Pomen proteinov (in encimov) v medicinski diagnostiki in prizdravljenju

www.medindia.net/Patients/patientinfo/tumor

Tumorski markerji so različni proteini

Encimi v medicinski praksi

Encimi kot diagnostični indikatorji (markerji)- zmanjšana aktivnost holinesteraz pri zastrupitvi z organofosfati (pesticidi, bojni strupi...)

- ala-transaminaza (ALT) in asp-transaminaza (AST)– razpad jeter (ciroza, rak...)

- alkalna fosfataza v krvi – kostne in jetrne bolezni

- kisla fosfataza v krvi – rak prostate

- specifični srčni encimi (LDH, CPK, AST) – infarkt

- lipaza in amilaza – pankreatitis

- Etc., etc…………..

Encimi kot zdravila- streptokinaza, aktivator plazminogena razgradnja strdkov v krvi

- asparaginaza razgrajuje Asp, ki ga nujno rabi ‘levkemično tkivo’ za rast

- Dodajanje encimov zaradi pomanjkanja (genske napake, itd.)

Encimi kot tarča zdravil

mitochondrijska AST 1 h LDH-5 (M4) 12 hCK 18 h citoplazemska AST 1 dniALT 2 dniLDH-1 (H4) 5 dni

Razpolovne dobe izoencimov

Časovni potek encimske aktivnosti po infarktu

Določanje kreatinske kinaze (CK), ala- in asp-transaminaz (ALT, AST) in laktatne dehidrogenaze (LH) v serumu po infarktu

tehnična kontrola

normalni vzorec

infarkt

Obolenje jeter

infarkt

2 dni po infarktu1 dan po infarktu

Zastoj srca, poškodba

CK

vzorec

Določanja serumskih CK in LDH z elektroforezo

pro2services.com/.

•Tkivni plazminogenski aktivator tPA (serinska proteinaza) •Streptokinaza (SK), and• Urokinaza (UK).

•Streptokinaza je hemolitični encim bakterije iz rodu Streptococcus • Je aktivator plazminogena in sodeluje v razgradnji strdkov v krvi•--------------------------------------------------•Medicinska uporaba - razgradnja krvnih strdkov, npr. pri akutnem miokardnem infarktu

•Stranski učinki – notranje krvavitve zaradi proteolize.

razgradni produkti

Encimi kot zdravila: trombolitična (fibrinolitična) sredstva

Terapija raka z encimsko aktiviranim pro-zdravilom

Terapija kroničnih vnetij – inhibicija proteolitičnih encimov z anti-proteinazami

Primeri proteinov, ki se uporabljajo v zdravljenju

Lehninger, 2008

19. StoletjeG. Mendel odkrije vzorce dedovanja

20. StoletjeJ. Watson in F. Crick leta 1953 razkrijeta strukturo DNA

21. StoletjeEra funkcijske genomike, celostnihraziskav genoma in njegovih funkcij

21. Stoletje - od gena preko proteina do označevalcev bolezni in zdravil

Pristopi funkcijske genomike za odkrivanje bolezenskih markerjevin tarč za zdravila

transkriptom proteom metabolom

-Ekspresijske mikromreže-RT-PCR-siRNA

- 2D proteinske mape /MS-LC/MS(n)

- metabolično profiliranje-Metabolični pretoki (fluks)

Genomika, proteomika in druge “omike” so v medicinskih in farmacevtskihraziskavah močno pospešile razvoj novih zdravil (z manj stranskimi učinki) in odkrivanje novih bolezenskih markerjev.

-Obravnava sestavo genomov in njihovih genov

-Dele DNA genomov lahko organiziramo v knjižnice (genomske ali cDNA)

- Z reakcijo verižnega pomnoževanja PCR lahko pomnožimo katerikoli del genoma (potebujemo začetne oligonukleotide)

-Mednarodno povezovanje je omogočilo določitev zaporedja človeškegagenoma in drugih genomov. Informacije so zdaj dostopne v javnihpodatkovnih zbirkah

Genomika

Science, 2001

Polymerase Chain Reaction

Lehninger, str. 315

Reakcija verižnega pomnoževanja PCR – revolucija v raziskavahgenoma (faza 1)

www.salisbury.edu/biology

Odkritje PCR je bilo ključno za pospešene raziskave genomov

Časovna skala določitve nukleotidnega zaporedja (sekvenciranja) genomov

Le dober procent človeškega genoma se prevede do proteinov……

Lehinger, 2008

Kaj pravzaprav pomeni sekvenciranje genoma, če pa ima vsak človek drugačen genom?

