II U N I D A DU N I D A D

BacteriologíaGeneral

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PRÁCTICA PRÁCTICA 11Reconocimiento de los tres ambientes del laboratorio de Microbiología yReconocimiento de los tres ambientes del laboratorio de Microbiología y

Parasitología.Parasitología.Uso del microscopio. BioseguridadUso del microscopio. Bioseguridad

1.- ¿Con qué finalidad se utiliza la solución salina o suero fisiológico?

La adición del suero es para promover el crecimiento de microorganismos menos resistentes. Los sueros más empleados son: suero de ternera, suero de bovino y algunas veces el suero humano.

2.- ¿Qué es agar?

Es un coloide hidrofílico obtenido de varias especies de algas rojas. Es utilizado para el cultivo solido de bacterias y otros microorganismos emulsificadores y como medio de soporte para inmunodifusión e inmunoelectroforesis.

3.- ¿Diga en qué momento se requiere el uso de los indicadores y amortiguadores?

Un amortiguador se usa cuando se necesita infundir algún cambio en la [H+]. El indicador se usa para dar a conocer la aparición y desaparición de un compuesto químico por un cambio de color o logro de un determinado pH.

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Partes del Microscopio

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PRÁCTICA PRÁCTICA 22Presencia de microorganismos en el medio ambiente. Técnicas para el aislamiento dePresencia de microorganismos en el medio ambiente. Técnicas para el aislamiento de

microorganismos. Necesidad de practicar las técnicas asépticamente. Cultivo demicroorganismos. Necesidad de practicar las técnicas asépticamente. Cultivo de organismos anaerobios.organismos anaerobios.

I. EXPERIMENTO N° 1:

Presencia de microorganismos en el medio ambiente

Fundamentación:Confirmar la presencia de microorganismos en el medio ambiente, mediante un procedimiento llamado siembra que consiste en acondicionar el microorganismo a un medio de cultivo fértil, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de incubación, pueda desarrollarse y multiplicarse.

Materiales 1 placa petri con agar nutritivo, agar sangre. Suero salino. Asa de Kolle

Procedimiento Tomar la placa con agar nutritivo y dividirlo en 4 cuadrantes con un plumón

indeleble. Dibujar estrias en medio de cultivo. 1º cuadrante: agua de caño. 2º cuadrante: Saliva. 3º Cuadrante: Agua de piso. 4º cuadrante: Agua de Piel. Tomar la placa de agar sangre y tosa en el. Incubar a 37ºC por 24h.

Resultados y conclusiones: En el sector con agua de caño no se observa crecimiento de

microorganismo. El sector con saliva presenta crecimiento pero no por la saliva porque no contiene microorganismos; esto demuestra que nuestra boca contiene gran cantidad de microorganismos como el Estreptococo mutans.

El sector con agua de piso y de piel también mostro crecimiento debido a la presencia de microorganismos en el medio ambiente.

En el agar sangre se observo la presencia de microorganismos pero ninguno realizo hemolisis, por lo cual no era un Estreptococo B hemolítico.

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II. EXPERIMENTO N°2:

Técnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las técnicas sépticamente.

FundamentoEn todos los ambientes habitan multiples microorganismos de diversos tipos y actividd fisiológica. Para efectuar el estuio de un organismo en particular es necesario separarlo de la población mixta en la que se encuantra. Para tal fin se emplean técnicas de aislamiento que conduzcan a la obtención de un cultivo puro. Los métodos usados son: diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, siembra por agotamiento.

Material 1 Placa Petri “Estéril” con Agar Nutritivo 1 Placa Petri “No Estéril” con Agar Nutritivo. 2 Tubos de prueba con caldo Nutritivo 1 Pipeta estéril de 1 ml. 1 Tubo con caldo de cultivo mixto de bacterias

Procedimiento: Aislamiento por método de sembrado de estrías. Estría Simple Estría por Agotamiento Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con el

asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo mixto y dibuje, estrías sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estéril con agar nutritivo.

Marque la placa con lápiz de vidrio y lleve a la estufa a 37°C por 24 h. Tome la placa Petri no estéril y márquela en su parte posterior colocando “No

estéril”, llévela a la estufa a 37°C por 24h. Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estéril transfiera 1 ml de caldo

de un tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos y llévelos a la estufa a 37°C por 24 a 48 h.

Resultados En las placas con estrías simples, se observa que hay crecimiento pero de un solo

tipo de colonia. En las placas de agotamiento por estrías, se trata de un método rápido y simple de

agotamiento y continuo de inoculo sobre un medio solido contenido en una placa petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas bacterias originara una colonia. Se obtiene diferentes colonias.

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III. EXPERIMENTO N° 3:

Cultivo de Organismos Anaerobios.

