1 Prefazione Lobiettivodiquestatesistatolostudiodelpolimorfismo,mediante tecniche NMR allo stato solido, di una serie di molecole di interesse farmaceutico. Ilpolimorfismolacapacitdiunamolecoladi organizzarsiinformecristalline diverse e la sua importanza, da un punto di vista applicativo, risiede nel fatto che infunzionedelpolimorfoconsideratopossonovariareproprietqualisolubilit, biodisponibilit,igroscopicit,duttilit,conducibilittermica,etcInambito farmaceuticotalefenomenodiestremaimportanzaperch,asecondadella formaconsideratapuvariarelabiodisponibilitediconseguenzalepropriet terapeutiche del farmaco. Molte volte, sia in ambito farmaceutico che industriale, unpolimorfopuesserescartatoacausadiproprietnoncompletamente conformiaiparametridiriferimento,equestosirifletteinterminieconomicisui processiproduttiviindustriali.Diconseguenzalostudio,lasintesiela caratterizzazionedeipolimorfihaattiratonotevoleinteressescientificononch grossi interessi economici. Daquinascelesigenzadiaveretecnicheingradodidistinguereivari polimorfi e soprattutto caratterizzarli. Una delle tecniche di gran lunga pi diffusa la diffrazione ai raggi X di cristallo singolo, che in grado di definire in modo esatto la struttura del composto ma necessita di un campione altamente cristallino che non sempre possibile ottenere. Unalternativa a questultima la diffrazione araggiXdipolveriche,seppurmenoinformativa,spessosufficienteper distinguerelevarieforme.Aquestesiaffiancanometodicalorimetriciqualila calorimetriaascansionedifferenziale(DSC)elanalisitermogravimetrica (TGA),moltointeressantiperquantoriguardalastabilittermicadeipolimorfi, oltre al Raman e lIR nel campo delle spettroscopie ottiche. Unatecnicachestaassumendosemprepiimportanzanegliultimianni lNMRallostatosolido,grazieallamessaapuntodisequenzeinnovativeper mezzodellequalisiingradodiottenererisultatiestremamenteinteressantie utili al fine dievidenziare differenze anche minime tra i diversi polimorfi.Questa tecnicapudareinformazioniquantitativesullacristallinitdiunprodotto, sullesistenza di polimorfi e di conseguenza sulla presenzadi siti non equivalenti. Daquestatecnicasipossono,inoltre,ricavareinformazioniestremamente 2 dettagliatesuilegamiidrogenoediconseguenzadistinguereidiversisiti molecolariinbasealleinterazioniincuisonocoinvolti,analisidifficilida evidenziareconaltretecniche.Questeinformazionisipossonoricavaredal chemicalshiftdeipicchiisotropichestrettamentelegatoallintornochimico, dallanalisidellanisotropiadelchemicalshift(CSA)grazieasequenze bidimensionali2DPASS,daitempidirilassamentooltrechedaesperimenti2D FSLG-HETCORingradodivalutareeterocorrelazionitraatomidiidrogenoe carboniopiomenodistanti.Inoltrequestatecnicamultinucleare,ovverosi possonoosservarepinucleiquali 1H, 13C, 15N, 31P, 29Si, 19F;diconseguenzail numero di molecole potenzialmente analizzabili mediante lNMR allo stato solido decisamente grande. Ecco quindi che oltre a distinguere i diversi polimorfi si ingradodistabilireinchemodolevarieformedifferisconoequaliatomisono pi o meno coinvolti in interazioni intermolecolari. Nelcorsodiquestatesisonostatepreseinconsiderazionetremolecoledi interesse farmaceutico: il Piracetam, un agente nootropico, la Didanosina, farmaco usatointerapieantiretroviralicheprevienelareplicazionedelvirusdellHIVe lAcidobarbiturico.Inoltresisonoanalizzatelepossibiliconversionimeccano-chimichetraidiversipolimorfi.Questostatofattopervederese,sottoponendo le diverse forme a forze meccaniche (come la macinazione) simulando in qualche modocichepuavvenireduranteilcicloproduttivodiunasostanza,si verificano passaggi da una forma ad unaltra. Infatti la stabilit di una forma di un determinatofarmacoduranteilprocessodiproduzionedinotevoleimportanza, per questo fondamentale monitorare tutto il ciclo produttivo di un prodotto fino allo stoccaggio e alla sua introduzione in commercio. Si inoltre osservato che la macinazioneingrado,inalcunicasi,diandareoltreallasempliceconversione tra polimorfi, infatti in condizioni particolari pu attivare equilibri tautomerici. 3 La tesi verr suddivisa in cinque capitoli principali: Nelprimocapitolositratterilpolimorfismoelimportanzaditale fenomenoneivaricampidellascienzaedellindustria,soprattutto farmaceutica.Inoltresianalizzerannoletecnicheperlaricercaeil monitoraggiodeipolimorfi,lastabilitdiquestultimiepossibilitdi interconversionetralevarieforme.Infineverrapprofonditoillegame idrogeno, che svolge un ruolo di primaria importanza in questo fenomeno. NelsecondocapitoloverrpresentatalaspettroscopiaNMRallostato solido,dallebasiteorichealletecnichesviluppateperottenerespettriin altarisoluzione,oltrealleinnovativetecnichebidimensionaliprimacitate perlanalisidellanisotropiadelchemicalshift(CSA)epervalutarele etrocorrelazioni. Nel terzo capitolo verranno riportati i risultati sperimentali e le discussioni relative allo studio del polimorfismo, al network di legami idrogeno e alle conversioni meccano-chimiche della molecola di Piracetam. Nelquartocapitoloverrannopresentatiirisultatisperimentaliele discussionirelativeallostudiodelpolimorfismodellamolecoladi Didanosina. Infinenelquintocapitoloverrannoillustratiirisultatisperimentaliele discussionirelativeallostudiodelpolimorfismo,alnetworkdilegami idrogenoeagliequilibritautomericidellamolecoladellAcido Barbiturico edei suoi derivati. 4 1.1Introduzione Una sostanza allo stato solido pu presentarsi sotto diverse forme: cristallina, amorfa e sotto forma di solvati o co-cristalli. Nel caso si trovi allo stato cristallino, possibile che la medesima molecola si organizzi in modi diversi, dando luogo a polimorfi,ciofasicostituitedallastessastrutturamolecolaremaconun differenteimpaccamentocristallino.Lostessopuavvenirenelcasodisolvatie co-cristalli, mentre alla stato amorfo la struttura priva di periodicit (Fig. 1). Nel 1965McCronedefiniscepolimorfounafasecristallinasolidadiundato composto,cherisultadallapossibileesistenzadialmenoduediversi arrangiamenti delle molecole di quel composto allo stato solido[1]. Fig. 1: Differenti modi in cui pu organizzarsi una medesima molecola Leprimeevidenzedellesistenzadelpolimorfismorisalgonoacirca200annifa, precisamente al 1788, ad opera del chimico tedesco Klaproth che prese in esame il polimorfismo del carbonato di calcio (calcite, laterite e aragonite) [2], anche se il riconoscimento vero e proprio dellesistenza di tale fenomeno appartiene al secolo scorsograzieallavorosvoltodaMitscherlich[3],ancheluichimicotedesco.Le cause del differente arrangiamento di una molecola allo stato solido, dipendono da pifattori,qualilastabilizzazione didiverseformedirisonanza,lapossibilitdi 5 multipleinterazionitramolecoledellostessotipoelaliberarotazioneattornoa legami semplici. Nonostanteilpolimorfismosiaconosciutoormaidamoltotempo,adoggi nonancorastatocompletamentecompreso.Questofenomenomoltodiffuso; infatti,unterzodellesostanzeorganiche,nellecondizioninormalidipressionee temperatura,presentapolimorfismo,mentreunaltroterzopudareoriginea solvatiedidrati.Intabella1,sonoriportatialcuniesempidicomposti, prevalentemente di interesse farmaceutico, con i loro relativi polimorfi, ma questo fenomenocoinvolgeunlargonumerodisostanzechehannounospiccato interesse in vari campi della scienza. FARMACON. PolimorfiAltre Forme (solvati, etc.) Ampicillina11 Barbital6 Codeina3 Cortisone21 Cortisone AcO8 Fluocortolone219 Nicotinamide7 Testosterone3 Tolbutamide3 Tab. 1: Composti farmaceutici con i loro rispettivi polimorfi Almomentoesistonodiverseconvenzioniperidentificareivaripolimorfichesi basano sulluso di lettere greche minuscole (, , , ecc), lettere latine maiuscole (A,B,C,ecc),numeriromani(I,II,III,ecc),piuttostochenomichene descrivano le propriet (colore, temperatura di transizione tra una fase e unaltra, forma, ecc..). Solitamente lordine con cui sono denominati, crescente nel caso dei numeri o progressivo nel caso delle lettere, relativo ad un ordine decrescente di stabilit. 1.2Tipi di polimorfi E possibile classificare il fenomeno del polimorfismo in diverse sottoclassi, lequalisidistinguonoinfunzionedelmotivochestaallabasedelladiversa 6 organizzazione strutturale della molecola. Un composto che presenta pi strutture dovuteadifferenzeconformazionalivieneidentificatoconilnomedi polimorfismoconformazionale[4].Risultaovvio,infatti,cheognicambiamento diimpaccamentocausauncambiamentogeometriconellemolecoleeviceversa [5], ed il grado di cambiamento cristallino dipender dalla rigidit della molecola. Nelcasodeisistemiadanello,questiconservanosemprelapropriaformanelle differentistrutture[6],mapossonomostraresostanzialidifferenze conformazionalineivaripolimorfi,anchenelcasodisistemirigidicomegli steroidi [7]. Ilpolimorfismoconformazionaleinoltrepresenteneicasiincuicuna rapidainterconversionetraisomeri[8].Racemiesistemiconglomeratiinrapida conversionechiralesonodifattopolimorfi[9].Questisistemipresentanoun semplicecambiamentoconformazionalechelirendelunolimmaginespeculare dellaltro. Bench sia difficile da accettare, le forme destrogira e levogira di simili sistemisonopolimorfi[10].Lalineadiconfinecheseparailpolimorfismodal polimorfismo conformazionale e dalla chiralit stato discusso per la prima volta da Eistert e collaboratori [11]. La tradizionale visione ristretta del polimorfismo, e diconseguenzalesclusionedellachiralitedellisomeria,haportato considerevoli difficolt ai ricercatori che lavorano in questo campo [8]. Un modo perevitaretaleproblemadiadottarelaterminologiapropostadaMcCronee collaboratori [12, 13]. Essi considerano polimorfi tutte le molecole che presentano insoluzionelamedesimastruttura,indipendentementedalpolimorfodacuiesse derivano,masenzaescludere,diperse,isomeritautomerieconformeri,come suggerito da Dunitz [14]. In questo modo sistemi che interscambiano rapidamente vengonoinclusi,mentresonoesclusiquellicheinterscambianolentamente. Nonostantelapparenza,questadefinizioneaumentadipocogliesempidi polimorfismo,maevita,daltrocanto,chevisianosituazioniartificioseincuisi accettano fasi come polimorfi basandosi solamente sul comportamento, senza che la struttura cristallina mostri la presenza di differenti impaccamenti cristallini [15-17]. Uncennoparticolarevaaisolvatieco-cristalli,iqualicostituisconouna classeparticolaredipolimorfi.Unsolvatounsolidocristallinocostituito 7 dallinsiemediduedifferentimolecoledicuiunaunsolvente.Lestrutturedei solvatipossonodifferiresiaperladiversadisposizionedellemolecolenel cristallo, sia per il diverso numero di molecole di solvente incorporate. Per questo motivoinalcunicasivengonochiamatipseudo-polimorfimettendoinevidenza che esiste una relazione simile a quella presente nei polimorfi. I solvati si possono dividereinduecategorie:stechiometricienonstechiometrici.Unsolvato stechiometricopupresentareunastrutturacristallinaunica,nonisomorfaad unaltraforma.Inquesticasi,disolito,lastrutturacristallinacollassaquandoil solvente viene rimosso (de-solvatazione) portando ad unopacit nel cristallo [18]. Epossibile,per,ancheotteneresistemistechiometriciconsolvatiisomorfitra loro,espessoancheisomorficonunaformaanidra.Questoportaallapossibilit che vi sia un passaggio cristallo singolo-cristallo singolo per solvatazione/de-solvatazione. Inoltre ci sono solvati non stechiometrici in cui spesso il solvente lacqua;inquestocasoicompostisonochiamatiidrati.Lemolecolediacqua, dotatediunfortemomentodipolare,inizialmentesiorientanointornoagliioni checostituisconolasuperficiedelcristallo,conlapartenegativaversogliioni positivioviceversa.Intalmodoindebolisconoleforzecoulombiane fragliioni, penetrandosemprepiprofondamentenelreticolocristallino,dandoinizioalla formazionedisolvati.Iprocessidisolvatazioneede-solvatazione,coscome linterconversionetraivaripolimorfi,possonoavvenireanchedurantela manipolazionedeifarmaciodialtriprodottiindustriali(soprattuttodurantela lavorazioneelaformulazione):diconseguenzalostoccaggiorisultaunarea chiaveperlindustriafarmaceuticaenon.Perquantoriguardaico-cristalliessi sonocostituitidallaggregazionedidueopicomposti,indipendentiluno dallaltro,iqualisipresentanoallostatosolidoatemperaturaambiente(RT).Si distinguono quindi dai solvati, ma anche dai sali, i quali, bench siano formati da duediversespecieallostatosolido(gliioni),nonsonoindipendentiluno dallaltroquindinonsipossonoconsiderareco-cristalli;tuttavia,nullavieta lesistenza di co-cristalli solvati. In fig. 2 sono rappresentati schematicamente due polimorfi di co-cristalli e un co-cristallo solvato. 