phuong phap xac dinh doc to.doc

Phương pháp sinh học định tính và định lượng các thành phần độc hại trong thực phẩm

GVHD: TS Trần Bích Lam

M C L CỤ ỤMỤC LỤC...............................................................................................................................1

MỞ ĐẦU.................................................................................................................................3

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU.......................................................................................................5

1.1. Độc tố thực phẩm..........................................................................................................5

1.2. Phân loại độc tố.............................................................................................................5

1.2.1. Phân loại theo nguồn gốc chất độc:........................................................................5

1.2.2.Phân loại theo bản chất lý hoá của chất độc:...........................................................5

1.2.3. Phân loại theo phương pháp phân tích chất độc: theo Stas-Otto............................5

1.2.4. Phân loại theo tác động của chất độc trên các hệ cơ quan của cơ thể:....................6

1.2.5.Phân loại theo tác dụng đặc biệt của chất độc:........................................................6

1.2.6. Phân loại theo nguồn gây độc:................................................................................7

1.3. Một số loại độc tố thường gặp trong thực phẩm...........................................................8

1.3.1. Độc tố PHA và HCA...............................................................................................8

1.3.2. Độc tố aflatoxin trong thực phẩm nhiễm mốc........................................................8

1.3.4. Nước tương và 3-MCPD và 1,3 – DCP..................................................................9

1.3.4. Acrylamid trong chiên, xào, nướng......................................................................11

1.3.5. Formal, borat.........................................................................................................11

1.3.6. Melamine trong thực phẩm...................................................................................11

1.3.7. Sudan.....................................................................................................................12

1.3.8. Ure.........................................................................................................................12

1.3.9. Rau quả nhiễm thuốc bảo vệ thực vật, kim loại nặng...........................................12

1.3.10. Hóa chất bảo quản trái cây..................................................................................12

1.3.11. Hóa chất gốc clo, thuốc diệt cỏ...........................................................................13

HVTH: Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang 1



1.3.12. Muối diêm...........................................................................................................13

1.3.13. BHA và BHT......................................................................................................13

1.3.14. Propyl gallate......................................................................................................13

1.3.15. Chất béo thể đồng phân.......................................................................................14

1.3.16. BPA (Bisphenol A).............................................................................................14

1.3.17. Aspartame...........................................................................................................14

CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỊNH TÍNH CÁC ĐỘC CHẤT TRONG

THỰC PHẨM........................................................................................................................16

2.1. Phân tích độc tố dioxins bằng phương pháp sinh học DR-CALUX...........................16

2.1.1. Giới thiệu về phương pháp...................................................................................16

2.2. Sử dụng phương pháp phân tích sinh học trên những nhóm hợp chất khác...............19

2.2.1. Phân tích estrogen.................................................................................................19

2.2.2. Phân tích chất kìm hãm enzyme Acetyl-choline esterase.....................................20

2.2.3 Phân tích độc tố trong động vật 2 mảnh vỏ...........................................................20

2.3. Phương pháp kiểm tra nhanh Chloramphenicol..........................................................21

CHƯƠNG 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỘC CHẤT

TRONG THỰC PHẨM.........................................................................................................22

3.1. Định lượng Dioxin bằng phương pháp ELISA...........................................................22

3.1.1. Phương Pháp ELISA.............................................................................................25

3.1.2. Chuẩn bị mẫu........................................................................................................26

3.1.3. Thiết kế kháng nguyên..........................................................................................27

3.1.4.Phát triển kháng thể...............................................................................................27

3.1.5.Phương pháp Ah-I..................................................................................................28

3.3.1.6.Kết luận...............................................................................................................29

3.2. Các phương pháp sinh học hiện đại xác định độc tô Butulinum (PCR - ELISA) 30







MỞ ĐẦU

Từ thời xa xưa, con người đã biết dựa vào những sinh vật sống để đánh giá độ an toàn

của môi trường sống cũng như của thực phẩm. Vào thời trung cổ, những người thử độc đã

được bố trí để đảm bảo thực phẩm không có chất độc. Những công nhân hầm mỏ cũng đã

biết sử dụng những chú chim để kiểm tra xem có chất khí độc hại bên trong hầm mỏ hay

không.

Cùng với sự hiểu biết ngày càng nhiều hơn về những chất độc, sự phát triển của các

phân tích hóa học cùng với mục đích giảm thiểu việc thử nghiệm trên động vật sống, ngày

nay chúng ta đang sử dụng rất nhiều các phương pháp hóa học để phân tích sự hiện diện của

các độc chất thông qua các thuộc tính hóa lý của chúng. Tuy nhiên, ngày nay, các thí

nghiệm sử dụng sinh vật sống là chuột vẫn là phương pháp đáng tin cậy nhất cho việc phát

hiện các độc tố thận và bại liệt có trong các loài động vật hai mảnh vỏ, và độc tố thần kinh

từ vi khuẩn clostridium botulinum. Những phân tích trên cá dùng trong đánh giá chất lượng

nước uống.

Tuy nhiên, dẫu cho sự phát triển nhanh của các phương pháp phân tích hóa học là như

vậy nhưng chúng ta cũng phải thừa nhận rằng những phương pháp này đã không hiệu quả

trong việc phân tích những hợp chất hóa học phức tạp hay sự thay đổi cấu trúc của các chất

độc hiện diện trong chuỗi thực phẩm của chúng ta. Hơn nữa, chúng ta thật sự rất cật những

phương pháp kiểm tra nhanh cho các hệ thống quản lý an toàn thực phẩm trên quy mô rộng

lớn.

Trong phân tích kháng sinh hiện diện trong sữa, hay trong thịt thì có nhiều phương

pháp được sử dụng cho mục đích này. Cùng với sự tiến bộ của công nghệ sinh học và sinh

học tế bào trong thời gian gân đây đã cho phép sự phát triển một thế hệ mới của các phương

pháp phân tích sinh học.

Sau đây chúng ta sẽ tìm hiểu một số phương pháp phân tích sinh học để thấy được

những tính chất ưu việt, đặc biệt kết hợp trong các phương pháp phân tích nhạy cảm. Những

phương pháp sinh học này có thể cho phép phát hiện ra những hợp chất mới, chưa được biết




tới, và đánh giá được cả nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe khi có sự hiện diện của những chất

này trong chuỗi thực phẩm.




CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1. Độc tô thực phẩm.

Các độc tố trong thực phẩm không phải là 1 nhóm các hợp chất hóa học mà là tất cả

những gì có thể gây hại cho cơ thể. Một số độc tố hay chất độc như hóa chất công nghiệp,

khí thải do đốt cháy, thuốc trừ sâu, các chất làm rối loạn nội tiết (nhựa), hay kim loại nặng,

các phụ gia thực phẩm, chất bảo quản và các loại thuốc.

1.2. Phân loại độc tô

Chất độc có thể được phân loại theo nhiều cách: theo nguồn gốc, bản chất lý hoá của

chất độc, phương pháp phân tích chất độc, độc lực, tác động của chất độc trên các hệ cơ

quan của cơ thể và nguồn lây nhiễm chất độc.

1.2.1. Phân loại theo nguồn gôc chất độc:

Chất độc có nguồn gốc thiên nhiên: động vật, thực vật, vi sinh vật.

Chất độc có nguồn gốc tổng hợp, bán tổng hợp.

1.2.2.Phân loại theo bản chất lý hoá của chất độc:

Các chất độc ở dạng khí, lỏng, chất rắn.

Các chất độc vô cơ: kim loại, á kim, axit, bazơ.

Các hợp chất hữu cơ: các hợp chất chứa carbon, các loại thuốc trừ sâu, aldehyd, các

axit hữu cơ, các ester, các hợp chất chứa nitơ, các hợp chất chứa lưu huỳnh, các

alcaloid, glycosid.

1.2.3. Phân loại theo phương pháp phân tích chất độc: theo Stas-Otto

Chất độc hoà tan trong nước hay các dung dịch axit, kiềm.

Chất độc hoà tan trong ether.




Chất độc có thể chiết tách được trong các dung môi hữu cơ.

1.2.4. Phân loại theo tác động của chất độc trên các hệ cơ quan của cơ thể:

Các chất độc tác động trên hệ thần kinh: cafein, strychnin, cyanid, chì,

hexachlorophen, thuốc trừ sâu clo hữu cơ...

Các chất độc tác động trên hệ tiêu hoá: asen, selen, canxi clorua, sulfat đồng, muối

thủy ngân vô cơ...

Các chất độc tác động trên gan, mật: tetraclorua carbon, phenol, aflatoxin, fumonisin,

acetaminophen, toluen, đồng...

Các chất độc tác động trên thận: thuốc kháng sinh nhóm aminoglycosid,

oxytetracyclin, sulfonamid, kim loại nặng, ochratoxin...

Các chất độc tác động trên hệ hô hấp: carbon monoxid, kim loại nặng, carbon dioxid,

formaldehyd, thuốc trừ sâu phospho hữu cơ, fumonisin…

Các chất độc tác động trên hệ tim, mạch: digitalis, digitoxin, cafein, cocain, monesin,

amphetamin...

Các chất độc tác động trên hệ máu: aspirin, benzen, chloramphenicol, chlorpromazin,

estrogen, phenylbutazol, T2 mycotoxin (đây là các chất gây thiếu máu).

Các chất độc tác động trên hệ sinh sản: testosteron, zearalenon, dicoumarol,

corticosteroid, fumonisin, chì, cadmi, selen...

Các chất độc tác động trên da: acid, base, formaldehyd, iodin, muối thủy ngân,

phenol, các chất nhạy cảm quang học...

1.2.5.Phân loại theo tác dụng đặc biệt của chất độc:

Chất độc gây ung thư:




Các chất độc có nguồn gốc thiên nhiên: aflatoxin B1, alcaloid pyrolizidin, aquilid Atrong

cây dương xỉ, alcanylbenzen trong cây de vàng.

+ Hợp chất ung thư hình thành khi chế biến thực phẩm: nitrosamin, các chất hydratcarbon

đa vòng thơm, các amin dị vòng.

+ Một số thuốc thú y: diethylstibestrol (DES).