Fundamentos Los microorganismos anaerobios constituyen la flora bacteriana predominante en el

ser humano y se hallan constantemente en el ser humano y en el tracto intestinal, vías respiratorias y aparatos genitourinarios. Aun cuando los anaerobios se encuentran en heridas y abcesos, hay que tener presente que pueden participar en cualquier tipo de infección. Para trabajos de laboratorio con estos microorganismos es preciso obtener condiciones de anaerobiosis; esta atmosfera tiene doble finalidad: eliminar o reducir la tensión de oxigeno y mantener el ambiente sin este o la menor concentración posible. Algunos procedimientos son más sofisticados otros más sencillos.

La vía metabólica utilizada por estos gérmenes permite la liberación de sustancias de metabolismo intermediario, como ácidos grasos volátiles de cadena corta como el acido butírico, valérico, etc., de olor desagradable y fácilmente detectable, que facilitan el diagnostico.

Material : 2 Tubos con Agar Nutritivos vertical 2 Tubos con Agar Nutritivos inclinado 2 Tubos con Caldo de Tioglicolato o caldo carne Campaña de Durham o Jarra Gaspack Cepas de Clostridium sporógenos y Bacillus subtilis

Procedimiento: Siembre cada cepa en uno de cada par de tubos, por puntura en el agar vertical, por

estría en el inclinado y asada en el caldo. Tapone los tubos y lleve a la Campaña de Durham. Incube a 37°C por 24 h.

Resultados El Clostridium sporogenos es un microorganismo anaerobio, por lo tanto al obtener

los resultados no se observo crecimiento alguno en el AGAR VERTICAL (falla en el cultivo) pero se debió observar en la base por ser zona anaerobia, en el AGAR DIAGONAL se observo crecimiento en la zona anaerobia y también hubo crecimiento en el caldo de TIOGLICOLATO.

El Bacillus subtilis es un microorganismo aerobio y presento crecimiento en el AGAR DIAGONAL (zona aerobia), pero también hubo crecimiento en el AGAR VERTICAL en la zona aerobia y en anaerobia porque el Bacillus es un anaerobio facultativo. También hubo crecimiento en el caldo de TIOGLICOLATO.

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PRÁCTICA 3PRÁCTICA 3Metabolismo Bacteriano. Enzimas de los microorganismos. Fermentación bacteriana.Metabolismo Bacteriano. Enzimas de los microorganismos. Fermentación bacteriana.

I. EXPERIMENTO N° 1:

Hidrólisis del Almidón

Objetivo: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen exoenzimas y que atacan substratos importantes como Carbohidratos y Proteínas.

El almidón es un polímero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. También puede ser hidrolizado por los Acidos Minerales.

ALFA AMILASA + ALMIDON = DEXTRINA + ALFA MALTOSABETA AMILASA + ALMIDON = ALFA MALTOSA

Las Amilasas son enzimas extracelulares

Materiales: Solución de Yodo (Lugol) Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli. 1 Placa de Agar Almidón

Procedimiento: Dividir en dos sectores la placa de Agar almidón Inocular en estrías cada sector con las capas de B. subtilis y E. coli. Incubarlo a 37ºC por 24 h.

ResultadosResultados

OrganismoOrganismo CrecimientoCrecimiento HidrólisisHidrólisisBacillus subtilisBacillus subtilis De bueno a excelenteDe bueno a excelente ++

EschercihiaEschercihia colicoli De bueno a excelenteDe bueno a excelente --

Luego de agregar el lugol:

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II. EXPERIMENTO N° 2:

Hidrólisis de la Gelatina

La gelatina es una proteína dotada de la propiedad de tomar GEL cuando se disuelve en agua caliente Por tratarse de una proteína puede ser atacada por alguna bacterias que la priven de su propiedad gelitificante.La hidrólisis de la gelatina es una reacción enzimática y se conoce por GELATINASA la enzima causante de esta transformación.

Materiales: Cepas de S. Aureus, B. subtilis y E. coli. Tres tubos de Gelatina Nutriente estéril Asa de Kolle en aguja

Procedimiento: Inocule cada uno de los organismos en un tubo de Gelatina Nutriente por puntura

hasta el fondo del tubo, una sola vez. Incube a temperatura ambiente por 2 a 7 días, no en incubadora porque derrite la

gelatina.

ResultadosResultados

OrganismoOrganismo CrecimientoCrecimiento Hidrólisis de GelatinaHidrólisis de GelatinaS. aureusS. aureus De bueno a excelenteDe bueno a excelente ++B. subtilisB. subtilis De bueno a excelenteDe bueno a excelente ++

E. coliE. coli De bueno a excelenteDe bueno a excelente --

Interpretación Interpretación

Hidrólisis de la gelatinaHidrólisis de la gelatina Positivo (+): cuando el medio en el tubo no está gelificado.Positivo (+): cuando el medio en el tubo no está gelificado. Negativa (-): cuando el medio en el tubo esta gelificado.Negativa (-): cuando el medio en el tubo esta gelificado.

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III. EXPERIMENTO N° 3:

Producción de Hemolisinas

Objetivo: Conocer y estudiar las exoenzimas que tienen efectos destructivos sobre los glóbulos rojos.

Hemolisina Beta: Destruye y decolora la Hemoglobina. Esto se observa como áreas claras alrededor de la colonia.

