Praktikum „Klinische Chemie SS 2011

Block 1 (Blut-Sauerstofftransport) Betreuer: Silvia Pitariu und Jana Hemmerling

Hämatokrit Hämoglobin Osmotische Resistenz Blutgruppenbestimmung

Block 2 (Blut-Differentialblutbild) Betreuer: Nico Gebhardt

Erythrozytenzählung Leukozytenzählung Differentialblutbild (Ausstrich, Färbung und Differenzierung)

Block 3(Blut-Immunologie-Blutgruppenserologie) Betreuer: Monika Weiher und Nadine Waldschmitt

Gesamtprotein Serumeiweißelektrophorese und Immunfixation Serumlipide CRP

Block 4 (Gerinnung und Entzündung) Betreuer: Lisa Gruber und Melanie Klein

Quick-Test: Manuelle Bestimmung mit der Häkelmethode Quick-Test: Bestimmung mit dem Kugelkoagulometer

Block 5 (Leber und weitere Blutparameter) Betreuer: Ingrid Schmöller

ASAT ALAT Bilirubin Apparative Messung verschiedener Blutparameter

Vorarbeiten

Herstellung von Serum- und Plasmaproben

Im Praktikum der klinischen Chemie werden unterschiedliche biologische Proben analysiert. Beispielsweise werden für die Messung des Hämatokrits oder die Herstellung eines Differentialblutbildes Kapillarblut oder venöses Vollblut verwendet. Um eine Gerinnung zu vermeiden werden Antikoagulanzien (z.B. EDTA) zugesetzt.

Für die Bestimmung der meisten klinisch-chemischen Messgrößen wird kein Vollblut, sondern Serum- oder Plasmaproben eingesetzt.

Plasma ist der annähernd zellfreie Überstand des zentrifugierten Vollblutes, dessen Gerinnungsfähigkeit sofort bei der Blutentnahme durch Antikoagulanzien gehemmt wird. Antikoagulanzien sind Verbindungen, die entweder Calcium komplexieren wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Oxalat, Citrat oder verschiedene Heparinsalze, die an verschiedenen Stellen des Gerinnungsvorgangs hemmend wirken.

Serum unterscheidet sich von Plasma dadurch, dass es aus spontan geronnenen Vollblutproben gewonnen wird.

Die Abtrennung der zellulären Bestandteile sollte immer so schnell wie möglich erfolgen. Beispielsweise kommt es bei zu langem Stehen der Vollblutproben durch glykolytischen Abbau zu einem merklichen Abfall der Glucosekonzentration.

Block 1 (Blut-Sauerstofftransport)

1. Hämatokrit

Prozentualer Volumenanteil fester Bestandteile (Zellen, vor allem Erythrozyten) am gesamten Blut Für Hämatologische Untersuchungen sollte normalerweise venöses Blut verwendet werden, da bei der Gewinnung von Kapillarblut durch die Beimengung von Gewebsflüssigkeit Volumenfehler von bis zu 20% auftreten können. Durch den Zusatz von Antikoagulanzien muss die Spontangerinnung der Blutprobe verhindert werden. Antikoagulanzien sind beispielsweise Na- bzw. K-EDTA, Natriumcitrat und Natriumoxalat (binden Ca2+) oder Heparinat (hemmt Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin).

Blutentnahme Kapillarblut

Stelle (z.B. seitlich am Finger, Unterrand des Ohrläppchens, beim Kleinkind mediale Fersenkante) mit Alkohol desinfizieren

mit Einmallanzette tief genug einstechen (2-3 mm) ersten Tropfen verwerfen (austretende Gewebsflüssigkeit, erste Tropfen mit

Mulltupfer trocken abwischen ) Die folgenden, von selbst austretenden Blutstropfen mit Kapillarpipette aufziehen nicht zu fest quetschen, da sonst z.B. die Erythrozyten verletzt werden und zu viel

Gewebsflüssigkeit austritt nach Möglichkeit luftblasenfrei entnehmen Einstichstelle erneut desinfizieren, evt. Pflaster

Prinzip: Der Hämatokrit (Hkt) gibt den Anteil der korpuskulären Anteile (feste Bestandteile) im Blut (zu 99% Erythrozyten, 1% Leukozyten und Thrombozyten) in Relation zum Gesamtblut an.

Zwischen den Erythrozyten befinden sich noch maximal 2% Plasma, die fälschlicherweise in den Hkt-Wert mit eingehen. Trotz dieser Ungenauigkeit ist die Hkt-Bestimmung mittels Zentrifuge eine Referenzmethode, mit der die Richtigkeit hämatologischer Analysensysteme überprüft werden kann.

Material: heparinisierte Hämatokritröhrchen; Kitt für Hämatokritröhrchen; Hämatokrit-zentrifuge, Messschablone

Ausführung: Eine heparinisierte Kapillare wird zu etwa 2/3 mit Blut gefüllt, das blutfreie Ende wird mit Kitt verschlossen (oder zugeschmolzen, die Röhrchenenden dürfen dabei nicht verbogen und das Blut nicht erhitzt werden). Zwei Kapillaren werden gegenüberliegend mit dem verkitteten Ende nach außen in die spezielle Hkt-Zentrifuge eingesetzt und 5 Minuten zentrifugiert (8000 upm).

Auswertung: Die Kapillare wird nach dem Zentrifugieren so auf die Ableseschablone gelegt, dass die 0% - und die 100% - Marken mit der Kittgrenze und der Luftgrenze übereinstimmt. Der Hkt-Wert kann an der Blut/Plasmagrenze abgelesen werden.

Normalwerte: Mann: 40-53 % Frau: 35-47 % unter Normalwert: Anämien

über Normalwert: entweder vermehrte Ery-Produktion ( pathologisch oder normal z.B. Leistungssportler ) oder Flüssigkeitsverlust ( Fieber, Durchfall ) und Exsikose ( Austrocknung )

Bei einem Hämatokrit über 45 bzw. 50% spricht man von Polyglobulie, bei Werten unter 35 bzw. 40% von einer Anämie. Da die Zellfraktion zu 99% aus Erythrozyten besteht handelt es sich meist um eine Veränderung der Erythrozytenzahl.

Versuch 2: Hämoglobinbestimmung (nach der Cyanhämoglobin-Methode) Das Hämoglobin ist mit 90% des Trockengewichtes der wichtigste Bestandteil der Erythrozyten und ist u.a. für den Sauerstofftransport zuständig.

Prinzip: Hämoglobin wird durch Kaliumhexacyanoferrat III (= Kaliumferricyanid) zu Hämiglobin oxidiert und anschließen mit KCN in Hämiglobincyanid übergeführt. Letzteres wird photometrisch bestimmt. Die Cyanhämiglobin-Methode ist ein Referenzverfahren, sie wird in modifizierter Form auch in mechanisierten hämatologischen Analysensystemen verwendet.

Material: Kapillarblut oder venöses EDTA-Blut; Hb-Reaktionslösung = Drabkinsche Lösung (0.6 mmol/Kaliumhexa-cyanoferrat III, 1.0 mmol/l Kaliumcyanid, 2.5 mmol/l Phosphatpuffer pH 7.2, 1.5 mmol/l Natriumchlorid, 0.05% Detergenz (Saponin, reaktionsbeschleunigend)).

Ausführung: Zu der bereits vorgelegten 2,5 ml Hb-Reaktionslösung (Drabkinsche Lösung) werden 10 µl EDTA-Blut gegeben (Doppelbestimmung). Nach dem Mischen wird 5 min inkubiert, dabei wird Fe2+ zu Fe3+ oxidiert und reagiert mit dem Reagenz zu Cyanmethämoglobin (rotbraune Farbe). Die Probe wird dann gegen einen Leerwert (Hb- Reaktionslösung ohne EDTA-Blut) bei einer Wellenlänge von 546 nm im Photometer gemessen.

Auswertung: Die Hb-Konzentration wird aus der gemessenen Extinktion (Eλ) nach dem Lambert-

Beerschen Gesetz abgeleitet:

ελ : molarer Extinktionskoeffizient

d = 1 cm (Küvetten-Schichtdicke)

Eλ

ελ x d c =

Die Hb-Konzentration der Probe (c) ergibt sich mit der Dimension g/dl unter Berücksichtigung des Molekulargewichts für Hämoglobin (MGHb : 64 458), des molaren Extinktionskoeffizienten für Hämoglobin (ε546 = 44 000) sowie des Verhältnisses aus dem Endvolumen des Ansatzes (Ev = 2,51 ml) und der eingesetzten Probe (P v =10 µl).

c = E546 x (64458/44000) x (2510/10) x 10-1 [g/dl]

= E546 x 36,8 [g/dl = g/100ml ]

Normalwerte: Mann : 14-18 g/ 100 ml Frau : 12-16 g/ 100 ml Neugeborener : - 24 g/ 100 ml

Versuch 3: Bestimmung der osmotischen Resistenz der Erythrozyten Die Erythrozytenmembran verhält sich in Salzlösungen wie eine halbdurchlässige Membran. Die intakte Membran kann Osmolaritätsänderungen widerstehen, aber bei beschädigten Membranfunktionen oder bei extremen Osmolaritätsverhältnissen hämolysieren die roten Blutkörperchen. Die Membranfestigkeit wird durch die Verdünnung der NaCl-Lösung gekennzeichnet, die die Erythorzyten noch ohne Hämolyse ertragen können. Die niedrigste Konzentration bei beginnender Hämolyse der roten Blutkörperchen wird als minimale osmotische Resistenz bezeichnet. Die NaCl-Konzentration, bei der alle Zellen hämolysieren wird als maximale osmotische Resistenz bezeichnet.

Unter Osmolarität versteht man die molare Menge aller in Lösung befindlichen osmotisch aktiven Moleküle pro Liter Lösung (Plasmaosmolarität: 290-300mosmol/l; physiologische Kochsalzlösung von 0,9% NaCl ist mit dem Blutserum isoton).

Die osmotische Resistenz der Erythrozyten hängt von morphologischen Gegebenheiten sowie ihrem Energiehaushalt ab. Die osmotische Resistenz ist beispielsweise herabgesetzt, wenn das Verhältnis von Erythrozyten-Oberfläche zu -Volumen zugunsten des Volumens verschoben ist wie bei der Kugelzellanämie oder wenn ein Mangel in der Enzymausstattung des Erythrozyten besteht wie bei den verschiedenen angeborenen Formen enzymopenischer hämolytischer Anämien. Eine erhöhte osmotische Resistenz findet sich bei Retikulozyten, Thalassämien (im Sinne einer erweiterten Resistenzbreite: normale bis leicht verminderte Minimalresistenz bei deutlich erhöhter Maximalresistenz).

Prinzip: Messung der Widerstandsfähigkeit der Erythrozyten gegenüber einer hypotonen NaCl-Lösung in absteigender Konzentration

Material: EDTA-Blut, Reagenzgläser, Natriumchloridlösung, Aqua dest.

Ausführung: NaCl-Verdünnungsreihe herstellen. Beginnend bei 0,56 % NaCl, jeweils mit Aqua dest. um 0,02% verdünnen. Als Ausgangslösung steht eine 1%ige NaCl-Lösung zur Verfügung.

% NaCl

(soll)

1% NaCl

Aqua dest. % NaCl

(soll)

1% NaCl

Aqua dest.

