Oxidized Phospholipids:  

Roles in Lipid Membrane Structure and Membrane ‐ Aβ Peptide Interactions 

Nguyen Vu Khanh Linh 

Degree Thesis in Chemistry, 30 ECTS

Master’s level

Report passed: 8th February 2011

Supervisor: Gerhard Gröbner

Examiner: Magnus Wolf‐Watz

 

Table of Contents Abstract ................................................................................................................................................... 2 

Background.......................................................................................................................................... 3 

Biological Membranes..................................................................................................................... 3 

Alzheimer’s Disease......................................................................................................................... 4 

Macromolecular Crowding.............................................................................................................. 5 

Lipid Classes..................................................................................................................................... 5 

Aim of the Project................................................................................................................................ 6 

Biophysical Techniques for Studying Lipid Membranes...................................................................... 6 

Differential Scanning Calorimetry (DSC) ......................................................................................... 6 

Solid State NMR............................................................................................................................... 8 

Material and Methods......................................................................................................................... 9 

Material ........................................................................................................................................... 9 

Sample Preparation for DSC Studies ............................................................................................... 9 

Sample Preparation for NMR Studies ........................................................................................... 10 

DSC Measurements ....................................................................................................................... 10 

Solid State NMR Measurements ................................................................................................... 10 

Results ............................................................................................................................................... 11 

Differential Scanning Calorimetry (DSC) ....................................................................................... 11 

NMR Studies .................................................................................................................................. 21 

Discussion.......................................................................................................................................... 29 

Effect of Oxidized Phospholipids on DMPC Membranes Studied by DSC ..................................... 29 

Crowding Effect ............................................................................................................................. 30 

Effect of Oxidized Phospholipids on DMPC Membranes Studied by Solid State NMR ................. 31 

Difference between H2O and D2O as Solvents for DMPC/OxLis in NMR Experiment ................... 33 

Interplay between Aβ Peptide and Oxidized Lipids Containing Membranes................................ 33 

Conclusion ......................................................................................................................................... 34 

Acknowledgement................................................................................................................................. 35 

References............................................................................................................................................. 36 

 

 

1  

Abstract Lipid membranes play a crucial  role  in cellular organization and  function. Since membrane compositions  can  change  during  aging  and  due  to  pathological  alterations,  numerous researches  focus on  the elucidation of  the  role of membranes  in  amyloidogenic diseases, 

most prominently Alzheimer’s disease  (AD). AD  is caused by  the aggregation of amyloid‐β peptide,  a  process which  can  accelerate  in  the  presence  of membrane  interfaces.  Since oxidized phospholipids are considered to be involved in pathological conditions like AD, the main  aim of  this project  is  to  identify  the  impact of oxidized  lipids on  the  structural  and dynamical  organization  of  biological  lipid  model  membranes  and  occurring  membane‐peptide  interactions.  For  this  purpose  two  biophysical methods were  applied:  differential scanning  calorimetry  (DSC) and  solid  state nuclear magnetic  resonance  (NMR). The model membranes used, were composed of neutral phosphatidylcholine  lipids  (DMPC) containing varying  amounts  of  oxidized  lipid  species  (PazePC,  PGPC).  The  obtained  results  reveal  a major impact of oxidized lipids on the organization of DMPC bilayer. However, the size of the effect  depends  on  the  pH  present  and  the  concentration  of  oxidized  lipid  present  in  the membrane  system. Moreover,  the  oxidized  lipid‐containing membrane  inhibits  structural changes upon incorporation of amyloid peptide by either dynamic or orientation changing.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2  

Background  

Biological Membranes Biological membranes play a central role  in both the structure and function of all cells, prokaryotic and  eukaryotic  organism  [1].  Lipids,  proteins,  and  carbohydrates  are  the  main  components  of biological membranes. Our  focus  in  this  study  is on  the membrane matrix  forming  lipid molecules (Figure  1).  Membrane  lipids  form  a  two‐dimensional  bilayer,  in  which  membrane  proteins  are embedded  to  fulfill  their  function.  In general,  this bilayer has  to be  in a  fluid‐like,  liquid‐crystalline state  for  the membrane  to  fulfill  its  biological  tasks.  This  fluidity  is modulated  by  the motional dynamics of the lipid molecules and especially their hydrophobic fatty acid chains; and regulation in the fluidity strongly influences the permeability and mechanical properties of the membrane, as well as the activity of membrane proteins [2]. 

 

 

Figure 1: General membrane structure (adapted from Gerhard Gröbner, Umeå University, Sweden). 

 

The most commonly  found membrane  lipids are glycerophospholipids, which are derivatives of sn‐glycero‐3‐phosphoric acid. Glycerophospholipids have the phosphate at the sn‐3 position of glycerol, and  two  long‐chain  hydrocarbons  attached  to  sn‐1  and  sn‐2  through  ester  or  ether  linkages  [1]. Glycerophospholipids  containing  polyunsaturated  fatty  acids  are  highly  prone  to  oxidative modifications  under  various  conditions  including  various  phases  of  disease  progression  to  form oxidized phospholipids  (oxPLs)  [3].  Lipid oxidation  in  vivo may  involve both enzyme‐catalyzed  and non‐enzymatic reactions  [4]. Since the polarity and shape of phospholipids oxidation products may differ  significantly  from  the  structure of  their parent molecules,  they are  supposed  to  change  the properties of biological membranes. Moreover, they can alter lipid‐lipid and lipid‐protein interactions as well as membrane protein functions [4].  

The main  focus  of  this  project  is  to  provide  a  general molecular  understanding  of  the  interplay between  oxidized  lipids  and  their  membrane  environment  and  any  occurring  consequences  for interactions between these membranes and amyloid‐β peptide, the key component in AD disorder.  

3  

Alzheimer’s Disease  Alzheimer’s  disease  is  the  predominant  form  of  senile  dementia  and  is  characterized  by  neuritic plaques and cerebrovascular amyloid deposits [5]. Amyloid‐β peptide (Aβ) is the main compound of Alzheimer’s  amyloid  deposits, which  is  a  cleavage  from  the  amyloid  precursor  protein  (APP).  The most  common  variant,  Aβ1‐42  composes  of  28  extracellular  (hydrophilic)  and  14  transmembrane (hydrophobic)  residues; while  the  shorter  species,  Aβ1‐40  has  only  12  residues  in  transmembrane domain  together with 28 extracellular  residues. The presence of both hydrophilic and hydrophobic residues results  in an amphiphatic behavior of the peptide. At higher concentrations under suitable conditions  of  pH  and  salt  concentration,  Aβ  undergoes  conformational  changes  from  a  non‐toxic random‐coil  structure  into aggregation prone  β‐sheet‐like conformation, which  further progress  to oligomeric  and  finally  fibrillar  structures,  a  process  shown  to  be  toxic  to  neurons  [5]. Due  to  its amphiphatic  property,  Aβ  peptide  can  exhibit  electrostatic  interactions  with  other  components which exist intra‐ and extracellular cell; and there is evidence that Aβ fibril assembly is dependent on interactions with biological surfaces, such as membranes [6]. Figure 2 shows the aggregation process of  the peptide  at  the membrane  surface.  Since oxidized phospholipids once  formed  can  alter  the membrane properties,  it  is  important  to study  the  interaction between Aβ peptide and membrane surface  in  the  presence  of  oxidized  phospholipids  species.  Nevertheless,  the  peptide  originates originally  from  the membrane where  it  is  in a  transmembrane position; a  situation which might  it even  protects  it  from  release  or  forces  it  already  into  ion‐channel  oligomeric  structures  at  this location [7]. However, there is no knowledge about the role of oxidized lipids in these processes.    

