1

LAPORAN

SKEMA KEDOKTERAN

PERAN NRF2 DALAM PATOGENESIS STEATOSIS PADA DEFISIENSI VITAMIN B12: KAJIAN STRES OKSIDATIF

Tim Pengusul

dr. Endin Nokik Stujanna, Ph.D (0306078805)

dr. Irena Ujianti, M.Biomed

dr. Etty Farida, Sp.DV

Nomor Surat Kontrak Penelitian : 333/F.03.07/2020

Nilai Kontrak : Rp. 25.000.000,-

PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA

TAHUN 2020

2

HALAMAN PENGESAHAN

Penelitian Ilmu Kedokteran Judul Penelitian

Peran Nrf2 Dalam Patogenesis Steatosis Pada Defisiensi Vitamin B12: Kajian Stres Oksidatif

Patomekanisme Steatosis Akibat Defisiensi Vitamin B12; Kajian Stres Oksidatif

Jenis Penelitian :Penelitian Ilmu Kedokteran

Ketua Peneliti :dr. Endin Nokik Stujanna, Ph.D

Link Profil simakip :http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/1199 Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978 Fakultas : Fakultas Kedokteran Anggota Peneliti :dr.Irena Ujianti, M.Biomed

Link Profil simakip :Click or tap here to enter text. Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978 Anggota Peneliti :dr. Etty Farida, Sp.DV

Link Profil simakip :Click or tap here to enter text. Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978 Waktu Penelitian : 6 Bulan

Luaran Penelitian

Luaran Wajib :Jurnal Nasional Terakreditasi sinta 3

Status Luaran Wajib : In Review

Luaran Tambahan :Prosiding nasional online

Status Luaran Tambahan :submitted

Mengetahui,

Ketua Program Studi Ketua Peneliti dr. Endin Nokik Stujanna, Ph.D dr. Endin Nokik Stujanna, Ph.D NIDN. 0306078805 NIDN.0306078805 Menyetujui, Dekan Fakultas Kedokteran Ketua Lemlitbang UHAMKA

Dr.dr.WawangSukarya,Sp.OG(K),MARS, MHKes

Prof. Dr. Suswandari, M.Pd

NIDN.0030064701 NIDN. 0020116601

3

SURAT KONTRAK PENELITIAN

4

5

ABSTRAK

Defisiensi Vittamin B12 merupakan masalah besar bagi beberapa negara terutama negara berkembang. Dikarenakan kekompleksan molekul pada vitamin B12, kondisi defisiensi menyebabkan gangguang pada level seluler yang kompleks. Manifestasi klinis dari defisiensi vitamin B12 adalah anemia, tetapi hal ini diyakini karena adanya kekompleksan dari vitamin B12, masih banyak penyebab gangguan lain yang terjadi pada level molecular. Studi ini memaparkan tentang bagaimana perjalanan penyebab kerusakan dari defisiensi vitamin B12 yang berfokus pada proses stress oksidatif melalui kajian Nrf2.

Tikus jantan jenis Sprague dawley di beri pakan selama 16 minggu. Terdapat 2 kelompok penelitian; (a) kelompok kontrol standar, yang diberi pakan standard yang diberi nama sebagai control group, (b) kelompok diet vitamin B12-restricted AIN-93 dengan pectin, kelompok ini mendapat perlakuan diet defisiensi vitamin B12 selama 16 minggu, dan dinamakan treatment group. Jaringan hati dan plasma tikus diambil dan disimpan pada suhu -80c, kemudian dihitung jumlah level aktivitas enzyme pada vitamin B12, Nrf2, MDA, SOD.

Jumlah aktivitas enzyme pada kobalamin, Nrf2, MDA dan SOD dihitung setelah diberikan prosedur pakan. Level plasma Kobalamin dihitung menggunakan ELISA. Plasma level dari vitamin B12 menurun diantara control dan treatment group, tetapi tida signifikan (24.55±3,13 ng/mL vs 16,81±2,87 ng/mL). level MDA hati meningkat secara signifikan diantara control dan treatment group (9,11±0,485 nmol/mL vs 12,29±0,81 nmol/mL p<0.01). aktivitas enzyme SOD menurun tetapi tidak signifikan (6,906±0,61 u/mL vs 5,83±0,37 u/mL). level Nrf2 hati menurun secara signifikan berbeda diantara kedua group (7.37x10-5± 3.1x10-6 pg/ml vs 8.14x10-6± 7.3x10-7, p=0,000).

Terdapat penurunan kadar vitamin B12 pada kelompok perlakuan disertai peningkatan kadar MDA pada jaringan hati. Selain itu terdapat penurunan kadar Nrf2 dan aktivitas enzim SOD pada jaringan hati