Chất độc gây đột biến: Hầu hết các chất gây ung thư đều có tác dụng gây đột biến.

Chất độc gây quái thai: các hợp chất este phospho hữu cơ, thuốc trừ sâu loại

carbamat, thuốc diệt nấm chứa thủy ngân, cloramphenicol.

1.2.6. Phân loại theo nguồn gây độc:

Các chất gây ô nhiễm không khí, nước và thực phẩm

Các chất phụ gia trong thực phẩm

Các hoá chất trong công nghiệp và các dung môi.

Thuốc bảo vệ thực vật, thuốc thú y.

Các nguồn khác




1.3. Một sô loại độc tô thường gặp trong thực phẩm

1.3.1. Độc tô PHA và HCA

Trong quá trình nướng, chất béo từ thực phẩm chảy xuống nguồn lửa bên dưới (than

hồng hoặc các thanh nhiệt trong lò nướng điện), kèm theo đó là lượng dầu được dùng để

phết thêm lên thực phẩm hoặc vỉ nướng sẽ tạo ra loại khí độc PHA (polycyclic aromatic

hydrocarbon) có thể gây ung thư... PHA sẽ bám vào thức ăn qua khói. Ngoài ra, khi nhiệt

tăng quá mức sẽ dẫn tới phản ứng giữa hoạt chất creatine và axit amino (có trong protein

của thịt) sinh ra nhiều độc tố khác có hại cho sức khỏe, mà điển hình là HCA (heterocyclic

amine). Những loại thịt chứa nhiều mỡ như thịt bò, thịt gà và cá ẩn chứa nhiều nguy cơ

nhất. HCA thường được tạo ra trong quá trình chế biến các món thịt giàu đạm ở nhiệt độ

cao như nướng, rán, đun sôi...

1.3.2. Độc tô aflatoxin trong thực phẩm nhiễm môc

Độc tố Aflatoxin thường có trong các thực phẩm khô đã lên mốc. Ngoài việc gây ngộ

độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg), độc tố Aflatoxin còn được xem là nguyên

nhân gây xơ gan và ung thư gan.

Theo tài liệu của Cục Dược phẩm và Thực phẩm (FDA) Hoa Kỳ, độc tố aflatoxin rất

bền với nhiệt. Khi đem lạc mốc rang lên, dù ở nhiệt độ rất cao, các bào tử nấm mốc bị tiêu

diệt, nhưng độc tố của chúng vẫn không bị phá hủy hoàn toàn. Các nghiên cứu cho thấy

rang lạc ở 1500C trong 30 phút, Aflatoxin B1 giảm trung bình 80% và Aflatoxin B2 giảm

60%. Như vậy, lạc mốc dù được chế biến ở nhiệt độ cao, ăn vào vẫn có thể gây nguy hiểm.

Aflatoxin được biết đến là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất tác động

qua đường miệng - nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin trong thời gian 89 ngày có

thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau.

Aflatoxin không chỉ độc vì có nhiều trong thực phẩm khô, gây nên bệnh ung thư gan

mà còn độc ở sự tồn tại dai dẳng của nó. Nó được sinh ra dưới dạng là chất hóa học, vì thế

chất Aflatoxin không bị mất đi khi xử lý ở nhiệt độ nóng hay thậm chí là nhiệt độ sôi




(1000C). Để loại bỏ chất độc này cần nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi, tuy nhiên, việc đó cũng

chỉ giúp hạn chế một phần nào chứ không loại bỏ được hoàn toàn. Cụ thể, với nhiệt độ rang,

sấy từ 1500C đến hơn 2000C sẽ loại bỏ được một phần nấm mốc"

Ðể phát triển, nấm mốc cần phải có môi trường phù hợp với chúng, đó là độ ẩm cao và

nhiệt độ nóng ấm thích hợp. Các nghiên cứu cho thấy, Aspergillus flavus chủ yếu xâm nhập

khi hạt lạc còn chứa 15 - 20% hàm lượng nước, nếu dưới 9% nước thì loại nấm mốc này

không thể nào phát triển được. Với gạo, hàm lượng nước dưới 12%, mốc sẽ không phát

triển được.

1.3.4. Nước tương và 3-MCPD và 1,3 – DCP

Độc chất 3-MCPD và 1,3-DCP được sinh ra trong quá trình sản xuất nước tương theo

phương pháp hoá giải. Nguyên nhân như sau:

Trong nguyên liệu sản xuất nước tương có 2 thành phần chính là protein và chất béo từ

bánh dầu đậu phộng (hoặc bã đậu nành). Khi nấu ở nhiệt độ trên 1000C phản ứng thuỷ phân

xảy ra, phân giải các mạch protein thành các chất bổ dưỡng là các acid amin. Đồng thời chất

béo cũng được thuỷ phân thành glycerol (còn gọi là glycerin) và acid béo. Glycerol tham

gia phản ứng thế với gốc Clo của acid clohric (HCl) tạo thành 3-MCPD và 1,3-DCP.

Phương trình phản ứng như sau:

3-MCPD viết tắt của 3-MonoCloroPropane-Diol (còn có tên 3-chloro-1,2 Diol) tức 1

gốc Cl gắn vào vị trí số 3 của propane diol

1,3 DCP viết tắt của 1,3-DiChloro-2-Propanol tức 2 gốc Cl gắn vào vị trí số 1 và 3 của

propanol




Với 3-MCPD:

- Liều 1mg/kg thể trọng/ngày (TT/N): tinh trùng giảm khả năng hoạt động & giảm khả

năng sinh sản của chuột đực.

- Liều lớn hơn 10mg đến 20mg/kg TT/N: gây tổn thương tinh hoàn chuột đực, biến đổi

hình dạng tinh trùng, giảm khả năng sinh sản của chuột đực.

- Lớn hơn 25mg/kg TT/N: gây tổn thương hệ thần kinh trung ương.

- Liều 30mg/kg TT/N: làm tăng trọng lượng thận của chuột.

Với 1,3-DCP:

Hàm lượng lớn hơn 19mg/kg TT/N trong nhiều ngày: gây khối u ở thận, gan, biểu mô

miệng, lưỡi, tuyến giáp và biểu hiện ung thư do biến đổi gen.

Như vậy với 1,3-DCP độc tính cao hơn 3-MCPD nhưng do có sự liên quan giữa 2 chất

về hàm lượng và 3-MCPD dễ phát hiện hơn nên trong chỉ tiêu chất lượng thường nhắm vào

3-MCPD.

Giới hạn tối đa cho phép chất 3-MCPD trong nước chấm:




Châu Âu: 0.020 mg/kg chất 3-MCPD: tính trên nước tương có độ khô 40% và sản

phẩm protein thực vật thủy phân acid (CE 466/2001 ngày 8/3/2001)

Úc và New Zealand (24/10/2001) 0,2 mg/kg cho chất 3-MCPD + 0,005mg/kg cho 1,3-

DCP

Canada (25/11/1999): chỉ tiêu có tính cách hướng dẫn là 1mg/kg chất 3-MCPD

Đài loan: 1mg/kg chất 3-MCPD

Việt Nam (QĐ 11/2005/QĐ-BYT) ngày 25/3/2005: 1mg/kg chất 3-MCPD trong nước

tương, xì dầu và dầu hào

1.3.4. Acrylamid trong chiên, xào, nướng

Acrylamid là chất dễ sinh ra từ cách chiên, xào, nướng khi làm thức ăn. Năm 2002,

Cơ quan quản lý thực phẩm Thụy Điển thông báo chính thức cho các nước trên thế giới đã

phát hiện acrylamid trong nhiều thức ăn nướng. Hàm lượng acrylamid đặc biệt cao trong

khoai tây chiên. Acrylamid có thể được xem là chất độc có khả năng gây đột biến gen và

ung thư cho người. Hàm lượng acrylamid sinh ra trong nướng thịt, cá thấp hơn đáng kể so

với khoai chiên, nhưng dù sao cũng nên thận trọng trong khi ăn thịt, cá nướng.

1.3.5. Formal, borat

Formal là dung dịch bão hòa của formaldehyde trong nước; là hóa chất thường dùng

để ướp xác và chế tạo keo dán, có thể gây ung thư. Vậy mà người ta vẫn lấy formal ướp thịt,

cá cho lâu hư, pha chế trong đậu hũ, bún, bánh phở, mì sợi..... cho có độ dai của thực phẩm.

Borat cũng có tác dụng tương tự.

Borat là loại hóa chất chủ yếu để sản xuất thuốc trừ sâu và chất tẩy rửa; nó là chất phụ

gia độc hại đã bị cấm dùng trong chế biến thực phẩm.

1.3.6. Melamine trong thực phẩm




Theo tiêu chuẩn mới, giới hạn chất melamine trong sữa bột cho trẻ em là 1mg/kg, các

loại thực phẩm khác và thức ăn cho gia súc là 2,5mg/kg.

Theo Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm - ủy ban chung của WHO và FAO phụ trách vấn

đề các chất gây ô nhiễm thực phẩm, melamine là loại hóa chất được sử dụng trong nhiều

quy trình xử lý công nghiệp khác nhau như sản xuất nhựa dùng làm đĩa đựng thức ăn, đồ

dùng nhà bếp, sơn lót các loại hộp đựng thực phẩm.

Do vậy, việc thực phẩm tiếp xúc với các đồ dùng trên ít nhiều có nhiễm melamine là

điều khó có thể tránh khỏi. Tuy nhiên ở mức thấp, điều này không gây ảnh hưởng đến sức

khỏe.

Theo tiêu chuẩn mới, giới hạn chất melamine trong sữa bột cho trẻ em là 1mg/kg, các

loại thực phẩm khác và thức ăn cho gia súc là 2,5mg/kg.

1.3.7. Sudan

Hàm lượng sudan đỏ có thể gây ung thư. Sudan chủ yếu để nhuộm vải, nhưng người

ta đã đưa vào son môi, vào đồ chơi trẻ em, vào nước uống cho có màu sắc dễ bắt mắt.

Người ta còn dùng sudan trộn vào thức ăn cho vịt ăn để đẻ ra trứng có lòng đỏ rất đẹp.