8 Fig. 2: Polimorfi di un Co-cristallo Dalpuntodivistatermodinamico,inlineadiprincipio,sipossono distinguere due grandi classi di relazioni che legano due o pi polimorfi: relazione enantiotropicaemonotropica.Duepolimorfienantiotropicisonoingradodi interconvertire ad una certa temperatura attraverso una transizione di fase solido-solido,mentreperquantoriguardaimonotropicilinterconversionenon possibileprimadellatemperaturadifusione[19,20].Esistonocasiincuiun polimorfopuessereinrelazionemonotropicaconunsecondopolimorfomain relazioneenantiotropicaconunterzopolimorfo.Unesempiorappresentato dallacidoflufenamico[21].Infigura3rappresentatoildiagrammadiun sistemaenantiotropicoaduespecie(curvaverdeerossa):allatemperatura indicatacontppuavvenirelatransizionetraledueforme,ovverocisonole condizionidiinterconvertibilit.Soprataletemperaturasolitamentesiottienela forma rossa, favorita termodinamicamente ad alte temperature, mentre al di sotto, la forma stabile quella verde, termodinamicamente favorita a bassa temperatura. 9 Fig. 3: Diagramma enantiotropico di un sistema a due specie Inunsistemamonotropico,figura4,adifferenzadiunsistemaenantiotropico, noncunpuntoincuileduecurvesiincontrano,quindinonsipossono verificarelecondizionidiinterconvertibilitvisteprima.Nonostantela termodinamicaneteorizziuno,questosolamentevirtualeesitrovaaldisopra della temperatura di fusione. La transizione pu avvenire solamente se si porta il sistemaaldisopradellatemperaturadifusioneeinognicasovienefavoritala forma cineticamente pi stabile. Fig. 4: Diagramma monotropico di un sistema a due specie. 10 Questultimofenomenodaconsiderarsiperalcuniaspettifastidioso,dal momentocheunaformatermodinamicamentepistabilepotrebberimanere nascostapermotivicineticiperpoimanifestarsiinunsecondomomento. Lesistenza di relazioni enantiotropiche tra i polimorfi indicativo del fatto che le stabilitrelative(epercianchelenergialiberadiGibbs)traunpolimorfoeun altro, sono molto simili [22, 23] e per tale ragione prevedere il polimorfismo di un dato composto difficilmente possibile [24,25]. 1.3Come si ottengono i polimorfi Benchspessositrovinopercaso,cisonosvariatimodi,dipendentida diversifattori,concuisipossonoottenereipolimorfi.Questipossonoessere ottenutitramiteraffreddamentodisostanzefuse,percondensazionedivaporio per cristallizzazione sotto diverse condizioni. Per ottenere diversi polimorfi di una molecola possibile variare le condizioni di cristallizzazione modificando [26]: Temperatura e conseguente velocit di raffreddamento della soluzione. Concentrazione e relativo grado di sovrasaturazione. Solvente e diverse interazioni soluto-solvente. Velocit di nucleazione. Unaspettomoltoimportante,sesidevepianificareunacristallizzazione,la sceltadelsolventedautilizzare;infattilottenimentodiunaformapiuttostoche unaltradipendefortementedatalescelta.Inparticolare,affinchilsolventesia unbuoncandidatoperilprocessodicristallizzazione,lasolubilitdelcomposto inesamedeveesserecompresatrai5e200mg/mLatemperaturaambiente. Solubilitmaggioriportanoadunliquidomoltoviscosochefavoriscela formazionediformeamorfe,mentresolventialtobollentipossonofavorirela formazionedifasimetastabili.Perrenderelasceltapiagevole,isolventisono raggruppati in funzione delle propriet chimico-fisiche, quali la polarit, la diversa proticit,latendenzaaformarelegamiidrogeno,lacostantedielettrica,la viscositelatensionesuperficiale.Cipermettediindividuarefacilmenteil gruppo di solventi che meglio presentano le caratteristiche desiderate ( Figura 5). 11 1Cicloesano (1.4), Benzene (61.7), Toluene (34.1), n-pentano (54.7), Mesitilene (8.3), Tetracloroetano(60.7). 2Etere di etilico (38.9), Trietilammina (64.5), Butilammina (27.8) 3Cloroformio (5.8), Acetato di etile (34.7), Tetraidroforano (5.1), Fluoro benzene (28.8), Clorobenzene (13.2). 4Acido Acetico (56.4), Propanolo (63.9), 1-butanolo (19.8), Etanolo (192.7), Mofolina (34.0), 1-pentanolo (39.4). 5Piridina (85.0), Butanone (9.0), Acetone (42.9),Pentanone (31.4), Ciclopentanone (62.2). 6N,N-Dimetilformamide (35.1), Dimetilsolfossido(74.7), N,N-Dimetilacetammide (59.1)7Acetonitrile (61.3), nitrometano (125.6) 8Anilina (1.3), Alcol Benzilico (13.3) 9Acido Formico 10Glicole Etilenico 11Metanolo 12Dietilammina 13Diclorometano 14Glicerolo 15Acqua Fig. 5: Scala di polarit di diversi solventi con relative costanti dielettriche. Un altro aspetto importante rappresentato dalla velocit di nucleazione che pu essereinfluenzatadadiversifattoriqualilavelocitdiagitazione,illivellodi sovrasaturazione,ilseeding,traccediimpuritetemperatura.Undiscorso analogo pu essere fatto per la velocit di crescita dei cristalli che, anche in questo caso,puessereinfluenzatadatemperatura,agitazione,densiteviscositdel solvente. Nella maggior parte dei casi, la temperatura ottimale per la nucleazione noncoincideconquellaottimaleperlacrescitadeicristalli,diconseguenza occorre trovare un giusto compromesso tra le due.In alcuni casi, possibile far uso di tecniche particolari quali il seeding dove, dopolasolubilizzazionedelcompostoinesameinunopportunosolvente,si introduconocristallidiuneteronucleo,assicurandosichenonsiasolubilenel solvente scelto, che presentano il gruppo spaziale desiderato. Questa operazione ingradodiindirizzarelacristallizzazioneversolaformadelleteronucleo introdotto.Unaltratecnicaparticolareperottenerepolimorfilutilizzodella CO2supercritica.Ilbiossidodicarbonio,allatemperaturadi37,7Cepressione di68atm,sitrovanellostatosupercritico,incuinonc'distinzionefrafase vapore e fase liquida ( vedi figura 6). 12 Fig. 6 : Comportamento della CO2 supercritica allaumentare della pressione Aumentandolatemperaturaapressionecostante(68atm),oviceversa aumentando la pressione a temperatura costante (37,7 C), si definisce una zona in cuilaCO2rimanenellostatosupercritico.Inparticolare,all'internodiquesto stato, varie combinazioni di pressione e temperatura portano a differenti propriet solubilizzantidelbiossidodicarbonio.Lanidridecarbonicainfasesupercritica assumelecaratteristichedisolventenonpolareedparagonabilealln-esano; conquestometodopercipossibilesolubilizzarecompostichepresentano determinatecaratteristichedipolarit.Ilvantaggiodiquestatecnicache lanidridecarbonicavieneallontanatasottoformadigasdandolapossibilitdi recuperareicompostisenzadoverevaporareilsolventeocristallizzareil composto. Ognicompostochesiprendeinesamecaratterizzatodaunapropriacurva di solubilit, che ne descrive landamento in un determinato solvente in funzione della temperatura. Fig. 7: Andamento della solubilitdi una generica speciein funzione di Temperatura e Concentrazione. 13 Infigura7riportatalacurvadisolubilitdiungenericocompostoincuisi possonochiaramentedistingueretrezone:unaincuiilcompostoinsoluzione, unazonametastabileeunazonadovelasovrasaturazionetalepercuisihala formazionediunprecipitato.Nelcasoincuiuncompostoabbiaduedistinti polimorfi,questiavrannoduecurvedisolubilitdistinteelottenimentodiuna formapiuttostochelaltradipenderdallecondizioniditemperaturae concentrazioneincuimiposizioner.Infigura8,riportatoildiagrammadiun sistema enantiotropico a due specie, dove si pu facilmente osservare che la forma I (blu) quella stabile a bassa temperatura, mentre la forma II quella stabile ad altetemperature.Osservandoildiagramma,sipunotarecheraffreddandoil sistemaeportandosinellecondizionidescrittedalpuntoA,sihaesclusivamente lacristallizzazionespontaneadellaformaI(stabileabassetemperature),mentre portandosinelpuntoD,cristallizzersolamentelaformaII(stabileadalte temperature). Fig. 8: Rappresentazione delle curve di solubilit per un sistema enantiotropico a due specie 14 Ci sono poi tutte le situazioni intermedie, ovvero quelle descritte dalla figura 9 al punto B, dove il polimorfo che si otterr dipender dalla velocit di nucleazione e diaccrescimentodelledueforme.Intalesituazioneilsolventegiocaunruolo decisivonelfavorirelaformazionediunaodellaltraforma.Unulteriore situazionerappresentatadalpuntoCdellafigura10:inquestocasola formazionedelpolimorfodipendedallacinetica,masoprattuttodalseeding accidentale. Basti pensare che il nostro corpo, a riposo, produce circa un milione di particelle di polvere al minuto. Fig. 9: Rappresentazione delle curve di solubilit per un sistema enantiotropico a due specie Fig. 10: Rappresentazione delle curve di solubilit per un sistema enantiotropico a due specie. 15 Bisogna porre attenzione al fatto che le trasformazioni allo stato solido nei cristalli molecolarispessomostranounaltogradodiisteresi.Quindi,puessere necessarioscaldarelaformastabileabassatemperatura,atemperaturemaggiori diquelladitransizionetermodinamica,primachesiosserviliniziodella transizione.Anchequandononsiosservanotransizionisolido-solidoa temperatura pi bassa del punto di fusione questa non una prova sufficiente che ilsistemasiamonotropico;latrasformazionepuesseresemplicementetroppo lenta per essere osservata. Allo stesso modo le trasformazioni inverse, ottenute per raffreddamentodellaformaadaltatemperatura,sonoinevitabilmente accompagnate da isteresi. A volte listeresi pu essere cos lunga, che la forma ad altatemperaturasipumantenereindefinitamenteatemperaturemoltoinferiori del punto di transizione. 1.4Importanza del polimorfismo Ilprincipaleinteresseperilpolimorfismonascedalfattochediversefasi cristallineoamorfe,purcontenendolastessamolecola,possonopossedere proprietchimiche,fisicheemeccanicheanchemoltodiverse,conconseguenze notevoli sul loro utilizzo, manipolazione ed assorbimento. Queste propriet, sono: Proprietfisicheetermodinamiche:densit,indicedirifrazione, conducibilittermicaedelettrica,igroscopicit,puntodifusione, potenzialechimico,energialibera,capacittermica,pressionedivapore, solubilit e stabilit termica. Propriet spettroscopiche: propriet elettroniche, vibrazionali e rotazionali, risonanza magnetica nucleare e caratteristiche spettrali. Proprietcinetiche:velocitdiscioglimento,cinetichedellereazioniallo stato solido, stabilit. Propriet meccaniche: durezza, compressibilit, espansione termica. Propriet chimiche: reattivit chimica e fotochimica. Proprietdisuperficie:energialiberadisuperficie,abitocristallino,area superficiale, distribuzione della grandezza delle particelle. 