Kata kunci: Vitamin B12, Nrf2, Oxidative stress, MDA, SOD

6

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL………………………………………………………...…1

HALAMAN PENGESAHAN………………………………………………….....2

SURAT KONTRAK PENELITIAN……………………………………………...3

ABSTRAK………………………………………………………………………..5

DAFTAR ISI…………………………………………………………………...…6

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………………….7

BAB 1. PENDAHULUAN…………………………………………………..…...8

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA………………………………………………...10

BAB 3. METODE PENELITIAN………………………………………………..15

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………….17

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………… 21

BAB 6 LUARAN YANG DICAPAI…………………………………………… 23

BAB 7 RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI………24

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………………25

LAMPIRAN……………………………………………………………………...28

7

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Kerangka teori

Gambar 2. Roadmap Peneliti

Gambar 3. Diagram Alir Penelitian

Gambar 4. Rerata dari level plasma Vitamin B12

Gambar 5. Rerata dari level MDA hati ** p < 0.01 vs control group pada 16 minggu

Gambar 6.Rerata dari level Nrf2 hati *** p = 0.000 vs control group pada 16

minggu

Gambar 7. Rerata dari aktivitas enzyme dari SOD hati

8

BAB 1. PENDAHULUAN

Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) merupakan penyakit hati kronik terbesar yang memiliki angka prevalensi tinggi di dunia.(Z. M. Younossi, Marchesini, Pinto-cortez, & Petta, 2019) Prevalensi tertinggi NAFLD terdapat di Amerika Selatan (31%) diikuti oleh AS (24%) dan Eropa (23%).(Z. Younossi et al., 2017) Sedangkan data terbaru menyatakan prevalensi NAFLD di Asia mencapai 29,62%, dengan angka tertinggi terdapat di Indonesia (51,04%) dan terendah di Jepang (22,28%).(J. Li et al., 2019) Kondisi tingginya prevalensi NAFLD diperberat dengan berkembangnya NAFLD menjadi penyakit hati lanjut, yaitu sirosis dan karsinoma hepatoseluler (HCC). (Chalasani et al., 2017.) Hal ini memberikan bukti beban anggaran kesehatan akibat NAFLD yang cukup besar sehingga perhatian lebih diperlukan dalam pembuatan kebijakan kesehatan di Indonesia. Studi pendahuluan berhasil membuktikan bahwa kondisi defisiensi vitamin B12 menyebabkan NAFLD pada hewan coba.(Sianipar et al., 2019) Vitamin B12 adalah vitamin esensial yang larut dalam air dan hanya ditemukann dalam makanan hewani, memiliki fungsi penting untuk proses hematopoiesis, kognitif dan kardiovaskular.(Moore et al., 2014),(Kibirige & Mwebaze, 2013) Vitamin B12 bertindak sebagai kofaktor untuk enzim metionin sintase yang mengkatalisis metilasi homosistein menjadi metionin.(Kozyraki & Cases, 2013),( Lagemaat, Groot & Heuvel, 2019)

Kekurangan vitamin B12 subklinis telah dilaporkan pada pasien dengan obesitas, resistensi insulin dan diabetes.(Z. Li, Gueant-rodriguez, & Quilliot, 2018),(Ho et al., 2014),(Mahalle, Kulkarni, Garg, & Naik, 2013) Kelompok yang rentan dan beresiko tinggi mengalami defisiensi vitamin B12 adalah geriarti, pasien dengan gastritis akut atau gaya hidup vegetarian. Defisiensi vitamin B12 merupakan silent disease yang dapat diketahui saat telah menimbulkan gejala klinis, karena itu data secara klinis defisiensi vitamin B12 di Indonesia baru dapat diketahui lewat data anemia, sebagai gejala klinis paling umum sebagai dampak deficiensi vitamin B12. Karena itu dibutuhkan suatu tindakan pencegahan defisiensi vitamin B12 yang dapat menyebabkan NAFLD, terutama pada faktor resiko tinggi. Hati merupakan salah satu organ yang rentan terkena dampak ROS akibat dari stres oksidatif. Defisiensi vitamin B12 yang merupakan penyebab dari peningkatan homosistein adalah faktor penyebab terjadinya peningkatan proses de novo lipogenesis (DNL) dan proses stres oksidatif di hati. Homosistein akan meningkatkan aktifasi lipogenesis dan pembentukan Radical Oxygen Species (ROS). Stres oksidatif selanjutnya menyebabkan berjalannya proses injury di hati, diikuti oleh terganggunya keseimbangan homeostasis dalam metabolisme lemak, protein dan karbohidrat. Kondisi tersebut selanjutnya memicu terjadinya proses inflamasi. Stres oksidasi dan inflamasi akan memperburuk kondisi patologi dari penderita NAFLD. Stress oksidatif tersebut akan memicu terjadinya inflamasi dan nekrosis sel hati. Inflamasi yang terjadi kemudian akan menstimulasi sel stellate hati memproduksi kolagen sehingga akan terjadi fibrosis pada hati. Kondisi tersebut bisa berlanjut menjadi sirosis hati.(Rolo, Teodoro, & Palmeira, 2012) Diharapkan penelitian ini akan memberikan informasi berupa pengetahuan tentang peran Nrf2 pada proses patofisiologi NAFLD lewat proses stres oksidatif karena defisiensi vitamin B12. Penelitian ini akan mendukung Uhamka sebagai universitas riset, karena akan memberi kontribusi dalam menemukan patomekanisme

9

patomekanisme dari NAFLD lewat proses stres oksidatif karena defisiensi vitamin B12.

