obinute sub form de: - preparate enzimatice brute-uscate; - preparate enzimatice brute lichide concentrate; - preparate enzimatice purificate concentrate, respectiv i uscate.

2

3

Figura 1.4. Schema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice

Procesele biotehnologice de obinere a preparatelor microbiene sunt complexe, realizarea lor presupune parcurgerea a trei etape: 1. Pregtirea mediului de cultur, prin prelucrarea mecanic i fizico chimic a materiilor prime ce intr n compoziia mediului de cultur (fermentativ). Aceast etap presupune operaii de dozare, mrunire, solubilizare, sterilizare etc. 2 Etapa biologic care const n obinerea culturilor starter intermediare i a culturii de producie, urmat de etapa fermentativ prorpiu-zis. 3. Etapa de separare, purificare i standardizare a enzimelor.

Ca surse de carbon n reetele mediilor industriale se folosesc urmatoarele: - Melasele care provin de la rafinarea zahrului. - Extractul de porumb, este reprezentat de extractul obinut din industria amidonului dup ce sufer o concentrare pn la 50% S.U. - Leiile sulfitice provin din industria hrtiei ca urmate a transformrii masei lemnoase n pulp celulozic sub aciunea bisulfitului de calciu. Surse de azot. Azotul din mediul de cultur are rol anabolic, participnd la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor i acizilor nucleici. Principalele surse de azot sunt:

A. Pregtirea mediului de cultur Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultur. Materiile prime trebuie s asigure principalii nutrieni microorganismelor n vederea dezvoltrii lor n timpul fermentaiei. Surse de carbon. Principala surs de carbon (surs de energie) pentru microorganisme o constituie glucidele, sub form de glucoz, fructoz, galactoz care sunt uor asimilabile, n timp ce maltoz, zaharoza i lactoza sunt asimilate doar dac microorganismele posed enzime capabile s le transforme n monoglucide. Poliglucidele pot fi utilizate doar de ctre microorganismele apte s sitetizeze enzimele care s le hidrolizeze extracelular n monoglucide capabili s difuzeze prin membrana celular.

- azot anorganic: amoniac, sruri de amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de diamoniu, - azot organic: hidrolizate proteice de cazein, soia, carne etc. Surse de ioni anorganici. Pentru dezvoltarea microorganimelor n timpul procesului de fermentaie este necesar prezena ionilor anorganici, acetia reprezint circa 8% din substana urcat a a celulelor microbiene. Principalii ioni anorganici care trebuie s fie prezeni n mediul de cultur sunt: macronutrienii (azot, fosfor, sulf, potasiu, i magneziu) i micronutrienii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc, molibden, cupru, mangan, nichel i seleniu). Surse de factori de cretere. Factorii de cretere sunt compui organici a cror prezen n mediul de cultur este necesar n cantiti mici, avnd un rol catalitic sau

structural pentru microorganisme. Factorii de cretere includ vitaminele, purine, pirimidine, nucleotide i nucleozide, aminoacizi, acizi grai, steroli i poliamide. Principalele vitamine necesare ca factori de cretere sunt: biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina. Tratementul termic al mediilor de cultur. Pentru buna desfurare a procesului de fermentaie este necesar cultivarea microorgnimelor pe un mediu de cultur steril pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea mediului de cultur se poate realiza direct n bioreatorul n care se realizeaz fermentaia sau ntr-un vas sub presiune separat, ulterior fiind transferat n bioreactor. B. Etapa biologic. Obinerea culturilor starter de producie

2 Pentru producerea enzimelor, fermentaiile industriale se desfoar n volume de 150 250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie pregtit o cantitate suficient de inocul. Cultura folosit drept inocul trebuie s fie n faza exponenial de cretere. La microorganismele care au vitez de cretere redus, se recomand s se foloseasc o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata iniieirii fermentaiei. Cultura starter de producie trebuie s conin celule active, adaptate la mediul industrial pentru ca fermentaia s se declaneze rapid. n cazul fermentaiilor desfurate pe mediul solid, pentru care se utilizeaz inocule sporifere se recomand s se asigure prin inoculare concentraii de 105-106 spori pe g mediu, iar n cazul celor submerse cultura starter de producie s fie de circa 10% din mediul de cultur.