  

Figure 2: Schematic model for Aβ peptide interactions with membrane. Top: Electrostatic adsorption to membrane surfaces. Bottom: Insertion of Aβ peptide into membranes (adapted from Bokvist, Gröbner, J. Mol. Biol. (2004) 335, 1039‐1049 [7]). 

4  

Macromolecular Crowding  

In general, membranous  system  found  inside a  cell experiences an effect,  called  “Macromolecular Crowding”,  which  describes  a  restricted  compartment  congested  by  macromolecules.  Therefore there  exist only  a  reduced  free  volume  for biomolecules;  an  effect which  favors  compact protein states  e.g.  by  reduced  protein  solubility;  a  process  which  causes  increased  self‐association  of amyloidogenic proteins  [8]. However,  there are no biophysical studies  to  investigate  the  impact of crowding on the phase behavior of cellular membrane matrices directly. Therefore we  investigated here any eventual effect of crowding agents on the physico‐chemical behavior of specific lipid model membranes. 

 

Lipid Classes  

Since  lipid  membrane  contains  about  thousand  different  pieces  of  phospholipids,  well  defined biological model membranes  have  to  be  used  to  study  structure‐function  relationship  of  a  lipid component  in cell membranes [9].  In this work, the main phospholipids species used here  is DMPC (1,2‐dimyristoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine),  which  has  two  carbons  of  a  glycerol  backbone connected to 14‐carbon long fatty acid chains while the other carbon is connected to phosphocholine group  (Figure 3). To study the impact of oxidized lipids on the properties of DMPC lipid membranes, two   different oxidized  lipids were  incorporated  in varying amounts, namely PazePC (1‐palmitoyl‐2‐azelaoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine)  and  PGPC  (1‐palmitoyl‐2‐glutaryl‐sn‐glycero‐3‐phospho‐choline) which have carboxylic functional groups at sn‐2 position of glycerol, respectively.  

 

         DMPC 

         PazePC 

         PGPC 

Figure  3:  Structures  of  lipids  used  in  this  project:  DMPC  (1,  2‐dimyristoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine),  PazePC (palmitoyl‐2‐azelaoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine), PGPC (1‐palmitoyl‐2‐glutaryl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine). 

 

5  

Membrane  lipids display different polymorphism, depending not only on  the  structure of  the  lipid molecule itself and on its degree of hydration, but also on temperature, pressure, ionic strength, and pH  [10]. Therefore,  in  this project,  the  impact of varying pH and of oxidized  lipids amounts on  the lipid membrane behavior was also investigated with the help of various biophysical techniques.  

 

Aim of the Project  

The  first  aim  of  this  project  is  the  characterization  of  the  structural  and  dynamic  organization  of defined DMPC  lipid bilayer  in  the presence of different OxLis. The  impact on membrane  fatty acid order  and dynamics  in  the membrane hydrophobic  core,  and occurring  long  range  effects on  the polar membrane  region.  Defined OxLis  such  as  PazePC  and  PGPC were  used  in  this  study. OxLis concentration  and  pH  of  the  environment  were  varied  to  observe  their  effect  on  membrane structure. Solvent effect was studied by comparison between normal water and heavy water (D2O) as solvents for NMR experiments. Crowding effect on OxLis is also investigated here by incorporation of Ficoll to the lipid dispersions.  

Secondly, the impact of OxLis species on the interaction between Aβ peptide and membrane matrix is investigated. In order to answer for the question if oxPLs may affect the membrane structure upon electrostatic interaction with the peptide, NMR approach is applied to get molecular insight into the system.  

 

Biophysical Techniques for Studying Lipid Membranes 

Differential Scanning Calorimetry (DSC)  

DSC is the most widely used of all the thermal analysis techniques to obtain information on thermal changes  in a membrane  sample and  therefore  its phase behavior and changes  induced by  specific lipid constituents. In general, the device has two chambers (Figure 4A), with one for the sample and one  for  the  reference  (often  buffer  used).  And  the  signal  from  the  instrument  depends  on  the difference  in energy used  to bring both chambers up  to  the  same  temperature upon heating    [1]. When the sample undergoes a thermo‐tropic phase transition, the sample and the reference behave differently, since the sample needs a very high amount of energy to undergo the phase transition. As a result, change in heat flow into the sample and the reference cells occurs, which can be recorded. The output of the instrument is a plot of differential heat flow (dE/dt) as a function of temperature in which the intensity of the signal is directly proportional to the scanning rate (dT/dt) [10]. 

For the gel to  liquid‐crystalline phase transition of simple phospholipids,  important  information can be achieved by analyzing  these thermograms  (Figure 4C). Tm  is  the highest  temperature during  the transition. T1/2  is the width of the peak at half high, which determines the sharpness of asymmetric peaks. Enthalpy of transition can be integrated from the peaks. 

ΔHcal =  ∫ TpdC  

6  

DSC technique has been of primary importance in studies of lipid phase transition in model biological membranes [9]. In order to have a precise measurement, the reference should have exactly the same composition with the sample cell, but without the target lipids.   

 

  A  B 

             

 C 

 

 D 

 

 

Figure  4:  Concept  of  DSC  studies:  A;  Principle  of  DSC  measurement,  B:  a  DSC  machine,  C:  DSC  thermogram  of  a phospholipid, D: Scheme of phase transitions between gel states (Lβ’), ripple state (Pβ’), and liquid‐crystalline phase (Lα’); (adapted from C. Aisenbrey). 

7  

Solid State NMR  

NMR has proved to be a very powerful tool in the study of lipid polymorphism, especially 31P and 14N solid  state NMR  [10].  Each phospholipids molecule has  at  least one phosphor nucleus  in  its head group, and the same is true with the nitrogen nucleus residing in the choline head group segments of phosphocholine  lipid  species.  The main methods  used  in  this work  for  study  transition  between various lipid phase structures were 31P and 14N solid state NMR.  

31P NMR exhibits 6.6% of the sensitivity of 1H NMR, and 31P is one of the most sensitive nuclei for the NMR  experiment  [11].  31P NMR  senses  the  dynamic  head  group  region  via  the  P  nucleus, whose behavior therefore reflects the membrane surface properties. The 31P line shapes (Figure 5, right) are a  result  of  various  dynamic  averaging  processes  and  can  normally  be  analyzed  based  on  the knowledge  of  the  particular  lipid  head  group  structure  and  the  existing  dynamic  processes  [10]. However,  they  are  not  theoretically  in  a  one‐to‐one  correspondence  with  the  particular  phase structure [11]. In general, in mixed phospholipids bilayers the static 31P NMR spectra are the result of overlapping sub‐spectra of the individual lipid species and therefore difficult to analyze. Therefore, in high  resolution  solid  state NMR,  the  sample  is  spun  at  the magic  angle  to  achieve  isotropic NMR peaks whose  positions  indicate  specific  lipid  species.  This method  is  called magic  angle  spinning (MAS), with the angle 54.70 according to the scaling factor [11]: 

(3cos2θ ‐ 1) 

where θ  is the angle between the axis of rotation and the external magnetic field. When θ = 54.70   

this term is 0 and under fast spinning conditions  the anisotropic chemical shift contributions to the NMR spectrum disappear and only sharp resonances remain, whose position presents the  isotropic chemical shifts, whose values are specific for different  lipids.   Figure 5 shows examples of static 31P and 14N NMR spectra and upon MAS conditions.  