1.3.8. Ure

Urê dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, trong ngành Dược (điều chế acid

barbituric); phổ biến là trong nông nghiệp: làm phân bón cung cấp nitơ cho lúa và các loại

cây trồng khác. Urê không có tác dụng trong việc bảo quản thực phẩm, không ức chế được

vi khuẩn, không chống mốc, không là chất điều vị, chất chống oxy hóa. Khi urê hòa tan

trong nước sẽ tạo độ lạnh (do phản ứng thu nhiệt). Urê làm cho da cá trơn bóng, thân cá hút

và giữ nước có urê làm căng mọng như cá tươi mới vừa đánh bắt lên.

1.3.9. Rau quả nhiễm thuôc bảo vệ thực vật, kim loại nặng

Các thuốc bảo vệ thực vật được xếp vào loại chất gây xáo trộn hệ thống nội tiết tố

(endocrine disrupting chemicals) ảnh hưởng đến hệ thống sinh dục, hay thai nhi…




1.3.10. Hóa chất bảo quản trái cây

Hóa chất được sử dụng phun lên trái cây để bảo quản trái cây tươi lâu hầu hết đều

nằm ngoài danh mục và với hàm lượng không thể kiểm soát được. Không chỉ làm giảm chất

lượng của trái cây mà những chất này còn gây ra những bệnh nguy hiểm cho người tiêu

dùng.

1.3.11. Hóa chất gôc clo, thuôc diệt cỏ

Táo, lê, cam, quýt kể cả nho bày bán cả tháng trời nhưng vẫn không hề hư hỏng và

màu sắc vẫn không thay đổi nhiều. Đặc biệt là trái cây nhập ngoại lưu thông trên thị trường

nhiều ngày do tốn thời gian vận chuyển nên hầu hết đều được giới kinh doanh trái cây phun

lên một lớp hóa chất bảo quản giữ trái cây tươi lâu.

Các loại hóa chất này có tác dụng vừa chống mốc vừa bảo quản hàng hóa lâu bị hư

hại. Hóa chất này có gốc clo, peroxit rất độc hại cho người sử dụng vì nó không mùi, không

vị, không màu nên rất khó phát hiện.

1.3.12. Muối diêm

Muối diêm dùng để bảo quản, tạo màu và hương vị cho các sản phẩm từ thịt. Muối

diêm thường được thêm vào thịt muối, jambon, cá xông khói, hotdog, thịt hộp để giữ hương

vị và tạo màu đỏ. Chất này ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn, nhưng là nguyên nhân gây

ung thư.

1.3.13. BHA và BHT

BHA và BHT là những chất chống oxi hóa, giúp cho dầu mỡ không bị ôi (oxi hóa)

nhưng chúng có thể gây ra ung thư. BHA và BHT được tìm thấy trong ngũ cốc, sing-gum,

khoai tây chiên và dầu thực vật.

Cấu trúc của BHA và BHT sẽ thay đổi trong suốt quá trình bảo quản thức ăn. Chúng

có thể tạo thành một hợp chất phản ứng lại với cơ thể và không được bài tiết ra bởi cơ thể.

1.3.14. Propyl gallate




Propyl gallate là 1 chất bảo quản. Nó là một chất chống oxi hóa, được dùng để giữ cho

dầu mỡ không bị hôi, thường dùng kết hợp với BHA và BHT. Chất này thỉnh thoảng thấy

trong các sản phẩm từ thịt, súp gà và kẹo cao su. Propyl gallate chưa được chứng minh là

gây ung thư cho người nhưng các nghiên cứu trên động vật cho thấy nó có liên quan đến

ung thư.

1.3.15. Chất béo thể đồng phân

Chất béo thể đồng phân (trans fats) cũng nằm trong 12 chất phụ gia nên hạn chế bởi vì

ăn nó quá nhiều sẽ dẫn đến bệnh tim. Trans fats đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra

ung thư và là điều kiện lý tưởng để hình thành chứng đột quị, đau tim, bệnh mạch vành, suy

thận. Nhà sản xuất đã phải điều chỉnh để giảm lượng trans fat trong thực phẩm và kê khai

trên nhãn lượng trans fat. Nhưng thực phẩm trong nhà hàng, đặc biệt là những cửa hàng

thức ăn nhanh vẫn chứa rất nhiều chất béo. Các chuyên gia khuyên rằng chúng ta không nên

ăn quá 2g trans fat mỗi ngày. Lưu ý việc ăn thịt và uống sữa không liên quan nhiều đến

trans fat.

1.3.16. BPA (Bisphenol A)

BPA là một loại hóc môn tổng hợp, được tìm thấy trong các sản phẩm như: hộp đựng

thực phẩm, bình sữa trẻ em, các chai nhựa và các dĩa CD. Hiện nay, chất này đã bị cấm sử

dụng trong các bình sữa trẻ em nhưng vẫn có thể tìm thấy trong một số loại đồ hộp. Tại Mỹ,

người ta đã cảnh báo BPA có thể ảnh hưởng xấu đến khả năng sinh sản của cả nam và nữ,

làm thay đổi chức năng của hệ miễn dịch, gây rối loạn hành vi và khả năng nhận thức. Về

lâu dài, nó có thể gây tổn thương não bộ, gây ra căn bệnh Alzheimer và một số bệnh ung

thư. Trẻ nhỏ sớm tiếp xúc với Bisphenol-A sẽ bị tổn thương vĩnh viễn.

1.3.17. Aspartame

Aspartame, thường được biết đến với tên Nutrasweet và Equal, là một chất phụ gia

được tìm thấy trong thực phẩm cho người ăn kiêng như món tráng miệng với hàm lượng

calori thấp, có thể có trong gelatins, nước hoa quả và thức uống không cồn. Nó cũng được

dùng để làm những gói đường hóa học.




Tính an toàn của aspartame là tâm điểm của hàng trăm cuộc nghiên cứu khoa học. Cơ

quan quản lý thực, dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), Tổ chức y tế thế giới (WHO), Hiệp Hội

Dinh Dưỡng Hoa Kỳ (ADA) và Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (FAO) cho rằng chất

phụ gia này an toàn.




CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỊNH TÍNH CÁC ĐỘC CHẤT

TRONG THỰC PHẨM

2.1. Phân tích độc tô dioxins bằng phương pháp sinh học DR-CALUX

2.1.1. Giới thiệu về phương pháp

Sau khi phát hiện sự hiện diện của chất độc dioxin trong chuỗi thực phẩm thì ngay lập

tức một vấn đề nảy sinh là không thể thiết lập một hệ thống rộng lớn cho việc phân tích

nhóm hợp chất này. Lý do chính là chi phí vô cùng đắt, thủ tục thì rất phức tạp khi thiết lập

một quy trình phân tích phát hiện hơn 17 nhóm hợp chất hóa học khác nhau này. Điều này

chỉ có thể thực hiện được bằng việc sử dụng hệ thống phân tích khối phổ có độ phân giải

cao trên một dải phổ rất rộng.

Từ những hạn chết về khả năng phân tích đó, phương pháp phân tích sinh học sử dụng

tế bào động vật hữu nhũ đã được phát triển, bước đầu dựa trên tác động của những hợp chất

này lên tế bào.

Phương pháp phân tích thụ thể đã được phát triển dựa trên liên kết giữa chất độc

dioxin và thụ thể đặc hiệu (thụ thể Ah) trên tế bào. Phân tích EROD đo lường sự loại bỏ gốc

ethyl của ethoxy-resorufin bới enzyme cytochrome P450. Cùng với sự liện kết giữa dioxins

và thụ thể Ah, sẽ hình thành liên kết phức tạp lên đoạn gen đặc hiệu (DREs) trên phân tử

DNA, làm cho sự phiên mã cho đoạn gen mã hóa enzyme tăng lên. Phân tích sẽ dựa trên

nguyên lý này để đánh giá mức độ nhiễm những hợp chất dioxins có trong mẫu môi trường.

Hạn chế lớn nhất của phương pháp phân tích này là khả năng enzyme sẽ bị ức chế bởi sự

hiện diện của nhiều hợp chất khác nhau có trong mẫu.

Nét đặc trưng của phương pháp được tăng lên bởi sự phát triển của một dòng tế bào

chứa các gen hiển thị luciferase có trong gen DRE của loài gặm nhấm. Khi có phản ứng với

dioxins, dòng tế bào khối u gan H4IIE của chuột sẽ tổng hợp enzyme luciferase tương ứng

với từng mức độ nhiễm dioxins có trong mẫu, do đó có thể định lượng được nồng độ

dioxins thông qua cường độ phát sáng sinh ra bởi phản ứng enzyme




Nguyên lý của phương pháp phân tích sinh học CALUX với thụ thể Ah. Sau khi lên

kết với thụ thể Ah, phức chất sẽ được vận chuyển vào nhân và liên kết với nhân tố đáp ứng

dioxins, dẫn đến làm tăng sự phiên mã đoạn gen luciferase và sự sinh tổng hợp enzyme này.

Enzyme này sẽ được đo lường thông qua một phản ứng phát sáng.

Do phản ứng được thực hiện trên 96 giếng mẫu, nên sẽ thu được phản ứng ở ít hơn 50

fg TCDD. Và hàm lượng dioxins có thể được định lượng qua việc so sánh với đường huẩn

dựng từ TCDD.




Đường chuẩn để xác định hàm lượng dioxins theo mức độ phản ứng trong phân tích sinh

học CALUX

2.1.2. Phân tích cho chất béo sữa

Phương pháp phân tích trên mẫu chất béo dựa trên nguyên lý trên cũng đã được phát

triển. Sử dụng dimethylsulphoxide như là một hợp chất trung gian. Dioxins được chuyển

vào môi trường mô giống và cho vào tế bào. Sau 24h thì nồng độ luciferase trong tế bào sẽ

được xác định. Phân tích được thẩm định trên mẫu chất béo sữa sử dụng số lượng mẫu được

đánh dấu từ 1 đến 15 pg i-TEQ/g chất béo với một hỗn hợp chứa 17 loại hợp chất nhóm

dioxins ở hàm lượng như nhau. Nồng độ các mẫu sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn

TCDD, ngưỡng phát hiện để có thể tính toán được hàm lượng là 1 pg i-TEQ/g chất béo.