1 0,56% 2,8ml 2,2 ml 10 0,38% 1,9 ml 3,1 ml

2 0,54% 2,7 ml 2,3 ml 11 0,36% 1,8 ml 3,2 ml

3 0,52% 2,6 ml 2,4 ml 12 0,34% 1,7 ml 3,3 ml

4 0,50% 2,5 ml 2,5 ml 13 0,32% 1,6 ml 3,4 ml

5 0,48% 2,4 ml 2,6 ml 14 0,30% 1,5 ml 3,5 ml

6 0,46% 2,3 ml 2,7 ml 15 0,28% 1,4 ml 3,6 ml

7 0,44% 2,2 ml 2,8 ml 16 0,26% 1,3 ml 3,7 ml

8 0,42% 2,1 ml 2,9 ml 17 0,24% 1,2 ml 3,8 ml

9 0,40% 2,0 ml 3,0 ml

Verdünnungsreihe in 17 Zentrifugenröhrchen herstellen ( Konzentrationsänderung um

0,02% pro Röhrchen ) mit 1% NaCl und Aqua dest. Verdünnungen gut mischen (Vortexen) in jedes Röhrchen 1 Tropfen Blut mit Pasteurpipette zugeben vorsichtig mischen (Röhrchen mit Parafilm verschließen und vorsichtig schwenken) 2 h erschütterungsfrei stehen lassen Hämolyse ablesen Röhrchen zentrifugieren (5min, 2000upm, RT) Hämolyse erneut ablesen

Auswertung: Abgelesen wird die beginnende Hämolyse = Minimalresistenz ( 1. Röhrchen in dem die überstehende Flüssigkeit gelb/rot ist ), und die totale Hämolyse = Maximalresistenz (Röhrchen in dem kein Bodensatz von Erythrozyten zu sehen ist)

Normalwerte : Minimalresistenz bei 0,48-0,42 % NaCl

Maximalresistenz bei 0,34-0,30 % NaCl

Erniedrigte Werte (erhöhte Resistenz) beispielsweise bei: Thalassämie, Leber-erkrankungen, Retikulozytose, perniziöse Anämie oder Eisenmangelanämie

Erhöhte Werte (erniedrigte Resistenz) beispielsweise bei: Hereditäre Sphärozytose, erworbene hämolytische Anämien, Benzolvergiftungen

Versuch 4: Blutgruppen (AB0)

Prinzip: Die Blutgruppenbestimmungen erfolgen ausschließlich über die Hämagglutination, ausgelöst durch Antiseren bzw. Antikörpern mit Blutgruppenspezifität. Entweder wird ein unbekannter Antikörper durch ein bekanntes Antigen (Testerythrozyt) oder ein unbekanntes Antigen durch einen bekannten Antikörper (Testserum) nachgewiesen.

Antigen-Nachweis ( direkt )

• bekannter Antikörper + 1Tr. Blut • Blutgruppe A agglutiniert bei A und AB, O hat keine Agglutination usw.

Antikörper-Nachweis ( direkt ) bekannte Antigene (Test-Erythrozyten) + 1 Tr. Serum Serum der Blutgruppe A agglutiniert bei B ; Serum der Blutgruppe O agglutiniert bei

A,B

Die Agglutination wird angegeben in (+), +, ++, +++, ++++

Wir verwenden im Praktikum die „Medtrokarte“ von der Fa. Medtro. Sie wird verwendet für die ABO-Identitätssicherung vor Transfusionen.

Material: Vollblut/EDTA-Blut, Medtrokarte (enthält monoklonales Anti-A- bzw. Anti-B-Immunserum), Spritze oder Pipette zum Übertragen des Bluttropfens, Lanzette

Ausführung: In die Membranen über den Kammern werden mit Pipettenspitzen Löcher vorgestochen. Jeweils ca. 10µl Blut (frische Pipettenspitzen!) in die Kammern des Teststreifens (anti-A bzw. anti-B) überführen. Durch vorsichtiges Schütteln werden die Flüssigkeiten vermischt. Die Agglutination ist bereits nach kurzer Zeit zu erkennen.

Auswertung: Agglutination mit Anti-A = Blutgruppe A (AA oder A0)

Agglutination mit Anti-B = Blutgruppe B (BB oder B0)

Agglut. mit Anti-A und –B = Blutgruppe AB

Keine Agglutination = Blutgruppe 0

Fehlerquellen : unempfindliche Testseren ( Verfallsdatum ) abgeschwächte Isoagglutinine ( alte Menschen, Säuglinge ) keine Isoagglutinine nachweisbar ( Neugeborene) Pseudoagglutination = Geldrollenbildung Autoagglutination ( Rheuma !)

Hämolyse statt Agglutination ( bei aktiviertem Komplementsystem )

Block 2 (Blut-Zellzählung und Differentialblutbild)

Versuch 5: Erythrozytenzählung

Die Erythrozyten-, Leukozyten- und Thrombozytenzahlen gehören zu den Basiskenngrößen einer hämatologischen Laboruntersuchung. Im Routinelabor werden dazu in der Regel elektronische Zellzählgeräte verwendet, mit denen die Anzahl und die Volumenverteilung der Zellen vollautomatisch bestimmt werden (Meßprinzip: Erfassung von elektrischen Widerstandsveränderungen an der durchströmten Kapillaröffnung, d.h. Impedanzmessung nach dem "Coulter"-Prinzip).

Kammerzählverfahren, wie sie in dieser Kursstunde angewendet werden, spielen in der Praxis aber auch heute noch eine Rolle, z.B. bei der Überprüfung nicht plausibler Ergebnisse. Die Reproduzierbarkeit der Zählergebnisse ist schlechter als bei einer automatischen Zellzahlbestimmung.

Prinzip: Heim’sche Lösung (bzw. Hayem’sche Lsg) zerstört Leukozyten und Thrombozyten und lässt Erythrozyten leicht schrumpfen (NaCl), so dass sie unter dem Mikroskop leichter zu erkennen sind. Die hohe Konzentration von SO42- -Ionen erhöht die negative Ladung der Erythrozyten auf der Zelloberfläche und verhindert dadurch deren Aggregation sowie die ungleichmäßige Verteilung in der Zählkammer. Die Anwesenheit von Quecksilberchlorid in der Lösung macht diese haltbar.

Material: EDTA-Blut; Hämocytometer (Neubauer-Zählkammer); Erythrozyten-Mischpipette (rote Mischperle); Heim’sche Lösung

Heim’sche Lösung: NaCl 1,0 - 0,5g

Na2SO4 2,5g

Quecksilberchlorid 0,25g

auf 100ml mit Aqua pur. auffüllen

Erythrozyten-Mischpipette:

Durchführung: Blut bis zur Marke 0,5 aufziehen; danach Heim’sche Lösung bis zur Marke 101 aufziehen. Die Blutverdünnung in der Kammer beträgt nun 1/200. Pipettenspitze mit Parafilm verschließen. Die Pipette zwischen Daumen und Mittelfinger nehmen und mischen. Nur das

Blut in der Kammer nimmt an der Verdünnung teil. Wenn sich noch Heim’sche Lösung im Kapillarteil der Pipette befindet, muss dieses vor der Beschickung der Zählkammer entfernt werden (4-5 Tropfen verwerfen).

Die beiden Seitenstege der Neubauer-Kammer werden mit einem nassen Tupfer leicht befeuchtet und das geschliffene Deckglas unter Druck aufgeschoben. Wenn unter dem Deckglas farbige, sog. Newtonsche Ringe sichtbar werden und sich das Deckglas beim Kippen nicht ablöst, haben die beiden darunter entstandenen Zählkammern ein definiertes Volumen (der Abstand beträgt dann ca. 0,1 mm).

Aus der gut gemischten Blut-Verdünnung einen Tropfen an den vorderen Rand des Deckglases bringen (Mischpipette dabei möglichst senkrecht halten). Durch Kapillarwirkung wird die Verdünnung unter das Deckglas in die Zählkammer gesaugt. Ca. 3 Minuten warten, damit die Zellen sedimentieren können. Unter dem Mikroskop werden in Phasenkontraststellung (oder mit zugezogener Blende bei Mikroskopen ohne Phasenkontrast) bei 100 - 400facher Vergrößerung (Objektiv 10-40x, Okular 10x) die Zellen in 5 diagonal angeordneten Kleinquadraten zu je 16 Kleinstquadraten ausgezählt. Zellen, die die linke oder die untere Begrenzung eines der Quadrate berühren (L-Form), werden mitgezählt, solche, die die obere oder die rechte Begrenzung berühren, werden nicht mitgezählt.

Neubauer improved Zählkammer:

Verwendet man heutzutage die Neubauer-Zählkammer, ist darauf zu achten, ob man das "ältere" Modell oder das neuere Modell benutzt. Die Netzteilung beider Zählkammern weisen "Kantenlängen" von 3 mal 3 großen Quadraten - von je 1 mm2 Fläche auf.

Die 4 Eckquadrate werden in der Regel zur Leukozytenzählung benutzt.

Beim "neuen" Modell - der Neubauer improved Zählkammer - weist das große Quadrat in der Mitte eine Unterteilung von 5 x 5 Gruppenquadraten auf. Die Maße eines solchen Gruppenquadrates sind die Kantenlänge von 0,2mm und somit eine Fläche von 0,04 mm2.

Ein besonderes Merkmal der Neubauer improved sind die dreifachen Grenzlinien, wobei die mittlere als eigentliche Maßlinie anzusehen ist.

Beim älteren Modell weist das Quadrat in der Mitte eine Unterteilung von "nur" 4 mal 4 Gruppenquadraten auf. und entspricht der alten Thoma - Kammer. Hier sind die dreifachen Grenzlinien nur an 2 Seiten zu finden und bei den Gruppenquadraten ist die innere Linie als Maßlinie anzusehen.

Auswertung: Berechnung der Erythrozytenzahl: Tiefe: 0,1 mm Fläche eines Kleinquadrates: 0,04 mm2 Volumen eines Kleinquadrates: 0,004 mm3 (= 0,004 µl) Volumen von 5 Kleinquadraten: 0,02 µl (x 50 = 1µl) Erythrozyten/ 0,02µl x 50= Zellzahl / 1µl Verdünnung 1:200 Faktor: 50 x 200= 10000

Erythrozyten aus 5 Kleinquadraten x 10000= Zellzahl pro µl

Normalwerte: Mann: 4,5-6 Mill./ µl Frau: 4,0-5,5 Mill./ µl Kind: 4,0-5,5 Mill./ µl

Neugeborener: 4,5-7 Mill./ µl

Bestimmung der Retikulozytenzahl (nicht im Rahmen des Praktikums) Retikulozyten sind junge, frisch aus dem Knochenmark ausgeschwemmte, kernlose Erythrozyten. Sie können in unfixiertem Zustand mit sog. Supravitalfarbstoffen (z.B. Brillantkresylblau) kenntlich gemacht werden. Dabei stellen sich die Reste der RNA/DNA (u.a. von Zellorganellen, Ribosomen, endoplasmatischem Retikulum) als netzartige, blaue Struktur dar (sog. substantia reticulo-granulo-filamentosa). Zur Quantifizierung der Retikulozyten im peripheren Blut wird nach Inkubation mit dem Farbstoff ein Blutausstrich angefertigt und die Zahl der Retikulozyten pro 1000 Erythrozyten bestimmt. Leukozyten nehmen Brillantkresylblau ebenfalls auf und dürfen mit den kleineren kernlosen Retikulozyten nicht verwechselt werden. Auch spezifische Erythrozyteneinschlüsse wie Jolly-Körperchen (bei Milzdysfunktion und Asplenie), Heinz-Körperchen (= Hb-Präzipitate bei einigen hämolytischen Anämien) sowie Malariaparasiten werden durch Supravitalfarbstoffe angefärbt.

Im hämatologischen Routinelabor werden die Retikulozyten heute meistens mittels Durchflusszytometrie nach Inkubation mit einem Fluoreszenzfarbstoff bestimmt. Die Richtigkeit dieser Bestimmungsmethode muss mit Hilfe der oben angegebenen Handmethode kontrolliert werden.

Versuch 6: Leukozytenzählung

Prinzip: Die Essigsäure in der Türk’schen Lösung lysiert die Erythrozyten (Hämolyse), der Farbstoff Gentianaviolett färbt die Leukozytenkerne an.

Material: EDTA-Blut ( Antikoagulanz ) oder Kapillarblut; Hämocytometer (Neubauer Zählkammer); Leukozyten-Mischpipette (weiße Perle)

Türk'sche Lösung: Eisessig 1,0 g (bis 3,0)

1%ige Gentianaviolettlösung 1-2 g

ad 100 ml Aqua pur.

Der Zusatz der Gentianaviolettlösung erleichtert das Auszählen der Leukozyten, erschwert aber das Reinigen der Pipette.

Durchführung: Kapillarblut bis zur Marke 0,5 aufziehen und mit Türk'scher Lsg. bis zur Marke 11 auffüllen. Pipettenspitze mit Parafilm verschließen. Die Pipette zwischen Daumen und Mittelfinger nehmen und vorsichtig mischen.

Die Verdünnung in der Perle beträgt 1:20. Vor der Befüllung der Zählkammer muss die Türk’sche Lösung, die sich noch im Kapillarteil der Pipette befindet, entfernt werden.