16 In figura 11, sono riportate alcune immagini, realizzate al microscopio elettronico, in cui si pu chiaramente vedere come nel caso del paracetamolo si possono avere forme dei cristalli differenti, a seconda del tipo di polimorfo. Fig.11: Immagini registrate al microscopio a scansione elettronica di differenti polimorforfi del Paracetamolo Lapossibilitcheunastessamolecolamostricaratteristicheavolteanche contrastanti,hanumeroseimplicazionieconseguenzeinmolticampidella chimica sia nellambito della ricerca che in quello industriale. Per quanto riguarda lambitoindustriale,ilpienocontrollodiunaformacristallinadiprimaria importanza,dalmomentocheleproprietultimediundeterminatoprodotto dipendonoinmanierapreponderantedalmodoincuilemolecolesono organizzate allo stato solido. Le industrie, oltre a conoscere esattamente la natura deimaterialiottenutiduranteilprocessoproduttivo,devonovenireaconoscenza dellastabilitdeiprodottineltempoedapprenderelediverseproprietchimico-fisichecausatedalledifferentiformecristalline.Peresempio,nellindustriadegli esplosiviilpolimorfismoestremamenteimportante,vistochealvariaredella formacristallinadiunprodotto,variaanchelasensibilitalladetonazione. Nellindustriaalimentareilcomportamentodigrassi,zuccheriepolisaccaridi durantelalavorazione,ilconfezionamentoelostoccaggio,pucambiarea secondadelpolimorfo,portandoancheadunprematurodeterioramentodel prodotto.Unesempio,quellodellacioccolata.Atutticapitatoalmenouna voltadimangiarecioccolatache,invecedisciogliersiinbocca,possedevauna consistenzaduraegranulosa;questoaccadequandoilcomponentepi importante,ilburrodicacao,subisceunatransizionedifasedallaformacon temperaturadifusionesimileaquellapresenteallinternodellabocca,aduna dellenumeroseformechehannotemperaturedifusionemaggiori.Ilburrodi 17 cacao, a seconda delle condizioni di raffreddamento, pu solidificare in differenti forme [27], ognuna delle quali ha un determinato punto di fusione. La pi stabile quellachepresentailpuntodifusionemaggiore,cheinrelazionemonotropica rispetto alle altre. La sua cinetica di nucleazione e di crescita dei cristalli molto lenta,diconseguenzalasiottienedifficilmenteincondizionidiraffreddamento diretto. Il numero di forme conosciute del burro di cacao cresciuto negli anni e tuttoggi sono riconosciute sei forme, anche se si suppone che ce ne siano sette. In tabella2sonoriportatilanomenclaturaelatemperaturadifusionedituttele forme conosciute. POLIMORFIPUNTO di FUSIONE (C) I17.3 II23.3 III25.5 IV27.3 V33.8 VI36.3 Tab. 2 : Temperatura di fusione dei polimorfi del burro di cacao. Lastessacosavalenel campodeicoloranti,siaditipoalimentarechenon,visto cheasecondadellafasepuvariarelacromaticit.Untipicoesempiodi composto che pu dare origine a tre diversi polimorfi cromaticamente differenti il5-metil-2-[(2-nitrofenil)amino]-3tiofencarbonitrileanchedettoROY(dallasua variazionecromaticaRed,OrangeeYellow).Talespecierappresentauntipico esempio di polimorfismo conformazionale, visto che le diverse forme, riportate in figura12,differisconoperildiversoangolodiedrotralanellofenilicoequello tiofenico[28].Infigura12sonoriportatelediversestruttureconformalideitre polimorfi, mentre in figura 13 si pu chiaramente vedere le variet cromatiche e le differenti caratteristiche sia strutturali che chimico-fisiche delle tre forme. 18 Fig 12 : Strutture dei tre polimorfi ( Red, Orange, Yellow) del 5-metil-2-[(2-nitrofenil)amino]-3-tiofencarbonitrile Fig 13 : Differenze di forma e di colore dei due polimorfi RO5 (red) e YO4 (yellow) del 5-metil-2-[(2-nitrofenil)amino]-3-tiofencarbonitrile. Anche in ambito farmaceutico, tale problema e di estrema rilevanza, sia perch le proprietdiefficienzaterapeuticaelatossicitpossonovariareinfunzionedel tipodipolimorfo,siadaunpuntodivistabrevettualeediconseguenza economico. Nellambito della ricerca, invece, sebbene studiato da tempo, il polimorfismo neicristallimolecolariancoraoggiunodeifenomenipiaffascinantidella chimica dello stato solido [1,29]. Esso rappresenta una sfida aperta allidea stessa 19 di poter progettare e costruire in modo razionale solidi cristallini con architetture e proprietdefinitepartendodallaconoscenzadeicomponentimolecolariutilizzati (ingegneriacristallina,crystalengineering)[30].Infatti,lacapacitdi controllarelinsorgenzadelfenomenotuttoralimitata.Inmolticasi lottenimentodiquestaoquellaformacristallinaodiunafaseamorfaun risultatodellacasualit,piuttostocheunprocessosottocompletocontrollo umano.Inoltrelapossibilitdiinterconversionetralevarieformepuavere conseguenzemoltoseriesullavitadiunprodottoesulmantenimentodelle proprietdesiderate,comeadesempiolefficaciaterapeuticanelcasodiun farmaco o le propriet cromatiche nel caso di un pigmento [31]. Pi in specifico, va considerato che, in funzione di variabili quali temperatura, pressione e umidit relativa,unaformametastabileputrasformarsiinunaforma termodinamicamente pi stabile o una forma cristallina anidra pu trasformarsi in una forma cristallina idrata per assorbimento di vapore dallambiente. Oppure una formacristallinasolvatapu,asuavolta,trasformarsiinunaformacristallina anidra o con diverso grado di solvatazione per perdita di solvente. Nella maggior parte dei casi la forma cristallina di arrivo ha propriet completamente diverse da quelladipartenza.Identificaretuttelefasicristallinediunasostanzaelaloro stabilit nel tempo ed agli agenti esterni (stabilit termica, chimica, meccanica) quindinecessariofindaglistadiinizialidelsuostudio,eancoradipiprima dellimmissioneincommercio,nelcasositrattidiunasostanzadiinteresse industriale.Cisonotreprincipalimotivichegiustificanolostudiodelfenomeno delpolimorfismo.Ilprimounmotivoeticocomenelcasodeifarmaci,lecui propriete glieffettisuipazientidipendonodaltipodipolimorfo;unaquestione scientifica, che spinge ad una pi approfondita conoscenza della materia, ed infine unaquestionecommerciale,legataaibrevetti,allaloroestensioneed allaggressione da parte di terzi. 1.5Il problema del POLIMORFISMO in ambito farmaceutico Daunpuntodivistapraticoilpienocontrollodiunaformacristallinadi primariaimportanzaperprogettareedottimizzareundeterminatoprocesso produttivo,dalmomentocheleproprietultimediunprodottoindustriale 20 dipendonodalmodoincuilemolecolesonoorganizzateallostatosolido.Per questomotivoprioritarioconoscereesattamentelanaturadeimaterialiottenuti duranteilprocessoproduttivo.Sideveconoscerelastabilitdelprodottonel tempoedapprenderelediverseproprietchimicheefisichecausatedalle differentiformecristalline.Ilfenomenodelpolimorfismodicuisiparlato ampiamentefinqui,giocaunruolofondamentalenelcampofarmaceutico; conoscereecontrollarelachimicadellostatosolidodeiprincipiattiviun importanteaspettodelprocessodisviluppodelfarmaco.Infatti,circal80-90% dei farmaci attualmente in commercio venduta e somministrata allo stato solido in forma di polvere, pastiglie o compresse [32].Unesempioemblematicodiimpattodelpolimorfismosuunaformulazione farma-ceuticaquellodelRitonavir(Norvir),farmacoperlacuradelHIV.A causadellimprovvisacomparsadiunaformapistabileedrammaticamente menosolubile,costrinselaAbbott(casaproduttrice)aritirareilfarmacodal mercato per un lungo periodo ed a sostituirne la distribuzione in forma solida con una formulazione in sospensione, con maggiori problemi legati alla stabilit. Tutto questoperlimpossibilitdiottenerelaformasolidaconlavolutasolubilit, autorizzatadallaFoodandDrugAdministration(FDA).Aseguitodiquesto episodio,lacomunitinternazionaleelaFDAhannocominciatoadoccuparsi,e soprattuttopreoccuparsi,delproblemadelpolimorfismocristallino.Ilfenomeno, come gi detto, molto comune in campo organico e farmaceutico; infatti il 70% deibarbiturati,il60%dellesulfonammidiedil23%deglisteroidiesistonoin diverse forme polimorfe o solvate (tabella 3). Basti pensare che Greeser e Burger hannoraccoltoinformazioniriguardanti599formepolimorficheesolvati(idrati inclusi) di composti farmaceutici solidi a 25 C [33,34]. FARMACI Composti Esaminati %di Polimorfi % di polimorfi instabili o metastabili Steroidi (p.f . Se linterazionequadrupolarepiccolarispettoaquellaZeemansiottieneper lHamiltoniano la seguente espressione: 2 21 (3 )(3cos 1)4 (2 1) 2CCQ ZQH I II I = elacorrispondentefrequenzaditransizionetrailivellienergeticimed(m+1) sar: 211 1(3cos 1)( )2 (2 1) 2 2CCm m ZeemanQmI I + = + + Perunadeterminatatransizioneuninterazionepuprovocareunallargamentodi banda;selalarghezzadellabandaparia,taleallargamentopuessere rimossointroducendounmixingdeglistatigeneratidallinterazioneaduna velocitpigrandedi.Neisolidiilmotomolecolarenonsufficientea mediareefficacementeivaristati,percuioccorreutilizzareopportunetecniche per realizzarne il mixing. 2.3 NMR SS in Alta Risoluzione Comesivistoprecedentementelinterazionedipolareelinterazionedi anisotropiadelchemicalshifthannounafortedipendenzaangolare,di conseguenzaquesteinterazionipossonoesseremediateazeroconopportuni accorgimenti,usandotecnicheparticolariqualilarotazioneallangolomagico (MAS) e il disaccoppiamento dipolare ad alta potenza (DD). 2.3.1 Magic Angle Spinning (MAS)Per uninterazione anisotropa la frequenza di risonanza pu essere in generale espressa come: eaniso= f(,) 46 con(0,)lecoordinatepolaridelversorelungoilcampomagneticoesterno.E possibile,mediantetrasformazionedelsistemadiriferimento,riferire lorientazionedelframmentomolecolarerispettoadunassearbitrariocheforma un angolo r rispetto al campo magnetico esterno in modo da passare al sistema di laboratorio, il cui asse z coincide con la direzione del campo magnetico stesso. Se inoltresiruotarispettoataleasse,lafrequenzarisultaunvaloremediosulle diverseorientazioni(definitedagliangolipolari0aea)assuntedalframmento molecolare rispetto allasse di rotazione. In particolare si ha che: =f ' (,) 1/2 3cos1anisor a a2 da cui risulta che nel caso in cui lasse di rotazione sia a 54.74 rispetto al campo magneticoesterno,valoreperilqualeiltermine(3cos20r-1)siannulla, eanisodiventaugualeazero,elasolacomponenteisotropadellinterazione contribuisce allo spettro.Langolo 0r detto angolo magico. Figura 3: Rappresentazione dellangolo magico. Edatenerepresentechelarotazioneadangolomagicoannullaleffettodelle anisotropie dellediverseinterazionisoltantose lafrequenzadirotazionemolto maggioredieaniso.Pervelocitinferiorisiosservanounaseriedibande,dette banderotazionaliospinningsidebands,distanziatediintervallimultiplidella frequenza di rotazione er,3 come si pu chiaramente osservare in figura 4. 47 Figura 4:Rappresentazione dellevolozione di un segnale anisotropo in funzione delle velocit di rotazione allangolo magico Con i moderni spettrometri si ottengono velocit massime pari a circa 30-35 kHz sufficientiquindiadeliminarelanisotropiadelchemicalshift,manontuttigli accoppiamentidipolari.Peresempio,nelcasodimolecoleorganicheincuile distanzecarbonio-protonesonopiccole(dellordinedi1-2),laccoppiamento dipolare 13C-1Hnonvienemediatoazerodallarotazioneadangolomagico.E quindinecessario,inquestocaso,combinarelatecnicaMASconil disaccoppiamento dipolare ad alta potenza. 