Từ nền tảng cơ sở của nghiên cứu trên thì những hợp chất dioxin trong các sản phẩm

dầu từ cá và các loài động vật hai mảnh vỏ cũng đã được phân tích.

2.1.3. Ứng dụng phân tích CALUX cho các loại mẫu khác




Các phân tích thực hiện trên các nền mẫu thực phẩm khác như mẫu trứng, mỡ động

vật và dầu thực vật cũng cho kết quả tốt. Phân tích cũng đã được kiểm định trên mẫu máu

của một số loài động vật hoang dã nhiễm dioxin với hàm lượng cao. Phương pháp cũng đã

được phát triển và kiểm chứng thành công trên các mẫu cặn, nước cũng như các mẫu môi

trường khác.

Với sự cần thiết của một biện pháp kiểm tra nhanh dioxin, phương pháp phân tích sinh

học này cần được đánh giá và phát triển rộng rãi trên toàn thế giới. Một ngân hàng dữ liệu

chuẩn hóa ho phương pháp này ũng cần được thiết lập. Hơn nữa, phương pháp này cũng cần

được phát triển để nhận diện các chất chưa biết trong lĩnh vực độc tố học.

2.2. Sử dụng phương pháp phân tích sinh học trên những nhóm hợp chất khác

2.2.1. Phân tích estrogen

Nhân loại ngày nay đã phát hiện ra những tác động có hại từ hoạt động của các nội tiết

tố, những chất mà trước đó được xem là vô hại. Rất nhiều những hợp chất khác nhau, bao

gồm các hormone sinh tổng hợp, thành phần tự nhiên trong thực vật, chất diệt côn trùng và

chất tạo dẻo cho thấy những tác động đến hoạt động của estrogen cũng như antiestrogen. Để

kiểm tra các hợp chất có hoạt tính estrogen trong môi trường, nhiều phương pháp sinh học

đã được phát triển dựa trên ảnh hưởng của estrogen trên tế bào tuyến vú. Việc sử dụng E-

screen, kiểm tra dựa trên sự gia tăng sản sinh tế bào khối u tuyến vú MCF-7, ta nhận thấy

hoạt tính estrogen của p-nonyl-phenol khi cho chất nhựa dẻo vào ống mô giống, được biết

nonylphenol là hợp chất được sử dụng sản xuất các loại nhựa dẻo trong đó có các loại nhựa

làm bao bì thực phẩm, hoạt tính estrogen sau đó được thẩm định lại bằng phương pháp cổ

điển trên chuột, dựa trên sự làm tăng kích thước dạ con của những con chuột non. Sự phát

hiện ra hoạt tính estrogen của một chất phụ gia được sử dụng rộng rãi trong ngành ông

nghiệp nhựa dẻo này cho thấy lợi ích của việc ứng dụng các phương pháp sinh học vào hệ

thống kiểm soát an toàn thực phẩm.

Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, một số phân tích gen chỉ thị đã được phát triển, hầu

hết các phương pháp sử dụng tế bào nấm men. Kết quả thu được từ sự đưa vào cả 2 dòng

gen là gen mã hóa thụ thể estrogen người và gen chỉ thị ho nhân tố đáp ứng estrogen. Phân




tích trên nấm men này đã được sử dụng để phân tích hoạt tính estrogen trên các mẫu môi

trường, trên bò và trên bò.

Tương tự với DR-CALUX, thì ER-CALUX, một dòng tế bò mới được phát triển có

thể sinh ra luciferase phản ứng với estrogen. Gen sản sinh estrogen này được điều hòa bởi

nhân tố đáp ứng estrogen (ERE) sẽ được đưa vào dòng tế bào khối u tuyến vú ở người

T47D, phản ứng có thể xảy ra với 17β-estradiol ở nồng độ thấp dưới 1 pM (50 fg/giếng

mẫu). Sự nhạy cảm của phương pháp này cho phép phát hiện ra estradiol trong thịt và máu

tới hàm lượng pg/g. Tuy nhiên phâ tích này mới chỉ được sử dụng trong phân tích các mẫu

môi trường, cần có những khảo sát sâu hơn để có thể ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm

2.2.2. Phân tích chất kìm hãm enzyme Acetyl-choline esterase

Một lĩnh vực nghiên cứu khá sôi nổi về các phương pháp phân tích sinh học đó là

phân tích chất ức chế enzyme acetylholin esterase, có trong các thuốc diệt côn trùng có

nguồn gốc phosphate hữu cơ và carbamate. Phân tích này xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi một

phương pháp nhanh để kiểm tra rau quả ngay từ cơ sở thu mua, nó còn giúp cho việc đánh

giá mức độ an toàn của những loại thuốc này khi sử dụng trên rau quả.

Đầu tiên mảnh giấy lọc sẽ được nhúng vào dịch chiết rau quả, sau đó bổ sung thêm

enzyme, và cuối cùng cho vào dung dịch indoxyl acetate, indoxyl acetate này sẽ bị chuyển

hó bởi enzyme tạo thành indoxyl chuyển giấy lọc sang màu xanh chàm, trong trường hợp có

mặt của chất ức chế enzyme acetylcholin esterase, mảnh giấy lọc vẫn giữ nguyên màu sắc là

màu trắng.

2.2.3 Phân tích độc tô trong động vật 2 mảnh vỏ

Đã có rất nhiều nỗ lực để thay thế các phương pháp phân tích trên chuột bằng các

phân tích hóa học cũng như phân tích miễn dịch. Nhưng nhìn chung các phương pháp đang

có không thể phát hiện được tất cả các hợp chất độc khác nhau. Có hơn 21 độc tố gây tê liệt

từ các loài ký sinh trên động vật 2 mảnh vỏ, 9 loại độc tố thần kinh, e loại độc tố gây tiêu

chảy có nguồn gốc từ acid Okadaic, và 7 loại độc tố thuộc nhóm acid domoic.

2.3. Phương pháp kiểm tra nhanh Chloramphenicol




Chloramphenicol là một loại kháng sinh phổ rộng, nó được sử dụng thường xuyên

cho quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc động vật nhờ có các đặc tính kháng khuẩn

và dược động học tuyệt vời của nó. Tuy nhiên, trong cơ thể người nó lại có thể gây ra

những độc tính huyết học, cụ thể là thiếu máu biến dạng với 1 hàm lượng nào đó chưa

được xác định rõ. Điều này dẫn đến việc Chloramphenicol đã bị cấm sử dụng trong việc

điều trị cho súc vật dùng làm nguyên liệu chế biến thực phẩm.

Nguyên tắc của xét nghiệm này là phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Xét

nghiệm nhanh bằng 1 bước duy nhất này là một xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh, trong đó

chất dò (detector reagent) bao gồm những mảnh vàng keo (colloidal gold) được tráng phủ

bởi các kháng thể kháng Chloramphenicol tinh khiết ái lực. Trong khi đó chất phát

hiện (capture reagent) là một phức hợp Chloramphenicol-protein được đính trên màng

của dụng cụ xét nghiệm. Trong quá trình xét nghiệm, mẫu thử đi qua màng này.

Càng có nhiều chất phân tích trong mẫu thử, chúng sẽ càng cạnh tranh mạnh hơn với

Chloramphenicol đính trên màng để gắn kết với các kháng thể của chất dò (có số lượng giới

hạn). Chloramphenicol, nếu tồn tại trong mẫu thử với hàm lượng trên 0,1 ppb sẽ ngăn

chặn sự gắn kết của chất dò với Chloramphenicol đính trên màng, cho ra kết quả dương

tính.




CHƯƠNG 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỘC CHẤT

TRONG THỰC PHẨM

3.1. Định lượng Dioxin bằng phương pháp ELISA

Với sự phát triển củ công nghệ sinh học đặc biệt là về kháng thể, các phương pháp

truyền thống để phân tích chất độc dioxin như sắc ký khí và khối phổ đang dần được thay

thế bởi các phương pháp sinh học như phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

(ELISA) và các phương pháp phân tích miễn dịch khác.

Những phương pháp này được đánh giá là nhanh, đơn giản và chi phí thấp khi so với

các phương pháp truyền thống.

Dioxin và những chất thuộc nhóm dioxin bao gồm poychlorinated dibenzo-p-dioxins

(PCDDs), polychlorinated dibenzofurans (PCDFs) và polychlorinated biphenyls (PCBs) là

một nhóm các hợp chất hóa học được xếp vào nhóm các chất ô nhiễm hữu cơ bền (POPs).

Hầu hết là những chất nhân tạo, được thải ra từ các hệ thống xử lý rác thải và một số ngành

công nghiệp như ngành quặng sắt, nấu nhôm và các nhà máy năng lượng.

Năm 1990 cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ đã ban hành phương pháp phân tích dioxin

được xem là phương pháp chuẩn được sử dụng trên thế giới đựa trên phương pháp phân tích

sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ. Đây được xem là phương pháp nhạy nhất và đáng tin cậy

nhất cho việc phân tích nồng độ dioxin. Tuy nhiên phương pháp này còn nhiều nhược điểm.

- Việc phân tích chỉ có thể được tiến hành bởi những nhân viên viên được đào tạo kỹ

lưỡng.

- Tốn thời gian rất lâu, phải mất 3 đến 4 ngày để phân tích một mẫu

- Cần thực hiện các biện pháp tiền xử lý phức tạp, tốn kém, chi phí thiết bị cao, chi phí

xây dựng và phòng thí nghiệm phân tích vô cùng tốn kém.

Những phương pháp sinh học phân tích dioxin được chia thành 2 nhóm:




- Phương pháp dựa trên phản ứng phát tín hiệu của thụ thể aryl hydrocarbon khi bị

kích hoạt bởi sự có mặt của dioxin.

- Phương pháp phân tích miễn dịch học dựa trên kháng thể.

Bảng 1: Nguyên tắc một sô phương pháp sinh học phát hiện dioxin

Phương pháp Nguyên tắc

Dựa trên tín hiệu của thụ thể AhR Khi dòng tế bào bị phơi nhiễm doxin, thụ thể AhR

được hoạt hóa đi vào trong nhân và tạo phức với

ARNT (aryl hydroarbon receptor nuclear

translocator). Phức chất liên kết với gen DRE bao

gồm sự thể hiện phiên mã của gen CYP1A1, được

phân tích bởi một trong các phân tích bên dưới.