The  nitrogen  nucleus  in  lipid  head  group  can  also  be  useful  for NMR  experiment  by  it  dominant population. With nuclear spin of I>1, 14N has an electric quadrupolar moment which arises from an asymmetrical distribution of  the nuclear  charge  [12]. The quadrupolar moment  interacts with  the electric field by quadrupolar  interaction, which can affect the Zeeman  interaction. The quadrupolar interaction is canceled out in the solution, but not in solid state sample; hence, it results in the Pake pattern as can be seen in Figure 5 (left). 

 

8  

 

31P NMR  14N NMR 

Figure 5: Scheme of 31P and 14N Solid State NMR with and without spinning on DMPC/DMPG and DMPC/DDAB vesicles (adapted from [13]). 

 

 

Material and Methods 

Material  1,2‐dimyristoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine  (DMPC),  1‐palmitoyl‐2‐azelaoyl‐sn‐glycero‐3‐phospho‐choline (PazePC), 1‐palmitoyl‐2‐glutaryl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine (PGPC), were from Avanti Polar Lipids  (Alabaster, USA).  Three  different  buffers were  used  in  this work:  buffer A  (pH  5.0,  20 mM CH3COONa, 10 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM EDTA),   buffer B (pH 7.4, 10 mM Tris, 10 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM EDTA), and buffer C (pH 9.5, 20 mM glycine, 10 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM EDTA).  

 

Sample Preparation for DSC Studies Appropriate amounts of the various lipids used were dissolved in chloroform: methanol (2:1 v/v). The solvent was removed by rotary evaporation and the lipid residue was hydrated. The solution of lipid in water was  then  further dried overnight under vacuum condition  to  remove all organic solvents. The dried lipid powder was collected and stored in the freeze. For each experiment, few milligrams of lipid powder were hydrated by suitable buffer and treated with several freeze‐thaw cycles to obtain homogenous mixtures  of  lipid.  The  liposomes were  used  directly  in DSC measurements  after  the preparation. 

9  

Sample Preparation for NMR Studies The  solid  lipid mixtures was dissolved  in  appropriate buffer  at 1:60 molar  ratios  (lipid/water)  and homogenized by several freeze‐thaw cycles. The liposome pellet was packed into a 4 mm MAS NMR rotor for NMR studies. 

DSC Measurements The measurements were performed on a VP‐DSC calorimeter (MicroCal, Inc., Northamton, MA, USA). All the samples were degassed before each run.  A volume of 0.5 ml of 3mM liposomes was injected into the sample cell, and the same volume of appropriate buffer was placed  into the reference cell. The cells were at first heated from 5°C to 45°C (scanning rate 60°C/h), then cooled down back to 5°C with the same scanning rate. Then a scan from 5 °C to 45 °C with scanning rate 2 °C/h was preformed and the results of these scans are presented.  

Solid State NMR Measurements 31P measurements were carried out on a 400 MHz Infinity spectrometer (Chemagnetics, U.S.A) with a 4‐mm double  resonance MAS probe. The  isotropic  shift of DMPC vesicles was used as an external reference. The static experiments were acquired by applying a Hahn echo sequence with an  inter‐pulse  delay  of  50 µs.  31P MAS NMR measurements were  done  under  proton  decoupling  using  a single π/2 pulse with 5.5 µs pulse length. 

14N MAS NMR spectra were acquired using a rotor‐synchronized quadrupole echo sequence with π/2 pulse  duration  of  7.3  µs.  For  static  14N NMR  spectra  a  200‐µs  interpulse  delay was  utilized.  The isotropic shift of DMPC vesicles were used as an external reference (0.0 ppm). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10  

Results  

Differential Scanning Calorimetry (DSC) 

Thermotropic phase behavior of  pure DMPC dispersions  

 

Figure 6: DSC heating thermogram of 3 mM DMPC dispersions in buffer B (pH 7.4). 

 

The DSC  heating  scan  of  a  fully  hydrated  aqueous  dispersion  of DMPC  exhibits  two  endothermic transitions  (Figure 6).  The  first event  at 13.00C  shows  the  transition  from  a planar  gel  (Lβ’)  to  the ripple  gel  (Pβ’).  The  second  event  at  23.1

0C  corresponds  to  the  transition  from  a  Pβ’  to  a  lamellar liquid‐crystalline phase (Lα). 

 

Effect of OxLis on DMPC Membranes  

Lipid  vesicles made of DMPC  lipids with  varying  concentrations of different OxLis were  examined under the same DSC conditions as for pure DMPC bilayers, namely from 50C to 450C with a 20C/h scan rate.  

Clearly the phase behavior of DMPC bilayers  is severely changed upon the presence of PazePC. The main  transition  observed  for  all  three  different  concentrations  of  PazePC,  seems  to  be  a supercomposition of two peaks.  As the PazePC concentration increases under the same pH condition (pH7.4), one  can  see  that  the  sharp  component  is  shifted  to  lower  temperatures while  the broad 

11  

component stays at the same position  (Figure 7). The total enthalpy  (Table 1) of both components increases according to an increasing PazePC concentration.  

 

 

Figure 7: DSC heating  thermogram of DMPC  in  the present of: 2%  (black), 5%  (blue) and 10%  (red) PazePC. The  lipid concentration is 3 mM in buffer B (10 mM Tris, pH 7.4).  

 

 DMPC/10%PazePC at Different pH 

In the presence of 10% PazePC there is a large impact on the DMPC transition as a function of the pH (Figure 8). The pre‐transition disappears at all three pH conditions (5.0, 7.4 and 9.5). At pH 5.0 and 7.4, the main transition behavior looks quite similar. Here, the thermograms seems to be asymmetric consisting of two overlapping thermal events; one of these components is considerably sharper than the other. The sharp component  is shifted to  lower temperatures compared to a pure DMPC main transition while the broad component is shifted to a slightly higher temperature. The total enthalpy of two components is larger than in pure DMPC (Table 1). There is a reducing of total enthalpy when the environment is more basic. Especially, at pH 9.5, the main transition is almost abolished. 

 

 

12  

 

Figure 8: DSC heating thermogram of DMPC in the present of 10% PazePC at three different buffers:  A (pH 5.0), B (pH 7.4) and C (pH 9.5). 

 

Crowding Effect  

To  study  the effect of  the crowding environment on  the phase behavior of  lipids membranes,  the lipid systems were also studied by DSC in the presence of 200 mg/ml Ficoll (see Figure 9, 10, 11, 12). It  can be  seen  that  even DMPC  alone  is  also  affected by  the  crowding  conditions.  The  significant effect caused by crowding is a reduction in enthalpy of the gel to liquid‐crystalline transition. Results are summarized in Table 1 and 2. 

13  

 

10 20 30

0

2

4

6

8

10

DMPC with Ficoll DMPC without Ficoll

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

 

Figure 9: DSC heating thermogram of pure DMPC in buffer B (pH 7.4) with (red) and without (black) 200mg/ml Ficoll. 

10 15 20 25 30 35 40

0

2

4

6

8

10

12 paze10% pH7.4 with Ficoll paze10% pH7.4

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

 

Figure 10: DSC heating thermogram of DMPC/10% PazePC in buffer B (pH 7.4); the red line corresponds to a lipid mixture with Ficoll present. 

 

14  

10 15 20 25 30 35 40

0

2

4

6

8

10

12

paze10% pH5.0 with Ficoll paze10% pH5.0

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

 

Figure 11: DSC heating thermogram of DMPC/10% PazePC in the presence of buffer A (pH 5.0). The red line corresponds to a lipid mixture with Ficoll present.  