2.3.2 Disaccoppiamento dipolare ad alta potenza (DD)Ilmetodopicomunementeusatoperannullarelinterazionedipolare eteronucleare 13C-1Hinesperimenti 13CMAS,consistenellirraggiamento continuoconuncampomagneticoB1 perpendicolareaB0 allafrequenzadi risonanzadeinucleiprotoniciduranteilperiododiacquisizionedelsegnale.In questomodolamagnetizzazionedelnucleo 1HprecedeintornoaB1 edilnucleo 13C vede una situazione media in cui il momento magnetico del nucleo protonico nullo. 48 2.4 Tecniche usate in NMR SS in Alta Risoluzione Letecnichefinquidescritteservonoperottenerespettri 13CNMRadalta risoluzioneinfasesolida.Tuttavia,perottenerequestispettriintempidimisura ragionevolidevonoessererisoltialtridueimportantiproblemi.Ilprimonasce dallalunghezzadeitempidirilassamentolongitudinaleT1 deinuclei 13C(anche dellordinedeiminuti)[2,3,6].Ilsecondocostituitodallabassaabbondanza naturaleebassasensibilitNMRdel 13C[7,8],cheimpongonolanecessitdi acquisireunelevatonumerodiFIDperavereunbuonrapportoS/N.Insieme questi due fattori possono rendere i tempi di misura proibitivi. 2.4.1 Cross-Polarization Unadelletecnichepiutilizzateperovviareaquestiproblemilacross-polarization(CP)chesfruttalapossibilitditrasferiremagnetizzazione(o polarizzazione)dall1H,ciodaunospinabbondante,al 13C,cioadunospin raro,adessoaccoppiatodipolarmente.Peraveretrasferimentodipolarizzazione tra due nuclei accoppiati dipolarmente occorre innanzitutto che entrambi siano in condizionedispin-lock.Sihaspin-lockquandolacomponentedella magnetizzazionelungouncampoapplicatoB1,perpendicolareaB0emolto maggioredeicampilocali(accoppiamentidipolari,chemicalshift),nonprecede intorno a B0 ma rimane allineata lungo tale direzione. La magnetizzazione di tale sistema di spin pu essere mantenuta in tale condizione solo per un tempo limitato infatti, essa pu rilassare longitudinalmente nel sistema ruotante, secondo il tempo caratteristicoT1p.Loscambiodipolarizzazionefra 1He 13Caccoppiati dipolarmenteavvienequandosiirradianocontemporaneamenteiduenucleicon campi B1 alle rispettive frequenze di risonanza tali che sia verificata la condizione di Hartmann-Hann: B1H= C B1C doveI ilrapportogiromagneticodelnucleoHeB1Ilintensitdelcampo magneticotrasversaleapplicatosulnucleoH.LequazionediHartmann-Hann implica che:1H = 1C 49 ovvero che i due sistemi di riferimento ruotanti siano sincroni e di conseguenza si ha possibilit di trasferimento di magnetizzazione. Se si parte da una situazione in cuisihasolomagnetizzazionedeinuclei 1H,dopoiltrasferimentodi magnetizzazionelacomponentedellamagnetizzazionedeinuclei 13C proporzionaleaquelladeinuclei 1Hchelhannogenerata,ovveroquelliche interagisconodipolarmente.Inognicasoilmassimoguadagnoin magnetizzazione,rispettoalleccitazionedirettadelnucleo 13C,almassimo H/C=4.Edatenerepresenteinoltrecheaifinideltempodiattesafrauna scansioneequellasuccessiva,contailT1 delnucleo 1Hche,rispettoaglialtri nuclei,hatempidirilassamentomoltopicorti.Inquestomodopossibile registrarespettri 13Cinabbondanzanaturaleintempirelativamentebrevi. Lesperimento 1H-13CCPgeneralmenteschematizzatocomeriportatoinfigura 5. La crescita della magnetizzazione dei nuclei 13C durante il tempo di contatto tCP segueunandamentoesponenzialecontempocaratteristicoTCP chedipendedalle interazioni dipolari dei nuclei coinvolti nel trasferimento di magnetizzazione. Figura 5: Rappresentazione schematica della sequenza CPMAS. E chiaro quindi che per nuclei 13C direttamente legati a nuclei 1H la crescita della magnetizzazionesarpirapidarispettoaquelladinucleiquaternari.Inoltre, 50 duranteiltempodicontattolamagnetizzazionedeinuclei 1Hequelladeinuclei 13C che si crea sono soggette a rilassamento longitudinale T1p. Tutto ci fa s che, inprimoluogo,leintensitdeidiversipicchiinunospettroCPnonrispettinole quantit relative dei diversi tipi di nuclei 13C presenti nel campione, e in secondo luogo,ladinamicadiCP,ciolandamentodellamagnetizzazionedel 13Cnel tempo, non sia una semplice funzione esponenziale. In particolare si ha che: M(t)=M01-TCH/T1 e -t/T 1e -t/T1 1-1HH LequazionesoprariportataconsentediottenereM0,ovveromassimala magnetizzazioneottenibiledaM(t)notiivaloridiTCH e1peridiversitipidi carbonio.M0 direttamenteproporzionalealnumerodinuclei 13Cche contribuisconoalpiccoinesameelasuadeterminazioneconsentequindidi ricavare le quantit relative dei diversi tipi di carbonio presenti in un campione. 2.4.2 CP-MAS La sequenza CP-MAS la combinazione delle tecniche di Cross Polarization ediMagicAngleSpinning.Essapermettediottenerespettriallostatosolidoin altarisoluzione,conlarghezzedibandadellordinediqualchedecinadiHzper nucleicomeil 13Coil 31P.Gliaccorgimentisopraelencati,perpotermediarele varieinterazioni,tecnicamenteportanoadifferenzedicostruzionedello spettrometroNMRallostatosolidorispettoallatecnicaclassicainsoluzione.In particolare la parte che racchiude in s tutti i dispositivi per ottenere spettri ad alta risoluzioneilprobe.Comeillustratonellefigureseguenti,ilprobediunNMR allo stato solido costituito da un blocco cilindrico che porta il campione al centro delcampodelmagnete,sucuiunatestinaangolataregolabilepermettela rotazione del campione allangolo magico. Ilcampionevieneintrodottoinunrotorecilindricoinzirconiachevienechiuso con un apposito tappo dotato di speciali alettature; una volta inserito nella testina, 51 il campione viene posto in rapida rotazione mediante due flussi di aria compressa, uno che solleva il rotore e laltro che agisce sulla alettature (figure 6). Figura 6: Esempi di probe per stato solido e differenti rotori utilizzati. 2.4.3 Spectral editing Lospectraleditingunatecnicausataperpotersemplificarespettri complessieperlassegnazionedeisegnalioriginatidanucleidiversiin esperimentiNMRinaltarisoluzione,iqualirisulterebberodifficilmente assegnabili con normali tecniche di cross polarizationAllo stato liquido le tecniche editing, quali DEPT, INEPT e ATP sono ormai esperimenti standard, mentre allo statosolido,nonostantelaCPMASsiacomunementeusatadacircauna20anni, le tecniche di editing sono poco sviluppate ed il loro utilizzo non routinario. Una delletecnichedispectraleditingmaggiormenteusataladipolardephasingo Non-Quaternary-Suppresion(NQS),masfortunatamentequestadasolo informazioni sui atomi di carbonio quaternari e metilici mentre non in grado di distinguerechiaramenteigruppiCHeCH2.Perpoterlidistingueresonostati proposti diversi metodi [9-13], tra cui tecniche bidimensionali quali separed-local-field(2DSLF)oppurelamedesimaadattatainmanieramomodimensionale.Tali sequenzesonobasatepuramentesulfattochegruppiCH2hannodue accoppiamenti dipolari C-H, perch possiedono due idrogeni, mentre i gruppi CH ne hanno uno solo. Nel 1992 stato proposto un semplice metodo per distinguere gruppiCH,CH2,CH3ecarboniquaternari(Cq)chiamatoCPPI(Cross-52 PolarizationPolarizazion-Inversion).Questosiottieneusandoungenerico esperimento CPMAS, integrato con una sequenza di inversione di polarizzazione (PI) [14-16], come si pu vedere nello schema della sequenza riportata in figura 7. Figura 7: Sequenza di impulsi per lesperiminto di Spectral-editing allo stato solido. GlispinsIrappresentanoilsistemadispinsabbondanti,ovveroilprotone(1H), mentre gli spins S corrispondono al sistema dispin del carbonio (13C, spin raro). SottolecondizionidiHartmann-Hahn,lamagnetizzazionedelcarbonio,MS, crescegradualmenteincrementandoiltempodicontatto,CP,durantelaCross-polarization. In seguito ad un tempo di contatto sufficientemente lungo gli spin S eIraggiungonounequilibriotermicocioaseguitodeltrasferimentodi magnetizzazionedallidrogenoalcarbonioraggiungonolastessatemperaturadi spin. A questo punto, cambiando la fase dello spin-lock sullo spin I (1H) di 180 la temperatura di spin dei protoni invertita quindi anche la sua magnetizzazione. Diconseguenzaisistemidispindicarbonioeidrogenononsonopi allequilibriotermicoeperchcisianonuovamentelecondizionicheportinoad unequilibrio,deveavvenireunulterioretrasferimentodienergia.Quindi,man manochesiincrementanoitempidiinversionedipolarizzazione,P1,la magnetizzazionedelcarbonioprimadecresce,poisiannullaeinfinediventa negativa. Questo processo denominato inversione di polarizzazione[16] in cui la dinamicadeglispinsimileaquellachesirealizzainunanormalecross-polarization. Tale tecnica pu essere applicata sia con basse, che con alte velocit dirotazione.Inparticolareusandobassevelocitdirotazionesifruttaladiversa velocitnelmeccanismodirilassamento(meccanismodicross-relaxation)ela diversa capacit termica, che indipendente dalla mobilit molecolare, dei gruppi 53 CH,CH2,CH3eCq.Questositraduceinunefficacianelmeccanismodi inversionecheseguelaseguenteserieCH2>CH>CH3>Cq.Adaltevelocitdi rotazione, nellordine dei 10 KHz, si sfrutta invece la diversit della componente dipolaredellhamiltonianodellequattrospecie.Inparticolarelacomponente dipolare dellhamiltoniano dei gruppi CH, mediata solo in parte dalla velocit di rotazionediconseguenzarisultadisomogenea,mentreperigruppiCH2la componente dipolare pi grande, circa 35 KHz, di conseguenza la rotazione non in grado di mediarla neanche in parte e di fatto risulta omogenea. Questo, porta nuovamenteadunamaggiorevelocitdiinversioneperigruppiCH2rispettoai CH.Provandounaseriedispettricontempidipolarizzazioneinversa,PI, differenti si in grado di ottenere uno spettro con i segnali degli atomi di carbonio quaternariedimetilipositivi,isegnalideiCHnullimentreiCH2negativi. Questosemplificanotevolmenteglispettrianchequandoquestisonomolto complicati dalla sovrapposizione dei segnali. In figura 8 riportato un esempio di spettro CPPI per il un campione di colesteril acetato [17]. Figura 8: a) Struttura del Colesteril Acetato b) Rappresentazione dello spettro CPMAS del Colsteril Acetato registrato ad una velocit di rotazione di 4.7 kHz cb) Spettro risultante dallesperimento di spctral-editing eseguita con un P1 pari a 20 sed ugule velocit di rotazione. I segnali contrassegnati dal pallino sono i 13CH. 54 2.4.4 2D-PASS Lapresenzadellespinningsidebands,allinternodiunospettro,rappresenta unproblema,maallostessotempounopportunitperricavareimportanti informazioni.Laloropresenzafasichelasensibilitpeggiori,perchlintensit delpiccoisotropodiminuisceafavoredelcontributoanisotropo,inoltre confondonoecomplicanomoltolinterpretazionedellospettro.Tuttaviaesse contengonoprezioseinformazionisulleanisotropiedischermodeivarisiti allinternodellamolecola.Questeinformazionisipossonoottenereregistrando spettri a basse velocit di rotazione, ma la presenza di diversi pattern di spinning sidebandsassegnatiaidiversipicchiisotropirendelospettrodidifficile interpretazione.Diconseguenzanatalesigenzadiottenereinformazioni sullanisotropiadelchemicalshift(CSA)didifferentisitipresentiallinternodi molecolecomplesseusandotecnichedirotazioneallangolomagico.Cisono numerosiapprocciperseparareleinformazioniriguardantilaparteisotropaed anisotropadelchemicalshift.Generalmentesidividonoinduetipologie:quelli cheottengonoinformazionisullaCSAdaspettriabandalargachericordanoil patterndiuncampioneinpolverestatico;oppurequelliincuilinformazione viene ricavata dallanalisi delle spinning sidebands presenti in un normale spettro CP-MAS.Solitamenteiprimisonometodimoltoelaboratiedifficiliperch richiedonocheglispininuncampioneruotantesicomportinocomesefossero statici.UnaparticolaretecnicacheriescearicavareutiliinformazionisullaCSA danormalispettriCP-MASregistratiabassevelocitdirotazione,un