Die beiden Seitenstege der Neubauer-Kammer werden mit einem nassen Tupfer gering befeuchtet und das geschliffene Deckglas unter Druck aufgeschoben (siehe Erythrozytenzählung).

Aus der gut gemischten Blut-Verdünnung wird ein Tropfen an den vorderen Rand des Deckglases gebracht (Pipette möglichst waagerecht halten) und durch Kapillarwirkung in die Zählkammer gesaugt. Nach ca. 3 Minuten sind die Zellen sedimentiert und können unter dem Mikroskop (Phasenkontrast) bei einer 100 - 400fachen Vergrößerung (Objektiv 10-40x, Okular 10x) gezählt werden. Bei der Leukozytenzählung werden 4 Großquadrate zu je 16 Kleinquadraten ausgezählt. Zellen, die die linke oder die untere Begrenzung eines der Quadrate berühren (L-Form), werden mitgezählt, solche, die die obere oder die rechte Begrenzung berühren, werden nicht mitgezählt.

Auswertung: Berechnung der Leukozytenzahl: Tiefe: 0,1 mm Fläche eines Großquadrates: 1,0 mm2 Volumen eines Großquadrates: 0,1mm³ Volumen von 4 Großquadraten: 0,4mm3 = 0,4µl Leukozyten/ 0,4µl x 2,5= Leukozyten/1µl Verdünnung 1:20 Faktor 2,5 x 20= 50

Leukozyten aus vier Großquadraten x 50= Zellzahl pro µl

Normalwerte : 4000-10000 / µl Blut

Die Thrombozytenzahl wird im Rahmen dieses Praktikums nicht bestimmt. Sie gehört aber – zusammen mit Quick-Wert und PTT – zu jeder hämostaseologischen Basisunter-suchung. "Quick-Wert" = Thromboplastinzeit, „PTT“ = Partielle Thromboplastinzeit (siehe Blutgerinnung)

Bei der Bestimmung der Thrombozytenzahl wird EDTA-Blut mit einer Lösung verdünnt, die eine Agglutination der Plättchen verhindert, ein Abrunden der Thrombozyten bewirkt und die Erythrozyten (nicht aber die Leukozyten) lysiert. Nach Auszählung unter dem Mikroskop wird die Thrombozytenzahl berechnet.

Fehlerquellen bei der Kammerzählung: Gerinnselbildung durch zu langsames Arbeiten bei der kapillären Blutentnahme EDTA-Blut nicht ausreichend gemischt Unsaubere, beschädigte oder noch feuchte Pipetten benutzt Verunreinigung der Verdünnungslösung mit Blut Luftblasen beim Aufziehen Pipette nicht ausreichend geschüttelt Reine Verdünnungslösung aus dem Kapillarteil der Pipette nicht vollständig

verworfen Deckglas nicht fest genug aufgesetzt, dadurch vergrößertes Kammervolumen Verunreinigte bzw. zerkratzte Kammern oder Deckgläser führen zur ungleichmäßigen

Zellverteilung Auszählung trotz ungleichmäßiger Zellverteilung Falsche Quadrate ausgezählt; falscher Umrechnungsfaktor

Versuch 7: Differentialblutbild

Prinzip: Im Differentialblutbild wird die prozentuale Verteilung der Leukozyten ermittelt. Gleichzeitig werden dabei Veränderungen an den Erythrozyten vermerkt.

Die reifen Leukozyten werden unterteilt in Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten, Plasmazellen. Die Granulozyten wiederum werden unterteilt in stab- oder segmentkernige neutrophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten oder basophile Granulozyten.

Material: Kapillarblut oder venöses EDTA-Blut, Objektträger, geschliffene Deckgläser, Färbereagenzien (May-Grünwald, Giemsa)

Durchführung: Auf einen Objektträger wird ein Tropfen frisches oder EDTA-Blut (ca. 10µl) rechts vom Mattrand aufgebracht. Anschließend wird ein geschliffenes Deckglas so auf den Blutstropfen aufgesetzt, dass sich das Blut an der Kante des Deckgläschens gleichmäßig verteilt. Das Deckglas wird im spitzen Winkel (45°) kurz in Richtung Mattrand bewegt und dann gleichmäßig und zügig in die Gegenrichtung ausgestrichen.

Je kleiner der Ausstrichwinkel, desto dünner wird der Ausstrich! Am Ende des Ausstriches muss eine Fahne oder Bürste entstehen.

Objektträger am Mattrand mit Bleistift beschriften (alkoholunlöslich). Präparat lufttrocknen lassen (min 30 min, besser länger; dabei vor Verunreinigung schützen).

Für einen Blutausstrich ist am besten EDTA-Vollblut geeignet (Heparin verfälscht die Färbung, Zitrat ist osmotisch wirksam und verändert damit die Zellform). Der Blutausstrich sollte nicht später als acht Stunden nach der Blutentnahme angefertigt werden, die weiteren Schritte, Fixierung und Färbung sind dagegen nicht zeitkritisch.

Panoptische Färbung nach Pappenheim Der nach Pappenheim gefärbte Blutausstrich ist auch heute noch die wichtigste Grundlage für eine differenzierte Beurteilung der Blutzellen. Mit dieser Färbung wird durch die Kombination zweier Färbelösungen (May-Grünwald und Giemsa) eine detail- und kontrastreiche sog. "panoptische"Anfärbung der Leukozyten erzielt:

Kerne: rötlich-violett Plasma: je nach Zellart entweder zart-rosa bis -violett (oxyphil), blaugrau oder

bläulich (basophil). Granula: dunkel rötlich-violett

Folgenden Kriterien sind bei der Beurteilung der Leukozyten zu beachten:

Anfärbbarkeit der Kerne/des Zytoplasmas Kernform und -struktur Zellgröße Kern/Plasma-Relation Zytoplasmaeinschlüsse (z.B. Granula)

Bei der Routinebeurteilung des Differentialblutbilds werden mindestens 100 Leukozyten differenziert. Da diese Stichprobe relativ klein ist, ist die Ungenauigkeit (Impräzision) der visuellen Blutbilddifferenzierung erheblich. Für verschiedene, am Mikroskop ermittelte Prozentsätze ergeben sich die folgenden 95%-Vertrauensbereiche (bei Differenzierung von 100 Leukozyten):

Gefunden (%): 0 2 5 10 20 30 40 50 70 90

95%-Intervall: 0-4 0-7 2-11 5-18 13-29 23-40 30-50 40-60 60-79 82-95

Neben der Differenzierung der Leukozyten umfasst die Befundung eines Blutausstrichs immer die vollständige Beurteilung aller Blutzellen d.h. Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten, evtl. vorhandene atypische Zellen!

Im Rahmen dieses Praktikums werden aus Zeitgründen nur die Leukozyten befundet.

Färbevorschrift für Tauchverfahren: Luftgetrocknete Blutausstriche für 5 min in May-Grünwald-Lösung (filtriert) einstellen.

1 min in PBS-Puffer waschen (unter Bewegung).

Blutausstrich für 20 min in Giemsa-Gebrauchslösung färben. (Giemsa-Gebrauchslsg.: Giemsa-Stammlsg. 1:20 mit PBS pH 7,2 verdünnen; filtrierte Stammlösung tropfenweise in PBS-Puffer unter Bewegung einbringen; täglich neu ansetzen)

Zellen gut mit PBS pH 7,2 spülen; 2 x 1min

Farbrückstände auf der Objektträgerunterseite mit 80%Ethanol abwischen und Objektträger an der Luft trocknen lassen.

Saures Wasser erzeugt rotstichige, alkalisches blaustichige Bilder. Deshalb wird eine Pufferlösung PBS pH 7,2 verwendet.

Differenzierung

Ausstrich auf den Kreuztisch des Mikroskops legen; Kondensor nach oben drehen Mit dem 10er-Objektiv die Ebene suchen Auf dem dünnen Teil des Ausstriches eine kleinen Tropfen Immersionsöl geben und

das 100er-Objektiv in den Strahlengang kippen Es werden 100 Leukozyten differenziert (Kriterien siehe oben) Da die Leukozyten auf dem Abstrich nicht gleichmäßig verteilt sind, sollte der

Abstrich mäanderförmig durchgemustert werden Gleichzeitig werden die Erythrozyten beurteilt (Kriterien siehe oben) Auch die Thrombozytendichte (ca 8-20/Gesichtsfeld schließen eine

Thrombozytopenie aus) und die Größe werden beachtet. Mit der Leukozytenzahl werden alle kernhaltigen Zellen erfasst, die kernhaltigen

Erythrozytenvorstufen werden zu 100% mitgezählt.

Neutrophile Granulozyten (50 bis 70 % der Leukozyten)

• 2 bis 5 verdichtete Kernsegmente • hellrosa Zytoplasma • Durchm.: 9 bis 15 µm • hellrote bis violette, feine Granula • „Jugendform": stabkernige Neutrophile (normal: 3

bis 5 % der Leukozyten)

Eosinophile Granulozyten (2 bis 4 % der Leukozyten)

• hantelförmiger, verdichteter Kern • hellblaues Zytoplasma • Durchmesser: 11 bis 16 µm • rote bis rotbraune, dichte, grobe Granula

Basophile Granulozyten (0 bis 1 % der Leukozyten)

• eingebuchteter oder kugeliger verdichteter Kern • blaßrosa Zytoplasma • Durchmesser: 9 bis 14 µm • violette bis schwarze, dichte, grobe Granula

Monozyten (2 bis 6 % der Leukozyten)

• nierenförmiger Kern mit lockerem oder scholligem Chromatin

• hellblaues Zytoplasma • Durchmesser: 10 bis 20 µm • keine Granula (selten zartrote Vesikel)

Lymphozyten (25 bis 45 % der Leukozyten)

• runder oder ovaler Kern • hellblaues Zytoplasma

a) kleine Lymphozyten (inaktiv) - sehr dichter Kern - schmaler Zytoplasmasaum (ø 5 bis 10 µm) - keine Granula b) große Lymphozyten (aktiv, selten) - schollige oder retikuläre Kernstrukturen - Zelldurchmesser: 10 bis 18 µm - rote Granula möglich

Die Thrombozyten sind blau mit violettem Kern und die Erythrozyten blassrosa.

Auswertung: Es empfiehlt sich, die differenzierten Zellen in ein Schema einzutragen, wobei in jeder senkrechten Spalte 10 Leukozyten beurteilt werden.

Beispiel:

Stabkernige GZ I I 2 Segmentkernige GZ

IIIII IIII IIIII II

IIII IIIII II

IIIII I IIIII IIIII II

IIIII II

IIIII 57

Eosinophile GZ I 1 Basophile GZ I 1 Monozyten II II I I 6 Lymphozyten III IIIII I III IIIII II III III II II IIII 33 Normalwerte (in %) Stabkernige GZ 3 – 5 %

Segmentkernige GZ 50 – 70 % Eosinophile GZ 2 – 4 % Basophile GZ 0 – 1 % Monozyten 2 – 6 % Lymphozyten 25 – 40 %

Fehlerquellen: Es wurde nicht mäanderförmig durchgemustert, dadurch erhält man falsche Leukozytenverteilung.

Fehlbeurteilung im Bereich, wo die Erythrozyten übereinander liegen. Farbniederschläge erschweren die Entscheidung.

Artefakte: Ausstriche sollten möglichst sofort hergestellt werden.

Verzögerungen führen im EDTA-Blut zu Erythrozyten- veränderungen (Stachelzellen), Degeneration von Neutrophilen und gelegentliche Lappung von Lymphozytenkernen.

In der Laborroutine werden heute verschiedene Systeme zur mechanisierten Blutbildanalyse eingesetzt (z.B. kombinierte Impedanz-, Konduktivität- und Streulichtmessung; wie z.B. Coulter STKS) oder zytochemische Reaktionen im Durchflussverfahren (Technicon H-Serie). Diese Geräte können große Zellzahlen (üblicherweise 10 000 Zellen) in wenigen Sekunden zählen und erreichen daher eine sehr viel bessere Präzision als die manuelle Mikroskopmethode. Sie eignen sich vor allem für die Analyse von Blutproben, die sich nur quantitativ vom Normalbefund unterscheiden (z.B. Anämie, Neutrophilie, Lymphozytose). Qualitative Veränderungen und pathologische Zellpopulationen (z.B. Blasten, atypische Zellen) werden von den mech. Blutanalysatoren oft nur durch ein Warnsignal angezeigt, wobei es nicht selten auch zu falsch negativen Ergebnissen kommen kann. Andere pathologische Blutzelleigenschaften wie z.B. die Zellform und Zellinhalte werden von Blutanalysatoren ebenfalls nicht erkannt. Deshalb sollten Blutausstriche von allen Patienten mit Verdacht auf eine hämatologische Erkrankung sowie von allen Blutproben, die im Blutanalysator ein Warnsignal ergeben, angefertigt werden und mikroskopisch nach der oben beschriebenen Methode identifiziert und beurteilt werden.