Hemolisina Alfa: No decolora la Hemoglobina, pero la cambia a un color verdoso. (Biliverdina)

Materiales: Cepa de Staphylococcus aureus (o B. subtilis) y Streptococcus pneumonias o

Streptococo Lact. Agar sangre (1 ó 2)

Procedimiento: Dividir en dos placas petri. Inocular en estrías las cepas en cada uno de los lados. Incubar a 37º C por 24-48 h. Observar si ha habido hemólisis

Resultados:Resultados: En el Estafilicoco aureus se pudo observar pqueños halos en los bordes, pero soloEn el Estafilicoco aureus se pudo observar pqueños halos en los bordes, pero solo

en un lado (hubo hemolisis pero poca), posible fallo en la siembra.en un lado (hubo hemolisis pero poca), posible fallo en la siembra. En el de E. coli debido a que produce hemolisina alfa por ello produce hemolisisEn el de E. coli debido a que produce hemolisina alfa por ello produce hemolisis

incompleta no decolora totalmente la hemoglobina.incompleta no decolora totalmente la hemoglobina.

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IV. EXPERIMENTO Nº 4:

Demostración de la Producción de Coagulasa N.

La Coagulasa es una exoenzima elaborada por el Staphylococcus aureus y que coagula el plasma humano o de cobayo.

Materiales: Cepa de S. Aureus Plasma humano o de cobayo citratados en tubo.

Procedimiento: Tomar una azada de la cepa e inocular en el tubo que contiene el plasma citratado. Incubar por 2-3 horas. Revisar cada 30’ el tubo para ver si han empezado a formar

coágulos. Para esto incline el tubo para ver que tan líquido está el plasma.ResultadosSe produjo coagulación del debido a la coagulasas del Estafilococo aureus.

Plasma citratado formación de coágulos, (+) turbio

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V. EXPERIMENTO N° 5:

Fermentación de Carbohidratos

Fermentación se refiere a la degradación anaeróbica de los carbohidratos. La capacidad para fermentar los carbohidratos depende de las enzimas que contenga cada bacteria. La degradación de los carbohidratos conduce a la formación de productos lácteos, por lo tanto se utilizará un indicador de ph: Rojo Fenol.

En la práctica se utilizará el medio TSI en tubo. Si la bacteria no tiene las enzimas necesarias para atacar los carbohidratos, no cambiará el ph.

La prueba contendrá lo siguiente: Agar TSI (3 azúcares y hierro) favorece el desarrollo de la mayoría de bacterias. Azúcares químicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa. Un indicador de ph.

NC no cambio de phA ácidoAG ácido y gasb básico

Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energía necesaria la obtiene la bacteria de proteínas y su producto final es gas amoniaco.

Materiales: Cultivo de Escherichia coli , Alcaligenes faecalis y Staphylococcus aureus 3 tubos con TSI en plano inclinado

Procedimiento: Sembrar por estría y puntura:

a) E. Coli - TSIb) Alcaligenes - TSIc) Staphylococcus - TSI

Incubar por 24 h. A 37°C

Resultados: El tubo correspondiente a la E. coli evidenciamos un cambio de color de rojo a amarillo (un medio acido); y esto evidencia la existencia de una fermentación. En función a la posición de los azucares observamos una prueba de lactosa + sacarosa + glucosa.

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Hubo fermentación en E. coli

En el tubo correspondiente a la siembra con alcaligenes se mantiene la coloración roja (medio básico), no hubo fermentación.

Alcaligenes, no hay fermentación

En el tubo con siembra de S. aureus, se observó una fermentación casi completa. Se muestra que este organismo es ayudado por el oxígeno.

Fermentacion en siembra de Staphylococcus

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Conclusiones: La capacidad de fermentar al CHO depende de la presencia enzimática del

microorganismo El cambio de pH está en relación a la capacidad fermentativa Los alcaligenes al no poder fermentar; esto se debe a la no presencia del material

enzimático correspondiente.

VI. EXPERIMENTO N° 6:

Reducción de Nitratos a Nitritos

En la respiración anaeróbica, las bacterias utilizan al nitrato como aceptor final de H +, este fenómeno lo pueden realizar algunos gérmenes aerobios, anaerobios, y anaerobios facultativos.Se observa al final de la reacción la presencia de gas nitrógeno libre.

Nitrato de Potasio KNO3 Nitrato de Potasio2H + NO3 H2O + NO2

Materiales: Cultivo de E. coli, Pseudomona areuginosa Caldo nutritivo con nitrato 6cc. Sol. Dimetil - alfa - naftilamina Sol. de ácido sulfanílico Tubos de pruebas estériles (3)

Procedimiento:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

2cc caldo de 2cc caldo de 2cc de caldonitrato + E. coli nitrato + Pseudomona nitrato + Bacillus

Incubar por 24 hrs. a 37ºC. Agregar a cada tubo 3 gotas de ácido Sulfanilico y 2 gotas de alfanaftilamina Observa cambio de color, color rosado o rojo: Prueba positiva.