(a) Q-PCR Phát hiện được sự gia tăng gen mRNA CYP1A1. Từ

đó tính được giá trị TEQ của dioxin

(b) CALUX Dòng tế bào tái tổ hợp được chuyển gen chỉ thị

luciferase của đom đóm, sau đó được tương tác với

mẫu chứa dioxin. Khi dioxin hoạt hóa AhR thì sẽ tạo

thành phức chất AhR-ARNT, phức này kết hợp với

DREs và gây ra sự biểu hiện gen chỉ thị luciferase.

Luciferase sẽ dễ dàng được phân tích bằng thiết bị

phân tích phát quang sau khi cho vào cơ chất

luciferin.

(c) CAFLUX Phân tích cũng giống như CALUX tuy nhiên lúc này

gen chỉ thị luciferase được thay bằng một protein có

khả năng phát huỳnh quang xanh. Giá trị TQE của

dioxin sẽ được xác định dựa trên cường độ phát

huỳnh quang của chất chỉ thị




(d) GRAB Mẫu được ủ với dịch bào tương của tế bào gan có

chứa AhR và ARNT. Dioxin sẽ thúc đẩy việc tạo ra

phức AhR-ARNT. Khi đoạn dò DNA có chứa gen

DRE được đánh dấu bởi đồng vị 32P liên kết với

phức chất trên thì tốc độ của DNA trên gel

polyacrylamide sẽ chậm hơn so với DNA không có

liên kết với phức chất.

(II) Liên kết phối tử AhR Dioxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với đồng vị TCDD

trong việc liên kết với AhR. Do đó nồng độ dioxin

trong mẫu tương ứng với sự giảm tính phóng xạ của

AhR.

(III) Phân tích miễn dịch

(a) ELISA

Phân tích này dựa trên liên kết giữa dioxin và kháng

thể kháng dioxin. Dioxin trong mẫu sẽ cạnh tranh

với chất chuẩn để liên kết với kháng thể. Sau khi rửa

trôi các phức KN-KT tự do, những KT lên kết với

chất chuẩn cố định TCDD được phân tích sau khi

liên kết với kháng thể thứ 2 được kết hợp với 1

enzyme.sau đó enzyme này sẽ được phân tích bằng 1

cơ chất đặc hiệu. Hoặc theo cách bố trí thứ 2 là

dioxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với chất chuẩn đã

gắn với enzyme trong quá trình liên kết với kháng

thể đã cố định trên đĩa. Dựa vào đường chuẩn được

xây dựng dựa trên các nồng độ dioxin chuẩn ta sẽ

suy ra được giá trị TEQ của dioxin.

Trong các phương pháp đã đề cập trong bảng trên thì CALUX được xem là phương

pháp có độ nhạy cao và phân tích nhanh. CAFLUX không cần sử dụng thêm cơ chất từ bên

ngoài, nhưng dễ bị nhiễu do đó cũng ít được sử dụng. GRAB sử dụng DNA được đánh dấu




bằng đồng vị 32P đòi hỏi phương tiện, thiết bị, kỹ thuật về phóng xạ nên chủ yếu chỉ được sử

dụng trong nghiên cứu. ELISA dựa trên liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể, có tính

đặc hiệu cao, không cần nuôi cấy tế bào, chi phí phân tích thấp hơn nhiều so với phương

pháp sắc ký và khối phổ nên có tiềm năng ứng dụng rộng rãi.

3.1.1. Phương Pháp ELISA

ELISA dựa trên tương tác đặc hiệu giữa dioxin và kháng thể. Hiện tại thì những hệ

thống phát hiện dioxin được xây dựng trên 2 cơ chế là ELISA cạnh tranh trực tiếp và

ELISA cạnh tranh gián tiếp.

Nguyên tắc cơ bản của ELISA cạnh tranh là dioxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với chất

chuẩn đã kết hợp với enzyme để liên kết với kháng thể đã được cố định trên giếng mẫu. Cơ

chất sẽ tương tác với enzyme trên phức enzyme-chất chuẩn, mức độ phản ứng này sẽ phản

ánh lượng chất chuẩn liên kết với háng thể trên giếng mẫu. Cường độ phản ứng này tỉ lệ

nghịch với nồng độ dioxin có trong mẫu. Nồng độ dioxin trong mẫu sẽ được tính toán dựa

trên đường chuẩn được xây dựng theo các nồng độ dioxin chuẩn đã biết.

Hình 1: Quy trình thí nghiệm ELISA cạnh tranh trực tiếp và cạnh tranh gián tiếp để

phân tích dioxin.

(a) Phân tích ELISA cạnh tranh gián tiếp, giếng mẫu được phủ bởi 1 loại kháng nguyên

thích hợp (1). Mẫu và kháng thể (Abs) được cho vào giếng mẫu. Kháng nguyên cạnh tranh

với dioxin liên kết với kháng thể (2). Sau khi ủ, các phân tử hòa tan bị rửa trôi. Kháng thể

thứ 2 có gắn enzyme được thêm vào và tương tác với kháng thể đã được cố định trước đó

(3). Cơ chất được thêm vào để phát hiện ra những kháng thể cố định (4).

(b) Phản ứng ELISA cạnh tranh trực tiếp. Giếng mẫu lúc này sẽ được phủ kháng thể kháng

dioxin Ab (5). Sau khi ủ, kháng thể hòa tan sẽ bị rửa trôi. Mẫu và chất chuẩn có gắn enzyme

được thêm vào và chúng sẽ cạnh tranh liên kết với kháng thể cố định. Sau khi ủ, phân tử

hòa tan sẽ bị rửa (6). Cơ chất được cho vào để phát hiện ra các chất chuẩn đã liên kết với

kháng thể cố định (7).




Phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp dựa trên sự cạnh tranh giữa dioxin trong mẫu và

kháng nguyên cố định trên giếng mẫu trong phản ứng liên kết với kháng thể. Sau khi rửa để

loại bỏ các phức KN-KT hòa tan, những kháng thể đã liên kết với kháng nguyên trên đĩa

được ủ với một kháng thể thứ 2 có gắn enzyme. Giống như phản ứng ELISA cạnh tranh

trực tiếp, mức độ nhiễm dioxin trong mẫu sẽ được đánh giá thông qua so sánh với đường

chuẩn. Mặc dù ELISA là một phương pháp đơn giản phân tích dioxin, nó có độ nhạy kém

hơn so với CALUX.

3.1.2. Chuẩn bị mẫu

Việc chuẩn bị mẫu rất quan trọng, nhằm phân tán đều cấu tử cần phân tích, loại bỏ chất

gây nhiễu nhằm cải thiện độ nhạy của phương pháp phân tích.

Phương pháp sắc ký khí và khối phổ đòi hỏi một quá trình trích ly, tinh sạch mẫu rất

phức tạp, tốn kém và mất nhiều thời gian. Với phương pháp ELISA thì quá trình này được

thực hiện nhanh chóng, dễ dàng và tiết kiệm hơn, hơn nữa quá trình chuẩn bị mẫu này ngày

càng được cải tiến để tối ưu hơn cho quá trình phân tích dioxin bằng ELISA.

Mẫu trích ly trước khi tiến hành phân tích ELISA cần phải được hòa tan vào dimethyl

sulfoxide (DMSO) trước khi phân tích. Quá trình làm sạch này còn nhằm mục đích làm

sạch chất gây nhiễu ra khỏi mẫu. Mẫu được làm sạch bằng cách cho đi qua cột sắc ký

silicagel và ô xít nhôm.




3.1.3. Thiết kế kháng nguyên

Tính đặc trưng và chọn lọc của phản ứng ELISA chủ yếu dựa vào kháng thể sử dụng và

việc thiết kế kháng nguyên này sẽ quyết định đặc điểm của kháng thể kèm theo.

Thường những phân tử nhỏ hiếm khi kích thích một phản ứng miễn dịch, do đó cần

thiết kế một chất kháng nguyên có khả năng kích thích sinh kháng thể bằng cách liên kết

trên chất mang là một loại protein để tạo thành phức KN-Protein. Có 2 nhân tố chính trong

kháng nguyên để tạo nên sự miễn dịch đó là cấu trúc hóa học và nhóm chức năng. Cấu trúc

hóa học là chìa khóa để tạo ra một kháng thể giá trị. Các nhóm chức năng giúp liên kết

những cấu trúc hóa học với protein vận chuyển bằng những liên kết cộng hóa trị.

Ứng với những nhóm dioxin khác nhau cần phải thiết kế một loại kháng nguyên chuyên

biệt.

3.1.4.Phát triển kháng thể

Một trong những nổi trội của những phản ứng sinh học phân tích dioxin là tính đặc hiệu

của chúng.

Hiện tại, có 3 loại kháng thể chính được sử dụng trong phản ứng ELISA: kháng thể đa

dòng, kháng thể đơn dòng, và kháng thể tái tổ hợp. Kháng thể đa dòng được sử dụng rộng

rãi, và dễ dàng thu nhận và tinh sạch từ huyết thanh.

Về nguyên tắc thì kháng thể đa dòng thể hiện một nhược điểm đó là không hoàn toàn

đặc hiệu mà nó có thể tạo thành các liên kết ngang với các phân tử khác, đây là các liên kết

không mong muốn có thể ảnh hưởng tới kết quả phân tích cũng như giảm độ nhạy của phản

ứng. Tuy nhiên với hản ứng phân tích dioxin thì đó là ngoại lệ, vì dioxin trong mẫu tồn tại

dưới dạng một nhóm các hợp chất cho nên việc kháng thể đa dòng có thể tạo thành các liên

kết ngang với các đồng phân này là một lợi thế cho việc phân tích tổng hàm lượng dioxin có

trong mẫu. Hiệu quả phân tích sẽ ngày càng cải thiện khi ta có thể phát triển các kháng thể

đa dòng có thể khả năng tạo thành những liên kết chuyên biệt cho các chất thuộc nhóm




dioxin mà ta cần phân tích. Ngoài ra để đạt được mục đích trên ta cũng có thể dùng giải

pháp sử dụng một hỗn hợp kháng thể nhằm tăng phạm vi phát hiện cho phản ứng.