esperimentobidimensionalechiamato2D-PASS(Twodimensionalphase-adjusted spinning sidebands) suggerito per la prima volta da Dixon agli inizi degli anni 80 [18, 19]. Lasequenzadiimpulsi2D-PASS,combinandospettricondifferentifasi delle spinning sideband, in grado di separare in righe individuali di uno spettro bidimensionalelespinningsidebandsdeidiversipicchiisotropiinbasealloro ordine(dovelespinningsidebandsdiordineksonoseparatedalrelativopicco isotropodakrconrugualeallavelocitdirotazionedelrotore). LinformazionesullaCSAquindiconservataedpossibilericostruireuno spettroquantitativoepuramenteisotropicoattraversounelaboratasommadelle 55 righedeldataset.Inaltreparoleilrisultatofinaleunacorrelazionetrala componenteisotropaeanisotropadiunospettroincuiattraversolaseconda dimensione si ottengono informazioni addizionali sullintorno chimico del nucleo. Uno schema dellesperimento 2D-PASS riportato in figura 9. Figura 9: Sequenza di impulsi per lesperiminto 2D-PASS allo stato solido Lasequenzainiziaconunanormalecross-polarization 1H-13Cnecessariaper accrescerelamagnetizzazionedelnucleoraro(13C)inmododapoteressere acquisito con una maggiore sensibilit e in tempi relativamente brevi. La sequenza evolvepoiperunperiodor(indicatoconilnomePASSinfigura9),parial periodo del rotore cio r = 2/r. Durante questo periodo si usano cinque impulsi perprepararelecomponentidellamagnetizzazioneinmanieratalechesiano introdotti dei cambiamenti di fase ben definiti nelle spinning sidebands. A questo puntolamagnetizzazionedelcarbonioliberadievolvereduranteitempodi 56 acquisizionet2incuiosservatainpresenzadidisaccoppiamentosulcanaledel protone.Nelprimoesperimento2D(t1=0)icinqueimpulsisonoseparati uniformementediunvalorepariar/6edispostisimmetricamenterispettoal centrodiunsingoloperiododelrotoredenominatoPASS.Intaleconfigurazione laquisizione durate il t2 non influenzata dalla sequenza di impulsi della PASS e quindilesperimentocorrispondeadunasempliceCP-MAS.Neisuccessivi incrementidit1,laposizionedegliimpulsivariaseguendolandamentodelle curve riportato nel diagramma sotto lo schema della sequenza 2D-PASS in figura 9. Queste differenti posizioni degli impulsi sono quelle che permettono di ottenere gli spettri con cambiamenti di fase delle spinning sidebands ben definiti. [17,20]. Ilnumerodiincrementidit1dipendedalnumerodispinningsidebandsdel compostoinesame.Nelcasodicompostichecontengonounnumerolimitatodi spinnig sidebands ne sono necessari solo pochi.UnesempiodiapplicazioneditalesequenzariportatoinFigura10perun campionediampicillinaacquisitoadunavelocitrdi1030Hz.Comesipu notare lo spettro 1D CPMAS (riportato in alto nel prospetto A in figura 10) appare alquantocomplicatoedidifficileinterpretazioneperilfattochelespinning sidebandssisovrappongonosiatralorocheconisegnaliisotropitipici dellampicillina.NelprospettoBlespinningsidebandssonoseparatelungola secondadimensioneinaccordoconilloroordinek(lordine0corrispondeai picchi isotropi, k positivi per le spinning sideband ad bassa frequenza e con segno negativo quelle a alta frequenza). Le sidebands per ciascun sito chimico giacciono diagonalmentenellospettro2D(mostratoincontourplotnelprospettoCin basso nella figura). Nello spettro 2D, lintensit relativa delle spinning sidebands perciascunsitolastessachesiottienenellesperimento1DMAS.Mediante lutilizzo di programmi numerici standard si pu procedere nellanalisi dei diversi patterndispinningsideband,separatidallasequenza2D-PASSefacilmente assegnabiliaivaripicchiisotropipresentiperottenereutiliinformazionisulla CSA. 57 Figura 10: a) Spettro 1D CP-MASS dellAmpicillina registrato a 1030 Hz; b) spinning sidebands separate lungo la seconda dimensione in accordo con il loro ordine k;c) spettro 2D-PASS in cui tre righe non contengono segnale.

58 2.4.5 HETCOR Letecnichedicorrelazioneeteronuclearesonomoltoimportantiperpoter migliorarelarisoluzionenellaspettroscopiaNMRmultidimensionale.La risoluzioneottenutaconquestometodooffrepromettentipossibilitdisviluppo siaperl'assegnazionedeisegnaliinununospettrosiaperladeterminazione strutturaledellemolecolepreseinesame.Recentementesonostatesviluppate sequenzebidimensionalidicorrelazioneeteronucleare 1H-13C(HETCOR), eseguiteadaltavelocitdirotazione,chefannousodiparticolarisequenzeper mediare la forte interazione dipolare 1H-1H [21, 22]. Generalmente, in tali spettri, sonopresentipipicchidicorrelazione(crosspeak)assegnabiliagliatomidi idrogeno,perciascunatomodicarbonio,chepossonoessereestremamenteutili perlinterpretazionedeglispettri.Talisequenzepossonoessereutiliancheper ottenereinformazionisulledistanzeintermolecolarieespazialitragliatomidi idrogenoecarbonio[23].Infigura11rappresentatalasequenzadiimpulsi2D eteronucleare di correlazione dipolare 1H-13C. Figura 11: Sequenza di impulsi per lesperiminto HETCOR 1H-13C allo stato solido. Inquestasequenzavieneanalizzatalevoluzionedellintesitdelsegnalediuno spin S (13C) nel tempo, durante una Cross Polarization mentre si irradiano gli spin I(1H)usandolasequenzaFrequency-SwitchedLee-Goldburg(FSLG).La magnetizzazionedelprotoneevolveduranteiltempot1sottol'efficace soppressionedell'interazionedipolareomonucleare 1H-1Hpermezzo dell'irradiamentoFSLG.Questosibasasullapplicazionediuncampoaradio-frequenze off-resonance, cioe' lontano dal campo di risonanza dei protoni, sugli 59 spins I in modo tale che il campo effettivo percepito da questi sia inclinato di un angolo pari a 54,7, angolo magico, rispetto all'asse z del campo magnetico statico BO.Questofasicheglispins,invecediprecedereattornoall'assezdiB0, comincino a precedere attorno ad un'asse inclinato all'angolo magico esattamente comesistesseruotandoilcampioneinunnormaleesperimentoMAS.Inaltre parole poich non possibile far ruotare il campione ad una velocit maggiore di 30-40 KHz , necessaria per mediare a zero linterazione dipolare omonucleare 1H-1H,lideaquelladifarruotareglispinprotoniciattornoadunasseinclinato allangolo magico. Come si vede in figura 11, la sequenza inizia con unimpulso (/2 + m) sul canale protonico (dove m e' il magic angle pulse cio un impulso a54.7gradi)immediatamenteseguitodaduefrequenzediimpulsoFSLGafasi invertite (-LG e +LG). Dopo il periodo di evoluzione t1, la magnetizzazione del protonerichiamatapermezzodiunsingolomagicanglepulsemchefar ruotaretuttelecomponentiperpendicolariallimpulsodellaLGnelpianoxye porterlecomponentibloccatelungol'impusodellaFSLGsullassez.Aquesto puntovieneapplicataunasempiliceCross-Polarizationnecessariaperaumentare lasensibilitdel 13C.Siprocede,poiconlacquisizionedelsegnaledi questultimoduranteiltempodiacquisizionet2disaccoppiandosulcanaledel protoneconunasequenzadiimpulsichiamataTPPM.Poiche'inquestotipodi esperimenti la comunicazione tra gli spin, il cos detto mixing, avviene durante lacross-polarization,unparametroestremamenteimportantenellasequenza FSLG-HETCORiltempodicontatto(contacttime)utilizzatodurantelaCP. Infatti impostando tempi di contatto inferiori a 100 s solo le correlazioni 1H-13C forti[23,24,25]comequellepresentiinlegamidirettiC-H,possonoessere registratineglispettri,mentresegliesperimentisonofatticontempidicomtatto pi lunghi (compresi tra 100 e 500 s) possono essere osservate le correlazione tra atomi 1H-13Cmaggiormentedistanziatinellospazio[22,24,25].Infigura12 riportatolospettro2D-FSLG-HETCORperuncampionediL-Tirosina[24],in cuisiriesconoavedereleforticorrelazionitragliatomidicarbonioeiprotni direttamente legati. Inoltre possibile osservare sia le correlazioni intramolecolari chequelleintermolecolariconiprotonidistantiattraversolospazio,usandoun basso livello di intensit dei cross-peak. 60 Figura 12:Spettro 2D-FSLG-HETCOR di un campione di L-Tirosina registrato ad una velocit di rotazione di 13 KHz. 61 Bibliografia capitolo 2 1.Schmidt-RohreSpiess,1994;AAVV,Ed.BlackwellScience,2002; Levitt, 2002, Mehring, 1983. 2.M.Mehring,NMR-BasicPrinciplesandProgress,Springer-Verlag, Berlin. 3.L.W.Jelinski e M.T.Melchoir, High Resolution NMR of Solids, 1980. 4.C.AFyfe,SolidStateNMRforChemists,C.F.C.Press,Guelph, Ontario, 1983. 5.S.AimeeR.GobettoinNMRdifasicondensateprincipied applicazioni2, GIDRM,Volume 1 1998. 6.R.K.Harris,NuclearMagneticResonanceSpectroscopy,Pitman, London, 1983. 7.A. Pines, M. G. Gibby, J. S. Waugh, J. Chem. Phys., 1972, 56, 1776. 8.A. Pines, M. G. Gibby, J. S. Waugh, Chem. Phys. Lett., 1972, 15,373. 9.E.F.Rybaczewisky,B.L.Neff,J.S.Waugh,andJ.S.Sherfinski,J. Chem. Phys. 1977, 67, 1231. 10. G. G. Webb and K. W. Zilm, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,1455. 11. N. K. Sethi, J. Magn. Reson. 1991, 95,352. 12. D.L.VanderHartandG.C.Campbell,PosterMP89,31stExperimental NMRConference, Asilomar, California, April 1990. 13. D. P. Burm and A. Bielecki, J. Magn. Reson. 1991, 95, 184. 14. M.TMelchior,Posterb-29,22ndExperimentalNMRConference, Asilomar, California, April 1981. 15. N. Zumbulyadis, J.Chem. Phys. 1987, 86, 1162. 16. X. Wu, s Zhang, and X. Wu, J. Magn. Reson. 1988, 77, 343. 17. X. Wu and K. W. Zilm, J. Magn. Reson. 1993, A102, 20. 18. W. T. Dixon, J. Magn. Reson. 1981, 44, 220. 19. W. T. Dixon, J. Chem. Phys. 1982, 77, 1800. 20. O.N.Antzutkin,Y.K.LeeandM.H.Levitt,J.Magn.Reson.1998, 135,144. 62 21. D.MarionandK.Wuthrich,Biochem.Biophys.Res.Commun.1983, 113, 967. 22. H. Kono, Biopol., 2004, 75,55. 23. K.Murataa,H.Konob,E.Katohc,S.Kurokia,I.Andoa,Polymer,2003, 44, 4021. 24. B.-J.VanRossum,H.Foster,andH.J.M.DeGroot,J.Magn.Reson. 1997, 124 516. 25. B.-J.vanRossum,C.P.deGroot,; V.Ladizhansky,S.Vega,H.J.M.de Groot, J. Am. Chem. Soc.,2000, 122, 3465. 63 3.1 Introduzione Il piracetam (2-oxo-1-pyrrolidineacetammide) un agente nootropico, ovvero unasostanzachefavorisceilmetabolismoelafunzionalitneuronale,edcomunementecommercializzatodalladittafarmaceuticaUCBPharmaconil nome Nootropil. Tale farmaco usato per trattare condizioni di declino mentale dovutoalletavanzata,nonchincasodialcolismoacutoecronicoassociatoa sintomididelirio[1].Essoagiscesullecellulenervosedeterminandoimportanti modificazionimetaboliche,soprattuttoalivellodell'acidoadenosintrifosforico (ATP),icuitassidiproduzioneediutilizzorisultanoconsiderevolmente aumentatiperazioneditalefarmaco.Questoaumentoportaadunmiglior metabolismocerebralenelsuocomplesso(sintesideifosfolipidi,delleproteine, ecc.)conconseguentemiglioramentodellecondizionicircolatorieedi ossigenazionelocali.Infigura1riportatalastrutturadellamolecoladi Piracetam. Fig. 1: Struttura del Piracetam Diquestocompostosonostatiindividuatiecaratterizzati,mediantediffrazionea raggiX[2,3],trepolimorfienominaticomeformaI,IIeIII.LeformeIeIII hanno una struttura monoclina, mentre la forma II triclina. Come si pu vedere lamolecolapossiedegruppiCOeNH2,diconseguenzahalapossibilitdi formare diversi motivi di legame a idrogeno a seconda del tipo di polimorfo. Tutti e tre le forme sono state studiate mediante analisi termochimiche e si visto che sono in relazione enantiotropica tra loro [4, 5, 6]. La gerarchia di stabilit la tra le varieformestatastudiatamettendoinrelazionelapressionedivaporedi sublimazionecontecnicheDSCesigiuntiallaconclusionecheatemperatura 64 ambiente lordine di stabilit II > III > I, mentre al di sopra di 399 K lordine di stabilit I > II > III [6]. Tuttavia, questi risultati sono in disaccordo con i metodi termomicroscopicieconlemisureDSC,inquantotalistudirivelanochea temperatura ambiente la forma III decisamente pi stabile della la forma II [5]. Il punto di fusione della forma I 426 K con un entalpia di fusione standard di 180 J/g. La fase II converte nella forma I a 399 K con unentalpia di transizione AHIII di24J/g,mentre lafaseIIIconvertenellaformaIa392KconunAHIIIIdi28 J/g[6].Utilizzandoparticolaritecnichedicristallizzazionepossibileinoltre ottenerealtredueformepolimorfichedelpiracetam.Inparticolare,lavorandoad altepressioni,siottienelaformaIVoformaadaltapressione(chenonverr discussainquestatesi),mentreatemperaturaambiente,possibilericavarela forma monoidrata (solvato) detta forma V. 3.2 POLIMORFI del PIRACETAM Qui di seguito verranno presentate le diverse forme del Piracetam in ordine di stabilit a temperatura ambiente e descritti i diversi network di legame idrogeno. 