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(+) (-) (+)

VII. EXPERIMIENTO Nº 7:

Reducción de ácido Sulfhídrico

Cuando se realiza la fermentación de las proteínas se obtiene como producto el ácido Sulfhídrico, ya que las proteínas contienen aminoácidos sulfurados. Algunas bacterias tienen enzimas que desprenden al ácido de azufre de estos aminoácidos, el cual es reducido con hidrógeno del substrato para formar ácido sulfhídrico. Por lo tanto el azufre funciona como aceptor de H +.

H2S + FeSO4 FeS + H2SO4(negro)

Materiales: Cultivo de E. coli y Proteus vulgaris Tubos con TSI, con superficie inclinada (2)

Procedimiento: Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. coli y Proteus respectivamente, por

estría y puntura. Incubar a 37ºC por 24 hrs. Observar la formación de FeS color negro.

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Resultado: El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

Conclusión

El átomo de azufre liberada por los organismo atreves de la acción con los H+ para formar ácido sulfhídrico.

Para detectar la formación del gas ácido sulfhídrico se requiere la incorporación de aditivos al medio, tales como hierro ya que reacciona con el ac. Sulfhídrico formando sulfuro insoluble (color negro).

La presencia de Ácido Sulfhídrico se evidencia por el ennegrecimiento de los tubos de TSI.

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VIII. EXPERIMENTO N° 8:

Demostración de la producción de Indol

Algunas bacterias degradan el aminoácido triptófano formando INDOL.

Materiales: Cultivo de E. coli y Bucillus subtilis Caldo Triptona 2 tubos con 3cc cada uno) Solución de Kovacs Pipetas de 1cc

Procedimiento: Inocular un tubo de caldo Triptona con E. coli y otro con Bacillus, Incubar a 37ºC

por 24 horas. Agregar a cada tubo y en zona el reactivo de Kovacs. Si el Indol está presente, al

agregar el reactivo de Kovac aparecerá un color rojo cereza.

Resultados: El tubo con E. coli se evidencia la presencia de indol. (1) El tubo de Bacillus subtilis no hubo presencia de indol. (2)

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IX. EXPERIMENTO N° 9:

Detección de la Catalasa

La Catalasa es una enzima que está relacionada con la capacidad de una bacteria para utilizar el oxígeno. La falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la causa de que el O2 les sea perjudicial. Cuando hay Oxígeno estos organismos lo emplean como aceptor final de Hidrógeno para formar Agua Oxigenada, pero ésta no puede desdoblarse en H2O y O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria.

Catalasa2H2O2 2H2O + O2 (gas)

Agua Oxigenada

Materiales: Cultivo de E. coli y Stafilococo aureus. Tubos con Triptosa Caldo (2) Agua Oxigenada 3.0%

Procedimiento: Inocular en cada tubo una de las cepas Incubar a 37ºC por 24 hrs. Cubrir la superficie del caldo con Agua Oxigenada y observar la presencia de

burbujas en el tubo donde hay catalasa.Resultados:

Funcion de catalasa (Efervescencia)Estafilococo aureus +

Clostridium -

En la prueba de E. coli (gram -) con peróxido de hidrogeno, no observamos las burbujas de oxígeno. Esto nos indica que la E. coli es CATALASA NEGATIVA; es decir, no presenta la enzima catalasa. (1)

En el caso de la bacteria Estafilococo aureus (gram +) con el H2O2 se observará la formación de burbujas por presentar la enzima catalasa que actuó con H2O2 para liberar oxígeno. El Estafilococo es CATALASA POSITIVA (2)

(1) (2)

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X. EXPERIMENTO N° 10:

Reducción de Azul de Metileno

Se trata de demostrar la oxidación en los procesos fermentativos, realizada por los gérmenes anaeróbicos, llamada oxidación anaeróbica, donde el sustrato cede un H +, para lo cual se necesitan aceptores de H +, el azul de metileno actúa como aceptor.

Azul de Metileno + 2H Azul de etileno - 2 H(azul) (Incoloro)

Reducción del azul de Metileno.

Materiales: Cultivo de E. coli 7.5cc. Tubo de Prueba (3) Pipetas estériles Azul de Metileno de Loeffer Caldo nutritivo 7.5cc

Procedimiento: Rotular los tubos con 1,2,3.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo34cc cultivo 2.5 cultivo 1cc. cultivo1cc de caldo 2.5 caldo 4cc de caldo

Mezclar y agregar 1 gota de azul de Metileno a cada tubo. Incubar a 37ºC. Observar cada 10 minutos hasta los 20 minutos y anotar los

cambios de color.ResultadosResultadosEl azul de metileno es un aceptor de H, posee la propiedad de cambiar de color al pasar de oxidado (azul) a reducido (incoloro). La E. coli reduce el azul de metileno por eso es observa que se muestra incoloro. Por eso el tubo 1 se ve más incoloro.