10

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

State of the Art Penelitian Peningkatan prevalensi NAFLD perlu mendapatkan perhatian yang serius dan penanganan yang tepat, sebab NAFLD dapat berkembang menjadi kegagalan hati bahkan carcinoma hati. Salah satu penyebab NAFLD yang jarang diketahui adalah defisiensi mikronutrien, yaitu Vitamin B12, terutama pada individu berfaktor resiko tinggi seperti pasien geriarti, pasien DM tipe 2 yang mengkonsumsi methformin dalam waktu lama, dan penganut gaya hidup vegan. Dengan ini, kami mengajukan penelitian yang diharapkan dapat mengetahui patomekanisme NAFLD karena defisiensi vitamin B12 melalui proses stres oksidatif, sebagai dasar untuk menghasilkan produk fitofarmaka penanganan NAFLD. Tinjauan Pustaka Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) merupakan penyakit hati kronik yang paling banyak diderita saat ini, berada dikisaran 24% dari populasi dunia secara umum, sedangkan di Indonesia mencapai kisaran angka 30,6%.(Z. Younossi et al., 2017). NAFLD merupakan spektrum kondisi yang ditandai secara histologis dengan steatosis hati. Secara histologis NAFLD terbagi menjadi steatosis sederhana dan steatosis pada tingkat yang lebih kompleks.(Caldwell & Argo, n.d.),

(Duseja et al., 2015). Kondisi steatosis terjadi saat lipid terutama trigliserida terakumulasi di hepatosit (lebih dari 5% keseluruhan hepatosit), dengan spektrum makro atau mikrovesikular, sedangkan adanya tanda inflamasi di parenkim hati atau Non Alcoholic Steatohepatitis (NASH), fibrosis, hingga sirosis hati yang bisa berkembang menjadi gagal hati dan hepatoseluler karsinoma, tanpa hubungan dengan konsumsi alkohol.(Duseja et al., 2015),(Caldwell & Argo, n.d.) Istilah NASH pertama kali diangkat pada 1980 di dalam penelitian Ludwig yang melaporkan perubahan histologi hati berupa steatosis, infiltrat inflamasi, badan Mallory, fibrosis dan sirosis pada 20 pasien tanpa adanya riwayat konsumsi alkohol yang signifikan. NAFLD dianggap berperan pada 90% lebih kasus kenaikan tes fungsi hati tanpa ditemukannya penyebab tertentu (virus, alkohol, penyakit hati yang diturunkan dan obat-obatan).(Cheung et al., n.d.) Patofisiologi dasar perkembangan NAFLD kompleks.(Schreuder, Verwer, van Nieuwkerk, & Mulder, 2008) Mekanisme patogenesis NAFLD dapat dijelaskan dengan menggunakan hipotesis ‘multi hit’. Tahap-tahap tersebut terdiri atas proses terjadinya akumulasi lemak dalam hati dan resitensi insulin (first hit) yang berlanjut dengan stress oksidatif (second hit) yang akan menyebabkan nekroinflamasi dan fibrosis.(Dietrich & Hellerbrand, 2014)

11

a. Stres Oksidatif dan Inflamasi Karena Defisiensi Vitamin B12 Pada NAFLD Stres oksidatif dan inflamasi merupakan karakteristik NAFLD, keduanya berperan dalam patogenesis dan progresivitas NAFLD. Faktor yang berperan dalam menginduksi stres oksidatif pada NAFLD antara lain pembentukan radikal bebas karena proses peningkatan homosistein yang mengalami autooksidasi akibat defisiensi vitamin B12.(Mahamid et al., 2018) Reaksi rantai radikal yang dihasilkan pada saat metabolisme tersebut dan berpotensi merusak ini dapat dilawan oleh antioksidan enzimatik dan nonenzimatik. Namun, pada NAFLD, keseimbangan redoks tidak terjadi sehingga menimbulkan disregulasi proses seluler dan berakhir pada kerusakan jaringan. Interaksi stres oksidatif dan inflamasi memiliki hubungan yang tidak dapat dipisahkan, stres oksidatif dapat memicu proses inflamasi melalui aktivasi NF-κB dan sebaliknya inflamasi dapat melepaskan ROS. Inflamasi merupakan mekanisme yang sensitif redoks, stres oksidatif dapat mengaktifkan faktor transkripsi seperti NF-κB, yang meregulasi ekspresi gen mediator inflamasi. NF-κB merupakan faktor dimer yang dipertahankan dalam keadaan inaktif dalam sitoplasma dengan berikatan pada protein inhibitor (anggota family I-κB). Fosforilasi, ubikuinasi dan proteolisis akan melepaskan dan mentransfer NF-κB ke dalam nukleus dan mengaktivasi gen-gen spesifik yang berperan dalam proses inflamasi antara lain sitokin, chemokines. Komponen sistem NF-κB terekspresi tinggi pada pasien NAFLD, yang memperantarai patogenesis inflamasi kronik.(Chen, Ni, Nagata, Xu, & Ota, 2016).