10 15 20 25 30 35 40-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

paze10% pH9.5 with Ficoll paze 10% pH9.5

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

 

Figure 12: DSC heating  thermogram of DMPC/10% PazePC  in  the presence of buffer C  (pH 9.5; black  line)  containing 200mg/ml Ficoll (red line).  

15  

Table 1: Phase  transition  temperature, enthalpy  for gel‐liquid crystalline  transition of pure DMPC  in buffer B  (pH 7.4) with and without Ficoll. 

pH 7.4 DMPC 

Without Ficoll  With Ficoll 

Tm (⁰C)  23.0  22.9 

∆H (kcal/mol)  5.38  5.21 

 

 

 

Table  2:  Phase  transition  temperature,  enthalpy  for  gel‐liquid  crystalline  transition  of  DMPC/10%PazePC  with  and without Ficoll. Tm1 and Tm2 are temperature for the sharp component and the broad component, respectively. At pH 9.5, these transition peaks were too broad to be integrated.  

pH 5.0  pH 7.4  pH 9.5 DMPC/10%PazePC Without Ficoll 

With Ficoll  Without Ficoll 

With Ficoll  Without Ficoll 

With Ficoll 

Tm1 (⁰C)  21.3  21.5  21.2   21.6   ‐  ‐ 

Tm2 (⁰C)  23.6  23.5  23.9  23.6     

∆H  total (kcal/mol)  

7.00   5.84  6.80  6.55  ‐  ‐ 

 

 

DMPC/2%PazePC at Different pH 

At lower concentrations of PazePC, namely 2%, the effect on DMPC bilayers is much less pronounced than  the  one  observed  for  10%PazePC.  The  pre‐transition  can  be  seen  as  7.6  0C,  but  it  is much broader  than  in pure DMPC and  the  intensity  is  reduced. At pH 7.4 and 9.5 a  second  component around the main transition area can be seen (Figure 13). The enthalpy is highest at pH 7.4, and quite similar at the other two pH conditions. Results are shown in Table 3. 

 

16  

20 25

0

10

20

paze2% pH9.5 paze2% pH5.0 paze2% pH7.4

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

 

Figure 13: DSC heating thermogram of DMPC  in the present of 2% PazePC at three different buffers:   A (pH 5.0), B (pH 7.4) and C (pH 9.5). 

 

Table 3: Phase transition temperature, enthalpy for gel‐liquid crystalline transition of DMPC/2%PazePC with and without Ficoll. For crowding effect, the thermograms are not shown. 

pH 5.0  pH 7.4  pH 9.5 DMPC/2%PazePC Without Ficoll 

With Ficoll  Without Ficoll 

With Ficoll  Without Ficoll 

With Ficoll 

Tm (⁰C)  22.9  22.9  22.9  23.0  22.8  22.9 

∆H (kcal/mol)  5.97  5.19  6.58  6.14  5.94  5.55 

 

DMPC/2%PGPC at Different pH 

Similar to PazePC, PGPC has a carboxylic group at the end of sn‐2 chain, but it has 4C less than in the sn‐2 chain. At 2% PGPC concentration, the pre‐transition can still be observed at around 80C, and the main  transition  is  almost  the  same  as  in  pure  DMPC  (Figure  14).  The  peaks  were  broadened compared  to  pure DMPC. At  pH  7.4  and  9.5,  there  is  another  component  appearing  in  the main transition. The total enthalpy increases according to increasing pH. The crowding effect also reduces the enthalpy of the transition peaks, with values given on Table 4. 

17  

20

0

5

10

15

PC/PGPC 2% pH9.5 PC/PGPC 2% pH7.4 PC/PGPC 2% pH5.0

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

Figure 14: DSC heating thermogram of DMPC in the presence of 2% PGPC at three different buffers:  A (pH 5.0), B (pH 7.4) and C (pH 9.5). 

 

Table 4: Phase transition temperature, enthalpy for gel‐liquid crystalline transition of DMPC/2%PGPC with and without Ficoll. 

pH 5.0  pH 7.4  pH 9.5 DMPC/2% PGPC Without Ficoll 

With Ficoll  Without Ficoll 

With Ficoll  Without Ficoll 

With Ficoll 

Tm (⁰C)  22.9  23.0  22.8  23.0  22.8  22.9 

∆H (kcal/mol)   5.84  5.73  5.96  4.43  6.49  5.56 

 

Effect of Aβ peptide Incorporated into DMPC/PazePC Dispersions  

Upon  incorporation of Aβ peptide,  the  transition behavior of DMPC/10%PazePC has changed with respect to transition temperature and enthalpy. As can be seen in Figure 15 the sharp component in peptide‐containing  lipid  dispersions was  broadened  and  shifted  to  lower  temperatures, while  the broad component was slightly shifted towards higher temperatures. Table 5 shows temperature and enthalpy values of the lipid mixture prior and upon incorporation of the peptide. Enthalpy of the gel‐liquid crystalline transition was significantly reduced upon the presence of peptide.  

18  

 

Figure  15: DSC  heating  thermogram  of DMPC/10%PazePC  (black)  in  buffer  B  (pH  7.4)  and  upon  incorporation  of Aβ peptide (red) at a molar ratio (DMPC/10%PazePC)/peptide 100/1. 

 

Crowding Effect on DMPC/PazePC/Peptide Dispersions  

Figure  16  shows  three  thermograms  of  peptide  free  DMPC/10%Paze  vesicles  (black),  DMPC/10%PazePC vesicles containing Aβ peptide at a 100/1 molar ratio without (red) and with ficoll crowding agent (200 mg/ml Ficoll; blue  line).  It can be seen that  in the presence of Ficoll the sharp component  in  the  thermogram  is  shifted  to  higher  temperature.  The  total  enthalpy  of  two components also increases.  

 

 

19  

 

Figure 16: DSC heating thermogram of DMPC/10%PazePC in buffer B (pH 7.4) and upon incorporation of Aβ peptide (red) at a molar  ratio  (DMPC/10%PazePC)/peptide at 100/1 molar  ration prior und upon  the presence of  Ficoll. Black  line: DMPC/10%PazePC, red line:  DMPC/10%PazePC/peptide, blue line: DMPC/10%PazePC/peptide + Ficoll 200mg/ml. 

 

 

Table 5: Phase  transition  temperature, enthalpy  for gel‐liquid crystalline  transition of DMPC/10%PazePC/peptide with and without Ficoll. Tm1 and Tm2 are temperature for the sharp component and the broad component, respectively. Buffer used was buffer B, pH 7.4. 

  DMPC/10%PazePC  (DMPC/10%PazePC)/peptide 100/1 molar ratio 

(DMPC/10%PazePC)/peptide 100/1 molar ratio with 200 

mg/ml Ficoll 

Tm1 (⁰C)  21.2  20.7  21.3 

Tm2 (⁰C)  23.9  24.3  23.8 

∆H (kcal/mol)  6.80  5.05  6.59 

 

20  

NMR Studies 

Behavior of DMPC Bilayers Studied by 31P Solid State NMR  

A typical NMR spectrum, also called “powder pattern” of multilammellar DMPC vesicles can be seen for different temperatures in Figure 17A. Upon increase in temperature the chemical shift anisotropy (the  width)  of  the  NMR  powder  pattern  becomes  smaller.  Figure  20  shows  the  temperature dependence of the relative chemical shift values for the high‐field edge of the NMR spectra. There is a decrease  in chemical shift values at around 286K, where the pre‐transition occurs. After that, the chemical shift increases back to the same level as before, and decreases again from 295K, where the main phase transition occurs. .   