Block 3 (Blut-Immunologie)

Versuch 8: Gesamtprotein im Serum

Das Gesamtprotein im Serum wird routinemäßig mit der Biuret-Methode nach Weichselbaum bestimmt.

Testprinzip In alkalischer Lösung bilden Stoffe, die mindestens zwei Peptidbindungen enthalten, mit Kupferionen einen violetten Farbkomplex. Die Intensität der Violettfärbung ist der Anzahl der Peptidbindungen und somit der Proteinkonzentration proportional.

Eine weitere Möglichkeit die Proteinkonzentration zu bestimmen bietet der Bradford Test. (Testprinzip: In Gegenwart von Proteinen und im sauren Milieu verschiebt sich das Absorptionsmaximum des Coomassie-Brillantblaus G 250 von 465 zu 595 nm. Die Stabilisierung des Farbstoffs in seiner unprotonierten, anionischen Sulfonat- Form erfolgt durch Komplexbildung zwischen Farbstoff und Protein. Dabei bindet der Farbstoff unspezifisch an kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten (Arginin am wichtigsten, dann Lysin, Histidin, Trypthophan, Tyrosin und Phenylalanin). Beide Farbtests werden photometrisch bestimmt.

Der Bradford Test gilt als der empfindlichste Farbtest, ist aber auch sehr störanfällig. Im Praktikum wird die Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode durchgeführt.

Indikation: Schwere Eiweißmangelzustände, Dehydrierung

Material: Serum, in Ausnahmefällen Plasma.

Reagenzien:

BSA-Standard (Rinderserumalbumin) in 0,9% NaCl gelöst (6g/dl) Kontrollserum (Normalserum Sollwert 6,48 g/dl) NaCl-Lösung 0,9% Biuret-Reagenz: 45g K-Na-Tartrat, 3g CuSO4 ⋅ 5 H2O, 5g KJ, 0,2N NaOH in 1 l H2O Halbmikroküvetten

Durchführung: Pipettierschema für die Kalibriergerade (1.5 ml Eppendorfreaktionsgefäß):

1(Leerwert) 2 3 4 5 6

NaCl-Lsg. 250µl 240µl 230µl 220µl 210µl 200µl

BSA-Standard

- 10µl 20µl 30µl 40µl 50µl

Biuretlsg. 1,25ml 1,25ml 1,25ml 1,25ml 1,25ml 1,25ml

Pipettierschema für die Proben (Doppelbestimmung):

Serum 1 Serum 1 Serum 2 Serum 2

NaCl-Lösung 230 µl 230 µl 230µl 230µl

Serum 20µl 20µl 20µl 20µl

Biuret-Lösung 1,25ml 1,25ml 1,25ml 1,25ml

Die Ansätze werden in Eppendorfreaktionsgefäße pipettiert, gut durchmischt und anschließend in Halbmikroküvetten überführt.

Die photometrische Messung erfolgt bei 540 nm gegen den Leerwert

Berechnung: Die Konzentrationen werden über die Kalibriergerade bestimmt (in g/dl).

Referenzbereiche: Erwachsene 66 – 83 g/l (Serum) Neugeborene 46 – 68 g/l (1. d bis 4. Woche) Säuglinge 48 – 78 g/l (2. bis 12. Monat) Kinder 60 – 80 g/l (> 1 Jahr)

Störungen: Falsch hohe Eiweißkonzentration bei Hämolyse, Lipämie, Bilirubin > 5 mg/dl, Plasmaexpander-, Kohlenhydratinfusionen, Röntgenkontrastmittel

Bewertung: Die Gesamteiweißbestimmung im Serum besitzt nur einen mäßigen diagnostischen Wert, ist aber wichtig zur Beurteilung und Berechnung von Serumeiweißelektrophoresen. Abweichungen vom Referenzwert weisen auf eine Störung des Wasserhaushaltes oder eine Dysproteinämie hin. Absolute Veränderungen sind zurückzuführen auf Ab- oder Zunahmen von Albumin oder Immunglobulinen.

Abweichungen vom Normbereich: Störungen des Wasser und Elektrolythaushaltes Defektproteinämie Veränderte Plasmaproteinzusammensetzung (Dysproteinnämie)

Versuch 9: Serumeiweißelektrophorese und Immunfixation

Serumeiweißelektrophorese

Prinzip: Im elektrischen Feld wandern bewegliche, elektrisch geladene Teilchen zum entgegengesetzt geladenen Pol. Positiv-geladene Teilchen (Kationen) wandern zum Minuspol (Kathode) und negativ-geladene Teilchen (Anionen) wandern zum Plus-Pol (Anode). Die verschiedenen Stoffe wandern im elektrischen Feld unterschiedlich schnell. Bei der Elektrophorese werden Gemische von Stoffen oder Teilchen nach ihrer Größe oder Ladung aufgetrennt.

Je stärker ein Teilchen geladen ist, desto schneller wandert es im elektrischen Feld Je kleiner ein Teilchen ist, umso schneller ist die Wandergeschwindigkeit Neben der Größe hat auch die Form des Teilchens einen Einfluss auf die

Geschwindigkeit Bei der Serumeiweiß-Elektrophorese werden die Proteine des Serums durch ein elektrisches Feld aufgetrennt. Die Proteine müssen deshalb elektrisch geladen sein. In einer wässrigen Lösung können Proteine, je nach ihrer Zusammensetzung, positiv, negativ oder neutral geladen sein.

Das Trennmedium ist ein Puffer mit einem pH-Wert von 8,6. Unter diesen Bedingungen sind alle Proteine negativ geladen und wandern entsprechend ihrer Ladung, Molekülgröße und -form unterschiedlich weit zur Anode. Nach der Trennung werden die Proteine angefärbt und mit einem Densitometer quantitativ ausgewertet.

Abb.: 3 Auftrennung von Serumproteinen mit der Serumeiweißelektrophorese auf Zelluloseacetat (Normalbefund). (aus: Proteindiagnostik, Lothar Thomas; Behring Diagnostika)

Auswertung: Die Fläche unter der Kurve (AUC = area under the curve) wird integriert und der prozentuale Anteil der Einzelfraktionen berechnet. Die Berechnung der Absolutkonzentration erfolgt unter Zuhilfenahme der Gesamtproteinkonzentration.

Störfaktoren: Hämolyse, Lipämie, Fibrinogen in Plasmaproben, bakterielle Kontamination, Kryoglobuline.

Indikation: Erkennung von Dysproteinämien.

Bewertung: Bei vielen Erkrankungen kommt es zu typischen Veränderungen der quantitativen und qualitativen Proteinzusammensetzung des Serums. Wichtiger als die quantitativen Konzentrationen der Proteinfraktionen ist die Beurteilung des qualitativen Bildes der Elektrophorese. Daher sollte man sich immer das Elektropherogramm ansehen, das für viele Krankheitsbilder ein typisches Aussehen aufweist (Abb. 4).

Die Elektrophorese gibt orientierende Hinweise für das Vorliegen von Dysproteinämien, z.B. Akute-Phase-Reaktion, chronische Entzündung, oder Immundefizienz.

Referenzbereiche Fraktionen rel. % absolut in g/l

Albumin 55 - 70 32 - 52

α- Globulin 2 - 5 1,4 - 3,5

α2 - Globulin 5 - 10 3,5 - 7,0

β- Globulin 10 - 15 6,3 - 11,2

γ- Globulin 12 - 20 7,0 - 15,4

Abb. 4 Charakteristische Trennbeispiele für die Elektrophorese auf Zelluloseacetatfolie

Immunfixation

Die Gammaglobulinfraktion kann mit Hilfe der Immunfixation näher bestimmt werden. Die Serumproteine werden, wie bei der Eiweißgelelektrophorese, im Agarosegel nach ihrer Ladung aufgetrennt und vorhandene Immunglobuline "in situ" durch Immunkomplexbildung" mit Antiseren unterschiedlicher Spezifität (gegen IgG, IgA und IgM sowie gegen freie und gebundene Kappa- und Lambda-Leichtketten) im Gel fixiert. Nach Auswaschen nicht komplexierter Proteine werden die verbleibenden Immunkomplexe angefärbt. Monoklonale Immunglobuline stellen sich in der Immunfixationselektrophorese als dichte schmale Präzipitate dar.

Eine polyklonale - elektrophoretisch breitbasig erscheinende - Gammaglobulinvermehrung findet sich unter anderem bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen, Lebererkrankungen und Autoimmunprozessen. Eine exzessive Vermehrung antigenetisch, strukturell und funktionell

einheitlicher Immunglobuline und/oder deren Fragmente, die als monoklonale Immunglobuline bezeichnet werden, findet man beispielsweise beim Multiplen Myelom, bei M. Waldenström oder anderen lymphoproliferativen Erkrankungen.

Indikationen für eine Immunfixation:

Abklärung von Zusatzbanden in der Serum-Elektrophorese Diagnose und Typisierung mono- bzw. oligoklonaler Gammopathien

Ergebnisinterpretation

Monoklonale Immunglobuline:

Monoklonale Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) Multiples Myelom

Monoklonale Gammopathien

Bei atypischen Banden im elektrophoretischen Muster von Serum- oder Urinproben, vor allem in den Beta- und Gammaglobulinfraktionen (häufig Zufallsbefunde) besteht immer der Verdacht, dass es sich um monoklonale Proteine (M-Proteine, Paraproteine, monoklonale Im-munglobuline) und damit um ein Anzeichen für monoklonale Gammopathien handeln könnte. Monoklonale Gammopathien werden bei bis zu 3 % bei älteren Personen (> 70 J.) und 0,1 - 0,3 % der jüngeren Personen gefunden mit folgender Verteilung:

IgG 46 %

IgA 9 %

IgM 38 %

IgD/E 0,1 %

biklonal 3 %

Leichtketten 3 %* * Davon 67 % Kappa - und 33 % Lambda-Leichtketten

Zur Identifikation dieser atypischen (monoklonalen) Banden hat sich die Serum-Immunfixation als sehr empfindliche Technik zur Klassifizierung und Typisierung von monoklonalen und oligoklonalen Immunglo-bulinen und freien Leichtketten (Bence-Jones-Myelom) durchgesetzt.

Jede monoklonale Gammopathie muß differentialdiagnostisch abgeklärt werden, da eine maligne Plasmazellvermehrung zugrunde liegen kann!

Durchführung: Die Immunfixation wird mit dem Elphormat 4 der Firma Desaga (Sarstedt-Gruppe) durchgeführt. Trennung:

MIDIGEL IFE2 vorsichtig aus der Verpackung nehmen (Pinzette) und auf ein leeres Blatt Papier legen. Durch Auflegen eines Filterpapiers auf die Auftragefläche soll überstehende Flüssigkeit entfernt werden.

Auftragsmaske auf dem Gel platzieren: Die beiden äußeren Kerben müssen auf die beiden Markierungen auf dem MIDIGEL eingestellt werden. Streichen sie leicht mir einem Finger über die Auftragsschlitze, um sicherzustellen, dass das Gel anklebt.

2 μl der Probe pro Schlitz auftragen und 5 Minuten stehen lassen, damit die Probe eindringen kann.

Überschüssiges Serum wird entfernt, indem ein Saugpapier über die Schablone gelegt wird und beides anschließend entfernt wird.

Die Folie in die Elektrophoresekammer einspannen (Probenauftragestelle auf der Kathodenseite (-)). Die Kammer muss bis zur Markierung mit Barbiturat-Puffer gefüllt sein. Die Enden der Folie müssen in den Puffer tauchen. (Anionen wandern zur Anode = Pluspol)

Die Proteintrennung erfolgt bei einer konstanten Spannung von ca. 120V für ca. 25min.