Trong những năm gần đây thì các nhà nghiên cứu đang phát triển dòng kháng thể đơn

dòng tái tổ hợp. Đây không hoàn toàn là một phương pháp mới vì nó đã được ứng dụng

trong lĩnh vực y học để tạo kháng thể cho con người. Phương pháp này trước đây cũng đã

được sử dụng trong phân tích thuốc diệt cỏ trước khi ứng dụng trong phân tích dioxin.

Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp xuất phát từ cDNAs mã hóa cho kháng thể, cDNAs này

được nhân bản bên trong tế bào sống, thường sử dụng tế bào E.coli và nấm men.

Những lợi thế mà kháng thể đơn dòng tái tổ hợp này có được so với các kháng thể đơn

dòng và đa dòng trước đó là tính ổn định, ái lực cao và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên quy

trình sản xuất lại phức tạp và đòi hỏi kỹ thuật cao về công nghệ sinh học.

3.1.5.Phương pháp Ah-I

Ah-I là phương pháp thông dụng khác để phân tích tổng độc tính dioxin dựa trên khả

năng liên kết và hoạt hóa AhR. Để xác định nồng độ dioxin thì một gen chỉ thị được sử

dụng, trong đó CALUX là được sử dụng phổ biến nhất. Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một số

mặt hạn chế, như là cần phải nuôi cấy tế bào, kéo theo cần có một đội ngũ chuyên viên kỹ

thuật thành thạo và thiết bị phức tạp.

Ah-I là phân tích liên kết AhR dựa trên nền tảng của phản ứng ELISA có thể phân tích

trực tiếp giá trị TEQ của dioxin mà không cần phải nuôi cấy tế bào. Đây là sự lai ghép giữa

một phản ứng phân tích miễn dịch và một phân tích liên kết AhR trong ống nghiệm.

Nguyên tắc của phương pháp này như sau: dioxin sẽ hoạt hóa AhR dẫn đến sự thay đổi

về hình thể, dẫn đến sự hình thành phức với ARNT và phức này sẽ liên kết với thụ thể

dioxin là DREs trên DNA. Phức chất AhR-ARNT sẽ được phân tích bằng phản ứng màu

sắc dựa trên phân tích miễn dịch, sử dụng kháng thể có gắn enzyme có khả năng liên kết với

AhR hoặc ARNT. Nồng độ TEQ của các hợp chất dioxin được suy ra từ đường chuẩn

TCDD. Quy trình chi tiết của phương pháp này được thể hiện trong hình 2. Độ nhạy và tính




đặc hiệu của phương pháp Ah-I được quyết định bởi phương pháp chuẩn bị mẫu cũng như

đặc tính của kháng thể được sử dụng.

Hình 2: Sơ đồ quy trình thí nghiệm Ah-I trong phân tích dioxin.

Giếng mẫu được phủ với protein Streptavidin (1). Cell lysate chứa AhR và ARNT, mẫu thử

có chứa dioxin, và đoạn DNA được đánh dấu bởi biotin có chứ DRE được thêm vào giếng

mẫu. DRE liên kết với streptavidin, AhR được hoạt hóa bởi dioxin sẽ liên kết với ARNT tạo

thành phức chất, phức này sẽ được cố định khi liên kết với DRE (2). Kháng thể kháng

ARNT (3) hoặc kháng thể kháng AhR được thêm vào để nhận diện phức chất. Kháng thể

thứ 2 và cơ chất được thêm vào để phát hiện (3, 4, 5, 6).

3.

3.1.6.Kết luận

So với phương pháp sắc ký và khối phổ, các phân tích sinh học dựa trên kháng thể như

ELISA và Ah-I được thực hiện nhanh hơn, tiết kiệm thời gian và chi phí hơn nhờ vào hệ

thống phân tích đơn giản, chi phí bảo trì thiết bị và chi phí chuẩn bị, tinh sạch mẫu thấp.

Tuy nhiên mặt hạn chế của nó là độ nhạy của phản ứng, điều này có thể được cải thiện từ

việc tối ưu phương pháp chuẩn bị mẫu, thiết kế kháng nguyên và phát triển kháng thể. Và

việc phát triển kháng thể đơn dòng tái tổ hợp sẽ giúp gia tăng tính khả thi của phân tích.

3.2. Các phương pháp sinh học xác định độc tô Butulinum:

Thí nghiệm trên chuột[3,9]

a. Cơ sơ khoa học :




Sự hiện diện của độc tố Botulinum được phát hiện bằng cách tiêm vào chuột trích xuất từ

thực phẩm rồi sau đó quan sát triệu chứng ngộ độc điển hình của độc tố này của chuột trong

khoảng thời gian 48 giờ.

b. Phương pháp

Một mẫu độc tố được chia thành ba phần:

phần thứ nhất để phục vụ như là mẫu kiểm soát, được đun nóng ở 1000C

trong 10 phút để phá hủy các loại độc tố trong mẫu.

phần thứ hai là mẫu xử lý bằng trypsin để kích hoạt các tiền độc tố có thể có.

phần thứ ba mẫu không được xử lý.

Mỗi phần được tiêm vào bụng 2 con chuột và quan sát trong 48 giờ để cho việc phát triển

các triệu chứng điển hình như khó thở và xuất hiện dấu hiệu “thắt lưng ong” đặc trưng. Sự

hiện diện của loại độc tố có trong chuột được xác nhận bởi thuốc kháng độc polyvalent và

loại độc tố đó có thể được xác định bằng cách sử dụng kháng huyết thanh monovalent.

Hình 5: Thí nghiệm độc tố trên chuột

c. Kết quả:

Dấu hiệu ngộ độc điển hình ở chuột bắt đầu xuất hiện trong 24 h đầu tiên ở lông, tiếp theo

khó thở, lưng ong, tê liệt và cuối cùng là tử vong do suy hô hấp. Cái chết của chuột mà

không có triệu chứng lâm sàng này thì không đủ bằng chứng cho thấy mẫu chứa độc tố tiêm




botulinum, nguyên nhân cái chết xảy ra từ các hóa chất khác có trong dung dịch tiêm, hoặc

từ chấn thương.

Nếu sau 48h quan sát, trừ những con chuột đã chết, lặp lại các thử nghiệm độc tính

bằng cách sử dụng dịch được pha loãng ơ nồng độ cao hơn. Cần phải pha loãng dung

dịch từ không giết chết con chuột đến giết chết con chuột để xác định liều tối thiểu gây chết

(MLD). Lượng MLD có trong dung dịch có độ pha loãng cao nhất giết chết hai con chuột

(hoặc tất cả các con chuột được tiêm), từ những dữ liệu này có thể tính toán số ml / MLD.

Hình 6: Chuột được tiêm Botulinum/ A (chuột phải) và dung dịch đệm muối phosphate

(chuột trái). Chuột bị tiêm chất độc có triệu chứng thắt lưng ong điển hình.

Phương pháp thí nghiệm trên chuột vẫn là một trong những phương pháp nhạy cảm nhất để

phát hiện Botulinum. Độ nhạy của phương pháp này trong khoảng 20-30 pg cho BoNT/A

và 10-20 pg / ml cho BoNT/B (Theo nghiên cứu của Ferreira và cộng sự 2004 , .Wictome et

al. , 1999).

d. Đánh giá:

Ưu điểm:

- Độ nhạy của phương pháp cao.

Nhược điểm:

- Liên quan đến vấn đề y đức khi sử dụng động vật thí nghiệm (dùng dấu hiệu chết của

chuột làm điểm kết thúc thí nghiệm).

- Thời gian thí nghiệm dài.




- Đòi hỏi phải có cơ sở vật chất chuyên ngành cho động vật,

- Ngoài ra còn có sự thay đổi đáng kể kết quả quan sát được ở các phòng thí nghiệm

khác nhau.

Phương pháp dựa trên acid nucleotide:

Phương pháp multiplex PRC [11]

a. Cơ sơ khoa hoc

Multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp inviro để tổng hợp và

khuyếch đại cùng 1 lúc nhiều đoạn DNA đặc thù trong cùng 1 ống nghiệm, nhờ công hiệu

của các cặp mồi oligonucleotide (CBML) gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham

gia của DNA polymerase.

b. Phương pháp:

Thực hiện các phản ứng PCR phát hiện riêng từng chủng C.btulinum nhóm A, B, E, F với

các cặp mồi CBMLA, CBMLB, CBMLE, CBMLF trong hỗn hợp DNA của bốn chủng

C.botulinum nhóm A, B, E và F.

c. Kết quả

Hình 7: kết quả phương pháp Multiplex PCR

Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2: C.

botulinum loại A; 3: C. botulinum loại B; 4: C.

botulinum loại E; 5:C. botulinum loại F; 6: C.

botulinum thủy phân protein loại A, B và F; 7:

C.botulinum không thủy phân protein loại B, E và F;

8: C. botulinum loại A, B, E, và F; và 9: mẫu trắng




Dựa vào gel agarose 1,5% sau khi điện di, xem kết quả điện di trên đèn UV kết quả được

trình bày ở bảng dưới đây:

Nhóm Mồi Trình tự từ 5’ – 3’Độ dài sản phẩm

PCR (bp)

ACBMLA1 AGCTACGGAGGCAGCTATGTT

782CBMLA2 CGTATTTGGAAAGCTAGGAAGG

BCBMLB1 CAGGAGAAGTGGAGCGAAAA

205CBMLB2 CTTGCGCCTTTGTTTTCTTG

ECBMLE1 CCAAGATTTTCATCCGCCTA

389CBMLE2 GCTATTGATCCAAAACGGGA

FCBMLF1 CGGCTTCATTAGAGAACGGA

543CBMLF2 TAACTCCCCTAGCCCCGTAT

Bang : các cặp mồi dùng trong phương pháp Multiplex PCR

d.Đánh giá:

Ưu điểm của phương pháp PCR:

- Thời gian cho kết quả nhanh, có thể phát hiện cùng lúc nhiều loại vi khuẩn Clostrodium

botulinum

- Mồi đặc hiệu nên hầu hết các loại độc tố có thể phát hiện và không xảy ra hiện tượng bắt

cặp mồi nhầm hay bắt cặp để phát hiện những loại vi khuẩn khác / độc tố loại C, D, G.