 

Effect of Oxidized Phospholipids on DMPC Studied by 31P Solid State NMR  

DMPC/10%PazePC at Different pH 

At  pH  7.4,  in  comparison with  pure DMPC  dispersions,  the NMR  spectra  of mixed DMPC/PazePC bilayers (10 %mole PazePC) are similar, but at a specific temperature range two overlapping powder sub‐spectra can be observed, named  inner domain and outer domain (Figure 17). Compared to the relevant DSC diagram, the second high‐field NMR peak appears in the temperature region, where the second broad phase transition can be seen (from 295K to 299K). With increasing temperature these inner NMR peaks move closer  to  the peak of  the wider  sub‐spectra. For  the main outer peak,  the chemical shifts have the highest values while the small peaks appear, and are in general higher in the liquid crystalline phase (above phase transition). Figure 18 shows the correspondence between DSC scan and NMR measurement spectra of the sample. In Figure 21 the temperature dependence of the chemical shift values of the high‐field peaks for both sub‐spectra are plotted.  

40 20 0 -20 -40

ppm40 20 0 -20 -40

ppm

 

BA 

0C

15

18

22

25

35

Figure 17: 31P NMR spectra at 400MHz proton frequency of multilamellar DMPC (A) and DMPC/10%PazePC (B) vesicles in H2O in buffer B (pH 7.4). 

21  

 

40 20 0 -20 -40

ppm20 30

0

5

10

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

 

B A 

15 

21 

22

23 

24

35 

0C

Figure 18: Phase behavior of DMPC/10%PazePC at pH7.4 studied by DSC (A) and 31P NMR (B). 

 

DMPC/2%PazePC and DMPC/5%PazePC 

Under  the  same  pH  condition,  DMPC  bilayers  containing  PazePC  at  a  2 mole  %  and  5 mole%,  generate  in  NMR  experiments  complex  spectra,  reflecting  a  polymorphic  membrane  behavior. However, the temperature dependent changes in the chemical shift values of the up‐field edge in the powder pattern (Figure 22) suggest a change in motional reorientation of the lipid. At higher PazePC concentrations, the width of the NMR spectra is reduced, indicating an increase in motional freedom in the membrane interface area.  

Figure 19 shows the NMR spectra of DMPC containing 2 mole% PazePC at pH 7.4. Since the start of the theses measurements, additional NMR resonances appeared compared to the spectra obtained on DMPC/10%PazePC vesicles. Over time the intensities of these components increased. Above 270C, the  sample  started  to behave differently,  resulting  in  complex  spectra. After  the end of  the  static NMR experiments,  the sample was studied by MAS NMR again, and more  than one  isotropic peak was observed (data not shown), indicating lipid fragmentation products.  

At  pH  9.5  the  lipid mixture  seems  to  be  unstable  and  therefore  a  normal wideline NMR  powder pattern was observed only  in  the  first hours of  the NMR  studies;  later  this  sample also degraded rapidly (data not shown). 

22  

A  B 

20 0 -20 -40

0C

21 22 23 24 25 26

0

5

10

15

20

ppm

Cp

(kca

l/mol

e/o C

)

Temperature (oC)

 

Figure 19: Phase behavior of DMPC/2%PazePC at pH7.4 studied by DSC (A) and 31P NMR (B). 

 

 

 

Figure  20:  The  temperature  dependence  of  chemical  shifts  (high‐field  edge)  in  31P  NMR  powder  pattern  of  DMPC multilammellar dispersions 

 

10 

15

18

20

21

23

24

25

27

26

23  

 

Figure 21: NMR chemical shifts (high‐field edge) of DMPC/10%PazePC vesicles as a function of temperature. 

 

 

Figure 22: Chemical shifts versus temperature for DMPC/PazePC at different PazePC concentrations. 

24  

Difference between H2O and D2O as Solvent for DMPC/OxLipids in NMR Experiments 

Since D2O is an essential solvent in NMR experiments, but has slightly different properties compared to H2O a comparison of the behavior of DMPC/Paze10% vesicles  in buffers composed of H2O versus D2O  was  carried  out.  There  are  clearly  differences  in  the  observed  NMR  powder  patterns  of DMPC/10%PazePC  in  these  two  environments.  In D2O  the  splitting  occurs  at  lower  temperatures compared to samples in the presence of H2O (Figure 23). 

40 20 0 -20 -40

ppm40 20 0 -20 -40

ppm

 

0CA  B 

15

21 

22

23

24

35 

Figure 23: 31P NMR spectra at 400MHz proton frequency of multilamellar DMPC/10%PazePC vesicles in H2O (A) and D2O (B). Buffers pH 7.4, 10 mM Tris, 10 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM EDTA in H2O/ D2O. 

 

DMPC/2%PGPC 

At 2 mole % PGPC concentration, the NMR powder pattern of these mixed DMPC/PGPC vesicles has a similar behavior as observed for pure DMPC bilayers (Figure 24). The only effect is a decrease in the size of  the  chemical  shift anisotropy of  the powder pattern, as  can be  seen  in Figure 25. The  less negative  chemical  shift values  for  the high‐field edge of  the NMR  spectra  compared  to  spectra of pure DMPC bilayers indicate a less ordered lipid structure.  

25  

40 20 0 -20 -40

ppm

 

0C

35 

15 

22 25

18 

Figure 24: 31P NMR spectra at 400MHz proton frequency of multilamellar DMPC/2%PGPC vesicles in buffer B containing H2O. 

 

 

Figure 25: Chemical  shifts versus  temperature  for DMPC and DMPC/2%PGPC  in buffer B  (pH 7.4). The blue  solid  line represents for DMPC/2%PGPC, and the green one represents for pure DMPC dispersions. 

 

Isotropic Peaks in 31P MAS NMR 

The  31P MAS NMR  isotropic peak of pure DMPC bilayers at a spinning speed 6 kHz appears at  ‐0.9 ppm  at  308K,  as  can be  seen  in  Figure  26.    In  the presence of  certain  amounts of  PazePC under different pH conditions, the chemical shifts vary slightly. At the presence of 10 mole % of PazePC, the isotropic peak of 31P  is  significantly affected at high pH conditions  (pH 9.5). The  same behavior  is observed  for  2 mole %  PazePC  containing DMPC membranes  under neutral  and  basic  conditions. Moreover, at 2mole %PazePC there was more than one single  isotropic peak to be observed  in the spectra, indicating that the sample was unstable. Values of all the isotropic peaks are summarized in Table 6. 

26  

80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80

ppm

31P MAS DMPC/10azePC pH 7.4

 

Figure 26: 31P MAS spectra at 6 kHz spinning speed of DMPC/10%PazePC at 308K, buffer B (pH 7.4). The isotropic peak is at ‐1.0 ppm. 

 

Table 6: Isotropic peaks for DMPC and different mixtures with oxidized lipids. σ3 is the  main isotropic peaks, whereas 

σ1 and σ2 are small peaks developing during the experiments with low intensities.  

  σ1 (ppm)  σ2 (ppm)  σ3 (ppm) 

DMPC -0.9

DMPC/10%PazePC pH7.4 -1.0

DMPC/10%PazePC pH9.5 -1.5

DMPC/2%PazePC pH7.4 -0.27 -0.82 -1.3

DMPC/2%PazePC pH9.5 -0.26 -0.8 -1.3

DMPC/2%PGPC pH7.4 -0.97

  

27  

Effect of Aβ Peptide on DMPC/PazePC Dispersions  

Both 14N and 31P solid state NMR experiments were carried out on DMPC/10%PazePC vesicles prior and upon incorporation of Aβ peptide (Figure 27 and 28). 