Med ljudmi je cca 1% razlike v nukleotidnem zaporedju (polimorfizmi)

• Razlike v eni sami bazi (SNPs),

• Mikrosateliti Microsatellites (short sequence repeats),

• Minisateliti (long sequence repeats),

• Delecije

• Duplikacije

Funkcijska genomika pri odkrivanju bolezenskih markerjev

education.scientity.com/Bioinformaticswww.well.ox.ac.uk/

Tehnologija DNA čipov in nova (naslednja, druga) generacija sekvenciranja

• Analiza genomske DNA (genotpizacija enojnih nukleotidnih polimorfizmov SNP, analiza variance števila kopij CNV oz. CGH, resekvenciranje).

• Analiza izražanja genov (ekspresijsko profiliranje: 3' ekspresijski, eksonski ali genski čipi, čipi za sledenje izražanja miRNA).

• Študije uravnavanja izražanja genov (kromatinska imunoprecipitacija na čipu ChIP-on-Chip, mapiranje prepisov).

.

Uporaba DNA mikromrežBazične (osnovne) raziskave– globalni pogled na izbrani biološki proces

Farmacevtska industrija - globalni pristop k testiranju potencialnih zdravilnih učinkovin- kreiranja tematskih DNA mikormrež za diagnosticiranje kompleksnih obolenj

Klinika – genotipizacija, odkrivanje normalnih in okvarjenih alelo- določanje enojnih nukleotidnih polimorfizmov (SNP) razvoj “osebne medicine- odkrivanje genov, vključenih v bolezenski fenotip večfaktorskih obolenj

http://www.ieee.org/portal/

47 000 transkriptov39 000 genov

Ekspresijsko profiliranje z mikromrežami

http://www.genomictree.com/images/bioimg09.jpg

Iskanje novih bolezenskih označevalcev - ekspresijsko profiliranjein pregled genoma z mikromrežami

DNA čipi so zbirka mikroskopskih “DNA točk”, cDNA ali oligonukleotidov, pritrjenihna trdo podlago. Omogočajo nam celostni vpogled v genom in transkriptom.

Uporabljajo se za:• Analizo genomske DNA (genotipizacija, SNP analiza, CHG, sekvenciranje).

• Analizo izražanja genov (ekspresijsko profiliranje) , kjer probe lahkopredstavljajo 3'–konce genov, eksone ali različne dele genov. Posebni čipi pa so za sledenje izražanja miRNA.

• Študije uravnavanja izražanja genov (določanje vezavnih mesttranskripcijskih faktorjev, metilacija kromatina), kjer probe predstavljajo 5’-neprevedene dele in nerepetitivne dele genov.

• Bistveno pripomogli k odkrivanju novih bolezenskih označevalcev, posebno pri različih vrstah raka.

DNA čipi - povzetek

Nova (naslednja, druga) generacija sekvenciranja

www.gatc.co.uk/cgi-bin/wPrintpreview.cgi?sour...

Nova generacija sekvenciranja- Sekvenciranje človeškega genoma je trajalo več let, z uporabo cca 20 kb BAC klonov, ki so vsebovali cca 100 kb dolge tarčne fragmente, in 8-kratnega pokrivanja vsakegadela tarče. Analiza s kapilarno elektroforezo.

-Nadaljnji razvoj sekvenciranja je temeljil na sočasnem sekvenciranju celotnegagenoma, ki je bil vstavljen v vektorje. Metoda je hitrejša, pušča pa velike praznine v zelopolimorfnih ali repetitivnih genomih. Analiza s kapilarno elektroforezo.

-Naslednja generacija sekvenciranja (2004) – visokozmogljivostno paralelno čitanjeodsekov DNA na ravni celega genoma preko PCR pomnoževanja enoverižnihfragmentov genomske knjižnice.

Za čitanje zaporedja celotnega genoma posameznika danespotrebujemo le nekaj dni

Naslednja generacije sekvenciranja – povzetek

• Nova generacija visokozmogljivostnega sekvenciranje omogoča razpoznavanjezaporedij DNA na ravni celega genoma, z resolucijo posameznega baznega para.

• Iz vsakega vzorca se pripravi knjižnica, ki vsebuje vse v vzorcu prisotne fragmenteDNA ali RNA (cDNA).

• Vse platforme bazirajo na PCR pomnoževanju, imajo pa različne pristopesekvenciranja:

•Razvijajo se tudi metode, ki pred sekvenciranjem ne potrebujejo pomnoževanja (tretjageneracija)

• Uporaba je podobna, kot pri klasičnih mikromrežah, prednost je v preprosti pripravivzorca in zmožnosti procesiranja velikega števila vzorcev v kratkem času.

•Procesiranje velikega števila vzorcev na eni/več aparaturah lahko upravlja 1 človek.

•Analiza celotnega genoma traja nekaj dni.

•Cena analize posameznikovega genoma naj bi v nekaj letih padla pod 500 eur –nov pristop k osebni medicini

V Sloveniji (2010) tovrstne aparature še nimamo……

-Proteom je zbirka proteinov, ki jih proizvede celica na podlagi zapisa v genomu.