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PRÁCTICA PRÁCTICA 44Determinación de los requerimientos mínimos para el crecimiento bacteriano. MediosDeterminación de los requerimientos mínimos para el crecimiento bacteriano. Medios

de cultivos selectivos y diferenciales.de cultivos selectivos y diferenciales.

I. EXPERIMENTO N° 1

Objetivo: Conocer los diferentes nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.

Materiales:

Ingredientes necesarios para la preparación de diferentes medios de cultivo.a) Unicamente Agar (lavado y purificado antes de disolverlo)b) Agar + Minerales (NH4 H2 PO4; Mg SO4; KCl)c) Agar + Minerales + Glucosad) Agar + Minerales + Glucosa + Fuente de Nitrógeno Orgánico (Peptona)

4 placas Petri estériles.conteniendo los medios de cultivo de a,b,c,y d. Cultivo Escherichia coli. (Sector1), Stafilococcus aureus (Sector2) y candida

Albicans (Sector 3).

Procedimiento:

Con un lápiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placa petri para dividirlo en cuatro sectores y enumera cada sector. Inocule los sectores correspondientes de cada placa con uno de los tres organismos.

Deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Vierta las placas, incúbelas a 38ºC por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores inoculados.

Resultado:

No hay crecimiento en las 3 primeras placas petri debido a que los requerimientos de las bacterias son importantes para su crecimiento y estas 3 placas no cumplen con ello. En la cuarta placa petri si hay presencia de crecimiento porque si cumple con los requerimiento nutricionales bacterianos permitiendo su desarrollo.

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II. EXPERIMIENTO N° 2:

Medios selectivos y diferenciales

Objetivo: Conocer los diferentes medios de cultivo, que permitan el aislamiento e identificación de bacterias.

Materiales:

Agar nutriente Porción de Agar-Cloruro de sodio Porción de rojo fenol-Agar Cultivo de Staphylococcus epidermidis y Alcaligenes (Pseudomona).

Procedimiento:

Con el lápiz de cera dividida cada placa en tres sectores: el primero etiquételo Alcaligenes faecalis el segundo S. Epidermidis y el tercero déjelo sin rotular.

Use el asa de Kolle para sembrar en estrías cada sector de la placa con el cultivo correspondiente. Invierta las placas Petri e incúbelas por 24 horas a 37°C.

Resultados:

En el AGAR NUTRIENTE la seudomona crece y libera tiocianina.En el AGAR CLORURO DE SODIO la gran concentración de sal limita el crecimiento bacteriano.En AGAR FENOL-AGAR toma un color rojizo.

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PRÁCTICA 5PRÁCTICA 5Citología de los microorganismos. Preparación del frotis y fijado. Tinción simple.Citología de los microorganismos. Preparación del frotis y fijado. Tinción simple. Tinción diferencial: coloración gram, ácido alcohol resistentes. Tinción negativa.Tinción diferencial: coloración gram, ácido alcohol resistentes. Tinción negativa.

Demostración de los gránulos metacromáticos.Demostración de los gránulos metacromáticos.

III. TINCIÓN DIFERENCIAL

Se denomina Coloración Diferencial cuando se emplean dos o más reactivos. La más empleada en la bacteriología es la coloración Gram y la coloración para bacilos ácido alcohol resistentes.

Coloración Gram

La tinción Gram se compone de cuatro reactivos diferentes: El Cristal Violeta que es el colorante básico inicial que tiñe todas las bacterias, el segundo reactivo es el lugol que actúa como mordiente (sustancia que aumenta la unión del colorante y el substrato). El tercer reactivo es el alcohol-acetona que actúa como decolorante. Mucho microorganismos retienen el cristal violeta permaneciendo teñidos y tomando el nombre de bacterias Gram positivas; otro grupo de mircroorganismos pierde el color fácilmente por acción del decolorante, al añadirse la safranina que es de color rojo, toman este segundo colorante, denominándose microorganismos Gram negativos.

Materiales: Solución Cristal Violeta de Genciana Solución de Lugol Alcohol Acetona Fucciana básica o Safranina Lámina portaobjeto, Asa de Kolle, Solución salina. Cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli.

Procedimiento: Frotis y fijado de la muestra Cubrir la muestra con solución de cristal violeta durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua de caño Cubrir la muestra con solución de lugol durante 1 minuto Lavar con agua de caño Decolorar con alcohol-acetona hasta que el alcohol-acetona no arrastre color. Lavar con agua de caño. Colorear con safranina por 30 segundos Lavar, secar y observar

Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersión (aceite). Las bacterias Gram positivas se tiñen de azul oscuro; las bacterias Gram negativas aparecen rojo rosadas.

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Resultados: Se realizo la prueba de acuerdo al procedimiento indicado. Luego se hizo una toma

de muestra del agar sangre y del agar simple y se los tiño con Gram: Estafilococo aureus y E. coli.

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Microscópicamente

E. coli

S. aureus

PRÁCTICA PRÁCTICA 66Evaluación de antibióticos por el método disco difusión.Evaluación de antibióticos por el método disco difusión.

I. EXPERIMENTO N°1:

Evaluación de antibióticos por el método disco difusión.