3.2.1 Forma III LaformaIIIdelpiracetamsipuottenerepercristallizzazionedauna soluzione diluita di metanolo effettuata a temperatura ambiente [7]. Fig. 2: Pattern di legame idrogeno presente nella forma III del Piracetam. 65 AnalizzandolestrutturearaggiX(figura2),siosservanoduetipidilegame idrogenointermolecolare:unocoinvolgelatomodiossigenoO(1)delcarbonile dellanelloelatomodiidrogenodelgruppoNH2O(1)HN(ON2.928A), mentreilsecondocoinvolgelatomodiossigenoO(2)delcarboniledelgruppo amidico e uno degli idrogeni del medesimo gruppo di una molecola spazialmente vicina, O(2) H---N (ON 2.894 A). Perquantoriguardainvecelaconformazionedellanellodelpirrolidone, presente una distorsione del ciclo, il quale risulta essere non planare, come si pu chiaramente vedere in figura. 3. Fig. 3: Distorsione dellanello del pirrolidone della molecola del Piracetam. 3.2.2 Forma II La forma II ottenuta mediante lenta evaporazione di una soluzione diluita di Piracetamdaunamisceladiisobutanolo-acqua95-5[7].Ilpatterndilegami idrogeno uguale a quello presente nella forma III, come si pu vedere in figura 4, ma cambiano le lunghezze del legame idrogeno. Fig. 4: Pattern di legame idrogeno presente nella forma II del Piracetam. 66 Limpaccamento risulta meno compatto con distanze tra gli atomi pesanti di 2.963 A per linterazione O(1) H-N e di 2.942 A per il legame O(2) H-N. Anche in questo caso lanello del pirrolidone, presenta una distorsione come nella forma III. 3.2.3 Forma I LaformaIdelPiracetamottenutascaldandoa410Kpertrentaminutila formaIIolaformaIIIesuccessivamenteraffreddatavelocemente(20K/s) mediante azoto liquido, tecnica comunemente chiamata quencing[8]. In questa forma l architettura dei legami idrogeno decisamente differente rispetto alle due forme precedentemente descritte, come evidenziato dalla figura 5. Fig. 5: Pattern di legame idrogeno presente nella forma I del Piracetam. InquestocasolalunghezzadilegametraO(1)H-Ndi2.945A,mentreper linterazioneO(2)H-Ndi2.971A.Nonostanteledifferenzeancheinquesto casolanellodelpirrolidone,presentaunadistorsionegiosservatanelledue forme sopra citate. 3.2.4 Forma Idrata (Forma V) IlPiracetamesiste,comedettoinprecedenza,ancheinformamonoidratao formaV.Solitamentetalefaselasiottieneeffettuandounacristallizzazioneda unasoluzioneacquosadiluita[7].Dallafasemonoidratapossibileottenerela formaIIpersemplicedeidratazionesottovuotoa293Kcompletatadaun riscaldamentoa333K.Comesipuosservareinfigura6,ilpatterndilegame idrogenodiquestaformadifferiscedalleprecedenti:infattilemolecoledacqua 67 sonoparteintegrantedellimpaccamentoinquantopartecipanoattivamenteai legami idrogeno. La struttura cristallina di tale fase caratterizzata da un network dilegameidrogenobidimensionalenonlineareripetutoinmanieratraslazionale, ed ogni piano connesso per mezzo di interazioni di Van der Walls. Fig. 6: Pattern di legame idrogeno presente nella forma IV (idrata) del Piracetam. Inquestaparticolareforma,ognimolecoladiPiracetampudarecinquelegami idrogenodifferenti,dovelatomodiossigenoO(2)agiscedadoppioaccettore. DuedeicinquelegamiidrogenoO(2)H-N(condistanzedi2.957e2.887), sonoresponsabilidellunicocontattodirettotralemolecoledipiracetam, formandounanellotraiduegruppiamidici,chedorigineadundimero centrosimmetrico, presente anche nelle forme III e II. Le rimanenti tre interazioni, O(w)-HO(2)(2.774),O(w)-HO(1)(2.735),O(w)H-N(2.957)(dove O(w)latomodiossigenodellacqua)sonocoinvolteincontatticonmolecole dacqua dando origine ad ulteriori due distinti anelli. Inquestocapitoloverrannodescrittiimetodidicristallizzazionedeitre polimorfi(I,II,III)edellaformaidrata,elalorocompletacaratterizzazione mediante l NMR allo stato solido. Infatti la caratterizzazione delle varie forme moltoimportanteinquantoinfunzionedelpolimorfopresoinconsiderazione possonocambiareleproprietdellamolecolaquali:fisiche,termodinamiche, spettroscopiche,cinetiche,chimicheedisuperficie.Inoltredalpuntodivista industriale la completa conoscenza della forma cristallina fondamentale, perch 68 lecaratteristichefinalidiundeterminatoprodottorispondanoabendeterminati standard. Inoltre verranno descritte le varie possibilit di interconversione tra una forma e laltra usando tecniche di macinazione e kneding. 3.3 Risultati e discussione TutteequattroledifferentiformedelPiracetamsonostatecristallizzatee caratterizzatemediantediversetecniche.Inparticolarelottenimentodellaforma desideratastatocontrollatoconfrontandolospettrodidiffrazionearaggiXdi polveri(XRPD)sperimentaleconquellocalcolato,comelesempioriportatoin figura7,emediantespettroscopiaFTIR.Inseguito,lacaratterizzazioneverae propria, stata effettuata tramite esperimenti NMR allo stato solido. 10 20 30 40 50Forma III calcolataForma III sperimentale2 Theta Fig. 7: Confronto tra la fase III calcolata (nero) e sperimentale(rossa) del piracetam 3.3.1 Ottenimento dei diversi polimorfi del Piracetam Comemostratoinfigura7,dalconfrontotralospettrodipolvericalcolato dellafaseIIIelospettrosperimentaledelprodottoSigma-Aldrich,sipotuto affermare che la fase commercializzata del Piracetam la fase III. La forma II si ottenutascaldandouncampionedifaseIIIa393Kpertrentaminutie raffreddandolavelocementeutilizzandoazotoliquido.Perquantoriguardala forma I del Piracetam, stata ottenuta portando un campione di forma III a 415 K per 35 minuti e raffreddandolo rapidamente mediante azoto liquido. Infine la fase 69 Idratasiottenutapermezzodiunacristallizzazionedaunasoluzioneacquosa diluitadiPiracetam.GlispettriXRDdipolveriottenutipertutteleformedel Piracetam, sono riportati in figura 8. 10 20 30 40 50 60 70FASE IIIFASE IdrataFASE IIFASE I2 Theta Fig 8: Spettri XRD di polveri delle diverse fasi del Piracetam. 3.3.2 Caratterizzazione Infrarossa (IR) Sono inoltre stati registrati gli spettri IR di tutte e tre le forme anidre(I, II, III) ediquellaIdrata(V)inmododapoterliconfrontareconquellitrovatiin letteraturaedavereunulterioreprovadiaverottenutolefasidesiderate.Gli spettri ottenuti sono riportati in figura 9. 3200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400Fase IFase IIFase IIICm-1Fase Idrata Fig. 9: Spettri IR delle diverse forme del Piracetam. Lesezionichemeritanoattenzioneperdistingureiquattrotipidipolimorfisono quelletra2900-3000cm-1incuicadonoglistretchingalifaticideigruppiCH, 70 quelletra1100-1250cm-1incuicadonoisegnaliassegnatiallevibrazioni dellanello del pirrolidone e quelle tra 600-700 cm-1 in cui sono presenti i bending fuori dal piano del C=O del gruppo amidico primario. Inoltre, sono interessanti le bandeassegnateaiCOchecadonotra1700e1600cm-1,chepresentanodegli shift differenti nelle quattro forme, dovuti alle diverse inteazioni legame idrogeno in cui sono coinvolti i gruppi carbonilici nei polimorfi [9, 10, 11]. 3.3.3 Caratterizzazione NMR allo Stato Solido Le analisi NMR allo stato solido (NMRSS), sia 13C che 15N, sono state fatte sututtiequattroipolimorfidelPiracetameglispettriottenutisonoriportatiin figura 10, mentre i chemical shifts con le rispettive assegnazioni sono riassunti in tabella 1. Come si pu chiaramente vedere, per quanto riguarda gli spettri 13C, si possonodistinguereintuttiequattroglispettriduegruppidisegnali,abasse frequenzeattribuibiliaidiversiCH2eadaltefrequenzeattribuibiliaidue carbonili.ItreCH2dellanello,C(2),C(3)eC(4)risuonanorispettivamente intornoa31,18e44ppmmentreilCH2dellacatena(C5)dorigineadun segnalecompresotra48-49ppm.IlpiccoassegnatoalC(1)cadeinunrange compresotra176-179ppmasecondadeltipodiinterazioneincuicoinvolto. Mentre fra 171 e 173 ppm c il segnale attribuito al carbonio amidico. Fig. 10: Spettri NMR CPMAS registrati ad una rotazione di 12KHz delle quattro forme del Piracetam. 71 Fig. 11: Spettro NMR CPMAS registrato ad una rotazione di 12 KHz: in gradimento della zona dei carbonili. Tab 1: Assegnazioni NMR 13C e 15N delle quattro forme del Piracetam. Daidatisoprariportati,sipuvederecheglispettripresentanodelledifferenze utiliadistinguereivaripolimorfi.Ancheseinalcunicasisonominime,esse risultano comunque significative. Si pu, inoltre, osservare che gli shift maggiori tra le diverse forme sono mostrati dai segnali dei carbonili (figura 10 e 11): questo abbastanza ragionevole visto che essendo entrambi coinvolti in legami idrogeno risentono maggiormente della variazione di forza o di network dellinterazioni fra le varie forme.InparticolarenellaformaIII,nellazonadeicarbonili,sonopresentidue segnali, uno a 179.0 ppm e laltro a 171.9 ppm per gli atomi C(1) e C(6) coinvolti Forma IForma IIForma IIIForma IV CO (C1)176.2177.7179.0178.2 CO (C6)172.1171.8171.9172.4 CH2(C5)48.948.148.048.5 CH2(C4)44.644.444.345.0 CH2(C2)30.431.430.732.0 CH2(C3) 18.217.417.518.0 N (1)94.694.496.294.8 N (2)80.081.082.281.3 72 inlegamiidrogenoconilgruppoNH2diunamolecoladiPiracetamadiacente (distanzeO-N2.945e2.971).NellaformaIIquestisegnalisonospostatia 177.7 ppm (C1) e a 171.8 ppm il (C6) in virt del fatto che il tipo di interazione in cui sono coinvolti la stessa ma le distanze NO sono differenti (2.963 e 2.942 ).PerlatomoC1siosserva,quindi,unospostamentoadaltefrequenzein funzione della diminuzione della distanza tra gli atomi pesanti come gi osservato inletteraturaperaltritipidimolecole[12].Perquantoriguardailcarboniodel gruppoamidicoprimarioC(6),linterpretazionedelloshiftpicomplessain quantoquestultimoinfluenzatoanchedallapresenzaedallaforzadilegami idrogenosulgruppoNH2 direttamentelegatoadesso.PoichsianellaformaII che nella III le distanze di questi legami sono molto similili (2.963 e 2.942 per la forma II e 2.971 e 2.945 per la forma III) si giustifica il piccolo e differente shiftpassandodallaformaIIIallaformaII.PerquantoriguardalaformaIil legameaidrogenoO(2)HNdecisamentepicorto(2.894)chenonnelle altre forme, ma tuttavia il segnale del C(6) non particolarmente spostato ad alte frequenze(172.1ppm).Questodovutoprobabilmenteaduneffetto compensativodovutoallaminoredistanzaONdeilegamiaidrogeno sullammina(2.928e2.894).Lospostamentomaggiore,nellaformaI,si osserva per il picco del C1 che cade a 176.2 ppm. O(1)HNH2O(2)HNH2Chemical-shift 13C (C1 C6) Forma I2.928 A2.894 A176.2 ppm172.1 ppm Forma II2.963 A2.942 A177.7 ppm171.8 ppm Forma III2.945 A2.971 A179.0 ppm171.9 ppm Forma IV2.735 2.957 178.3 ppm173.2 ppm Tab. 2: Distanza legame idrogeno tra CO e gruppo NH2 con relativi chemical shift 13C dei gruppi carbonilici. Come detto in precedenza i segnali relativi ai gruppi