b. Peran Gangguan Aktivasi Nrf2 Terhadap Patogenesis Stres Oksidatif dan Inflamasi Telah diuraikan bahwa stres oksidatif dan inflamasi berperan penting dalam patogenesis dan progresivitas NAFLD. Peningkatan produksi ROS menimbulkan kerusakan dan disfungsi jaringan dengan menyerang, mendenaturasi dan memodifikasi struktur dan fungsi molekul dan mengaktifkan faktor transkripsi yang sensitif redoks dan jalur transduksi sinyal. Hal ini akan memicu terjadinya nekrosis, apoptosis, inflamasi, fibrosis. Sistem redoks termasuk enzim antioksidan dan enzim detoksifikasi fase 2 akan melindungi jaringan dari keruasakan yang diakibatkan oleh ROS. NRf2 berperan penting aktivitas basal dan menginduksi gen-gen yang mengkode beberapa antioksidan dan enzim detoksifikasi fase 2. NRf2 adalah faktor transkripsi sitoprotektif penting. NRf2 akan diaktifkan dengan adanya oksidan, elektrofil, ataupun stres retikulum endoplasma. NRf2 terdiri dari 6 domain yaitu: Neh1merupakan domain yang mengandung struktur bZIP yang dibutuhkan untuk berikatan dengan DNA dan membentuk dimer. Neh2 sisi yang berinteraksi dengan keap1. Neh3,4,5 memperantai aktivitas transaktivasi Nrf2 dengan berikatan pada CREB binding protein (CBP) dan domain Neh6 yang berperan dalam regulasi negatif. 16, 17 Dalam kondisi basal, NRf2 berlokasi di sitoplasma dan inaktif, berikatan dengan

12

molekul represor kelch-like ECH association protein 1 (Keap1) membentuk kompleks NRf2-Keap1. Keap1 terdiri dari beberapa residu sistein yang bertindak sebagai sensor terhadap status redoks intraselular. NRf2 secara cepat akan didegradasi oleh jalur ubikuitin proteosom. Sinyal dari ROS dan elektrofil akan mengakibatkan disosiasi NRf2 dari keap1. Kemudian, NRf2 akan bertranslokasi ke nukleus. Di dalam nukleus, NRf2 terikat pada sekuens regulator yang disebut antioxidant response element atau electrophile response elements (ARE/EpRE) yang berlokasi di regio promotor dari gen yang mengkode antioksidan dan enzim detoksifikasi fase 2. Proses ini diperantarai oleh heterodimerisasi dari NRf2 dengan faktor transkripsi lainnya, seperti small Maf, yang berada dalam nukleus. Selanjutnya, akan meningkatkan transkripsi dari berbagai antioksidan, enzim detoksifikasi fase 2 dan protein yang berkaitan seperti katalase, superoksid dismutase, NAD(P)H quinine eksoreduktase, heme oksigenase-1, gltation S-transferase, glutation peroksidase, thioredoksin, dan lainnya. Gen-gen protektif ini dengan cepat akan menetralkan, mendetoksifikasi berbagai xenobiotik yang menyerang. Adapun peran NRf2 dalam proses inflamasi adalah dengan menghambat faktor transkripsi NF-κB sehingga terjadi penurunan proses inflamasi. Gangguan NRf2 berakibat pada penurunan hambatan terhadap faktor transkripsi dari NF-κB, selanjutnya terjadi peningkatan ekspresi dari gen-gen yang mengkode mediator inflamasi. Karena NAFLD merupakan suatu kondisi terjadinya kerusakan hati secara progresif, hati akan mengalami penurunan atau tidak dapat melakukan fungsinya dengan baik. Hal tersebut ditandai dengan adanya kelainan histopatologi hati. Berbagai faktor dapat memicu keadaan ini, baik salah satunya defisiensi vitamin B12, sehingga terjadi peningkatan produksi radikal bebas, proses stress oksidatif dan inflamasi. Stres oksidatif dan inflamasi mempunyai peran dalam patogenesis berbagai penyakit termasuk NAFLD. Keduanya saling mempengaruhi dan dapat meningkatkan kejadian satu sama lain. Ketidakseimbangan produksi radikal bebas dan pertahanan oksidan mengakibatkan stres oksidatif yang akan memicu inflamasi dan sebaliknya inflamasi akan menghasilkan radikal bebas. Mekanisme tubuh untuk melawan keadaan ini adalah melalui pertahanan antioksidan. Dengan adanya radikal bebas tubuh akan menghasilkan antioksidan. Produksi antioksidan ini diatur oleh Nrf2, suatu faktor transkripsi yang dapat meningkatkan produksi dari berbagai antioksidan endogen.

13

Gambar 1. Kerangka teori

Roadmap Penelitian Pada tahap pertama, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui patomekanisme dari kondisi steatosis hati yang disebabkan defisiensi vitamin B12, melalui kajian proses stres oksidatif. Sedangkan pada tahap kedua, penelitian ini bertujuan meneliti Hibiscus sabdariffa Linn yang ditargetkan menjadi fitofarmaka untuk penanganan NAFLD. Penelitian pendahuluan yang telah dilakukan yaitu penentuan standar pakan tikus dan lama pemberiannya agar mendapatkan tikus NAFLD. Penelitian ini akan terbagi menjadi 2 tahapan yaitu: 1. Penelitian tahap ke-1 bertujuan untuk mengetahui patomekanisme dari kondisi restriksi vitamin B12 terhadap peningkatan produksi radikal bebas yang menyebabkan terjadinya kondisi steatosis lewat proses stres oksidatif.

14

2. Penelitian tahap ke-2 bertujuan untuk mengetahui potensi bahan formula fitofarmaka terhadap upregulasi gen antioksidan melalui jalur Nrf2.