Materiales: Cultivo de S. aureus, E. coli. Disco de antibiograma para gram + y gram -. Placas petri con agar nutritivo TSA.

Mechero, asa de kolle, hisopo estéril.

Procedimiento: Sembrar con hisopo estéril en la superficie de las placas cada sp. Asépticamente colocar con pinzas los discos de antibiograma en cada placa. Incubar por 24 hrs. a 37°C y dibujar los resultados.

Resultados:Se pudo observar mediante el tamaño del halo:

E. coli resistente a ciprofloxacina, gentamicina. Parcialmente resistente a amikacina.

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S. aureus resistente a

oxacilina, ampicilina. Sensible a

nitrofurantoina.

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PRÁCTICA 7PRÁCTICA 7Destrucción e inhibición de microorganismos. Efecto de la concentración de iones H+,Destrucción e inhibición de microorganismos. Efecto de la concentración de iones H+,

PH. Efecto del calor. Acción oligodinámica de metales pesados.PH. Efecto del calor. Acción oligodinámica de metales pesados.

I. EXPERIMENTO Nº 1:

Efecto de la Concentración de iones H+El pH de una solución es el valor negativo del logaritmo en base 10 de su concentración de iones hidrógeno en mol x lt.

pH = - log H +

Según Bronsted y Lowry (1923), un ácido se caracteriza por su tendencia a perder H+, mientras que una base se caracteriza por su tendencia a asociarse con H+. Por lo tanto, los ácidos aportan con una concentración determinada de H+.Aplicando la fórmula encontraremos que a mayor concentración de H +, menor pH (mayor acidez).

El pH puede ejercer una acción bactericida según la concentración de hidrógenos y la especie de la bacteria sometida a dicho pH.

Materiales:Cepas de E.coli o Estafilococo en suspensiónReactivos: HCL 1.0N y NAOH 1.ONMedio de Cultivo: Caldo Peptonado.

Procedimiento:Es tres tubos con caldo de cultivo estériles, realizar la siembra de E. coli en asadas.A cada tubo agregarle gota HCL 1.0N, NAOH 1.0 N hasta que en los tubos se obtengan los siguientes pH: 2 y 9 respectivamente. El tercer tubo servirá de control.Volver a taponar los tubos e incubar a 37ºC por 24 hrs. Después de este tiempo, leer por turbidez.

Resultados:Tubo1: sin crecimiento de E. coli en medio ácido. Caldo peptonado trasparente.Tubo2: crecimiento de E. coli en medio alcalino. Caldo peptonado turbio.Tubo3: por fallas de procedimiento también se observo crecimiento de E. coli. Debió haber sido trasparente el caldo peptonado.

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II. EXPERIMENTO 2:

Efecto del calor

Materiales:

Cepas de E.coli o EstafilococoEquipo: Baño María y estufaMedios de cultivo: caldo peptonado

Procedimiento:

Empleando tres tubos de caldo peptonado, realizar la siembra de E.coli.Someter a dos de los tubos a la acción del calor por baño María, graduando en 40ºC y 100ºC por 10 minutos respectivamente. El tercer tubo no se somete a la acción del calor para que sirva de control.Retirar los tubos del baño María e incubar los tres tubos a 37ºC por 24 horas. Realizar la lectura por turbidez.

Resultados:

Tubo 1 (Experimental) 40ºCTubo 2 (Experimental)

100ºCTubo 3 (Control)

Turbidez

Si ++ No. Trasparencia Si +

La E. coli presenta temperatura optima de crecimiento 40ºC pero puede presentar crecimiento a temperatura ambiente porque su límite de temperatura va de 8-47ºC

A mayor turbidez, indica que hubo mayor proliferación bacteriana, es decir, que el medio acido es el adecuado para estas bacterias.

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III. EXPERIMENTO Nº 3:

Acción oligodinámica de los metales pesados.

Las sales solubles de mercurio, arsénico, plata, cobre y otros metales pesados, alteran la actividad enzimática formando mercáptidos con grupos sulfhidrilo de residuos de cisteína. La reacción inicial es reversible, y si se agregan grupos SH extraños en forma de glutation o tioglicolato de na, muchas de las células se recuperan. La capacidad de unión de los mercuriales se extiende en un amplio rango de ligandos a demás de los grupos que contienen SH, por ejemplo carboxilados, fosfatos y aminas.

Materiales:

Cepas de E. coli ó Estafilococo Reactivo: Mercurio Cromo. No3Ag al 1% Medios de cultivo: caldo peptonado Equipo: Estufa

Procedimiento:

Realizar la siembra de una cepa de E. coli en dos tubos de caldo y en dos placas con Agar nutritivo hacer la siembra en toda la superficie del agar.

A uno de los tubos, agregarle 5 a 10 gotas de mercurio cromo o nitrato de plata. El otro constituye el control.

Incubar a 37ºC por 24 horas. La lectura se hace por turbidez en la siembra en caldo y por halo de inhibición en agar.