CH2 non variano di molto e le loro assegnazioni possono essere viste in tabella 1. Lunica variazione riguarda ilC(2)chenellaformaIeIIIrisuonaacirca30ppmmentrenellaIenellaV risuonaacirca32ppm.Questopuessereattribuitoalladifferenteinfluenza dellimpaccamento cristallino nelle varie fasi. 73 Dallanalisi di questi dati si pu affermare che le differenze in chemical shift sono principalmentedovuteaduemotivi:a)alnetworkeddallaforzadeilegamia idrogeno;b)allarrangiamentocristallino.Ilprimoriguardaprincipalmentei gruppidirettamentecoinvoltinelleinterazionimentreilsecondohauninfluenza minore,maagiscesututtalamolecola.Eimportantenotareche,benchle variazioni della distanza del legame idrogeno, che coinvolge i due carbonili delle differenti forme anidre siano minime, cos non dal punto di vista NMR dove la presenza di shift nei segnali assegnati a i gruppi CO sono abbastanza distinguibili ecipermettonounanalisiapprofonditadeldiversonetworkdilegameidrogeno traunaformaelaltra.Questodimostraulteriormentecheilchemicalshift decisamente influenzato dalla presenza o meno di un legame idrogeno sullatomo in osservazione, sebbene il 13 C non sia direttamente coinvolto in tali interazioni. Undiscorsoaparteriguardalaformaidrata,inquantolarchitetturadelle interazioneincludemolecoledacqua.Icarbonilicadonoa178.2ppme172.4 ppmrispettivamenteassegnatialC(1)eC(6).Bisognatenerepresentecheil carbonileC(1)formaunlegameidrogenoconmolecoledacqua,mentreilC(2) formaduelegamiidrogenounoconunamolecoladiacqua edunocon ilgruppo NH2. Come si pu notare i segnali in questa forma sono decisamente pi spostati rispettoaquelleanidreequestopuesseresicuramenteattribuitoallapresenza dellemolecoledacquaallinternodelreticolocristallino,masoprattuttoal diverso pattern di legami idrogeno presente in questo polimorfo. Per quanto riguarda gli spettri 15N, riportati in figura 12, in tutte e quattro le formesipossonoidentificareduedifferentisegnaliattribuitiallazoto appartenenteallanelloN(1)cherisuonanotra94-96ppmequellodelgruppo amidicoN(2)cherisuonanoinunrangetra80-82ppm.Percicheconcernela formaIIIlN(1)cadea94.6ppm,mentrelN(2)cadea80ppm;perlaformaII N(1) cade a 94.4 ppm e N(2) a 81.0 ppm e nella forma I lN(1) cade a 96.2 ppm mentrelN(2)a82.2ppm.Bisognafarpresentechelazotodelgruppoamidico porta idrogeni che sono direttamente coinvolti in legame idrogeno con i carbonili e in particolare, se si analizzano le distanze di queste interazioni, si pu notare che passandoprogressivamentedallaformaIallaIIIledistanzeaumentano,con conseguentespostamentoversoaltefrequenzedeirelativisegnaliNMR.Per 74 quantoriguardalN(1),essononlegatoaprotonicoinvoltiinlegamiidrogeno, comenelcasoprecedente,madirettamentelegatoaduncarbonile(ilC(2)),il quale viene coinvolto mediante latomo di ossigeno O(1) in legami idrogeno. Se si osservanoledistanzedeilegamiidrogenodiquestultimonelletreformeanidre, sivedecheaumentapassandodallaformaIallaIII.Diconseguenza,anchein questocaso,allaumentaredelladistanzadellegameidrogenochecoinvolgeil carbonile adiacente allN(1), i chemical shift di questultimo si spostano verso alte frequenze.Perquantoriguardalaformaidrata,lN(2)cadea81.3ppmed coinvoltoinlegamiidrogenoconmolecoledacquaeconlO(2)carbonilicodi unaltra molecola, mentre lN(1) cade a 94.8 ppm. Fig 12 : Spettri CPMAS 15N registrati ad una velocit di rotazione di 8 KHz, per le diverse forme del Piracetam. 4.1Conversioni meccano-chimiche Limportanza della stabilit di una forma di un farmaco durante il processo di produzionegistatasottolineatanellintroduzioneallatesi.Leindustrieoltrea conoscereesattamentelanaturadeimaterialiottenutiduranteilprocesso produttivo,devonovenireaconoscenzadellastabilitdeiprodottineltempoed 75 apprenderelediverseproprietchimico-fisiche,causatedalledifferentiforme cristalline.Perquestoimportantemonitoraretuttoilcicloproduttivodiun determinato prodotto fino allo stoccaggio e alla sua introduzione in commercio.Aquestoscopopuessereutileunostudiodicomelevarieforme,diun determinato composto, sono in grado di reagire quando sottoposte a forze esterne chenepossonosimulareilcicloproduttivo,peresempionelcasodielevate pressioniperottenerneunaformacommercialeinpastigliapiuttostoche particolariforzeacuisonosottopostiiprodottiduratelostoccaggio.In particolare,persimularetaliforzesipossonosottoporrelevarieforme,a macinazioneevalutarecomeessereagiscono.Lamacinazionepuessere effettuata con mortaio e pestello o nel caso si voglia una macinazione decisamente pienergeticasifausodelmulinoapalle.Erisaputochelenergiafornitada tecnichedimacinazionepuindurreatrasformazioniallostatosolidoche possono portare da fasi cristalline a fasi amorfe [13] o viceversa [14], nonch alla conversionetradiversipolimorfi.Lametodologiachepresentiamoancheuna possibilitperottenerespecifichetrasformazionipolimorfiche,edinteressante sia dal punto di vista del high-throughput, monitoraggio di polimorfi, sia come unastradaalternativaperottenerelediverseformediuncompostoevitandodi ricorrereatecnichedicristallizzazione,aprendoprospettivenellambitodella chimicaverdeosostenibile(greenchemistry).La"GreenChemistry" rappresentaunnuovomododiconcepirelachimicaperrenderlaecosostenibile. Infatti conletecniche meccano-chimichevengonosuperatituttiiproblemilegati al recupero, lo smaltimento e lo stoccaggio dei solventi. La macinazione pu essere effettuata a secco oppure utilizzando alcune gocce disolventeinquantitcatalitica,tecnicadenominataKneading,ingradodi attivarelaconversione.Infattirecentementesivistoche,conquestultima tecnica,siaumentalacineticadellecocristallizzazioni[15]esiriescead indirizzare la cristallizzazione di un composto verso uno specifico polimorfo [16]. Qui di seguito, in tabella 3, sono riportati i risultati di tutte le prove di conversione meccanochimiche,aseccoecontecnichedikneading,sullequattroformedel piracetam. 76 FASECONVERSIONE FASE I + EtOHFASE II FASE I + CH3OHParzialmente FASE II FASE I + H2OFASE idrata FASE II a secco (2 h.)FASE III FASE II + H2OFASE idrata FASE II macinata 20 minutiParzialmente FASE III FASE III macinata a manoFASE III FASE III + EtOHFASE III FASE III + IsobutanoloFASE III FASE III + Acetone (18 h.)FASE III FASE III macinata a mano in CH2Cl2FASE III FASE III + H2OFASE Idrata FASE Idrata (da fase I) FASE III FASE Idrata (da fase II) FASE III Tab. 3 : Conversioni meccanochimiche tra fasi differenti del Piracetam per mezzo di tecniche di macinazione. Comesipunotare,dopoavereffettuatolemacinazioniriportateintabella3,la maggiorparteeseguitecontecnichediKneadingsisonoverificatediverse transizionidifase.InparticolarelaformaIcongoccediEtOHingradodi convertire in forma II, mentre con gocce di MeOH la conversione non completa neanchedopolunghemacinazioni.UsandogoccediH2Oinvecepossibile ottenerelaformaIdrata.LaformaIIingradoditrasformarsiinformaIIIper semplice macinazione di circa 2 ore al mulino a palle e non necessita la presenza diparticolarisolventi,masequestultimaeffettuataperuntemporidotto(20 min.),laconversionenontotalecomesipubenosservareinfigura13,dove sonoriportatiglispettriXRPDdimonitoraggiodelciclodimacinazione.Per quanto riguarda la forma III, n la macinazione con gocce di solvente a differente polaritnetantomenolasemplicemacinazioneingradodifarlaconvertirein una delle altre fasi, tranne effettuando la macinazione con gocce di acqua che in gradodifaravvenirelatransizionedafaseIIIallafaseIdrata.Questultima ottenutamacinandolafaseIIIeIIIcongoccediacquaeperulteriore macinazione di essa si ottiene in tutti e tre i casi la fase III. 77 Fig. 13 : Monitoraggi per via XRD di polveri della conversione della fase II a fase tre; a) Fase II; b) Fase II macinata per 20 min; c)Fase II macinata due ore; d) fase III calcolata. Facendoriferimentoallordinedistabilittermodinamica,atemperatura ambiente,riportatonellintroduzionediquestocapitolo:III>II>I,sipossono giustificare i risultati ottenuti nella seguente maniera. Essendo la forma III la fase termodinamicamentepistabile,nonriesceadessereconvertitainaltreforme trannechenellaformaidratausandoalcunegoccediacquadurantela macinazione. Per quanto riguarda le altre fasi tutte le conversioni seguono lordine di stabilit termodinamiche ovvero convertono sempre verso la forma pi stabile, infattilaformaIsitrasformanellaformaIIoltreaquellaidrataelaformaIIin forma III oltre quella idrata. Tutte le possibili conversioni meccano sono riportate nello schema riportato in figura 14. Fig 14: Schema riassuntivo delle conversioni meccanochimiche possibili: 1)Kneading con gocce di acqua; 2)Macinazione per 2 h al mulino a palle; 3)Kneding con gocce di CH3OH.; 4)393 K per 30 min. ,5)ulterirore macinazione della fase idrata ottenuta dalla fase III; 6) 415 K per 35 min 78 Dallanalisi degli spettri NMR allo stato solido si pu stabilire che, in funzione del tipo di polimorfo preso in esame, ci sono dei caratteristici spostamenti dei segnali, sia 13Cche 15Ndipendentidaldiversonetworkdilegameidrogenoincuisono coinvoltelemolecoledellequattroforme.Effettuandoprovemeccano-chimiche, sivistochesonopossibilitransizionidifase,mainognicasolaformapi stabile(formaIII)nonriesceaconvertireinnessunadelleformeanidre,ma solamentenellaformaidratainseguitoadunciclodimacinazioneusando tecniche di kneading con gocce dacqua. Sono invece possibili transizioni di fase: III,IIIIeIIIII.Tutteleformeanidrepermacinazionicongoccediacqua convertono nella fase idrata e questultima per macinazione a secco converte nella forma III. 5.1Parte Sperimentale IlpiracetamstatoacquistatodallaSigma-Aldricheusatosenzaulteriori purificazioni. Tramite spettro di polveri del reagente da barattolo si accertata la presenza della forma III. PerquantoriguardalaDifrazioneaRaggiXdiPolveristatoutilizzatoun difrattometrodipolveriBragg-BrentanoconunasorgentearaggiXgeneratada un anticatodo di Cobalto (Co) (ku=0.17902 nm) con una tensione dello strumento tarata a 40 kV e una la corrente di 20 mA. Per le analisi di spettroscopia infrarossa si utilizzato uno spettrofotometro a trasformatadiFourierNicolet5700(ThermoElectronCorporation)tramite Attenuated Total Reflection (ATR). PerleanalisiNMRsiusatounostrumentoBrukerAdvanceII400MHz Ultra-shieldequipaggiatoconunprobeda4mmoperantea400.23MHzper 1H, 100.63MHzperil 13Ce40.56MHzper 15N.Unesperimentostandarddicross-polarizzationconrampaduranteilcontacttimeperottimizzarelecondizionidi Hartmann-Hahnadaltevelocitdirotazionedelrotorestatoutilizzatoper acquisireglispettri.Generalmentecontacttimedi3.5ms(13C)e5.0ms(15N) sonostatiusaticontempidiripetizioneda5-60sperunnumerodiscansionidi 32-64 per gli spettri 13C e 3000-4000 per gli spettri 15N. Tutti i campioni sono stati impaccati in rotori di zirconia del diametro di 4 mm con un volume di circa 80 l 79 efattiruotareadunavelocitdi12kHz.Ilriferimentoperlascaladeichemical shiftdel 13Cstatofattoposizionandoilsegnalemetilenicodellaglicina(usato come standard esterno) a 43.86 ppm mentre per la scala del 15N stata utilizzata la risonanza del (NH4)2SO4 (355.8 ppm rispetto alCH3NO2). 80 Bibliografia capitolo 3 1.P.Francesca,A.Gabbiani,R.David,S.Parsone,R.Colin, CrystEngComm, 2005, 7(29), 179. 2.G.Admiraal,J.C.Eikelenboom,A.Vos,ActaCrystallogr.Sect.B,1982, 38, 2600. 3.D.Lour,M.Lour,V.A.Dzyabchenko,V.Agafonov,R.Celin,Acta Crystallogr. Sect. B, 1995, 51, 182. 