Gambar 2. Roadmap Peneliti

15

BAB 3. METODE PENELITIAN

Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental in vivo menggunakan subjek hewan coba dengan pemberian pakan standar sampai dengan 16 minggu untuk kelompok kontrol, sedangkan kelompok perlakuan diberikan pakan defisiensi vitamin B12 selama 16 minggu. Lama perlakuan dan jumlah hewan coba pada masing masing kelompok di dasarkan pada penelitian sebelumnya.(Sianipar et al., 2019),(Pooya et al., 2012),(Ghosh, Sinha, Putcha, & Raghunath, 2016)

Tempat dan Waktu Penelitian Rencana penelitian akan dilakukan mulai bulan Mei 2020 sampai dengan Oktober 2020 di Laboratorium Terpadu FKUI. Subjek dan Sampel Penelitian Subjek penelitian adalah tikus Rattus norvegicus strain Sprague Dawley jantan usia 38-40 minggu dengan berat badan 300-350 gram dengan jumlah 18 ekor tikus. Berdasarkan rumus Resource Equation Method(Arifin & Zahisruddin, 2017), dengan rumus :

E= Jumlah Total Hewan Coba – jumlah kelompok

Apabila terdapat 2 kelompok penelitian, berdasarkan rumus tersebut perhitungan besar sampel adalah :E= 14 –2 E= 12 (nilai E berada pada kisaran 10 dan 20 sehingga dapat diterima). Selebihnya menggunakan antisipasi dropout dilakukan koreksi jumlah hewan coba menjadi 18 hewan coba.

Prosedur penelitian

• Kelompok kontrol akan diberi pakan standar, sedang kelompok perlakuan akan diberi pakan defisiensi vitamin B12 selama 16 minggu

• Tikus akan di dekapitasi sesuai minggu yang telah ditentukan. Teknik Pemeriksaan Sampel

• Pemeriksaan ELISA berupa pemeriksaan kadar vitamin B12 di jaringan hati

• Pemeriksaan kadar Nrf2 di jaringan hati

• Pemeriksaan histopatologi jaringan hati, akan dikerjakan untuk mengetahui apakah telah terjadi setatosis pada hati tikus.

Analisis Statistik

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan uji T- test independent., jika data tidak normal dan setelah ditransformasi tetap tidak normal selanjutnya dilakukan uji nonparametrik. Pengolahan data akan dilakukan dengan menggunakan program SPSS 21.

16

Gambar 3. Diagram Alir Penelitian

Subjek dan Sampel Penelitian Subjek penelitian adalah tikus Rattus norvegicus strain Sprague Dawley jantan usia 38-40 minggu dengan berat badan 300-350 gram dengan jumlah 18 ekor tikus. Prosedur penelitian • Kelompok kontrol akan diberi pakan standar, sedang kelompok perlakuan akan diberi pakan defisiensi vitamin B12 • Tikus akan d di dekapitasi sesuai minggu yang telah ditentukan. Teknik Pemeriksaan Sampel • Pemeriksaan ELISA berupa pemeriksaan kadar vitamin B12 di jaringan hati • Pemeriksaan kadar Nrf2 di jaringan hati • Pemeriksaan histopatologi jaringan hati

17

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

Model eksperimental yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus galur Sprague Dawley yang diinduksi dengan pakan defisiensi vitamin B12, AIN93M (testDiet, Florida, USA) dan pakan standart sebagai diet pada kelompok kontrol (RatBio, Bogor, Indonesia). Pemilihan pakan AIN93M karena didasarkan pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Gosh et.al , Amani et.al dan Santoso et.al yang menunjukkan bahwa pemberian pakan AIN93M dapat memicu terjadinya penurunan kadar vitamin B12 dan peningkatan kadar homosistein pada plasma serta jaringan hati, juga dapat menginduksi kerusakan struktur serta fungsi ginjal, jantung dan hati. (Ghosh et al., 2016),(Santoso et al., 2019),(Amani et al., 2019)

Pada penelitian ini di dapatkan hasil pengukuran kadar vitamin B12 plasma pada kelompok control sebesar 24.55±3,13 ng/mL, sedangkan pada kelompok defisiensi yaitu sebesar 16,81±2,87 ng/mL. Walaupun tidak di dapatkan perbedaan signifikan, namun terlihat penurunan kadar vitamin B12 plasma antara kelompok control dan perlakuan. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Amani et.al dan Santoso et.al dimana penggunaan Pakan diet AIN93 pada tikus Sprague dawley memperlihatkan penurunan kadar vitamin B12 pada plasma. (Santoso et al., 2019),(Amani et al., 2019) Belum terlihatnya perbedaan yang signifikan, salah satu factor penyebabnya dikarenakan durasi penelitian yang kurang lama.