Resultados:

Tubo Problema

Tubo Control

AgNO3 1% Si NoCrecimiento (Turbidez) No Si

Precipitación Si No

Tubo problema: no hay crecimiento bacteriano = acción oligodinamica de los metales.

Tubo control: si hay crecimiento bacteriano.

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PRÁCTICA 8PRÁCTICA 8Limpieza de la piel y antisepsia cutánea.Limpieza de la piel y antisepsia cutánea.

I. EXPERIMENTO Nº 1:

Materiales (Observación del crecimiento):

Placa petri (3) con agar nutritivo o TSA dividido en 2 sectores cada uno Isopos de algodón estéril (3) Solución antiséptica, alcohol yodado Un tubo con caldo nutritivo estéril

Procedimiento:

En el sector 1 toque con sus dedos varias zonas, lavase las manos con agua y jabón séquese y toque con sus el sector 2, lavase las manos por segunda vez y toque el sector 3 lavase las manos por tercera vez y toque el sector 4.

En otra zona de su piel aplique el desinfectante por 2 minutos sobre esta zona humedezca con caldo nutritivo y siembra esta con el hisopo estéril en la zona 5. Aplique el desinfectante por dos minutos más y repita lo anterior para sembrar en el sector 6.

Incube a 37°C por 24 hrs. observe y comente los resultados.

Resultados:

1º placa petri: en el 1º sector hay crecimiento bacteriano debido a que no hubo una buena asepsia, en el sector 2º gracias al lavado de manos hubo disminución del crecimiento bacteriano.

2º placa petri: sector 3º y 4º gracias al lavado de manos varias veces hubo un menor crecimiento bacteriano.

3º placa petri: no hubo crecimiento bacteriano porque se hizo una asepsia con desinfectante y alcohol yodado.

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CUESTIONARIO

¿Qué es SIEMBRA POR ESTRÍA?Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.Medio de cultivo: agar base inclinado.Instrumento: asa o aguja bacteriológica.

¿Qué es SIEMBRA POR AGOTAMIENTO?Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material.b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladasc- El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente.Medio de cultivo: solido en placa de Petri.Instrumento: Asa Kolle.Finalidad: Obtener colonias aisladas

¿Qué es AGAR NUTRITIVO? Es un medio para fines generales utilizado en el examen de agua y productos lácteos; también para el cultivo de la mayoría de microorganismos menos fastidiosos; de la misma manera para el transporte de cepas; para el cultivo preliminar de muestras sometidas a exámenes bacteriológicos y para aislar organismos en cultivos puros.ComposiciónExtracto de carne 3gPeptona 5gAgar 15gpH final 6.8

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¿Qué es AGAR SANGRE?Se prepara a partir de un medio base al cual se le añade sangre, lo que permite aislar y cultivar organismos fastidiosos y exigentes. El pH ligeramente ácido, del medio base favoreces reacciones hemolíticas precisas.ComposiciónInfusión de corazón vacuno 500g.Triptosa 10gpH 6.8Cloruro sódico 5gAgar 15g

¿Qué es AGAR ALMIDÓN? Es un medio para cultivos de organismos que se analizan para determinación de hidrólisis del almidón o para estudios comparativos.Composición Extracto de carne 3gAlmidón soluble 10gBacto Agar 12gpH final 7.5 +/- a.2 a 25ºC

¿Qué es AGAR GELATINA?Se utiliza para determinar la licuefacción de la gelatina por organismos proteolíticos, facilitando el recuento directo en la placa, para la determinación de poblaciones bacterianas y para el aislamiento de cultivos puros. Sin embargo su uso es limitado en procedimientos de siembra y aislamiento, ya que, la incubación tiene que realizarse a 20ºC (temperatura más baja que la optima para mucho microorganismos), además muchos organismos tienen la capacidad de licuar y atacar a la gelatina.Composición Extracto de carne 3gPeptona 5gGelatina 120gpH final 6.8 +/- 0.2 a 25ºC.

¿Qué es AGAR TSI?Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. 

FundamentoEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

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Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesExtracto de carne 3.0

Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar

con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta

profundo.

Pluripeptona 20.0Cloruro de sodio 5.0

Lactosa 10.0Sacarosa 10.0Glucosa 1.0

Sulfato de hierro y amonio 0.2Tiosulfato de sodio 0.2

Rojo de fenol 0.025Agar 13.0

pH final: 7.3 ± 0.2

¿Qué es CALDO TRIPTONA?Es un medio de cultivo microbiológico que presenta abundante triptófano, se utiliza para la reacción del indol (liberación de triptófano). Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante la enzima triptofanasa.

¿Qué significa CALDO MIXTO?Es decir tiene como finalidad ser un medio selectivo y un medio diferencial.