In 31P NMR spectra, it can be seen that at high temperature (350C) there is no significant difference in  DMPC/10%azePC  behavior when  the  peptide  is  present  (Figure  27).  At  gel‐to‐liquid  crystalline transition temperature (230C), however, there is reducing of powder pattern width, and the high field edge  in the powder pattern was shifted to  less negative chemical shift. Two splitting  indicating two phases in the powder pattern can still be seen upon addition of peptide. 

For  14N NMR  spectra  of DMPC/10%PazePC  upon  addition  of  peptide,  the  splitting  in  the  powder pattern decreases about 0.5 kHz at both room temperature and higher temperature (Figure 28). At 230C, moreover, there are other components in the spectra compare to DMPC/10%PazePC only. 

 

 230C 350C 

 

Figure 27: 31P NMR spectra at 400MHz proton frequency of multilammellar DMPC/10%PazePC vesicles at 350C and 230C, respectively. The upper panel shows spectra of peptide‐free vesicles and  the  lower panel spectra obtained of vesicles upon peptide incorporation at a 100/1 lipid to peptide molar ratio. 

 

28  

 

350C  230C

Figure 28: 14N NMR spectra at 400MHz proton frequency of multilammellar DMPC/10%PazePC vesicles at 350C and 230C, respectively. The upper panel shows spectra of peptide‐free vesicles and  the  lower panel spectra obtained of vesicles upon peptide incorporation at a 100/1 lipid to peptide molar ratio. 

 

 

 

Discussion 

Effect of oxidized Phospholipids on DMPC Membranes Studied by DSC  

As seen  in our studies,  lipidperoxidation can cause disordering of  lipid membranes by  incorporation of oxidized lipid species; a process which can alter the polarity of the bilayer interior, the chain‐chain hydrophobic interactions and chain‐water interactions [14]. 

DSC results in this work indicate that the presence of oxidized phospholipids has significant effects on the  physico‐chemical  behavior  of  DMPC membranes,  especially  at  high  contents  and/or  a  basic environment.  

As seen  in Figure 7 the presence of PazePC  lipids  induces the  formation of two components  in the DSC  thermogram  of  mixed  DMPC/PazePC  membranes,  with  the  second  component  already appearing at 2 mole% PazePC. However, at 2 mole% and 5 mole% PazePC, the second component is present  but  not  totally  separated  from  the  sharper  component.  In  general,  an  increasing  PazePC concentration  shifts  the  transition  temperature  to  lower  values;  a  behavior  which  indicates  a 

29  

perturbation of DMPC’s gel phase by the presence of oxidized  lipids. This behavior can be seen for many membrane effectors molecules including e.g. peptides such as gramicidin as shown previously [15]. 

In  the presence of 10% of PazePC,  two  thermal events, visible as a sharp and a broad component, were clearly observed in the gel‐to‐liquid‐crystallize transition area of the DSC profile (Figure 8). The sharp  and broad  components  correspond  to differential melting of OxLi‐poor  and OxLi‐rich DMPC regions, respectively; an observation also seen upon incorporation of cholesterol [16]. At pH 7.4 and 5.0,  the  transition  of  the  sharp  component  was  shifted  to  lower  temperatures,  indicating  a destabilization  of  the  gel  state  in  OxLi‐poor  domain.  The  broad  component,  on  the  other  hand, shifted to slightly higher temperatures; a behavior indicating a destabilization of the liquid‐crystallize phase  in  OxLi‐rich  DMPC  lipid  domains.  The  total  enthalpy  of  the  two  components  in  PazePC‐containing DMPC bilayer is larger than in pure DMPC dispersions, but changes according to the pH of the  environment. Under  acidic  condition  (pH  5.0)  the  total  enthalpy  is  higher  than under neutral conditions (pH 7.4), and at high pH conditions (pH 9.5), the transition is almost abandoned.  For DMPC vesicles containing 2 mole % PazePC, the measured transition temperature was similar to the one observed  for pure DMPC, but  the widths of  the  transition peak were  affected by  the pH conditions  present  (Figure  13). At  pH  5.0,  there  is  only  a  single  peak  indicating  the  gel‐to‐liquid‐crystalline transition. This suggests that under these acidic environment, the presence of 2% PazePC does not induce another component in the DMPC membrane due to the fully protonated, uncharged carboxyl group at  the  sn‐2  chain. The  second  component  starts  to appear at pH 7.4 and 9.5, and Figure 6 shows that the transition peaks are broaden when the pH is higher.   When  studying DMPC bilayers with PGPC  lipids  incorporated at concentrations of 2 mole%, nearly the same effect is induces as in the presence of 2 mole% PazePC (Figure 14). The sn‐2 chain in PGPC has 4‐carbons less than PazePC; this difference in structure does not cause significant differences in bilayer behavior at this concentration. At pH 5.0 there is a single peak; an observation indicating that the carboxyl group in PGPC is still uncharged. However, the transitions seem to be composed of two overlapped  peaks  at  higher  pH.  That  maybe  due  to  the  partially  deprotonated  and  totally deprotonated of carboxyl groups at pH 7.4 and 9.5, respectively.  

Crowding Effect  The  crowding  effects  were  almost  the  same  for  all  mixtures  in  the  study  (DMPC/10%PazePC, DMPC/2%PazePC, DMPC/2%PGPC). The most pronounced effect of the presence of crowding agent (200mg/ml Ficoll) can be seen  in a  reduction of  the enthalpy  for  the gel‐to‐liquid crystalline phase transition;  and  variously  a  reduction  in  the  width  of  the  phase  transition.  However,  the  phase transition  temperature of  the  sharp  component  increases,  indicating a more  stable gel  state. That implies the crowding environment favors the more ordered membrane structure; in the other words, the gel state is stabilized.  The  effect  is  similar when  the Aβ peptide was  incorporated  to  the DMPC/10%PazePC dispersions using buffer B which contained 200 mg/ml Ficoll. In OxLis‐poor domain Ficoll induces more stable gel state  by  higher  phase  transition  temperature,  while  the  OxLis‐rich  domain  was  not  significantly affected.  

30  

Effect of Oxidized Phospholipids on DMPC Membranes Studied by Solid State NMR  

Since lipid bilayers are spontaneously formed by phospholipids molecules after they are hydrated, it is necessary to study  the structure and properties of  these  lipid bilayers composed of well defined molecular species  in  the presence of defined excess of water  [9]. Here 1:60 molar  ratio of  lipid  to water was used for the NMR experiments. 