Gambar 4. Rerata dari level plasma Vitamin B12

Hasil pengukuran kadar MDA rata-rata pada kelompok kontrol adalah sebesar 9,11±0,485 nmol/mL, sedangkan pada kelompok perlakuan sebesar 12,29±0,81 nmol/mL. Berdasarkan uji beda didapat nilai signifikansi sebesar p< 0,01, hal ini memperlihatkan perbedaan bermakna kadar MDA antara kelompok kontrol dan

0

5

10

15

20

25

30

control treatment

Vit B12 Plasma

18

perlakuan. Kadar MDA rata-rata pada kelompok perlakuan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol karena peningkatan produk radikal bebas yang disebabkan defisiensi vitamin B12 mengakibatkan peroksidasi lipid pada membran sel, hasil dari reaksi antara radikal bebas dan fosfolipid membran sel epitelium salah satunya adalah malondialdehid (MDA). (Sutti et al., 2014) Stres oksidatif pada kondisi defisiensi vitamin B12 diakibatkan peningkatan kadar homosistein intraseluler, hingga terjadi peningkatan produksi radikal bebas (ROS). (Lai & Kan, 2015) Hal ini sesuai dengan studi yang dilakukan oleh Jakubowski et.al yang menyatakan bahwa peningkatan kadar homosistein intrasel mengakibatkan kondisi toksik pada sel tersebut dan studi yang dilakukan oleh sianipar et al, juga menyatakan bahwa defisiensi vitamin B12 menyebabkan terjadinya peningkatan kadar homosistein jaringan hati. (Sianipar et al., 2019),(Jakubowski, 2007) Homosistein juga dapat meningkatkan produksi ROS dalam tubuh dengan cara meningkatkan aktivitas NADPH oksidase dalam menghasilkan ion superoksida. .(Deshmukh et al., 2013)Kadar MDA yang lebih tinggi pada kelompok perlakuan disebabkan karena ROS yang meningkat, sehingga terjadi peroksidasi lipid terutama pada membrane basal sel hepatosit dengan hasil produk MDA. (Sutti et al., 2014)

Gambar 5. Rerata dari level MDA hati ** p < 0.01 vs control group pada 16 minggu

Hasil analisis statistik kuantifikasi protein Nrf2 menggunakan uji T-test indipendent pada seluruh kelompok uji berbeda bermakna (7.37x10-5± 3.1x10-6

pg/ml vs 8.14x10-6± 7.3x10-7, p=0,000). Penurunan yang signifikan dari kadar Nrf2 jaringan yang diikuti penurunan berbagai enzim antioksidan endogen antara lain SOD tampak pada penelitian ini. Nrf2 merupakan faktor transkripsi yang berperan penting dalam mempertahankan homeostasis redoks sel dengan meregulasi ekspresi

0,0000

2,0000

4,0000

6,0000

8,0000

10,0000

12,0000

14,0000

control treatment

Liver MDA**

19

protein sitoprotektif. (Howden, 2013) Secara normal, peningkatan produksi ROS mengakibatkan peningkatan kadar Nrf2 intra sel sebagai efek sitoprotektif terhadap radikal bebas, namun proses homosisteinilasi protein yang disebabkan peningkatan homosistein mengakibatkan terjadinya degradasi protein Nrf2, sehingga kadar Nrf2 di dalam sel berkurang. (Perła-Kaján et al., 2008),(Elanchezhian et al., 2012) Hal ini sesuai dengan hipotesis pada penelitian ini yang menyatakan bahwa defisiensi vitamin B12 mengakibatkan peningkatan produksi ROS, yang disebabkan peningkatan kadar homosistein dan terganggunya system pertahanan antioksidan akibat gangguan ekspresi enzim SOD karena kadar NRF2 yang berkurang pada jaringan hati.

Gambar 6. Rerata dari level Nrf2 hati *** p = 0.000 vs control group pada 16 minggu

Hasil pengukuran aktivitas enzim SOD rata-rata pada kelompok kontrol adalah sebesar 6,906±0,61 u/mL. Sedangkan nilai aktivitas enzim SOD rata-rata pada kelompok perlakuan adalah sebesar 5,83±0,37 u/mL. Berdasarkan uji beda antara dua kelompok didapat nilai signifikansi sebesar 0,147, hal ini berarti tidak terdapat aktivitas enzim SOD antara kelompok kontrol dan perlakuan. Aktivitas enzim SOD pada kelompok perlakuan lebih rendah daripada kelompok kontrol. Hal ini diduga karena ROS dapat merusak protein di dalam sel. (Wilcken et al., 2000) Saat enzim SOD telah rusak atau terinaktivasi oleh ROS, maka aktivitas enzim SOD juga akan menurun. Hal ini didukung oleh pernyataan Aquil et al. yang menyatakan bahwa radikal bebas dapat menginaktivasi protein. (González, 2014) Rendahnya aktivtas enzim SOD pada kelompok perlakuan juga dapat disebabkan karena factor

0

0,00001

0,00002

0,00003

0,00004

0,00005

0,00006

0,00007

0,00008

0,00009

control treatment

Live

r Nrf

2pg

/ml

***

20

transkripsi Nrf2 yang mengekspresikan enzim ini mengalami kerusakan, sehingga ekspresi SOD berkurang , sesuai dengan hasil yang didapatkan pada penelitian ini.