Figura 1.5. Schema bloc pe operaii de obinere a preparatelor enzimatice microbiene brute

Tehnici de fermentaie

Pentru producia de preparate enzimatice de origine microbian se poate aplica dou tehnici de baz : Fermentaia de suprafa n care se utilizeaz un mediu solid pe care se cultiv microorganismul (de regul un mucegai filamentos). Aceast tehnic are avantajul c mediul de cultur va deveni un mediu bogat n activitate enzimatic ; Fermentaia de submers, n care mediul este lichid ce se afl ntr-un reactor unde toi parametrii fermentaiei sunt perfect controlai. Aceast ultim tehnic este superioar primei metode din punct de vedere tehnologic i biochimic. Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc menionm urmtoarele : Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola. La sfritul fermentaiei microorganismul trebuie distrus cu condiia pstrrii intacte a activitii enzimatice. Microorganismele cultivate pot produce extracelular sau intracelular. n funcie de tipul variaz i procedeul de extracie. n ceea ce tipurile de culturi submerse, ne putem situa din urmtoarele cazuri: enzime acestora privete n unul

- nivelul de proteine. La procedeul nealimentat se pot monta diferii senzori care arat : - pH-ul care se poate regla prin adaus de baze sau acid ; - temperatura care se poate regla prin debitul de circulaie al apei reci n mantaua fermentatorului sau n serpentina din interiorul fermentatorului ; - nivelul de spum care se poate combate cu un antispumant aflat ntr-un rezervor ataat fermentatorului; - presiunea care se regleaz prin supape care se deschid la presiuni de 1 pn la 3 bar ; - coeficientul respirator QR care se msoar prin cantitatea de CO2 produs fa de cantitatea de oxigen consumat ; - nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenilor. Procedeul alimentat, n care se ncepe cu un volum de 10 30% de substrat n care se introduce inoculum, dup care fermentatorul se alimenteaz cu restul de mediu, dup care oprirea fermentaiei se face dup un anumit timp fixat experimental. Acest procedeu se aplic n cazul n care sinteza enzimelor ar fi reprimat de concentraiile ridicate ntr-unul din nutrienii mediului de cultur sau n cazul cnd creterea microorganismelor, n funcie de concentraia n unul din componenii mediului, ar provoca creterea vscozitii, care trebuie s fie reglat n timp. Alimentarea fermentatorului poate fi repetat de mai multe ori efectundu-se sutiraje (evacuri) programate, dar ntotdeauna trebuie lsat n fermentator un volum de 30%, care servete n acest caz drept cultur de producie.

Procedeul nealimentat, n care caz toate ingredientele mediului de fermentare sunt pregtite n fermentator la pH-ul i temperatura dorit nainte de a introduce inoculum. Dup introducerea inoculum, fermentaia principal ncepe i finalizarea ei se urmrete prin prelevarea de probe, n mod steril, care arat : - creterea microorganismelor (biomas, vscozitatea mediului) ; - concentraia n enzim (activitatea enzimatic a mediului) ; - consumul de glucide ;

Fig. 1.8. Cultivarea submers a microorganismelor.

Procedeul continuu necesit alimentarea continu a fermentatorului cu mediu i folosirea unei

culturi concentrate de microorganisme. n acest caz, bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a

celulelor este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. n figura 1.9. se arat schia unei astfel de instalaii format dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la care exist i posibilitatea de a recicla biomasa.

2 -mediul de cultur poate fi colmatant pentru membrana de ultrafiltrare; -chiar la densiti mari de celule, la sfritul ciclului de dezvoltare este posibil o oarecare liz a celulelor, ceea ce face necesar o purjare a bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care conduce la micorarea vrstei medii a celulelor care rmn n sistem. O variant a procedeului continuu de obinere a biomasei/ enzimelor const n folosirea bioreactorului cu membran. C. Etapa de separare a enzimelor

Procedeul continuu Avantajele unui urmtoarele : astfel de procedeu cultur sunt prin

-se poate detoxifica mediul de eliminarea produsului de inhibare ; -celulele reciclate devin perfuzate ;