The lipid bilayer is highly anisotropic, and the main motion of phospholipids is an axial rotation about the lipid long axis in the bilayer [11]. This rotational process and additional wobbling of the lipid long axis and  internal motion  result  in a powder pattern  like NMR  line shapes as can be seen  in Figure 17A.  The  observed  line  shape  is  composed  of  the  sum  of  all  orientations  present  in  powder dispersion  [13], where different molecular orientations present  in  the sample give  rise  to different spectra  frequencies.  These  lineshapes  are  typical  for multilammellar  lipid  bilayers  in  their  liquid‐crystalline phase [13]. The high‐field maximum of the powder pattern corresponds to the molecules oriented perpendicular  to  the magnetic  field axis, and  the downfield maximum corresponds  to  the molecules parallel to the magnetic field [11].  If the molecular motional processes are restricted, an increase  in  the  width  of  the  NMR  powder  pattern  is  expected  due  to  a  reduction  in motional averaging. In Figure 20, the first observed decrease in chemical shift anisotropy occurs around 130C, the temperature where the membrane undergoes its first pre‐transition according to the DSC profile (13.10C).  In  the  gel  state,  the molecules  are  less  flexible  than  in  the  ripple  state. After  the main transition  at 230C,  a  second decrease  in  chemical  shift  values occurs,  as  also  clearly  visible  in  the spectral width of the wideline NMR spectrum as seen  in Figure 17 (left). The smaller spectral width obtained  in  the  liquid‐crystalline phase  can be explained by an additional wobbling motion of  the polar head group and  the  lipid molecule along  its  long axis  [17]. The higher  the  temperature,  the faster  the  rotation  and  the wobbling  (including  amplitude) of phospholipids molecules will be;  all effects resulting in reduced chemical shift anisotropy and reduced width line NMR spectra.  

For DMPC bilayers in the presence of 10%PazePC at pH 7.4,  two different membrane domains can be observed,  indicating an OxLi‐poor (broad sub spectrum) and OxLi‐rich domains, as seen  in Figure 8. These two domains are also visible as a sharp and a broad component in the DSC thermogram. The P nucleus in the two domains may experience two different environment with different dynamics and perhaps slightly different magnetic environment (e.g. ox  lipids with charged carboxyl group sticking out  of  the membrane  [18]  and  others  with  neutral  carboxyl  group  being  incorporated  into  the hydrophobic membrane core.  

Upon combining DSC and NMR data one can conclude that the two phase NMR spectra appear in a temperature range which corresponds to OxLi‐rich domains. The MAS experiment at 350C shows one isotropic peak at  ‐1.0 ppm, which slightly more high‐field shifted than the one  is observed for pure DMPC bilayers (Table 6). 

Figure 21 shows changes  in  the corresponding high‐field edge chemical shift values obtained  from the  temperature  dependent NMR  spectra  acquired  for DMPC/10%  PazePC  vesicles.  A  correlation between the peaks with reduced values  (smaller sub‐spectra) and the main peaks (outer peak) can be  seen.  In  general,  the  anisotropic  chemical  shifts  are  highest  at  the  gel‐liquid  crystalline  phase transition,  and  at  high  temperatures  (350C).  The  increasing  in  chemical  shifts  can  be  due  to  two effects: orientation and dynamics of  the  lipid head group. About orientation,  literature has  shown 

31  

that there is reversal in the sn‐2 acyl chain of oxidized lipids [19], [20] as can be illustrated in Figure 29.  The  oxidized  sn‐2  chain with  the  carboxylic  functional  group  in  PazePC  can  stick  out  of  the membrane surface to be perpendicular or parallel to the bilayer [20]. Once pointing out, the negative charge may have electrostatic interactions with the positively charged nitrogen of the choline group and, hence, changes the orientation of the head group. This way the averaging of the chemical shift 31P tensor around the  lipid  long axis will be affected,  leading to a change  in observed chemical shift anisotropy. In the case of 10% PazePC present the chemical shift anisotropy of the NMR lineshapes is reduced compared to the one obtained for pure DMPC bilayers under the same conditions, as seen in Figure 13. On the other hand, the head group may be oriented closer to the magic angle with respect to the membrane surface (600 values for pure DMPC vesicles at 308 K) [13]. 

The  reversal  of  oxidized  sn‐2  chains  can  affect  dynamic  of  the  head  group  [20].  The  oxidatively modified fatty acyl chains prefer to locate closer to the interface than the corresponding unoxidized chains  to  minimize  the  free  energy  penalty  caused  by  burying  the  polar  groups  within  the hydrophobic membrane core, and thereby to induce lateral expansion of the membrane [18].  

The reorientation of sn‐2 chains can be illustrated in Figure 24. This expanding may lead to increasing of membrane flexibility and then faster lateral diffusion in membrane. 

With DMPC vesicles containing 2 mole% of PazePC, the sample seems to be unstable, and there were additional  components developed  in  the  static NMR  experiments  (Figure 19).  For 5% PazePC,  the membrane behavior was similar (data not shown). After all the static 31P experiments, MAS NMR was run for the sample 2% and 5% PazePC. The results show that some new components occurred in the spectra over time.  

At  a more  basic  environment  (pH  9.5)  the membrane  behavior  does  not  generate  longer  a NMR powder pattern  typical  for pure DMPC bilayers  (Figure 8,  red  line). The carboxylic group  in PazePC molecules is totally deprotonated at this pH, and the sn‐2 acyl chain may point out of the membrane surface. That disturbs the membrane structure, and the bilayer is not formed. In addition, under this conditions  the  enzymatic  cleavage  of  the  fatty  acids  from  the  glycerol  backbone might  occur,  as visible in additional components in the static (Figure 19B) and even MAS spectra. 

The presence of 2 mole% PGPC shows no significant effect  in solid state spectra NMR of the mixed DMPC bilayers (Figure 24). The only change  is the chemical shifts of the powder patter edge. In the presence of PGPC, the chemical shifts are  less negative than pure DMPC,  indicating a more flexible structure in the lipid bilayer (Figure 25).  

32  

 

Figure 29: A Schematic illustrations of the possible arrangements of the sn‐2 acyl chains of DMPC and PazePC. For PazePC the sn‐2 chains tend to be located close to the bilayer surface (A) or protrude out of the monolayer plane (B). Adapted from [187] 

 

Difference between H2O and D2O as Solvents for DMPC/OxLis in NMR Experiments  

Figure 23 shows the effect of the substitution of D2O by H2O on the NMR spectra of DMPC/10mole% PazePC  vesicles.  Clearly,  the  occurrence  of  two  sub‐spectra  in  NMR  powder  pattern  of DMPC/10%PazePC mixture  appears  now  at  a  lower  temperature  range.  This may  imply  a more ordered structure in D2O‐hydrated bilayer. 

Heavy water  (D2O)  has  different  physicochemical  properties  to  some  extent  compared  to  normal water. It has been shown that exchange of H2O by D2O affects the time‐averaged properties of the PC bilayer [21]. The substituting D2O for H2O is known to influence the interfacial region and affect the phase behavior of phosphatidylcholine. By molecular dynamic simulation, authors concluded that in D2O the bilayer surface area is slightly decreased, resulting in a denser packing of atoms in the center of the acyl chain, a higher degree of acyl chain order, and increased thickness [21]. The more ordered structure  in  D2O‐hydrated  bilayers may  cause  the  splitting  to  appear  sooner  in NMR  experiment compared to H2O‐hydrated bilayer. 

It could also been shown by DSC that in D2O, both the pretransition and main trainsition of DMPC are shifted  to  higher  temperatures.  This  observation  clearly  supports  the  conclusion  that  the  DMPC membrane possesses a more ordered structure when hydrated by D2O. 

 

Interplay between Aβ Peptide and Oxidized lipids  Containing Membranes  

The  Aβ  peptide  has  shown  some  effects  on membrane  structure  which  contains  oxidized  lipids species.  31P  (Figure 27) and  14N NMR  (Figure 28) gives  information about  the  lipid head group and orientation upon addition of the peptide. The smaller powder pattern in both 31P and 14N spectra at transition temperature  indicating either more flexible structure of the  lipid head group or there are changes  in  the  head  group  orientation.  It  has  been  shown  that Aβ  peptide  can  interact with  the 

33  

membrane  interface  region  e.g.  via  its  charged  Lys  29  by  electrostatic  interactions.  This  type  of anchoring process at the interface may affect the head group orientation.  