-Proteomika obravnava strukturo, funkcijo in izražanje teh proteinov v celici.

-Integrirane raziskave, kjer poleg genoma, transkriptoma, proteoma preiskujemo še druge“ome” in skušamo celostno razumeti dogajanje v celici, opišemo z izrazom sistemska biologija

- Celični proteom lahko preiskujemo z 2D gelsko elektroforezo ali različnimivečdimenzionalnimi tekočinskimi kormatografijami, v povezavi z masno spektrometrijo.

- Poleg DNA čipov poznamo tudi proteinske čipe, s katerimi preiskujemo izražanje celičnegaproteoma.

Proteomika

http://bioinformatics.ubc.ca/about/what_is_bioinformatics/images/computer.gif

www.gwumc.edu

Pomen bionformatika pri iskanju bolezenskih markerjev(in tarč za zdravila)

Izzivi povezovanja podatkov

Primer projekta sistemske biologije za odkrivanje bolezenskih markerjevnealkoholne bolezni jeter

Bioinformatics

Making sense of the huge amounts of DNA data produced by gene sequencing projects.

Bioinformatics and computational biology involve the use of techniques from applied mathematics, informatics, statistics, and computer science to solve biologicalproblems.

Research in computational biology often overlaps with systems biology.

Major research efforts in the field include sequence alignment, gene finding, genome assembly, protein structure alignment, protein structure prediction, prediction of gene expression and protein-protein interactions, and the modeling.

The terms bioinformatics and computational biology are often used interchangeably, although the former typically focuses on algorithm development and specific computational methods, while the latter focuses more on hypothesis testing and discovery in the biological domain.

Wikipedia

Spojina Fiziološki efekt Molekularna tarča

Molekularna tarča Spojina Fiziološki efekt

Funkcijska genomika pri razvoju zdravil

- Farmakologija – veda, ki se ukvarja z odkrivanjem, kemijo, sestavo, razpoznavanjem, biološkimi in fiziološkimi efekti, uporabo in proizvodnjo zdravil

- Kandidati za zdravila morajo učinkovito moduliratisvoje tarče (proteine, encime)

- Morajo imeti primerne lastnosti, da dosežejo tarče

Rognan D. J Pharmacol. 2007, 152:38-52. Epub 2007 May 29. Review.

Molekularna tarča – protein (encim), z znano 1D - 3D strukturo

Prostor proteinske tarče in liganda – molekulrani prstni odtisi (fingerprint)

Primerjamo serijo kompleksov med n ligandi in enim proteinov ali med enimligandom in n sorodnimi proteini

Rognan D. J Pharmacol. 2007, 152:38-52. Epub 2007 May 29. Review.

Analize SAR – povezava med strukturo molekule in njeno aktivnostjo

Analitske metoda za določevanjeaktivnosti

Pomembne proteinske družine, kiso tarča zdravil: - Z G-proteini povezani receptorji- Jedrni receptorji- Kinaze- Proteinaze- Fosfodiesteraze

Iskanje struktrnih značilnosti aktivnihspojin s SAR

Knjižnice (zbirke) kemijskih spojinz znanimi biološkimi profili (aktivnostjo)

In silico ribarjenje pri iskanju ligandov in proteinskih tarč

Uporaba algoritmov strojnega učenja, Bayesove statistike, itd. za iskanje prstnih odtisov molekul vbiološko dobro anotiranih podatkovnih zbirkah.

Zbirka človeških proteinov, ki vežejo spojine vodnice, imenujeno “genom, ki galahko zdravimo” (druggable genome).

“Genom, ki ga lahko zdravimo”

- Ključ za izboljšanje odkrivanja zdravil je v organizaciji verige funkcijskih raziskav

- Informacije se morajo pretakati iz osnovnih raziskav analize genoma, proteinov, metabolitov, kemijskih spojin, itd., do stopnje kliničnih raziskav in sprostitve zdravila na trg.

- Združevanje tako različnih področjih naravoslovnih in matematično-informatičnih znanostipredstavlja še vedno velik izziv.

- Potrebni so mostovi, ki pomagajo raziskovalcem enega področja pri komunikaciji z drugimiraziskovalci interdisciplinarnih skupin.

Obstoječi izzivi hitrejšega razvoja zdravil

www.ncrisproteins.org/

Optimizem pri razvoju novih zdravil

-Znano je zaporedje človeškega genoma-Genomske in proteomske tehnologije se hitro razvijajo-Pristopi sistemske biologije so vse bolj napredni-Razvijajo se napredne tehnike medicinske vizualizacije-Napredek je v nanotehnologiji in tkivnem inženirstvu-Napredek v kombinatorni kemiji in rešetanju spojin na mikro skali- Itd.