Immunpräzipitation:

Am Ende der Elektrophorese MIDIGEL auf ein dünnes Blatt Filterpapier mit der Gel Seite nach oben legen und mit Hilfe eines Saugpapiers die überschüssige Pufferlösung von der Oberfläche des Gels entfernen (Pinzette).

Antiserum-Maske sorgfältig auf das Gel auflegen und leicht mit dem Finger an den Stegen andrücken. Die Maske muss absolut luftbalsenfrei auf dem Gel aufliegen.

Gel in Gelbox/Inkubationsbox legen und Fixativ- und Antiserum auftragen und mittels Kippen der Box gleichmäßig verteilen:

o EP-Spur: 40 μl Fixativ Lösung o Andere Spuren: 40 μl der entsprechenden Antiseren

Inkubationsbox schließen und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubieren. Färbung:

Antiserum-Überschuss mit deinem dünnen Blatt Filterpapier aufnehmen und zusammen mit der Antiserum-Maske vorsichtig entfernen.

MIDIGEL mit der Gel Seite nach oben auf ein Saugpapier legen und ein in Kochsalz-Lösung (0,9 % NaCl) getränktes dünnes Blatt Saugpapier luftblasenfrei auf das Gel legen. Zwei dicke Blatt Filterpapier auflegen und mit Gewicht für 10 Minuten zum Pressen beschweren. Gel in Gelrahmen einbringen und für 10 Minuten in Kochsalz-Lösung (0,9% NaCl) geben. Diesen Schritt noch 1-mal wiederholen.

Gel in destilliertem Wasser spülen und im Trockenschrank bei 70 °C für 30 Minuten trocknen.

MIDIGEL für 5 Minuten in der Färbelösung anfärben und anschließend nacheinander in zwei Entfärbebäder zum entfärben legen.

Gel mit destilliertem Wasser abspülen und unter einem Heißluftstrom (Fön) trocknen. Ergebnis kann nun visuell und/oder mittels eines Densitometers ausgewertet werden.

Fehler: Treten mehrere Banden im IgA- bzw. IgM-Feld auf, wird zusätzlich eine Immunfixation nach Vorbehandlung mit Mercaptoethanol durchgeführt, um Aggregate zu spalten.

Beispiel einer monoklonalen Gammopathie vom Typ IgG - Kappa

Versuch 10: Lipidelektrophorese

Prinzip: Im Prinzip wird die normale Serumelekrophorese durchgeführt (elektrophoretische Auftrennung). Allerdings wird anschließend nicht mit einem Proteinfarbstoff, sondern einem Fettfarbstoff (Öl-Rot oder Sudan-Schwarz) gefärbt. So werden die Lipoproteine sichtbar, die in der α-Fraktion (HDL), einer prä-β- (VLDL) und der ß-Fraktion (LDL) wandern. Chylomikronen bleiben an der Auftragstelle liegen.

Die Gele befinden sich auf durchsichtigen Trägern und können mit den für die Immunfixation benutzten Densitometern nachgewiesen werden. Unter Bezug auf das zuvor gemessene Gesamtcholesterin im Serum (wird im Rahmen des Praktikums nicht gemacht) und unter Verwendung von „Normogrammen“, die den unterschiedlichen Cholesteringehalt der Lipoproteinfraktionen berücksichtigen, können die Pherogramme gut reproduzierbar und zuverlässig quantitativ ausgewertet werden. Im Praktikum werden die Werte lediglich auf den Gesamtcholesteringehalt bezogen und mit Hilfe einer speziellen Auswertesoftware quantifiziert (semiquantitativ).

Voraussetzung für sinnvoll auswertbare Lipidelektrophoresen sind, dass der Patient sicher nüchtern war, keine Cholestase gegeben ist, keine Haparintherapie vorliegt und kein heparinisiertes Serum verwendet wurde. Bei Nicht-Nüchternserum ist mit dem Auftreten von

atypischen Lipoproteinfraktionen wie Chylomikronen und IDL zu rechnen. Bei Cholestase ist der Lipoproteinstoffwechsel krankheitsbedingt verändert und ein neues Lipoprotein Lp-X (Lp-X ist ein Gallenlipid-Apolipoprotein-Komplex, der das Enzym γ-GT binden kann. Es handelt sich um einen sicheren Cholestaseparameter) tritt in Erscheinung. Bei Heparintherapie kommt es zu Störungen der Wanderungseigenschaften der Lipoproteinfraktionen

Für die routinemäßige Lipidelektrophorese werden meist Agarosegele verwendet. Sie zeigen eine gute Auflösung und erlauben eine relativ gute Quantifizierung der Lipoproteinklassen, wenn der Gesamtcholesteringehalt bekannt ist.

Durchführung: Die Lipidelektrophorese wird mit dem Elphormat 4 der Firma Desaga (Sarstedt-Gruppe) durchgeführt. Trennung:

MIDIGEL LIPO GEL vorsichtig aus der Verpackung nehmen (Pinzette) und auf ein leeres Blatt Papier legen. Durch Auflegen eines Filterpapiers auf die Auftragefläche soll überstehende Flüssigkeit entfernt werden.

Auftragsmaske auf dem Gel platzieren: Die beiden äußeren Kerben müssen auf die beiden Markierungen auf dem MIDIGEL eingestellt werden. Streichen sie leicht mir einem Finger über die Auftragsschlitze, um sicherzustellen, dass das Gel anklebt.

4 μl der Probe pro Schlitz auftragen und 5 Minuten stehen lassen, damit die Probe eindringen kann.

Überschüssiges Serum wird entfernt, indem ein Saugpapier über die Schablone gelegt wird und beides anschließend entfernt wird.

Die Folie in die Elektrophoresekammer einspannen (Probenauftragestelle auf der Kathodenseite (-)). Die Kammer muss bis zur Markierung mit Barbiturat-Puffer gefüllt sein. Die Enden der Folie müssen in den Puffer tauchen. (Anionen wandern zur Anode = Pluspol)

Die Proteintrennung erfolgt bei einer konstanten Spannung von ca. 100V für ca. 25min.

Färbung:

Am Ende der Elektrophorese MIDIGEL mit dem Gel nach oben 10 Minuten in eine Fixiermittellösung (90 ml dest. H2O, 30 ml Eisessig, 180 ml EtOH) tauchen.

Gel für 5 Minuten in destilliertem Wasser waschen und waagrecht im Trockenschrank bei 70 °C für ca. 30 Minuten trocknen.

Trockenes MIDIGEL in Gelrahmen einbringen unf für 10 Minuten in die Farblösung tauchen. Anschließend in 2 aufeinander folgenden Entfärbebädern enfärben.

MIDIGEL erneut mit destilliertem H2O abspülen und unter einem Heißluftstrom (Fön) für 5 Minuten trocknen.

Ergebnis kann nun visuell und/oder mittels eines Densitometers bei 580 nm (gelber Filter) ausgewertet werden.

Versuch 11: CRP (Akute-Phase-Protein)

CRP (C-reaktives Protein bzw. Capsel-reaktives Protein) wird in der Leber synthetisiert. Es ist das klassische Akute-Phase-Protein und historisch eines der zuerst entdeckten. Es wurde bereits am Anfang des 20. Jahrhunderts erstmals beschrieben und erhielt seinen Namen, da es zusammen mit Calciumionen mit dem C-Polysaccharid (teichoinsäurehaltige C-Substanz) der Pneumokokken reagiert und eine Präzipitation hervorruft.

Ein Anstieg in Plasma erfolgt nach entzündlichen Erkrankungen, vor allem nach bakteriellen Infektionen, Aufgrund der Freisetzung inflammatorischer Zytokine (z.B. Interleukin 6). Das CRP wird als unspezifischer Entzündungsmarker unter anderem zur Beurteilung des Schweregrades entzündlicher Erkrankungen herangezogen. Aber maligne Tumoren wie z.B. der Morbus Hodgkin oder ein Nierenzellkarzinom können ebenfalls Zytokine bilden und somit eine Akute-Phase-Antwort auslösen, die Fieber und eine erhöhte Konzentration von CRP im Plasma induziert.

Prinzip: Serum mit C-reaktivem Protein verursacht die Agglutination der mit spezifischen Antikörpern gecoateten Latexpartikeln. Die Agglutination der Latexpartikel ist proportional der CRP-Konzentration im Serum und wird turbidimetrisch (Trübung) gemessen.

Material:

R1-Lösung (A): Pufferlösung (Tris, Natriumchlorid) R2-Lösung (B): Latexsuspension mit Anti-human CRP Antikörper Beide Lösungen sind gebrauchsfertig. Als Konservierungsmittel ist Natriumazid zugesetzt (Vorsicht Giftig). Standard: Humanserum mit Standardkonzentration an CRP (Konzentration wird im Praktikum bekannt gegeben, da diese je nach Charge variieren kann. Probandenseren Kontrollserum mit bekannter CRP-Konzentration Halbmikroküvetten (Einmalküvetten) und Photometer Durchführung: Eine Ausreichende Menge an „Gebrauchslösung“ herstellen. Dazu werden Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:4 gemischt und diese im Wasserbad auf 37°C erwärmt. Je 750 µl Gebrauchslösung werden in eine Küvette überführt und 5 µl Serum zugegeben. Sofort mischen und nach 10 Sek. bei einer Wellenlänge von 540 nm im Photometer (37°C) messen (E1). Nach 2 Minuten wird der zweite Wert gemessen (E2). Als Blank (Nullabgleich) dient Aqua dest. Der Standard und alle Proben werden in Doppelbestimmung durchgeführt.

Standard Kontrollplasma Probe E1 E2 E1 E2 E1 E2

1 2 Mittelwert Proz. Abw. Berechnung: (E2 – E1)Probe _____________________ * Konzentration Standard = mg/l CRP (E2 – E1)Standard Normalwert: bis zu 5mg/l Interferenzen: Hohe Bilirubinwerte (über 20 mg/dl) oder Hämoglobinwerte (über 1 g/dl) können den Test stören.

Block 4 (Gerinnung und Entzündungsmarker)

Die Erstdiagnostik von Gerinnungsstörungen kann nur durch eine Kombination verschiedener Methoden erfolgen. Das Minimalprogramm ist der Quick-Test, die partielle Thromboplastin-zeit (PTT) und die Thrombinzeit. Verlaufskontrollen einer Gerinnungsstörung können z. T. mit einer einzigen Untersuchung erfolgen (z.B. PTT bei F VIII-Mangel).

Messtechniken: Gerinnungstests werden mit Citratplasma durchgeführt (1 Teil Na-Citrat 0,11M + 9 Teile Blut). Das Plasma wird bei 3000 x g 10 min abzentrifugiert und abgenommen. Alle Gerinnungstests werden bei 37 °C durchgeführt.

Koagulometrische Verfahren: Prinzip der Gerinnungstests: der Zeitpunkt der Entstehung eines Gerinnsels wird gemessen.Dieses Prinzip liegt verschiedenen Methoden zugrunde.

Manuell: Häkchenmethode (s. Praktikum) Geräte: Häkchenkoagulometer nach Schnittger & Groß

Prinzip des Häkchenkoagulometers

Zwischen zwei Elektroden, die in die Probe eintauchen, wird permanent der Widerstand gemessen. Entsteht ein Gerinnsel, bleibt es an den Elektroden hängen und der Widerstand verändert sich. Es wird der Zeitpunkt bis zur Änderung des Widerstands gemessen.

Kugelkoagulometer (Praktikum)

Prinzip des Kugelkoagulometers

Das Röhrchen mit dem Gerinnungsansatz und einer Metallkugel rotiert im Wasserbad (unterhalb der Küvette befindet sich ein Motor mit einem Magneten, der die Kugel antreibt). Bildet sich ein Gerinnsel, stoppt die Rotation der Kugel. Die Kugelbewegungen werden durch einen Sensor erfasst (Impulssensor). Bleibt der Impuls aus, stoppt die Uhr, die für den jeweiligen Gerinnungsansatz mitläuft.

Photometrisch: sprunghafte Trübung bei Gerinnselbildung, es wird die Zeit bis zum Trübungsanstieg gemessen.

Chromogen: Umsetzung von chromogenen Substraten durch Gerinnungsfaktoren,

photometrische Messung.

Für die Erstdiagnostik werden vor allem Quick-Test, die partielle Thromboplastinzeit (PTT) und die Thrombinzeit bestimmt.