4.S. Toscani, Thermochim. Acta, 1998, 321, 73. 5.M.Khnert-Brndstter,A.Brger,R.Vollenkee,Sci.Pharm.,1994,62, 307. 6.R.Colin,V.Agafonov,D.Lour,V.A.Dzyabchenko,S.ToscaniandJ. M. Cense, J. Solid State Chem., 1996, 122, 186. 7.L. Merrill and W. A. Bassett, Rev. Sci. Instrum., 1974, 45, 290. 8.D. Lour, M. Lour, V. A. Dzyabchenko, V. agafonov, Acta Cryst., 1995, B51, 182. 9.A. V. Pavlova , Pharmazie, 1979, 34, 449. 10. A.V.Pavlova,K.Konstantinova,H.Daskalov,A.Georgiev,Pharmazie, 1979, 38, 634. 11. M.KuhnertBrandsttter,A.Burger,R.Vollenklee,Sci.Pharm.,1994, 62, 307. 12. T. Kameda, I. Ando, J. Mol. Struct. 1997, 412,197 13. K. J. Crowley, G. Zografi, J. Pharm. Sci., 2002, 91, 492. 14. M. R. Caira, Y. Robbertse, J. J. Bergh, M. N. Song, M. M. De Villiers, J. Pharm. Sci., 2003, 92, 2519. 15. N. Shan, F. Toda, W. Jones, Chem. Commun., 2002 ,2372. 16. A. V. Trask, W. D. S. Motherwell, W. Jones, Chem. Commun., 2004, 890. 81 4.1 Introduzione Ladidanosinaunnucleosideanologoalladenosina,cheprevienela replicazionedelvirusHIV(humanimmunodeficiencyVirus)inibidendonela trascrizione inversa. Fa parte di una combinazione di farmaci usati in terapie che hannounaltaattivitantiretrovirale.Essasomministrataindosilimitatee specialmente in pazienti ziduvodine-resistenti [1, 2, 3]. Ditalefarmacononsiconoscelesistenzadiformepolimorfichederivateda cristallizzazioni di soluzioni in diversi solventi. Quindi si usata la tecnica della cristallizzazione in CO2 supercritica per valutare se con questa nuova metodologia siapossibileottenernedinuove.Inquestocapitoloverrannopresein considerazionelevarieformedellaDidanosinaottenutepercristallizzazionein CO2supercriticaadiversepressioni,inoltreverrannocaratterizzatemediante tecniche NMR allo stato solido. In figura 1 riportata la formula di struttura della Didnosina. FIG. 1: Struttura della Didanosina 4.2 Ottenimento dei Campioni:Precipitazione di particelle di didanosina inCO2 supercritica mediante il processo Supercritical AntiSolvent (SAS). PerlaprecipitazionediparticelledididanosinamedianteSASstato utilizzato lo strumento schematizzato in Figura 1: 82 Fig. 1. Schema dello strumento usato per analisi SAS. 1 contenitore di CO2; 2 pompa a membrana; 3 criostato; 4 valvola di entrata; 5 valvola a tre vie; 6 colonna; 7 linea di lavaggio; 8 camera termostatata; 9 termostato; 10 valvola di uscita; 11 vessel di raccolta del solvente; 12 soluzione di didanosina; 13 pompa HPLC; 14 metanolo; 15 pompa HPLC. LaCO2 (grado99,9%,Sapio,Piacenza)contenutainunabombolainforma liquidaaunapressionedicirca50bar.Permezzodiunapompaamembrana Speed SFE viene pompata allinterno di una cella di precipitazione posizionata in unacameratermostatata.Uncriostatopermettedimantenerelatestatadella pompa alla temperatura di 3,2C, al fine di mantenere liquida la CO2 pompata ed evitarefenomenidicavitazione.Lacelladiprecipitazionecostituitadauna colonnadi200mmdilunghezzae14mmdidiametroconunvolumedi32cm3, svuotataeposizionatainsensoverticaleconallinternounfiltroinvetro sinterizzatosulluscitainferiore.Incimaallacolonna,ovverosullentrata superiore, inserita una valvola a tre vie che permette un pre-mescolamento della CO2 supercritica con una soluzione di didanosina in dimetilsolfossido (100mg/ml) prima dellentrata in colonna; tale soluzione pompata da una pompa per HPLC PharmaciaLKB-2248adunflussodi0.01ml/min.Ilcircuitosicompletaconun manometroperilcontrollodellapressioneinuscita,unavalvoladiespansione micrometrica, un vessel di raccolta del solvente condensato, un flussimetro a sfera 83 (Air Products) posto a valle del vessel e un contatore per il gas posto alluscita del flussimetro.Lavalvoladiespansionemicrometricamantenutaauna temperaturadi85Cinmododaevitarecheessasiblocchiacausadella precipitazionedieventualesolutodiscioltoinCO2supercriticaprovenientedalla colonna.LavalvolapermettediregolaremanualmenteilflussodiuscitadiCO2 chevienemantenutosucirca0.03molidiCO2alminuto.Lesecuzionediun tipicoesperimentoprevedelottenimentodellatemperaturadesideratasianella camera termostatata che nella valvola di espansione micrometrica. In seguito si fa fluirelaCO2supercriticaallinternodellacolonnafacendoequilibrareilsistema perqualcheminuto,dopodichlapressionevieneportataalvaloredesiderato.A questo punto si apre la valvola di espansione micrometrica in uscita e si aziona la pompaperHPLCchemandalasoluzionedididanosinainDMSOallavalvolaa tre vie. Il vessel di raccolta in uscita refrigerato con un bagno di ghiaccio-NaCl alfinediprovocarelacondensazionedelDMSOinuscita.Lecondizioni operative adottate prevedono una temperatura della camera termostatata di 45C, di85Cperlavalvoladiespansionemicrometricaepressionidi100,150,200 bar. Un lavaggio finale per circa 2 ore a un flusso di 150 ml/min con sola CO2 supercritica delle particelle precipitate assicura la rimozione di tutto il solvente e previene la condensazione durante la depressurizzazione. 4.3 Caratterizzazione NMR alo Stato Solido Tuttiequattroicampionidididanosinasonostatiregistratiglispettri 13C CPMASeCPPISPIperladeterminazionedellamolteplicitdegliatomidi carbonioeglispettri 15NCPMAS.Lanumerazionedegliatomiseguequella presentata in figura 1. Lo spettro 13C CPMAS mostrato in figura 2, mentre tutti i chemical shift con le assegnazioni sono riportati in tabella 1. 84 FIG. 1: Spettri 13C CPMAS dei diversi composti ottenuti in CO2 supercritica. Per quanto riguarda la didanosina tal quale, (TQ), quasi tutti gli atomi di carbonio presentinellamolecoladannoorigineaduepicchi.Questoindicalapresenzadi duemolecoleindipendentinellunitdicellaasimmetrica.Pidifficilmentepu esserecausatodaunequilibriocheto-enolicoinquantoquestoinfluenzerebbe principalmenteisegnalidegliatomidicarbonioC6,C2,C4eC5lasciando praticamenteinvariatiglialtri,cosa,per,nonriscontrata.Inoltreisegnalisono moltostretti(circa70-80Hz)indicediunaltacristallinitdelcampione. Lassegnazione dei segnali stata fatta combinando le informazioni del chemical shiftconilsegnodeisegnaliosservatinellesperimentodispectralediting riportato in figura 3 (atomi di carbonio quaternari e metili positivi, CH nulli e CH2 negativi). Il segnale del C=O, C6, cade a circa 156.9 ppm. Gli atomi di carbonio quaternarideglianellicondensatidannooriginerispettivamenteaduesegnalia 147.8 e 145.5 ppm per il C4 e a due segnali a 123.8 e a 122.0 ppm per il C5. Gli atomidicarbonioC2eC8legatiadueatomidiazotodannoorigine rispettivamenteaunarisonanzadiintensitdoppiaa149.3ppm(C2)eadue risonanzea138.5e136.0ppm(C8).GliatomiC1eC4risuonano rispettivamente a 85.3 e a 84.7 entrambi di intensit doppia, mentre i C2 ed i C3 generanociascunoduesegnali,a33.9e30.9ppm(C2)ea26.5e23.7ppm (C3). Infine il C5 d un solo picco di doppia intensit a 61.7 ppm. 85 FIG. 2: Spettri 13C Spectral editino del campine tal quale di didanosina.I segnali asteriscati corrispondono ai gruppi CH. Lo spettro 15N CPMAS(figura 3) caratterizzato da 7 segnali per quattro tipi di azoto presenti nella molecola. Fra 145 e 165 ppm cadono gli atomi di azoto N(1) e N(9),acirca183ppmcisonoisegnalidelatomoN(3),mentrelazotoN(7)d origine ad un solo segnale a circa 211 ppm. FIG. 3: Spettri 15N CPMAS dei diversi composti ottenuti in CO2 supercritica. 86 Glispettrideicompostiottenutia100,150e200barsonoperfettamente sovrapponibili quindi per comodit verr discritto solamente quello ottenuto a 200 bar. Lo spettro 13C CPMAS molto simile a quello della didanosina TQ. Tuttavia alcunepiccolemanettedifferenzeconfermanolacristallizzazioneinunaforma diversadaquellaconosciuta.Lentitdelledisuguaglianzefapensarealla possibilitdiaverottenutounpolimorfoconformazionaleincuivarialangolo diedroC(4)-N(9)-C(1)-Ociosihaunaleggerarotazioneattornoallasse formatodallegameN(9)-C(1).Laprincipaledifferenzariguardaisegnalidegli atomi C(3): infatti in questo composto danno origine a due segnali a 25.6 e a 24.4 ppm molto meno separati rispetto al composto TQ. Le altre differenze riguardano le risonanze del C(8) che sono shiftate a frequenze minori di circa 1.2 e 0.7 ppm, ilsegnaledelC(1)cheinquestocasosisdoppiadandoorigineaduepicchia 85.0(sovrappostoalsegnaledelC(4))eda83.9ppmed,infine,allarisonanza delC(2)cheshiftaleggermenteafrequenzeminoriandandoasovrapporsial segnaledelC(4)(148.3ppm).Glialtrisegnalispettrononpresentanodifferenze rispetto al composto TQ, valgono quindi i commenti gi fatti precedentemente. Nel caso degli spettri 15N tutti i picchi presentano degli shift di circa 0.2-0.5 ppmrispettoaltalquale.Ledifferenzepisignificativeriguardanolatomodi azotoN(1)ilcuisegnalea152.8shiftaa153.6esiallarga(da48a57Hz)e latomoN(7)ilcuisegnalesiassottiglia(da100a40Hz).Inentrambiicasila causa della variazione della larghezza del segnale pu essere un diverso tipo o una diversa forza delle interazioni deboli che li coinvolgono. AtomonoteTQ100150200 C(6) C(2) C(4) C(8) C(5) C(4) C(1) C(5) C=O (H)NC(H)N C(q) (R)NC(H)N C(q) CH CH2OH CH2 156.9 155.4 149.3 (2) 147.8 145.5 138.5 136.0 123.8 122.0 85.3 (2) 84.7 (2) 61.7 (2) 33.9 156.6 155.2 148.3 (2) 148.3 145.5 137.3 135.3 123.7 121.9 85.0 (3) 83.9 61.7 (2) 33.2 156.6 155.2 148.3 (2) 148.3 145.5 137.3 135.3 123.7 121.9 85.0 (3) 83.9 61.7 (2) 33.2 156.6 155.2 148.3 (2) 148.3 145.5 137.3 135.3 123.7 121.9 85.0 (3) 83.9 61.7 (2) 33.2 87 C(2) C(3) CH2 30.9 26.5 23.7 30.2 25.6 24.4 30.2 25.6 24.4 30.2 25.6 24.4 N(1) N(1) N(3) N(3) N(7) N(9) N(9) NH NH N(q) N(q) N(q) N(q) N(q) 152.8 146.3 186.7 178.9 211.3 (2) 159.5 156.6 153.6 146.0 186.9 179.5 211.1 (2) 159.7 156.4 153.6 146.0 186.9 179.5 211.1 (2) 159.7 156.4 153.6 146.0 186.9 179.5 211.1 (2) 159.7 156.4 Tab 1: Assegnazioni 13C e 15N dei composti tal quale (TQ), cristallizzato a 100 bar(100), cristallizzato a 150 bar (150) e cristallizzato a 200 bar (200). I valori tra parentesi sono relativi ai valori degli integrali. Dallanalisideirisultatiottenutisipotutoaccertarechepermezzodi tecnichedicristallizzazioneinCO2supercriticapossibileottenereunanuova formadellaDidanosina.Moltoprobabilmentesitrattadiunnuovopolimorfo conformazionaledovutoallavariazionedellangolodiedroC(4)-N(9)-C(1)-O, ovverounaleggerarotazioneattornoallasseformatodallegameN(9)-C1. Questo provoca una variazione dellintorno chimico di alcuni atomi che giustifica lospostamentodeilorosegnaliversoalteobassefrequenze.Avertrovatouna nuovaformadellaDidanosina potrebbeavere ripercussioniimportantiincampo farmaceutico soprattutto se questa nuova forma risultasse avere propriet migliori di quella attualmente usata in terapia. 4.4 Parte sperimentale IcampionisonostatifornitidalgruppodiricercadelProf.Bettini, Dipartimento di Farmacia, Universit di Parma. 88 Bibliografia capitolo 4 1.L.S.Velasque,R.C.E.Estrela,G.Suarez-Kurtz,C.J.Struchiner,BrazJ Med Biol Res, 2007, 1, 40. 2.R.Ferraresia,L.Troianoa,E.Roata,E.Nemesi,E.Luglia,M.Nasia,M. Pinta, M. Calvanib, M. Iannuccellib, A. Cossarizzaa, FEBS Letters, 2006, 580, 6612. 89 5.1 Introduzione L'acidobarbituricounderivatodellapirimidina,siottieneperreazione dell'ureaconl'acidomalonicoedilcapostipitedellaclassedifarmaci denominati barbiturici. A temperatura ambiente si presenta come un solido bianco ed inodore. In passato alcuni suoi derivati erano usati nella pratica clinica in modo massiccio:ilveronal(acidodietilbarbiturico)comesedativoeilpentothal(acido metilpentilbarbiturico)comefarmacoipnot