¿Qué significa CALDO TIOGLICOLATO?Se utiliza para pruebas de esterilidad para ciertos productos biológicos que estén turbios. Contienen tioglicolato para neutralizar el efecto bacteriostático de preservantes mercuriales.No contiene agar, lo que le hace adecuado para probar materiales viscosos y aparatos que tengan tubos con pequeñas aberturas.Composición Extracto de levadura 5gCasitona 10gL-cistina 12gTioglicolato sódico 0.5gCloruro sódico 2.5gDextrosa 5.5g

¿Qué es un MEDIO SELECTIVO?El medio de cultivo selectivo favorece el crecimiento de organismos pero también inhibe el crecimiento de otros. Este medio contiene compuestos químicos que favorece e inhibe el crecimiento de ciertos microorganismos, este medio también tiene ciertos tintes que provoca que ciertas bacterias fermentadoras de lactosa crezcan y se tiñe de dicho color característico del tinte.

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¿Qué es un MEDIO DIFERENCIAL?El medio de cultivo diferencial es el que facilita la detección de diferentes clases de bacterias a base de cambios visibles en el medio de cultivo o diferencias en la apariencia de las colonias, este medio también utiliza ciertos tipos de tintes que tiñen ciertos tipos de bacterias.

DIFERENCIAS ENTRE MEDIO SELECTIVO Y DIFERENCIAL.La diferencia de este medio con el medio selectivo es que el selectivo solo provoca que algunas bacterias en específico se tiñan mientras que el diferencial tiñe todas las bacterias para así poder diferencias una de otras.

¿Qué es el ANTIBIOGRAMA?Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los antibióticos. Por extensión, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y otros quimioterápicos.Utilidad: La razón por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibióticos de las distintas especies bacterianas y, más aún, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes diferencias de sensibilidad a un determinado antibiótico entre unas y otras cepas.El antibiograma es un método de diagnóstico rápido y precisoCon ayuda del antibiograma se puede escoger el antibiótico más adecuado para el tratamiento de una enfermedad.

Método de la difusión en medio sólidoSe siembra, con el germen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la superficie del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibiótico o quimioterápico a ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observará un halo, en el cual no hay proliferación de bacterias. Si el germen es resistente al antibiótico, crecerá uniformemente y no habrá ningún halo de inhibición en torno al disco de papel.

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Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS: Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un

tratamiento a la dosis habitual. Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de

esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto

terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posología).

TIPOS DE HEMÓLISISFundamentoMuchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen responden de diferente manera según      realicen o no la lisis de los glóbulos rojos (hemólisis) producida por la acción de una enzima llamada hemolisinaPodemos diferenciar tres tipos de hemólisis:

Hemólisis alfa: es una hemólisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso.  

Hemólisis beta: en este caso la hemólisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente.

  

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 Hemólisis gamma (no hemólisis): el microorganismo en cuestión no es capaz de realizar la hemólisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia. 

EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN TINCIÓN GRAM

Alcohol - acido en la coloración de Ziehl – Neelsen.

El alcohol-acido se usa para decolorar la muestra en una tinción de Ziehl Neelsen, la cual es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertos paracitos y bacterias contienen ácidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después de la tinción con colorantes básicos.

Soluc ión de Lugol y alcohol acetona en la coloración Gram.

S o l u ci ó n d e L u g o l : El Lugol se aplica como mordiente, el lugol está formado por yodo (I2) en equilibrio con yoduro de potasio (KI), el cual está presente para

solubilizar el yodo. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

Poe eso se le llama mordiente porque como es estable esta interacción (con el cristal violeta) quedan e n a m b o s t i p o s d e bacteria. De no ponerlo, este complemento no se formaría y el cristal violeta saldría del medio ante el lavado con agua. Tiñéndose todo Gram (-).

A l c oh o l a c e t o n a : Sirve para decolorar, ya que en la misma es soluble el complejo yodo/cristal violeta. Los organismos GRAM + no se decoloran mientras los GRAM - si lo hacen.

Entonces permite que el complemento cristal violeta – lugol salga de la célula al debilitar la pared de los GRAM (-).

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¿Por qué se empleó la tinción negativa o de contraste?

Porque tiñe el fondo de la preparación y no el microorganismo, aumentando de este modo su contraste, mostrando la imagen exacta de los microorganismos, nos permite apreciar el tamaño real de estos.Se usa también para la tinción de capsulas, la presencia de estos indica patogenecidad.

EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN LA TINCIÓN DIFERENCIAL

Alcohol-ácido en la coloración de Ziehl-Neelsen.

El uso de este alcohol sirve para intentar decolorar la muestra de bacterias fijadas con calor en la muestra, si este alcohol q es muy fuerte no llega a decolorar a las bacterias pero si a los espacios, y seguido a esto la aplicación del color contraste azul de metileno, se podría deducir la estructura de l a pared bacteriana compuesta por ácido micólico lo cual le confiere una propiedad hidrofóbica y cerosa por eso su resistencia a este acido alcohol.

Solución de Lugol y Alcohol-Acetona en la coloración Gram.

El lugol actúa como un fijador entre el primer colorante básico aplicado y la muestra de bacterias, mientras que el alcohol acetona funciona como el decolorante, casi similar al acido alcohol, pero con menor potencia.

RESULTADO ESQUEMATIZADO

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