A.) Quick-Test (Thromboplastinzeit (TPZ), Prothrombinzeit): Der Quick-Test wurde 1936 von dem amerikanischen Hämatologen Arman James Quick entwickelt. Er erfasst nur den exogenen Teil des Gerinnungssystems und den gemeinsamen exogenen + endogenen Teil, also die Faktoren VII, X, V, II, I und Faktoren, die das exogene System beeinflussen (z.B. Heparin, Fibrinogenspaltprodukte).

(Genaueres siehe Versuchsanleitung)

B.) PTT (Partielle Thromboplastinzeit): Der PTT-Test erfasst das endogene System (F XII, XI, IX, VIII) und das gemeinsame endogene + exogene System (F X, V, II und I). Das Messergebnis wird außerdem beeinflusst z.B. von Heparin oder Fibrinogenspaltprodukten.

Testprinzip: Patientenplasma + Phospholipid-Kaolin-Gemisch (Phospholipid = partielles Thromboplastin, ersetzt den in vivo vorhandenen Plättchenfaktor III, Kaolin = aktive Oberfläche) + CaCl2 Bestimmung der Gerinnungszeit (koagulometrische Methode)

Normbereich: Abhängig vom Reagenz, ca. 40 sec

Indikationen sind beispielsweise: Voruntersuchung vor operativen Eingriffen, Suchtest bei unbekannter Gerinnungsstörung, Methode der Wahl zur Erkennung von Hämophilie A oder B, Überwachung bei Heparintherapie (der PTT ist dann um den Faktor 1,5 – 2 verlängert), Kontrolle bei Lebererkrankungen (z.B. Hepatitis, Leberzirrhose), Verdacht auf Vitamin K-Mangel.

Ursachen für pathologisch verlängerte PTT: Verminderung der Faktoren XII, XI, IX, VIII (z.B. bei Hämophilie A und Hämophilie B) bzw. Hemmung von Einzelfaktoren z.B. durch Autoimmunerkrankungen oder bei einer Heparintherapie.

C.) Thrombinzeit: Die Thrombinzeit erfasst die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin und Faktoren, die diese Umwandlung beeinflussen (z.B. Antithrombine, Heparin, Fibrinogenspaltprodukte).

Testprinzip: Patientenplasma + Thrombin Bestimmung der Gerinnungszeit (koagulo-metrische Methode)

Normbereich: ist abhängig von der Menge an Thrombin im Testansatz (je nach Hersteller 1 – 6 Einheiten). z.B. 9 – 13 sec (6 Einheiten); 18 – 23 sec (1,5 – 2 Einheiten)

Indikationen: Überwachung einer Heparintherapie (Thrombinzeit 2-4-fach verlängert), Überwachung einer Fibrinolysetherapie, z.B. mit Streptokinase oder Urokinase bei Herzinfarkt, Verdacht auf Fibrinogenmangel.

Pathologisch verlängerte Thrombinzeit: Starke Verminderung von Fibrinogen, Abnormales Fibrinogen, Fibrinogenspaltprodukte

Abkürzungen: F = Faktor; PAF = Plättchenaktivierender Faktor; PTT = Partielle Thromboplastinzeit; vWF = von Willebrand-Faktor, AT III = Antithrombin III

Im Praktikum wird zur Veranschaulichung nur der Quick-Test durchgeführt Versuch 12: Quick-Test mit der Häkelmethode

Versuch 13: Quick-Test mit dem Kugelkoagulometer

Der Test wird sowohl manuell nach der Häkelmethode als auch mit dem Kugelkoagulometer durchgeführt.

Blutabnahme: Citratblut (1 Teil Na-Citrat + 9 Teile Blut v/v) aus der Vene 10 min bei 3000 U/min zentrifugieren, Plasma abpipettieren. Gerinnungstests möglichst innerhalb von 4 h durchführen. Plasma nicht im Kühlschrank aufbewahren (Kälteaktivierung von F VII). Einfrieren des Plasmas möglich (4 Wochen bei -20 °C).

Indikationen sind beispielsweise Voruntersuchung vor operativen Eingriffen, Suchtest bei Blutungsneigung bzw. unbekannter Gerinnungsstörung, Überwachungstest bei Marcumar-therapie, Kontrolle bei Lebererkrankungen (z.B. Hepatitis, Leberzirrhose) oder Verdacht auf Vitamin K-Mangel.

Sollwerte bzw. Referenzbereiche der Kontrollplasmen / Normbereiche für die Patienten-plasmen: Bitte auf den aktuellen Tafelanschrieb achten. Diese Werte sind reagenzien- und chargenabhängig.

Prinzip: Nach Zugabe von Gewebethromboplastin und Ca2+ entsteht aus Prothrombin Thrombin (extrinsisches System). Thrombin führt zur Bildung von Fibrin aus Fibrinogen. Erfasst werden haupts. die Aktivität von Faktor II (=Prothrombin), VII und X. Diese werden in der Leber gebildet und benötigen zur Synthese Vitamin K. Sie werden gemeinsam mit dem ebenfalls Vit.K-abhängigen Faktor IX (=antihämophiles Globulin B) als „Prothrombinkomplex“ bezeichnet. Der Faktor IX wird allerdings mit dem Quick-Test nicht erfasst. Ca2+ muss zugegeben werden, weil durch das Citrat im Plasma Ca2+ gebunden wurde. Ohne Ca2+ kann keine Gerinnung stattfinden.

Maßeinheit: Quickwert in % bzw. INR (International Normalized Ratio, s. S.14)

Auswertung: Kalibrierkurve auf doppelt log. Millimeterpapier auftragen: x-Achse = % Gerinnungsaktivität, y-Achse = Gerinnungszeit (sec).

Durchführung:

Reagenzien: NaCl 0,9 % Quick-Reagenz (Technoplastin HIS von Technoclone): Lyophylisat in 10 ml

aqua dest. lösen, sofort gebrauchsfertig. Haltbarkeit: bei RT 24 h, bei +4 °C 6 Tage, bei -20 °C 2 Monate. ISI-Wert s. Tafelanschrieb

Kontrollplasma für Normalbereich (Coagulation Control N): Lyophylisat in 1 ml aqua dest. lösen, vorsichtig schwenken (Schaumbildung vermeiden, nicht vortexen!), 10 min bei RT stehenlassen, dann gebrauchsfertig. Haltbarkeit: bei RT 4 h, bei +2 bis +8 °C 8 h, bei -20 °C 1 Monat (Plasma darf nur 1 x eingefroren werden!).

Kontrollplasma für den pathologischen Bereich (Coagulation Control A). Herstellung s. Coagulation Control N.

Patientenplasma: Citratplasma von 2 verschiedenen Probanden.

Kalibrierkurve für die Häkelmethode (manuell): Die Kalibrierkurve wird mit normalem Kontrollplasma (Coagulation Control N) erstellt. Dafür wird zunächst eine Verdünnungsreihe erstellt:

Verdünnungsreihe: Ansatz (einfach) in Eppis 1,5 ml

Messung: in Doppelbestimmung

Glas-Reagenzröhrchen im Wasserbad bei 37 °C vortemperieren.

In die temperierten Röhrchen pipettieren: 100 µl Plasma oder Plasmaverdünnung 1 min bei 37 °C inkubieren 200 µl Quick-Reagenz (Technoplastin HIS) gleichzeitig Messung starten (Stoppuhr drücken) im Wasserbad mit Platinöse „häkeln“, bis sich Gerinnsel bildet bei Gerinnselbildung sofort Stoppuhr drücken. Werte in Tabelle eintragen

Gefäß-Nr. 1 2 3 4 5

Referenzplasma (µl)

Entfällt, direkt in RG pipettieren

125 65 35 25

NaCL (µl) --- 125 195 245 225

Quick-Wert (%)

100 50 25 12,5 10

Referenzplasma [% der Norm]

Gerinnungszeit 1 [sec]

Gerinnungszeit 2 [sec]

Mittelwert [sec]

100

50

25

12,5

10

Messen der Kontrollen und Patientenproben: Überprüfen Sie die Kalibrierkurve mit Kontrollplasma für den Normalbereich (Coagulation Control N) und den pathologischen Bereich (Coagulation Control A). Liegen die Quickwerte der Kontrollen im erlaubten Bereich, ist die Kalibrierkurve in Ordnung. Im Anschluss werden die Plasmaproben von zwei „Patienten“ gemessen.

Eintragen der Werte in Tabelle:

Untersuchungsmaterial Quick [sec] Quick [%] INR

1.Messung 2.Messung Mittelwert

Control N

Control A

Patient 1

Patient 2

Bestimmung des Quick-Werts mit dem Kugelkoagulometer Koagulometer auf 37° C temperieren. Mit Taste “PT” Programm für Quick-Bestimmung aufrufen Für das Kugelkoagulometer wurde bereits eine Kalibrierkurve erstellt und im Gerät

abgespeichert. Es müssen nur noch die Kontrollen und die Patientenproben in Einfachbestimmung gemessen werden.

In die temperierten Reagenzröhrchen mit Kugelspender jeweils 1 Metallkugel geben, dann dazupipettieren:

50 µl Plasma (möglichst die gleichen Proben wie bei der manuellen Methode verwenden).

1 min bei 37 °C inkubieren 100 µl Quick-Reagenz (Technoplastin HIS). Gleichzeitig mit Reagenz-Zugabe mit

“Start” die Zeitmessung starten. Wenn sich ein Gerinnsel gebildet hat, stoppt die Zeitmessung automatisch.

Die Messwerte werden ausgedruckt. Das Gerät errechnet anhand der vorher bestimmten Kalibriergerade den Quickwert in %. Dieser Wert muss noch in INR umgerechnet werden.

Normbereich: 70 – 120 % (alte Einheit), neu: INR (International Normalized Ratio), s.u.

Therapeutischer Bereich: 10 – 35 %, soll durch gezielte Therapie (z.B. Marcumar) erreicht werden.

Ausgeprägte Blutungsneigung: <10 %, Gegenmaßnahmen notwendig

INR: Die Angabe des Quick-Wertes in % ist problematisch, weil er vom jeweils verwendeten Reagenz abhängt. Um eine Vereinheitlichung der Quick-Werte und somit auch der therapeutischen Bereiche für Patienten unter Antikoagulantientherapie zu erreichen, wurde die INR-Standardisierung eingeführt. Dazu wurden die auf dem Markt befindlichen Quick-Reagenzien mit einem Standard-Reagenz verglichen und jedem Reagenz eine Sensitivitätszahl zugeordnet (ISI = International Sensitivity Index). Die Sensitivitätszahl wird der Packungsbeilage des jeweiligen Reagenzes entnommen. Mit folgender Formel wird die Reagenzien-Empfindlichkeit in die Quick-Wert-Berechnung einbezogen:

ISI

KontrollegesundeneinerzeitGerinnungsPatientenbeimzeitGerinnungsINR ⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡=

[sec][sec]

Normal: INR = 1 (entspricht Quick-Wert von 100 %)

Therapeutischer Bereich: INR = 2,0 – 3,0

Ursachen für pathologisch verminderten Quick-Wert:

Verminderung der Faktoren VII, X, V, II, I (angeboren oder erworben) Erhöhung der Fibrinogenspaltprodukte im Blut >50 µg/ml Erhöhter Heparinspiegel (Heparintherapie) Hemmung einzelner Gerinnungsfaktoren Vitamin K-Mangel Lebererkrankungen (z.B. Leberzirrhose)

Block 5 (Leber)

Versuch 15: Bilirubinbestimmung Die beiden Metabolite Bilirubin und Bilirubin-di-glucuronid des Hämoglobinabbaus stellen diagnostisch wichtige und analytisch gut fassbare Komponenten auf dem Weg Erythrozyt RES Leber Galle Darm dar. Aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen physio-chemischen Eigenschaften und ihrer Stellung innerhalb dieses Abbauweges ermöglichen sie differentialdiagnostische Aussagen insbesondere zur Funktion des Leber-Galle-Systems. Freies Bilirubin ist praktisch wasserunlöslich und toxisch. Es wird im Plasma als Bilirubin-Albumin-Komplex transportiert. In dieser Form ist es weder über die Niere noch die Gallenwege ausscheidungsfähig. Überangebot führt zu Anreicherung in der Lipidphase (Subcutis, Conjunctiva, Gehirn) mit dem klinischen Bild des Ikterus. In der Leber wird Bilirubin durch UDP-Glucuronsäure-Transferase in Bilirubin-di-glucuronid überführt (vgl. Vorlesung). Dieses Konjugat ist gut wasserlöslich, damit gallenfähig und, soweit es von der Leber aus auch wieder in die Blutbahn gelangt, auch gut nierenfähig.