At around  transition  temperature,  the  smaller powder pattern  in  31P NMR  spectra may be due  to changing in head group orientation upon the presence of the Aβ peptide. If the head group position comes closer to the magic angle, it is rotating faster, results in smaller chemical shift anisotropy.  The splitting in the powder patter is similar to the mixture without peptide incorporation; that indicates the binding of peptide to membrane surface does not affect the phase structure in the membrane.  

These  effects  also  appear  in  14N  NMR  spectra. Moreover,  at  230C,  the  powder  pattern  changes significantly compared to the DMPC/10%PazePC mixture behavior. That means there are significant changes in the N nucleus position upon incorporation of the Aβ peptide.  

 

 

 

Conclusion  

The  results  from  this work  lead  to  important  conclusions.  Some  oxidized  lipid  species  at  certain concentrations have a strong effect on DMPC bilayers. They affect phase behavior of lipid dispersions in  term  of  temperature  and  enthalpy  of  the  transition;  and  the  effects  depend  on  pH  of  the environment and oxidized lipids concentration. At high pH the transition can be abolished indicating the bilayers structure is strongly disturbed. Crowding agents favor the more ordered state; it means the gel state is stabilized. Both DSC and NMR data show that oxidized lipids induce two phases in the DMPC dispersions at gel‐to‐liquid crystalline transition temperature, named oxidized  lipid‐poor and oxidized  lipid‐rich domains. The phase transition of bilayer structure also depends on solvent used; normal water and heavy water affect the behavior of DMPC/PazePC membrane differently. The final conclusion  is the effect of oxidized  lipids on Aβ peptide‐membrane  interactions.  In the presence of PazePC  the membrane  structure  under  interaction with  the  peptide  has  changed  in  either  head group orientation and/or dynamical behavior, which can alter the physical‐chemical properties of the cell membrane.   

 

 

 

 

 

 

 

34  

 

Acknowledgements  

Firstly,  I would  like  to  thank my  supervisor,  Professor  Gerhard  Gröbner,  for  offering me  a  great opportunity  to  work  with  NMR  spectroscopy,  one  of  my  most  interesting  subjects.  During  five months, he has given me a very useful guidance to improve my knowledge as well as my skill in the lab. I am appreciated to be one of his students. 

 I  also  thank  for  Professor Magnus Wolf‐Watz  and  Professor  Pernilla Wittung‐Stafshede  for  their precious review on my work.  

I also wish to thank Marcus Wallgren, for his kindness and willing help whenever I need. 

For these other people, I am grateful to know them, since 

Johan Vestergren did help me a lot with Origin software and is a very friendly friend, 

Tofeeq Rehman instructed me about DSC software and a lot of extra help in the lab, 

Tobias Sparrman offered me useful knowledge about NMR, and any help  related  to   NMR spectroscopy, 

Jan Procek has shown me many other things beside scientific knowledge, and 

My family and all of my friends have been by my side, given my best advice and loved   me always. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

35  

 

References  

[1]. Robert B. Gennis, Biomembranes Molecular Structure and Function, Springer‐Verlag.  

[2]. David F. Bocian, Sunney I. Chan, NMR studies of Membrane Structure and Dynamics, Ann. Rev. Phys. Chern, 1978, 29: 307 ‐35. 

[3]. Aneta D. Petelska, Zbigniew A. Figaszewski, Effect of pH on the Interfacial Tension of Lipid Bilayer Membrane, Biophysical Journal, 78, 2000, 812–817. 

[4]. Gilbert O. Fruhwirth, Alexandra Loidl, Albin Hermetter, Review: Oxidized phospholipids: From molecular properties to disease, Biochimica et Biophysica Acta 1772, 2007, 718‐736. 

[5]. Evelyne Terzi, Gunter Hölzemann, Joachim Seelig, Interaction of Alzheimer β‐Amyloid Peptide(1‐40) with Lipid Membranes, Biochemistry 1997, 36, 14845‐14852 

[6]. McMcasters, M., PhD thesis, Influence of surface chemistry on the aggregation of beta amyloid peptide, B.S., Arkansas State University, 2006. 

[7]. Marcus Bokvist, Fredrick Linström, Anthony Watts, Gerhard Gröbner, J. Mol. Biol. (2004) 335, 1039‐1049 

[8]. Huan‐Xiang Zhou, Crowding Effects of Membrane Proteins, J. Phys. Chem. B 2009, 113, 7995–8005. 

[9]. Ching‐hsien Huang, Shusen Li, Calorimetric and molecular mechanics studies of the thermotropic phase behavior of membrane phospholipids, Biochimica et Biophysica Acta ,1422,1999, 273‐307. 

[10]. Yeagle, P., The structure of biological membranes, CRC Press, Boca Raton, Florida, 2004. 

[11]. Berliner, L., Reuben, J., Biological Magnetic Resonance, Plenum Press, Newyork and London. 

[12]. Lindström, F., Biological membrane interfaces involved in diseases: A biological study, PhD, Thesis, Umeå University, 2006. 

[13]. Fredrick Lindström, Philip T. F. Williamson, Gerhard Gröbner, Molecular Insight into the Electrostatic Membrane Surface Potential by 14N/31P MAS NMR Spectroscopy: Nociceptin‐Lipid Association, J. AM. CHEM. SOC. 2005, 127, 6610‐6616. 

[14]. Francesco M. Megli, Karen Sabatini, EPR studies of phospholipid bilayers after lipoperoxidation, Inner molecular order and fluidity gradient, Chemistry and Physics of Lipids, 125, 2003, 161–172. 

 [15]. V. P. Ivanova, I. M. Makarov, T. E. Schäffer, T. Heimburg, Analyzing heat Capacity Profiles of Peptide‐Containing Membranes: Cluster Formation of Gramicidin A, Biophysical Journal, 84, 2003, 2427‐2439.  

36  

[16]. David A. Mannock, Ruthven N.A.H. Lewis, Ronald N. McElhaney, A calorimetric and spectroscopic comparison of the effects of ergosterol and cholesterol on the thermotropic phase behavior and organization of dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membrane, Biochimica et Biophysica Acta,1798, 2010, 376‐388. 

[17]. Michèle Auger, Biological Membrane Structure By Solid‐State NMR, Curr. Issues Mol. Biol. (2000) 2(4): 119‐124. 

[18]. Juha‐Pekka Mattila, Biophysical Characterization of Oxidized Phospholipids, Academic Dissertation, Institute of Biomedicine/Biochemistry University of Helsinki Finland, 2009. 

[19]. Himanshu Khandelia, Ole G. Moutirsen, Lipid Gymnastics: Evidence of Complete Acyl Chain Reversal in Oxidized Phospholipids from Molecular Simulations, Biophysical Journal, 2009, 2734‐2743. 

[20]. Lenka Beranova, Lukasz Cwiklik, Piotr Jurkiewicz, Martin Hof, Pavel Jungwirth, Oxodation Changes Physical Properties of Phospholipid Bilayers: Flourescence Spectroscopy and Molecular Simulations, Langmuir, 2010, 26(9), 6140‐6144. 

[21]. Tomasz Rog, Krzysztof Murzyn, Jeannine Milhaud, Mikko Karttunen, Marta Pasenkiewicz‐Gierula, Water Isotope Effect on the Phosphatidylcholine Bilayer Properties: A Molecular Dynamics Simulation Study, J. Phys. Chem. B 2009, 113, 2378‐2387. 

 

 

37