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PURFICIACIN DE UNA LECTINA
A .-PREPARACION DE LA MUESTRA
Habas peladas (250g)
Remojar una noche,4 C en litro de agua destilada
Licuar en 500mL de NaCl (5-10min)
Guardar la mezcla a 4 C (agitando de vez en cuando con una
bagueta)
Filtrar con gasa doble
Centrifugar el filtrado 1 hora a 4000rpm
Descartar el precipitado y el sobrenadante conservar a 4 C
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PRECIPITACION DE PROTEINAS
Agregar al sobrenadante NH4SO4al 100% con agitador magntico
agregando poco a poco
la sal
La mezcla centrifugarla a 900rpm durante h.
Descartar el sobrenadante y disolver el precipitado en un
volumen de 5ml de buffer fosfato,
agregndolo de manera que los tubos queden limpios (
aproximadamente 30ml volumen
total).
DILISIS
Dializar frente a buffer fosfato 5mM pH 7,6 durante 48 h. a 4 C,
realizando cambios del
buffer cada 2 h.
Centrifugar y guardar el sobrenadante lmpido a 4 C
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B .-CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR EN SEPHADEX G-75
Empacar la columna con sephadex G-75 y equilibrarla con buffer
fosfato 5mM pH
7,6
Pasar por la columna el sobrenadante lmpido obtenido.
Realizar la colecta.
C.-MEDIDA DE LA ACTIVIDAD HEMAGLUTINANTE Y PROTEINA
Probar en las fracciones obtenidas la presencia de lectinas;
descartando aquellas que no
muestran actividad hemaglutinante. Se obtiene una lectina de
bajo peso molecular.
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FUNDAMENTACIN TERICA
El trmino lectina fue introducido por Boyd y otros en 1954 (Boyd
y Slapeigh, 1954).
Su interpretacin no ha sido uniforme debido al desconocimiento
de las funciones
fisiolgicas de stas. Existen diferentes proposiciones para
definirlas, pero la ms aceptada
es la siguiente: las lectinas son protenas o glicoprotenas de
origen no inmune, fijadoras de
carbohidratos con capacidad para aglutinar clulas y precipitar
glicoconjugados (Goldstein,
1980).
Las lectinas estn presentes en casi todo lo vivo, es as que
tenemos lectinas en
microorganismos (Lu-Lu et al., 1992), animales (Gabius, 1994) y
plantas (Peumans etal.,1995) En las plantas se han detectado,
principalmente en los cotiledones y endospermos de
las semillas y constituyen del 2 % al 10 % del total de las
protenas de stas. En el reino
animal se han encontrado en invertebrados, tales como cangrejos,
camarones, caracoles,
lombrices y moluscos. Estn presentes fundamentalmente en la
hemolinfa y rganos
sexuales (Hartmut, 1988; Sharon y Lis, 1980).
La gran importancia de las lectinas se debe fundamentalmente a
sus propiedades
biolgicas, tales como aglutinacin de eritrocitos y otras clulas
como linfocitos,
espermatozoides, plaquetas y bacterias, induccin de mitosis en
linfocitos, efectos
citotxicos sobre linfocitos, aglutinacin de virus y otras (
Sharon y Lis, 1972; Boyd y
Slapeigh, 1954).
Las lectinas se consideran armas valiosas en el campo de la
Gentica, la Biomedicina
y la Inmunologa. Su utilidad est basada en la propiedad que
tienen de combinarse con
varios tipos de glicoconjugados presentes en las superficies
celulares y fluidos corporales.
PROCEDIMIENTO
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1.1.Material biolgico
Se emplearn semillas de Vicia fabaL.
Eritrocitos humanos lavados de los grupos sanguneos del sistema
ABO, del
factor Rhesus positivo (Rh+
) y del factor Rhesus negativo (Rh-
).
1.2.
Reactivos
NaCl (NaCl 0.9%)
Sulfato de amonio
Buffer fosfato 5 mM de pH 7,6.
Sephadex G-75
Buffer fosfato 5mM de pH 6,5
Cloruro de sodio 1,5 M.
NaOH 1M
Reactivo de Biuret
Agua destilada
1.3.Preparacin del extracto crudo
250 g de semillas enteras de Vicia fabaL. son colocadas en un
erlenmeyer de 1000
ml con tapn de goma, para lavarlas varias veces con agua
destilada. A continuacin, las
semillas lavadas se dejan remojando en 500 ml de agua destilada
hasta el da siguiente a 4
C.
Una vez que se descart el agua en la que las semillas estuvieron
toda la noche, estas
se colocan en un vaso de licuadora, aadindoles 500 ml (proporcin
1:2 v/v) de solucin
fisiolgica de NaCl (NaCl 0.9%); procediendo luego a
homogenizarlas durante 5 a 10
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minutos. La mezcla resultante se guarda en un recipiente
adecuado hasta el da siguiente a
4C tratando de removerla de vez en cuando haciendo uso de una
bagueta.