Prinzip: Der Nachweis erfolgt photometrisch im Plasma, Serum oder Harn mittels einer üblichen Diazo-Reaktion:

Sulfanilsäurechlorid + Natriumnitrit Diazoniumchlorid

Diazoniumchlorid + Bilirubin(glucuronid) Azofarbstoff

Die Azo-Reaktion kann zunächst nur das wasserlösliche Bilirubinglucuronid erfassen (als sogenanntes "direktes Bilirubin"). Um auch das albumingebundene Bilirubin mit derselben Reaktion messen zu können, muss es erst kompetitiv aus der Bindung am Albumin verdrängt werden, durch Zusatz relativ hoher Konzentrationen z.B. von Coffein (s.u. Reagentien). Man ermittelt damit das Gesamtbilirubin.

Geräte: Photometer, Halbmikroküvetten, Mikropipetten

Reagentien:

1.) NaCl-Lsg.: (9 g/l) 2.) Coffein-Reagenzlösung: ( 5g Coffein, 7,5g Natriumbenzoat und 12,5g Natriumacetat, ad 100ml Aqua. dest.) 3.) Sulfanilsäure-NaNO2-Reagenzlsg.: Erst wird 0,5g Sulfanilsäure in 60ml H2O gelöst (mäßig erwärmen) mit 1,5ml Salzsäure (konz.) versetzt und auf 100ml mit H2O aufgefüllt. Anschließend werden zu 10ml der Sulfanilsäurelösung 0,25ml Natriumnitritlsg. (0,5g/100ml)gegeben (frisch zubereiten!!!). 4.) Kaliumnatriumtartratlsg.: 35g Kaliumnatriumtartrat, 10,0g NaOH, ad 100ml H2O 5.) 0,2 n Salzsäure 6.) Albumin-Reagenzlsg.: 2g BSA in 100ml 0,9% NaCl-Lsg. (1) (frisch herstellen!!!) 7.) 0,1 M Natriumcarbonatlsg.: 1,06 g Natriumcarbonat (Na2CO3 wasserfrei) in 100ml H2O 8.) 5 n Essigsäure: (28,5 ml Essigsäure 99%, ad 100ml H2O) 9.) Bilirubin-Stammlösung: 0,0456g Bilirubin (trocken, kühl und vor Licht geschützt aufbewahren) in 200 ml 0,1 M Natriumcarbonatlsg. (7) 5 ml dieser Lösung werden werden mit 10 ml Albumin-Reagenzlsg. (6) und 0,2 ml 5n Essigsäure (8) gemischt (Lösung frisch machen!!!)

Ausführung:

Herstellung einer Eichkurve (Bilirubin-Eichlösungen): 0,1 / 0,2 / 0,4 / 0,6 / 0,8 ml Bilirubin-Stammlösung (9) werden jeweils mit Albumin-Ragenzlösung (6) zu 1 ml aufgefüllt (in Eppis). Je 0,4 ml der Bilirubin-Eichlösungen (bzw. 0,4 ml Albuminlösung beim 0-Wert) werden, wie in der Tabelle beschrieben mit den übrigen Reagenzien gemischt. Die Extinktion wird bei 600nm (gegen den 0-Wert ohne Bilirubin) im Photometer gemessen. Die korrigierten Extinktionen der Eichansätze entsprechen Konzentrationen von: 1,5 mg; 3,0 mg; 6,0 mg; 9,0 mg bzw. 12,0 mg Bilirubin je 100ml Serum.

Durchführung: Folgende Reagenzien werden in Reagenzgläsern zusammenpipettiert und gemischt (vor Licht geschützt):

Reagenz 0 1,5 3 6 9 12

mg Bilirubin /100ml Serum

NaCl-Lsg. (1) 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml 0,6 ml

Coffeinlsg. (2) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

Sulfanilsäure/NaNO2 (3) 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Albumin-Lsg.(6) 0,4 ml

Bilirubin-Eichlösungen

(versch. Konzentrationen)

0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml

Die Mischung wird bei RT 10min inkubiert, anschließend jeweils 1,5ml Kaliumnatrium-tartrat-Lsg. zugebeben und gemischt.

Nach 5 min (spätestens 60min) werden die Eich-Werte gegen den 0-Wert im Photometer bei 600nm gemessen.

Bestimmung der Bilirubinkonzentration im Serum:

Folgende Reagenzien werden in einem Reagenzglas zusammenpipettiert und gemischt (Doppelbestimmung):

Reagenzienlsg. Serum1 Serum1 Serum2 oder

path. Kontrolle

Serum2 oder

path. Kontrolle

Natriumchloridlsg. (1) 0,8 ml 0,8 ml 0,8 ml 0,8 ml

Coffeinlsg. (2) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

Sulfanilsäure/NaNO2 (3) 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Serum 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Die Mischung wird bei RT 10min inkubiert, anschließend jeweils 1,5ml Kaliumnatrium-tartrat-Lsg. zugegeben und gemischt.

Nach 5 min (spätestens 60min) wird die Probe gegen den 0-Wert (aus der Bestimmung der Eichgerade) im Photometer bei 600nm gemessen.

Normalwerte: Gesamt Bilirubin im Serum: weniger als 1 mg/dl (80% an Albumin gebunden, 20% konjungiert). Grenzbereich zwischen 1-1,5mg/dl. Werte ab 1,5mg/dl sind als pathologisch anzusehen.

Fehlerquellen: Einfluss von Licht auf die Probe: Bilirubin wird durch Licht zu Biliverdin oxidiert. Dadurch werden für Bilirubin zu niedrige Werte gefunden. (Aufbewahrung im Dunkeln).

Versuch 16/17: Bestimmung der Transaminasen ASAT und ALAT

a.) AST (ASAT bzw. GOT)

Die AST (Aspartat-Amino-Transferase, Glutamat-Oxalazetat-Transaminase) ist ein zytoplasmatisches und mitochondriales Enzym, das im Herzmuskel (am reichlichsten), im Hirn, in der Leber, im Magen (Mukosa), in der Skelettmuskulatur, in der Niere und im Serum vorkommt. Man kann zwei Isoenzyme AST1 und AST2 unterscheiden, die Differenzierung spielt in der Diagnostik keine Rolle.

Indikation: Verdacht auf Lebererkrankungen (akute, chronische Hepatitis, Leberzirrhose, Fettleber, Lebermetastasen) sowie auf Herzerkrankungen (Herzinfarkt).

Prinzip: Durch GOT wird die Reaktion L-Aspartat + α-Ketoglutarat ⇔ Oxalazetat + L-Glutamat katalysiert. Das entstandene Oxalazetat wird in der Indikatorreaktion unter Katalyse der Malat-Dehydrogenase (MDH) zu Malat reduziert:

Oxalazetat + NADH + H+ ⇔ Malat + NAD+ Die Abnahme der NADH-Konzentration wird photometrisch gemessen.

Warnhinweis und Vorsichtsmaßnahmen: Die Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Nicht verschlucken und Berührung mit der Haut und Schleimhäuten vermeiden.

Material: Die GOT-Bestimmung erfolgt mit den Reagenzien von der Fa. „diaglobal“. Zudem werden Serum oder Plasma, Halbmikro-Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm und ein Photometer benötigt.

Ausführung: Reagenz 1 enthält L-Aspartat, Malatdehydrogenase (MDH) und Lactatdehydro-genase (LDH) in Tris-Puffer. Reagenz 2 enthält 2-Oxoglutarat und NADH.

Reagenz 1 wird im Verhältnis 10:1 mit Pyridoxalphosphat gemischt.

250 µl dieser Mischung werden in eine Halbmikroküvette gegeben, mit 50µl Serum gemischt und 5-30 min bei RT (25°C) inkubiert.

Anschließend werden 250 µl Reagenz 2 zugegeben, ebenfalls gemischt und nach 1,2 und 3 Minuten die Extinktion bei 340 nm gemessen (25°C).

Berechnung:

Aus den abgelesenen Extinktionen wird ΔE/min berechnet.

ΔE/min * 1745 = ASAT-Aktivität in U/l Diese Berechnung ist auf 37°C ausgelegt. Da im Praktikum bei RT bzw. 25°C gearbeitet wird, müssen die Werte noch korrigiert werden.

U/l 25°C = U/l 37°C * 0,48

Normalwerte: Männer unter 35 U/l; Frauen unter 31 U/l

Erhöhte Werte beispielsweise bei:

Lebererkrankungen (akute, chronische) Herzinfarkt (Ansieg 4-8h nach dem Infarkt, Maximum nach 16-18h, Normalwerte

wieder nach 3-6 Tagen)

b.) ALT (ALAT bzw. GPT)

Die ALAT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Alanin-Aminotransferase) ist ein zytoplasmatisches Enzym, das sich in der Leber in hoher Konzentration, in Niere, Herz- und Skelettmuskel in geringer Konzentration findet.

Indikation: Verdacht auf Lebererkrankungen

Prinzip: Durch GPT wird die Reaktion L-Alanin + α-Ketoglutarat Pyruvat + L-Glutamat katalysiert. Das entstandene Pyruvat wird in der Indikatorreaktion unter Katalyse der Lactat-Dehydrogenase (LDH) zu Lactat reduziert.

Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+

Mittels Photometer wird die Abnahme der NADH-Konzentration gemessen.

Warnhinweise: Die Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Nicht verschlucken und Berührung mit der Haut und Schleimhäuten vermeiden.

Material: Die GPT-Bestimmung erfolgt mit den Reagenzien von der Fa. „diaglobal“. Außerdem werden Serum oder Plasma, Halbmikro-Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm und ein Photometer benötigt.

Ausführung: Reagenz 1 enthält L-Alanin, und Lactatdehydrogenase (LDH) in Tris-Puffer. Reagenz 2 enthält α-Ketoglutarat und NADH.

Reagenz 1 wird im Verhältnis 10:1 mit Pyridoxalphosphat gemischt. 250 µl dieser Mischung werden in eine Halbmikroküvette gegeben, mit 50µl Serum gemischt und 5-30 min bei RT (25°C) inkubiert. Anschließend werden 250 µl Reagenz 2 zugegeben, ebenfalls gemischt und nach 1,2 und 3 Minuten die Extinktion bei 340 nm gemessen (25°C).

Berechnung:

Aus den abgelesenen Extinktionen wird ΔE/min berechnet.

ΔE/min * 1745 = ALAT-Aktivität in U/l Diese Berechnung ist auf 37°C ausgelegt. Da im Praktikum bei RT bzw. 25°C gearbeitet wird, müssen die Werte noch korrigiert werden.

U/l 25°C = U/l 37°C * 0,55

Normalwerte: Männer unter 45 U/l

Frauen unter 34 U/l

Erhöhte Werte bei Lebererkrankungen (z.B. Hepatitis)

Versuch 18: Apparative Messung verschiedener Blutparameter

In der Praxis werden Klinisch-Chemische Parameter in der Regel mit einem Klinisch-Chemischen Analysegerät, in welchem in kurzer Zeit viele Parameter gemessen werden können, durchgeführt.

Bei dem im Praktikum verwendeten Analysegerät „Piccolo“ der Firma HITADO handelt es sich um ein einfach zu bedienendes tragbares Analysegerät. Die Reaktionen finden in „Reagenzienscheiben“ statt, welche mit dem zu untersuchenden Serum befüllt werden. Die Ergebnisse werden photometrisch ermittelt.

Material: Die Firma bietet unterschiedliche „Panels“ an. Im Praktikum werden folgende Parameter bestimmt:

Alkal. Phosphatase (ALP) 42-141 U/l Alanin Aminotransferase (ALT) 10-47 U/l Aspartat Aminotransferase (AST) 11-38 U/l Amylase < 100 U/l Albumin (ALB) 3,3-5,5 g/dl Gamma GT 12 – 64 U/l (Männer), 9 – 36 U/l (Frauen) Gesamt-Protein (TP) 6,4-8,1 g/dl Gesamt-Bilirubin (TBIL) 0,2-1,6 mg/dl Blut Harnstoff-Stickstoff (BUN) 7-22 mg/dl Kreatinin (CRE) 0,6-1,2 mg/dl Calcium (CA++) 8,0-10,3 mg/dl Harnsäure (UA) 3,5-7,1 mg/dl (M), 2,5-5,9 mg/dl (F) Glucose (GLU) 73-118 mg/dl

Durchführung: Alle Parameter werden photometrisch bestimmt. Als Untersuchungsmaterial wird Serum verwendet.