Extracia. La procedeul discontinuu (nealimentat) i cel alimentat, dup terminarea fermentaiei se separ partea solid insolubil (celule i produse insolubile) de partea lichid care conine enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontal sau microfiltrare. Soluia steril obinut este apoi ultrafiltrat pentru a concentra enzimele. n cazul n care enzimele sunt destinate a intra n compoziia unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizeaz cu polioli (sorbitol, glicerol) i/sau sruri (NaCl, MgSO4), respectiv se adaug bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat). n cazul n care enzima (enzimele) intr n compoziia unui preparat comercial pulbere, ultrafiltratul se suplimenteaz cu un suport i se usuc prin atomizare (suplimentarea se face cu amidon, dextrine). nainte de atomizare mai poate fi realizat o filtrare steril. Pentru a obine i enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separat de partea lichid, este supus lizei. Liza poate fi realizat chiar de enzimele proprii microorganismelor ce alctuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albuul de ou, preparate enzimatice exogene complexe de natur bacterian care conin chitinaz, mananaz, -1,6glucanaz, proteaze, cteodat n combinaie cu adaosul de metabisulfit. n cazul n care enzima este periplasmic, un oc osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. Se poate realiza i o liz mecanic (folosire de presiuni mari de 600 1000 bar, urmat de detenta brutal) Se pot folosi i ultrasunetele cu frecvene mai mari de 20 MHz pentru liza celulelor i deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare. Odat eliberate, enzimele intracelulare sunt supuse operaiilor aplicate i enzimelor extracelulare. Preparatele enzimatice se comercializeaz de regul sub form de pulbere, de microgranule, precum i sub form lichid.

-cantitatea de mediu de cultur care se introduce n bioreactor este controlat de cantitatea de permeat care traverseaz membrana de ultrafiltrare ; -celulele au posibilitatea de a se dezvolta pn la concentraii relativ mari ( 300 g substan uscat/l, n cazul drojdiilor) ; -aceste concentraii mari de celule se constituie ca o barier eficace fa de contaminarea exterioar ; -retenatul poate fi evacuat i el periodic, fiind constituit din biomas care conine enzime intracelulare, dup care este trecut la prelucrare ulterioar (extracie) ; -permeatul de la ultrafiltrare, care conine enzime nu mai are celule microbiene i poate fi, deci, stocat sau dirijat direct la o operaie n aval de purificare sau concentrare. Neajunsurile acestui procedeu de obinere biomasei i enzimelor sunt urmtoarele : a

-membranele trebuie s fie rezistente la sterilizarea cu vapori de ap i la igienizare cu substane chimice ; -costurile energetice sunt destul de ridicate;

3 Preparatele enzimatice sub form de pulbere sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul, maltodextrinele, zahrul, sarea. La aceste preparate se controleaz granulometria, umiditatea ( 6%). Suportul trebuie s nu fie higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloae. n preparatele comerciale pulbere sau lichide, coninutul de enzim este redus raportat la suport i de aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, n comparaie cu nivelul de enzim coninut. n ceea ce privete preparatele comerciale microgranulate, acestea se obin dintr-un ultrafiltrat care se amestec cu un suport (sare, amidon solubil, maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat este astfel calculat nct s se obin titrul enzimatic dorit n microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat mpreun cu un agent liant care reprezint 0,1% pn la 0,5% fa de masa suportului. Picturile pulverizate sunt uscate ntr-un turn de uscare, cu aer la 70 - 90C. Preparatele comerciale lichide sunt formulate n general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se utilizeaz n proporie de 20 50% fa de preparatul lichid. La aceste formulri se adaog o substan bacteriostatic (de exemplu benzoat de sodiu n proporie de 0,1 0,2%).1.2.6. Condiiile de inocuitate pe care trebuie s le ndeplineasc preparatele enzimatice Numr total de germeni (NTG), maximum 5.10 4/g ; Coliformi, maximum 30/g ; Escherichia coli absent/ 25 g ; Salmonella absent/ 25 g ; Activitate antibiotic de origine microbian absent ; Aflatoxina B1, ochratoxin A, sterigmatocistin, toxina T 2 (zearalenona) n cazul preparatelor de origine microbian absente ; Metale grele : -arseniu -plumb -alte metale grele 3 mg/Kg ; 10 mg/Kg ; 40 mg/Kg (exprimat la Pb).

_______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________