Posteriormente, la suspensin obtenida es filtrada a travs de
doble capa de gasa, a fin
de retirar las partculas grandes as como el material insoluble.
A continuacin el filtrado es
centrifugado durante una hora a 4000 rpm. El precipitado
obtenido es descartado, mientras
que el sobrenadante se conserva a 4 C para proseguir con la
purificacin.
1.4.Precipitacin con sulfato de amonio
Al sobrenadante de la etapa anterior, se le agrega, con agitacin
constante, suficiente
sulfato de amonio slido para alcanzar una saturacin del 100%. La
mezcla se centrifuga a
4000 r.p.m. durante una hora. Se descarta el sobrenadante y el
precipitado es disuelto en un
volumen mnimo (5 ml) de buffer fosfato 5 mM de pH 7,6. A
continuacin se dializa frente
a buffer fosfato 5 mM de pH 7,6 por espacio de 48 horas a 4C
(realizando cambios del
tampn cada 2 horas). Luego se centrifuga y se guarda el
sobrenadante claro a 4 C.
1.5.
Cromatografa de gel filtracin en Sephadex G-75
El sobrenadante claro de la etapa anterior es colocado en una
columna cromatogrfica
empacada con Sephadex G-75 (Tanzima et al., 2001), previamente
equilibrada con buffer
fosfato 5 mM de pH 7,6. Se colectan fracciones de 2 ml y en cada
una de ellas se mideactividad hemaglutinante y protena. Las
fracciones que no muestren actividad
hemaglutinante se descartan, mientras que aquellas que si la
muestran son guardadas.
1.6.
Determinacin de protena (mtodo de Biuret)
1.6.1. Determinacin de la curva estndar de protenas
Para la determinacin de la curva estndar de protenas, se emplea
albmina de suero
de bovino (BSA) en concentraciones de 2 mg a 10 mg.
Seguidamente, se aade NaOH 1M
hasta completar un volumen de 1 ml, luego se agrega 4 ml de
reactivo de Biuret para
obtener un volumen final de 5 ml. A continuacin se incuba a 37 C
por 30 minutos y se
procede a leer en un fotocolormetro Klett Summerson a 540 nm
(filtro verde).
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El factor de calibracin se calcula empleando la siguiente
ecuacin:
1.6.2. Determinacin de protena de la muestra problema
A 0,1 ml de muestra problema se le aade 0,9 ml de NaOH 1M y se
completa con 4
ml del reactivo de Biuret para obtener un volumen final de 5 ml.
Se incuba a 37C durante
30 minutos, al cabo de este tiempo se determina la cantidad de
protena (mg/ml)
multiplicando la absorbancia de la muestra problema por el
factor de calibracin.
1.7.
Medida de la actividad hemaglutinante
La actividad hemaglutinante de la lectina, es ensayada sobre
eritrocitos humanos
lavados de los grupos sanguneos del sistema ABO, del factor
Rhesus positivo (Rh+) y del
factor Rhesus negativo (Rh-).
1.7.1. Lavado de eritrocitos
En un tubo de ensayo se coloca 1 ml de sangre total, luego se
aade 4 ml de suero
fisiolgico (NaCl 0.9%) a temperatura ambiente. La mezcla se
centrifuga a 1700 r.p.m.
durante 3 minutos. Se elimina el sobrenadante y al sedimento de
le aade otros 4 ml de
suero fisiolgico, procediendo como en el caso anterior. Este
proceso se repite cuatro veces.
)(
][..
EstndarAb
EstndarCF
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Despus del cuarto lavado, se elimina el sobrenadante por
decantacin y con el
precipitado (pelet de eritrocitos) se prepara una dilucin 1:20
con suero fisiolgico y se deja
en refrigeracin a 4 C hasta el momento de usar.
1.7.2. Prueba de aglutinacin
En una placa de porcelana de 12 pozos, se colocan 50 l de CTBS
(Tris-HCl 20 mM;
NaCl 150 mM, pH 7,5 y CaCl25 mM) e inmediatamente despus se
agregan 50 l de la
solucin de lectina de Vicia fabaL. en el primer pozo. A
continuacin, la lectina es diluida
seriadamente, con agitacin y transferencia de 50 l para el pozo
siguiente hasta el
penltimo pozo. En el ltimo pozo, el cual no contiene lectina, se
agregan 100 l de
suspensin de eritrocitos lavados; por lo que es considerado como
control negativo.
Terminadas las diluciones, a cada pozo se le adicionan 50 l de
la suspensin de
eritrocitos lavados. Las lecturas son realizadas despus de 1
hora de incubacin de la placa
a temperatura ambiente. Para la evaluacin se toma en cuenta la
mnima concentracin de
lectina que permita la visualizacin de los eritrocitos
aglutinados.