Disk luftblasenfrei mit 100 µl Serum befüllen und anschließend in das Gerät einlegen. Nach der Messung werden die Werte auf eine ins Gerät eingelegte Ergebniskarte gedruckt.

Leber Theorie zu den einzelnen Parametern: Alanin Aminotransferase (ALT) Aspartat Aminotransferase (AST) Gesamt-Bilirubin (TBIL) (Siehe Skript bei den jeweiligen Gesamt-Protein (TP) Versuchen) Albumin (ALB) Alkalische Phosphatase (ALP)

Zellmembrangebundenes Enzym altersabhängige Referenzwerte Es gibt mehrere Isoformen, welche gewebsunspezifisch oder gewebsspezifisch

exprimiert werden. Diese können sich auch noch durch ihre Glykosylierung unterscheiden (z.B. Leber und Knochen)

Indikationen: Verdacht auf cholestatische Lebererkrankungen Erkrankungen des Knochens Beteiligung des Skelettsystems bei anderen Erkrankungen

Erhöhungen: Leber- und Gallenwegserkrankungen (z.B. akute und chronische Hepatitiden, Leberzirrhose, Fettleber (leicht), Cholangitis, primäres Leberzellkarzinom, Lebermetastasen, Medikamenten-bedingte Leberschäden)

Knochenerkrankungen (Vitamin-D-Mangel, Osteosarkom, Knochenmetastasen)

Verminderungen Angeborene Hypophosphatasämie, Angeborene Hypothereose

Amylase:

α-Amylase Beim Menschen gibt es fünf Isoformen (AMY1A, AMY1B, AMY1C (Speichel-

Amylasen) und AMY2A sowie AMY2B (Pankreas-Amylase) Speichel-Amylase wird von der Ohrspeicheldrüse gebildet. Die Bauchspeichel-

drüse (Pankreas) produziert Pankreas-Amylase. Die Ausschüttung der Pankreas-Amylase erfolgt hauptsächlich durch hormonale Stimulation (Cholecystokinin).

Indikationen: Amylase wird nicht immer routinemäßig bestimmt, sondern vor allem bei

Verdacht auf eine akute Entzündung der Bauchspeicheldrüse (akute Pankreatitis). Zur Sicherung der Diagnose ist jedoch auch die Bestimmung der pankreasspezifischen Lipase erforderlich.

Drei bis sechs Stunden nach Beginn der Oberbauchschmerzen bei akuter Pankreatitis steigt der Alpha-Amylase-Spiegel im Blutserum auf mindestens das Dreifache der Norm. Nach maximal fünf Tagen ist der Blutserum-Wert wieder normal. Im Urin bleibt die Alpha-Amylase bis zu 15 Tage lang erhöht. Je höher der Alpha-Amylase-Spiegel ist, desto schwerer ist der Patient an einer akuten Pankreatitis erkrankt.

Erhöhungen: Akute Pankreatitis Schub einer chronischen Pankreatitis Pankreasabszessen, Tumoren in oder neben dem Pankreas Verletzungen des Pankreas Operationen im Magen-Darm-Bereich

Verminderungen Bei Absterben (Nekrose) von Pankreasgewebe (die Bauchspeicheldrüse ist nicht

mehr in der Lage, Enzyme zu produzieren). Unnatürlich niedrige Werte treten können bei Gabe von Oxalat, Zitrat, EDTA oder

Fluorid auftreten Wasser und Elektrolythaushalt Calcium (CA++) Calcium kommt im Plasma in drei Hauptfraktionen vor: proteingebunden (~45 %), im Komplex mit kleinen diffusiblen Liganden wie z. B. Citrat, Lactat, Phosphat und Bicarbonat (~10 %) und in ionisierter Form (~45 %). Nur ionisiertes Calcium ist physiologisch aktiv. Diese Fraktion steht im dynamischen Gleichgewicht mit den anderen Formen (Abhängig v.a. von Proteinkonzentration und pH-Wert des Blutes).

Indikation pH-Verschiebungen Dysproteinämien Störungen des Calcium-/Phosphatstoffwechsels 1,25-(OH)2D3-Therapie Chronische Niereninsuffizienz mit Calcium-/Phosphatbinder-Therapie Dialysebehandlung Großvolumige Blut- oder Plasmatransfusionen Kardiopulmonale Bypasschirurgie Verdacht auf Knochenmetastasen, Multiples Myelom

Kohlenhydratstoffwechsel – Diabetesdiagnostik Glucose (GLU) Die Blutglucosekonzentration wird im Wesentlichen durch die Hormone Insulin und Glukagon reguliert. Insulin entfaltet seine Wirkung u.a. durch Steigerung der Glykogensynthese und Hemmung der Glykogenolyse und der Gluconeogenese; Glukagon wirkt entgegengesetzt. Ab einer Glucosekonzentration im Blut von etwa 180 mg/dl wird die Nierenschwelle überschritten und Glucose erscheint im Urin.

Indikation Erkennung einer diabetischen Stoffwechselstörung, Therapie und Verlaufskontrolle des Diabetes mellitus, Nachweis einer Hypoglykämie

erhöhte Werte Diabetes mellitus, Pankreaserkrankungen, endokrinologische Erkrankungen (M. Cushing, Akromegalie, Phäochromozytom, Hyperthyreose), Hämochromatose, Lebererkrankungen

erniedrigte Werte Überdosierung von Antidiabetika, Inselzelltumoren, extrapankreatische Tumoren, Malnutrition, starke körperliche Arbeit, Malabsorption, chronischer Alkoholismus, Lebererkrankungen

Störfaktoren Antidiabetika: erniedrigte Werte. Lange Probenverwahrzeit: falsch erniedrigte Werte Filtrationsleisung der Niere Die Kontrolle der glomerulären Filtration ist überall Bestandteil der Basisdiagnostik. Vor allem Kreatinin und Harnstoff (Stickstoff), beides Substanzen, die überwiegend über die Niere durch Filtration ausgeschieden werden. Kreatinin (CRE) Das in Leber, Pankreas und Nieren gebildete Kreatin wird im Muskelgewebe in energiereiches Kreatinphosphat umgewandelt. Kreatinphosphat dient im Muskelgewebe als Energiespeicher und -carrier. Beim Zerfall von Kreatin und Kreatinphosphat entsteht auf nichtenzymatischem Wege Kreatinin, das vollständig durch glomeruläre Filtration eliminiert wird. Die gebildete Menge an Kreatinin und dessen Konzentration im Plasma sind individualspezifisch und abhängig von der Muskelmasse und damit indirekt von Konstitution, Geschlecht und Alter.

Indikation Diagnostik und Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen

erhöhte Werte

Niereninsuffizienz (ab einer Reduzierung der GFR um über 50%), Muskeltraumata, Akromegalie, Verbrennungen

erniedrigte Werte Gravidität, juveniler Diabetes mellitus, Myopathien, Verminderung der Muskelmasse

Einflußfaktoren Als Metabolit des Muskelstoffwechsels hängt seine Konzentration auch von der individuellen Muskelmasse ab

Kreatinin-Clearance oder Glomeruläre Filtrationsrate Da der Kreatiningehalt im Serum abhängig von der Muskelmasse und dem Muskelstoffwechsel ist, bestimmt man besser die Kreatinin-Clearance (Klärvermögen der Niere) oder die Glomeruläre Filtrationsrate (GFR). Die Clearance ist ein Maß dafür, wie schnell die Niere bestimmte, zum Teil harnpflichtige Substanzen aus dem Blut entfernen kann (und damit im Harn auftauchen).

Formel: U-Krea (mg/dl) x V (ml)

C- Krea (ml/Min.) = ——————————— S-Krea (mg/dl) x t (Min.)

Schätzung der Kreatinin-Clearance bzw. GFR Dafür gibt es Formeln, mit denen man sehr zuverlässig die Funktion schätzen kann. Für die Schätzung der Kreatinin-Clearance nach den beiden Entwicklern mit Namen Cockroft und Gault braucht man Ihr Körpergewicht, Ihr Alter, Ihren Kreatinin-Wert im Blutserum und die Angabe Ihres Geschlechtes.

Kreatinin-Clearance = (ml/min)

(140 - Lebensjahre) x kg Körpergewicht

72 x Serum-Kreatinin (in mg/dl) oder

(140 - Lebensjahre) x kg Körpergewicht

0,82 x Serum-Kreatinin (in µmol/l)

Wichtig: Bei Frauen wird der Wert nochmals mit 0,85 multipliziert

Normale Clearance-Werte liegen zwischen etwa 90 bis 120 Milliliter pro Minute (ml/min).

Was bedeutet eine Erhöhung der Clearance/GFR?

Werte über 120 ml/min treten z.B. zu Beginn der Nierenerkrankung auf. Sie zeigen, dass die Niere versucht, wie oben beschrieben, mehr auszuscheiden. Das ist z.B. bei Diabetikern bereits in einer sehr sehr frühen Phase der diabetischen Nierenerkrankung beschrieben. Sobald dann die Ausscheidung sehr geringer Mengen von Eiweiß (Mikrobalbuminurie) hinzukommt, sollte man bereits aufmerksam werden. Diese Eiweißbestimmung im Harn wird viel zu selten bei Diabetikern gemacht, ist jedoch ganz einfach mit einem bestimmten Teststreifen durchzuführen. Was bedeutet eine Senkung der Clearance/GFR?

Die Senkung der Clearance-Werte zeigt eindeutig das Nachlassen der Nierenfunktion. Wird nicht behandelt, schreitet die chronische Nierenerkrankung in der Regel "automatisch" fort. Pro Jahr kann dann die Klärfähigkeit um mehr als 10ml/min abnehmen. Dies kann durch gute Behandlung auf wenige ml/min jährlich verzögert werden (z.B. Blutdrucksenkung auf unter 130/80 mmHg). Blut Harnstoff-Stickstoff (BUN, Blood Urea Nitrogen) Harnstoff ist der Hauptausscheidungsstoff des Protein-Stickstoff-Stoffwechsels im Menschen. Er macht den größten Anteil der nicht-proteinhaltigen Stickstoffkomponente im Blut aus. Harnstoff wird in der Leber produziert und über die Nieren im Urin ausgeschieden. Folglich hängen die sich im Umlauf befindlichen Harnstoffmengen von Proteinaufnahme, Proteinabbau und Nierenfunktion ab. Lebererkrankungen, kongestivem Herzversagen, Diabetes und Infektionen. Erhöhte Werte bei verminderter glomeruläre Filtrationsrate, bei behindertem Harnabfluss (Stein, Tumor) und bei übergroßer Proteinzufuhr (z.B. alimentär oder nach massiven Bluttransfusionen). Erhöhte Werte aber auch bei Lebererkrankungen, kongestivem Herzversagen, Diabetes und Infektionen. Harnsäure Harnsäure ist das Endprodukt des Purinstoffwechsels. Als Nahrungsbestandteil wird Purin mit Fleisch, vor allem mit Innereien, aufgenommen. Harnsäure ist nur sehr gering im Blut löslich (unter 420 µmol/l). Bei höheren Konzentrationen bilden sich vor allem in den Gelenken Harnsäurekristalle, die dort massive Entzündungsreaktionen hervorrufen können. Es kommt zum so genannten Gichtanfall. Die Veranlagung, einen Gichtanfall zu erleiden, ist erblich.

Indikation Oft wird Harnsäure routinemäßig bei Blutuntersuchungen bestimmt. Speziell wird sie gemessen zur Diagnostik und Verlaufskontrolle bei Gicht und als Kontrolle bei Nierenversagen.

erhöhte Werte Vermehrter Purin-Aufnahme über die Nahrung (vorhanden in Fleisch und

Innereien) Gesteigerter Purinbildung im Körper (Zelltod) Nierenfunktionsstörungen

erniedrigte Werte Xanthinoxidasemangel Einnahme von Medikamenten wie Allopurinol und Probenecid