Gambar 7. Rerata dari aktivitas enzyme dari SOD hati

Hasil penelitian menyebutkan bahwa pemberian pakan defisiensi vitamin B12 dapat meningkatkan menginduksi stres oksidatif, menurunkan kadar Nrf2, dan meningkatkan kadar MDA jaringan hati. Metionin sintase, salah satu enzim yang menggunakan vitamin B12 sebagai kofaktornya. Enzim ini berperan mengkatalisir remetilasi homosistein ke metionin. Defisiensi vitamin B12 dapat mengganggu proses ini, sehingga menyebabkan kenaikan homosistein. Homosistein diketahui mengandung gugus sulfhidril yang reaktif, dan cenderung membentuk ikatan disulfide dan melepaskan radikal bebas sebagai produk sisanya. Homosistein juga meningkatkan ekspresi nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oksidase yang banyak menghasilkan produk sisa berupa radikal bebas superoksida, yang dapat merusak membran sel dengan menyebabkan terputusnya asam lemak tidak jenuh. (Mendes et al., 2014) Hasil dari reaksi antara radikal bebas dan fosfolipid membran sel epitelium salah satunya adalah malondialdehid (MDA). Pembentukan MDA dapat dicegah oleh senyawa antioksidan yang berasal dari dalam tubuh, seperti superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), dan glutathione peroxidase (GPx). (Dianti et al., 2017) Sistem redoks termasuk enzim antioksidan dan enzim detoksifikasi fase 2 akan melindungi jaringan dari keruasakan yang diakibatkan oleh ROS. NRf2 berperan penting dalam aktivitas basal dan menginduksi gen-gen yang mengkode beberapa antioksidan dan enzim detoksifikasi. Nrf2 merupakan faktor transkripsi yang berperan penting dalam mempertahankan homeostasis redoks sel dengan meregulasi ekspresi protein sitoprotektif.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

control treatment

SOD

21

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan pada penelitian ini antara lain, terjadi perbedaan kadar vitamin B12 plasma pada hewan coba yang diberikan pakan defisiensi vitamin B12, dimana kelompok perlakuan memiliki kadar yang lebih rendah dibandingakan kelompok kontrol, terdapat perbedaanan kadar MDA pada jaringan hati antara kelompok kontrol dan perlakuan, dimana kadar MDA jaringan hati lebih tinggi kelompok perlakuan lebih tinggi disbanding kelompok kontrol. Aktivitas enzim SOD kelompok perlakuan lebih rendah di banding kelompok kontrol, sedangkan kadar Nrf2 kelompok perlakuan lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol.

22

BAB 6 LUARAN YANG DICAPAI

Jurnal

IDENTITAS JURNAL 1 Nama Jurnal CMH - Clinical and Molecular Hepatology 2 Website Jurnal https://www.e-cmh.org/

3 Status Makalah Submitted

4 Jenis Jurnal Jurnal International 4 Tanggal Submit 03-desember-2020 5 Bukti Screenshot submit

Pemakalah di seminar

IDENTITAS SEMINAR 1 Nama Jurnal ICNSSE 2020 - International Conference On Natural

And Social Science Education

2 Website Jurnal https://conference.uhamka.ac.id/lic

3 Status Makalah Accepted

23

4 Jenis Prosiding Presenter international 4 Tanggal Submit 08-10-2020 5 Bukti Screenshot submit

Pemakalah di seminar

IDENTITAS HAK KEKAYAAN INTELEKTUAL 1 Nama Karya Bolema - Mathematics Education Bulletin

2 Jenis HKI Hak Cipta/ Hak Paten.

3 Status HKI Submitted/Granted

4 No Pendaftaran Prosiding International/ Prosiding Nasional

24

BAB VII RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI

Minimal mencakup 2 hal ini.

Hasil Penelitian Pada penelitian ini diketahui bahwa terjadi perbedaan kadar vitamin B12 plasma pada hewan coba yang diberikan pakan defisiensi vitamin B12, dimana kelompok perlakuan memiliki kadar yang lebih rendah dibandingakan kelompok kontrol, terdapat perbedaanan kadar MDA pada jaringan hati antara kelompok kontrol dan perlakuan, dimana kadar MDA jaringan hati lebih tinggi kelompok perlakuan lebih tinggi disbanding kelompok kontrol. Aktivitas enzim SOD kelompok perlakuan lebih rendah di banding kelompok kontrol, sedangkan kadar Nrf2 kelompok perlakuan lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol.

Rencana Tindak Lanjut

Penelitian pendahuluan yang telah dilakukan yaitu penentuan standar pakan tikus dan lama pemberiannya agar mendapatkan tikus NAFLD. Sehingga bisa dijadikan dasra dalam penelitian yang akan dilakukan saat ini. Pada penelitian ini tujuan utamanya adalah untuk mengetahui patomekanisme dari kondisi steatosis hati yang disebabkan defisiensi atau restriksi vitamin B12 terhadap peningkatan produksi radikal bebas yang menyebabkan terjadinya kondisi steatosis lewat proses stres oksidatif, melalui kajian proses stres oksidatif. Sedangkan rencana tindak lanjut penelitian ini adalah meneliti Hibiscus sabdariffa Linn yang ditargetkan menjadi fitofarmaka untuk penanganan NAFLD. Sehingga penelitian selanjutnya bertujuan untuk mengetahui potensi bahan formula fitofarmaka terhadap upregulasi gen antioksidan melalui jalur Nrf2.

25

DAFTAR PUSTAKA

Caldwell, S. H., & Argo, C. K. (n.d.). Nature of the Condition Non-alcoholic fatty

liver disease : Hype or harm ?