- Độ nhạy của phản ứng có thể phát hiện 10-2 – 103 spores/g mẫu thực phẩm.

- Ít tốn kém về mặt nhân sự

Nhược điểm:

- Điều kiện phản ứng phức tạp do nhiều phản ứng bắt cặp cùng xảy ra trong cùng 1

ống nghiệm.

- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn đến

trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết.

- Qúa trình phân tích trên gel agarose có thể xảy ra khó khăn do bị nhiễm bởi các yếu tố môi

trường.

- Kết quả cần phải so sánh với kết quả của thí nghiệm trên chuột.




e. Cải thiện bằng phương pháp Real-time PCR:[8,12]

Real time PCR có thể cải thiện sự nhiễm tạp chất từ bên ngoài có trong phương pháp

multiplex PCR do bỏ qua quá trình phân tích trên gel agarose.

Độ nhạy của phản ứng cao 103 - 105CFU/ml tổng DNA trong phản ứng PCR.

Tuy nhiên, phương pháp Real-time PCR đòi hỏi mồi phải gắn chất phát quang và giá thành

để thực hiện 1 phản ứng cao hơn so với các phương pháp Multiplex PCR.

Phương pháp sư dung DNA microarrays[2]

a. Cơ sở khoa học

Một micorarray DNA là phương pháp cho phép các nhà khoa học để thực hiện một thử

nghiệm trên hàng ngàn gen cùng một lúc. Mỗi điểm trên một microarray chứa nhiều sợi đơn

DNA. Trình tự DNA trên mỗi điểm là duy nhất, nên mỗi điểm đại diện cho một gen. Hàng

ngàn điểm được dàn trận trong các hàng và cột theo một trật tự nhất định trên một bề mặt

rắn. Vị trí chính xác và trình tự của mỗi điểm được ghi lại trong một cơ sở dữ liệu máy tính.

Khi các gen gây độc tốc Botulinum (có gắn chất phát quang) kết hợp với các đơn sợi DNA

sẽ tạo màu dưới sự kiểm soát của máy tính.

b. Phương pháp




Hình 8: phương pháp DNA microarray

Đoạn gen của độc tố sẽ được trích ly dưới dạng RNA trong quá trình phiên mã, sau đó đoạn

RNA sẽ được chuyển đổi thành cDNA là đoạn DNA đơn sợi có khả năng kết hợp khi gặp

đơn sợi DNA tương đồng. Đoạn cDNA trước khi thực hiện thí nghiệm sẽ được đánh dấu

bằng chất phát quang.

Sau khi cDNA được nhỏ vào microarrays, những cDNA đơn sợi sẽ kết hợp với những DNA

đơn sợi có săn trong microarrays và giải phóng chất phát quang.

c. Kết quả

Microarrays sẽ được đọc trên máy tính, chất phát quang thường dùng trong microarrays

thường tạo ra 3 màu:

Màu đỏ: là những điểm chứa đoạn gene gây độc tố

Màu xanh: là những điểm chứa đoạn gen đối chứng

Màu vàng: là những điểm chứa đoạn gen vừa gây độc tố vừa đối chứng

d. Đánh giá

Ưu điểm:

- Có thể phát hiện nhanh các đoạn gen Botulinum gây độc tố, độ nhạy cao.

- Những đoạn gen cố định trên microaarays là những đoạn gen đã biết được trình tự

săn, do đó có thể phát hiện nhiều loại vi khuẩn mang gen độc tố Botulinum cùng lúc.

- Thời gian thực hiện ngắn

Nhược điểm:

- Khó khăn trong việc trích ly các RNA trong quá trình phiên mã

- Đòi hỏi những máy móc, thiết bị chuyên dụng

- Giá thành thực hiện phương pháp cao




Phương pháp dựa trên kháng thể – kháng nguyên:

III.3.1. Phương pháp sandwich ELISA[1,4,7,13]

a. Cơ sơ khoa học

ELISA (Enzyme-linked immunoSorbent Assay- xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với

enzym) dựa vào sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản

phẩm có màu hay phát sáng. Trong đó tích chất hoạt hóa của enzyme và độ đặc hiệu của

kháng thể là không đổi.

b. Phương pháp

Tách C. botulinum từ các dịch nổi, sau được pha loãng trong dung dịch đệm casein. Thêm

100 µL của kháng thể được phát hiện pha loãng với từng ống. Sự thay đổi màu sắc được đo

bằng một multiscanner ELISA tại 492nm , các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng

cách sử dụng các kháng thể thứ cấp có gắn với ezyme alkaline Phosphatase. Bằng cách theo

dõi sự đổi màu, có thể phát hiện và định lượng kháng nguyên

Hình 9: cơ sở khoa học phương pháp Sandwich ELISA

c. Kết quả




Hình 10: kết quả thực hiện phương pháp Sandwich ELISA với những độ pha loãng mẫu

khác nhau

Dựa vào chỉ số LD50 (hàm lượng độc tố Botulinum dùng để gây chết 50% động vật trong 1

khoảng thời gian xác định), phương pháp Sandwich ELISA có thể phát hiện được độc tố

Botulinum trong các mẫu thực phẩm khác nhau với độ nhạy khá cao (LD50=200) khi độ

pha loãng là 20 lần. (theo nghiên cứu của Hervé Volland và cộng sự, 2007).

Một nghiên cứu khác của Scotcher, Cheng và Stanker, cũng đưa ra kết luận rằng, phương

pháp sandwich ELISA có thể phát hiện nhanh 25pg/ml độc tố Botulinum A và 39pg/ml độc

tố Botulinum B có trong bơ và sữa.

d. Đánh giá

Ưu điểm

- Thời gian thực hiện ngắn

- Độ chính xác cao khi độ pha loãng thấp, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi

trường

- Được dùng để phát hiện nhanh thực phẩm (rắn, lỏng) bị nhiễm độc tố

- Theo nghiên cứu khác của Sharma và cộng sự, 2006 [17], phương pháp ELISA

truyền thống có thể phát hiện hầu hết các độc tố Botulinum với độ nhạy 60pg/ml cho

BoNT/A, 176pg/ml cho BoNT/B, 163pg/ml cho BoNT/E, 117pg/ml cho BoNT/F,

phương pháp ELISA còn có thể phát hiện nhanh thực phẩm bị nhiễm 4 loại độc tố




Botulinum A, B, E, F với nồng độ 2ng/ml. Do đó, phương pháp sandwich ELISA có

khả năng phát hiện độc tố nhạy hơn so với phương pháp ELISA truyền thống.

Nhược điểm :

- Phương pháp cần sử dụng nhiều đến kỹ thuật đánh dấu chất phát quang

- Chi phí thực hiện cao

III.3.2. Sử dụng ái lực giữa kháng nguyên và kháng thể:[10,18]


Dựa vào ái lực giữa phức kháng nguyên - kháng thể và các chất có khả năng giữ kháng thể

có săn trong màng lọc, sẽ giữ lại các phức kháng nguyên - kháng thể. Dưới tác động của

dung dịch có chứa horseradish – peroxidase (HRP)-labeled steptavidin sẽ kết hợp với biotin,

và dung dịch hoạt hoá enzyme HRP sẽ làm kết tủa 3,3’5’,5’ tetramethyl-benzidine (TMP)

tạo thành 1 vệt màu có thể nhìn thấy bằng mắt thường ở nhiệt độ phòng.

b. Phương pháp

Mẫu có chứa độc tố sẽ được ủ với biotinylated để kết hợp với kháng thể trong khoảng 10

phút, tạo thành phức kháng nguyên- kháng thể. Phức kháng nguyên và kháng thể sẽ được

giải ly qua cột chứa màng lọc có gắn chất có khả năng giữ kháng thể.

Sau đó 1 dung dịch có chứa HRP-labeled steptavidin được đưa qua cột để HRP kết hợp

được với biotin có trong phức kháng nguyên-kháng thể.

Một dung dịch khác cũng tiếp tục chảy qua cột để làm hoạt hoá enzyme HRP bằng cách làm

kết tủa TMP tạo thành vệt màu.

Những phức kháng nguyên-kháng thể hay những kháng nguyên sẽ không kết hợp được với

kháng thể có trong màng lọc sẽ được đưa ra ngoài.




Hình 11: cơ sở khoa học phương pháp sử dụng ái lực giữa kháng nguyên và kháng thể

c. Kết quả

Hình 12: kết quả phương pháp sử dụng ái lực giữa kháng nguyên- kháng thể phát hiện độc

tố Bolutinum

Theo nghiên cứu của Jason Brunt và cộng sự, 2010, có thể phát hiện 0.05ng/ml cho

BoNT/A, 5ng/ ml cho BoNT/B, 0.5ng/ ml cho BoNT/E và 5ng/ ml cho BoNT/F

d. Đánh giá

Ưu điểm:

- Phương pháp thực hiện đơn giản

- Độ nhạy cao, thời gian thực hiện ngắn (<20 phút)

Nhược điểm

- Theo nghiên cứu của Jason Brunt và cộng sự, 2010, phương pháp này cho kết quả

âm tính đối với mẫu là nước ép táo. Theo tác giả, nguyên nhân có thể giải thích một

số chất có trong nước ép táo có thể tác động đến khả năng tạo phức của kháng

nguyên- kháng thể hay khả năng kết hợp giữa phức với chất giữ kháng thể có trong

màng lọc.




III.3.3. Lateral flow assays[14]

Hình 13: cơ sở khoa học của phương pháp Lateral flow assays

Từ cơ sở khoa học giữa ái lực kháng nguyên- kháng thể mà các nhà khoa học đã phát minh

thành công 1 sản phẩm thương mại có thể phát hiện nhanh độc tố Botulinum, tên là lateral

flow assays.


Cơ sở khoa học của phương pháp này gần giống với cơ sở khoa học của phương pháp

ELISA và phương pháp hiện màu giữa kháng nguyên và kháng thể.