Chalasani, N., Younossi, Z., Lavine, J. E., Charlton, M., Cusi, K., Rinella, M., …

Sanyal, A. J. (2017.). The Diagnosis and Management of Nonalcoholic Fatty

Liver Disease : Practice Guidance from the American Association for the

Study of Liver Diseases, (317).

Chen, G., Ni, Y., Nagata, N., Xu, L., & Ota, T. (2016). Micronutrient Antioxidants

and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. https://doi.org/10.3390/ijms17091379

Cheung, O., Kapoor, A., Puri, P., Sistrun, S., Luketic, V. A., Sargeant, C. C., …

Sanyal, A. J. (n.d.). The Impact of Fat Distribution on the Severity of

Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Metabolic Syndrome, 1091–1100.

https://doi.org/10.1002/hep.21803

Dietrich, P., & Hellerbrand, C. (2014). Best Practice & Research Clinical

Gastroenterology Non-alcoholic fatty liver disease , obesity and the metabolic

syndrome. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 28(4), 637–

653. https://doi.org/10.1016/j.bpg.2014.07.008

Duseja, A., Singh, S. P., Saraswat, V. A., Acharya, S. K., Chawla, Y. K.,

Chowdhury, S., … Upadhyay, R. (2015). Non-alcoholic fatty liver disease and

metabolic syndrome-position paper of the Indian National Association for the

study of the liver, endocrine society of India, Indian college of cardiology and

Indian society of gastroenterology. Journal of Clinical and Experimental

Hepatology, 5(1), 51–68. https://doi.org/10.1016/j.jceh.2015.02.006

Ho, M., Halim, J. H., Gow, M. L., El-Haddad, N., Baur, L. A., Cowell, C. T., …

Marzulli, T. (2014). Vitamin B12 in obese adolescents with clinical features

of insulin resistance. Nutrients, 6(12), 5611–5618.

https://doi.org/10.3390/nu6125611

Kibirige, D., & Mwebaze, R. (2013). Vitamin B12 deficiency among patients with

diabetes mellitus : is routine screening and supplementation justified ?, 2–7.

Kozyraki, R., & Cases, O. (2013). Vitamin B12 absorption: Mammalian physiology

and acquired and inherited disorders. Biochimie, 95(5), 1002–1007.

26

https://doi.org/10.1016/j.biochi.2012.11.004

Li, J., Mpp, B. Z., Yeo, Y. H., Feng, Y., Xie, X., Lee, D. H., … Nguyen, P. M. H.

(2019). Articles Prevalence , incidence , and outcome of non-alcoholic fatty

liver disease in Asia , 1999 – 2019 : a systematic review and. The Lancet

Gastroenterology & Hepatology, 1253(19), 19–21.

https://doi.org/10.1016/S2468-1253(19)30039-1

Li, Z., Gueant-rodriguez, R., & Quilliot, D. (2018). Folate and vitamin B12 status

is associated with insulin resistance and metabolic syndrome in morbid

obesity. Clinical Nutrition, (2017), 1–7.

https://doi.org/10.1016/j.clnu.2017.07.008

Mahalle, N., Kulkarni, M. V, Garg, M. K., & Naik, S. S. (2013). Vitamin B12

deficiency and hyperhomocysteinemia as correlates of cardiovascular risk

factors in Indian subjects with coronary artery disease, 61(4), 289–294.

https://doi.org/10.1016/j.jjcc.2012.11.009

Mahamid, M., Mahroum, N., Bragazzi, N. L., Shalaata, K., Yavne, Y., Adawi, M.,

… Watad, A. (2018). Folate and B12 levels correlate with histological severity

in NASH patients. Nutrients, 10(4), 1–9. https://doi.org/10.3390/nu10040440

Moore, E., Pasco, J., Mander, A., Sanders, K., Carne, R., Jenkins, N., … Watters,

D. (2014). The prevalence of vitamin B12 deficiency in a random sample from

the Australian population. Journal of Investigational Biochemistry, 3(3), 95–

100. https://doi.org/10.5455/jib.20140716041521

Review, Lagemaat, Groot & Heuvel (2019). Vitamin B 12 in Relation to Oxidative

Stress : https://doi.org/10.3390/nu11020482

Rolo, A. P., Teodoro, J. S., & Palmeira, C. M. (2012). Role of oxidative stress in

the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Free Radical Biology and

Medicine, 52(1), 59–69. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2011.10.003

Sianipar, I. R., Ujianti, I., Yolanda, S., Murthi, A. K., Amani, P., Irawati, D., …

Santoso, S. (2019). Developing vitamin B12 deficient rat model based on

duration of restriction diet : Assessment of plasma vitamin B12 , homocysteine

( Hcy ), and blood glucose levels Developing Vitamin B12 Deficient Rat

Model Based on Duration of Restriction Diet : Assessment of Plasma Vitamin

27

B12 , Homocysteine ( Hcy ), and Blood Glucose Levels, 10001.

https://doi.org/10.1063/1.5096672

Younossi, Z., Anstee, Q. M., Marietti, M., Hardy, T., Henry, L., Eslam, M., …

Bugianesi, E. (2017). Global burden of NAFLD and NASH: trends,

predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology &

Hepatology, 14(1), 11–20. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.109

28

LAMPIRAN (bukti luaran yang didapatkan)

29