Khi các kháng nguyên và kháng thể kết hợp, dưới tác dụng các chất có săn trong môi trường

sẽ hiện màu thể hiện mẫu có chứa độc tố Botulinum

b. Phương pháp

Dưới tác động của lực dẫn mao quản, mẫu chứa độc tố sẽ theo dòng chảy đến vị trí có

kháng thể chứa các chất phát màu (nanoparticle) và kết hợp với các kháng thể đó.

Các phức giữa mẫu và nanoparticle sẽ tiếp tục theo dòng chảy đến vị trí có chứa các chất

phát hiện màu để ủ trong thời gian ngắn. Sau đó, dòng chảy sẽ tiếp tục đưa mẫu đến với vị

trí chứa các kháng thể.

Các phức giữa mẫu ( có chứa hay không chứa độc tố) và nanoparticle sẽ kết hợp với các

kháng thể ngay tại vị trí đó và hiện màu.




c. Kết quả

Nếu trên thanh kiểm tra có chứa 2 vạch màu đỏ : mẫu có chứa độc tố Bolutinum

Nếu trên thanh kiểm tra có chứa 1 vạch màu đỏ ở phía trên : mẫu không có chứa độc tố

Bolutinum

d. Đánh giá

Ưu điểm

- Phương pháp thực hiện nhanh, trong thời gian ngắn

- Các bước chuẩn bị mẫu đơn giản

Nhược điểm:

- Độ nhạy không cao

- Không phát hiện được độc tố Botulinum thuộc nhóm nào

I. Kết luận[1,5,15]:

Sự phát triển các phương pháp hiện đại phát hiện nhanh độc tố Botulinum trong môi trường

in vitro đã tập trung vào một hoặc cả hai mục tiêu:

(1) phản ứng nhạy có thể thay thế cho thí nghiệm trên chuột

(2) cơ chế phản ứng xảy ra nhanh mà có thể được sử dụng để sàng lọc mẫu trong thời gian

ngắn.

Do đó, phương pháp phát hiện độc tố Botulinum dựa trên acid nucleic và dựa trên kháng thể

–kháng nguyên tiếp tục được các nhà khoa học trên thế giới cải thiện và phát triển sao cho

khả năng phát hiện độc tố ở nồng độ thấp (pg/mL hoặc thấp hơn), trong thời gian ngắn với

độ nhạy cao hơn so với các phương pháp truyền thống như thí nghiệm trên chuột.

Hiện nay, các phương pháp mới đã giải quyết được vấn đề về thời gian, độ nhạy nhưng vẫn

còn 1 số hạn chế như:

- Đối với phương pháp PCR / Multiplex PCR chỉ phát hiện trong môi trường có sự

hiện diện của vi khuẩn Clotrodium botulinum thông qua DNA của loài vi khuẩn này,




chưa phát hiện được trong môi trường chứa vi khuẩn này có sự tồn tại của độc tố

Botulium hay không.

- Đối với phương pháp xác định độc tố dựa trên kháng nguyên và kháng thể, hiện nay

được xem là phương phám mang lại nhiều điểm ưu việt cho việc phát hiện độc tố

Botulinum hơn phương pháp sử dụng acid nucleotide vì độ nhạy của các phương

pháp thường bằng hoặc cao hơn so với phương pháp chuẩn là phương pháp thí

nghiệm trên chuột. Tuy nhiên, các phương pháp dựa trên tương tác giữa kháng

nguyên và kháng thể không giải đáp được vấn đề về độc tố đang ở dạng hoạt động

hay không có khả năng hoạt động.

- Bên cạnh đó, vấn đề sự tồn tại của độc tố trong các môi trường khác nhau, hay nhiều

loại độc tố Botulinum hay độc tố của các loài vi khuẩn khác cùng tồn tại trong 1 môi

trường cũng tạo nên những khó khăn và thách thức cho các phương pháp hiện đại với

độ nhạy tương đối cao.

- Mặt khác, đối với những mẫu khó phát hiện độc tố Botulinum thì quá trình tách, trích

ly, làm tinh sạch độc tố cũng góp phần tạo nên những vấn đề đang tồn tại với những

phương pháp hiện đại như PCR, tạo nên giá thành cho 1 phản ứng thử nghiệm tương

đối cao.

Vì những lý do trên và những kiến thức và thành công cơ bản của các phương pháp hiện

nay, trong tương lai các nhà khoa học có thể cải tiến, phát minh ra những phương pháp mới

có thể phát hiện độc tố Botulinum và hạn chế tối đa được những vấn đề đang tồn tại.

TAI LIỆU THAM KHAO:

1. Andreja Rajkovic, B. E. M., Youssef Fikri, Katelijne Dierick, Willy Zorzi,

Ernst Heinen, Ahu Uner, Mieke Uyttendaele (2012). "Detection of

Clostridium botulinumneurotoxins A and B in milk by ELISA and immuno-

PCR at higher sensitivity than mouse bio-assay." Food Anal. Methods 5: 319-

326.

2. Brian H. Raphael, L. A. J., Loretta M. McCroskey, Carolina Lúquez, Susan E.

Maslanka (2010). "Detection and differentiation of Clostridium




botulinumtype A strains using a focused DNA microarray." Molecular and

Cellular Probes 24: 146-153.

3. Haim M. Solomon and Timothy Lilly, J. (2001). Chapter 17: Clostridium

botulinum. Bacteriological Analytical Manual

4. Hervé Volland, P. L., Marie-Claire Nevers, Christelle Mazuet,Eric Ezan,

Laure-Marie Neuburger, Michel Popoff, Christophe Créminon ( 2008 ). "A

sensitive sandwich enzyme immunoassay for free or complexed Clostridium

botulinumneurotoxin type A." Journal of Immunological Methods 330: 120–

129.

5. Jay W. Grate, R. M. O. J., Marvin G. Warner,James D. Marks, Cynthia J.

Bruckner-Lea (2010). "Advances in assays and analytical approaches for

botulinum-toxin detection." Trends in Analytical Chemistry 29(10): 1137-

1156.

6. L., N. D. (2008). Ve Sinh An Toan Thuc Pham, Nha xuat ban Ky Thuat.

7. Larry H. Stanker, P. M., Miles C. Scotcher, Luisa W. Cheng (2008).

"Development and partial characterization of high-affinity monoclonal

antibodies for botulinum toxin type A and their use in analysis of milk by

sandwich ELISA." Journal of Immunological Methods 336: 1-8.

8. Lucia Fenicia, P. F., Bart J. van Rotterdam, Fabrizio Anniballi, Bo Segerman,

Bruna Auricchio,Elisabetta Delibato, Raditijo A. Hamidjaja, Peter R.

Wielinga, Cedric Woudstra, Joakim Ågren,Dario De Medici, Rickard

Knutsson (2011). "Towards an international standard for detection and typing

botulinum neurotoxin-producing Clostridia types A, B, E and F in food, feed

and environmental samples: A European ring trial study to evaluate a real-

time PCR assay." International Journal of Food Microbiology 145: S152–

S157.

9. Luisa W. Cheng, K. M. L. a. L. H. S. (2012). Current Methods for Detecting

the Presence of Botulinum Neurotoxins in Food and Other Biological

Samples. Bioterrorism: 1-16.




10. Maria Sz|Âlagyi, V. R. R., Dwayne Neal, Gerald A. Merrill, Mark A. Poli

(2000). "Development of sensitive colorimetric capture elisas for Clostridium

botulinumneurotoxin serotypes A and B." Toxicon 38: 381-389.

11. MIIA LINDSTRO¨M, R. K., ANNUKKA MARKKULA, MARI NEVAS,

SEBASTIAN HIELM, HANNU KORKEALA (2001). "Multiplex PCR Assay

for Detection and Identification of Clostridium botulinumTypes A, B, E, and

F in Food and Fecal Material." APPLIED

ANDENVIRONMENTALMICROBIOLOG 67(12): 5694-5699.

12. Sebastian Kirchner, K. M. K., Martin Schulze, Diana Pauly, Daniela Jacob,

Frank Gessler, Andreas Nitsche, Brigitte G. Dorner and Martin B. Dorner

(2010). "Pentaplexed Quantitative Real-Time PCR Assay for the

Simultaneous Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin-

Producing Clostridia in Food and Clinical Samples." Appl. Environ.

Microbiol. 76(13): 4387-4397.

13. Seung-Mok Han, J.-H. C., Il-Hoon Cho, Eui-Hwan Paek, Hee-Bok Oh, Bong-

Su Kim, Chunsun Ryu, Kyunghee Lee, Young-Kee Kim, Se-Hwan Paek

(2007). "Plastic enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)-on-a-chip

biosensor for botulinum neurotoxin A." Analytica Chimica Acta 587: 1-8.

14. Shashi K. Sharma, B. S. E., Robert L. Bull, Donald H. Burr,and Richard C.

Whiting (2005). "Evaluation of Lateral-FlowClostridium botulinum

Neurotoxin Detection Kits for Food Analysis." APPLIED

ANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY 71(7): 3935-3941.

15. Theresa A.N. Ekong, K. M., Dorothea Sesardic (1995). "Detection of

Clostridium botulinurn toxin type A in therapeutic preparations "

Immunological Journal of Immunological Methods 180: 181-191.

16. Thước, T. L. (2010). Xây dựng quy trình và chế tạo các bộ kit PCR để xét

nghiệm các vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm NXB ĐH Quốc gia

Tp.HCM.

17. Sharma, S. K., Ferreira, J. L., Eblen, B. S., and Whiting, R. C. (2006).

Detection of type A, B, E, and F Clostridium botulinumneurotoxins in foods




by using an amplified enzymelinked immunosorbent assay with digoxigenin-

labeled antibodies. Appl Environ Microbiol72(2), 1231-8

18. Jason Brunt, Martin D. Webb, Michael W.Peck (2010), Rapid affinity

Immunochromatography Column-Based tests for sensitive detection of

Clostridium botulinum neurotoxins and Escherichia coli O157, Appl Environ

Microbiol76(13), 4143-4150


Documents

phuong phap xac dinh doc to.doc