PENGGUNAAN 32p dan 35S SEBAGAI PENANDA PADA PENGU­KURAN PEMBENlUKAN MASSA MIKROBA RUMEN KERBAU

C. Hendratno*

ABSTRAK - ABSTRACT

PENGGUNAAN S2p DAN SSg SEBAGAI PENANDA PADA PENGUKURAN PEMBEN·

TUKAN MASSA MIKROBA RUMEN KERBAU. Telah dilakukan pengukuran pembentukanmassa mikroba dengan mcnggunakan 32p dan 35S dalam cairan rumen yang diambil dari kerbauyang dipotong di "jagal". Ternyata bahwa tidak terdapat perbedaan antar individu hewan, padakandungan fosfor maupun sulfur dalam mana mikroba ataupun cairan rumen, demikian pula

konsentrali N-NH3 dalam rumen menl1I\iukkan'tidak adanya perbedaan. S~baliknya terdapatvariaai antar hewan yang cukup beaar pada inkolporasi S2p dan S5S ke dalam massa mikrobasedang recovery radioaktif pada penggunaan fOifor adalah 76,40% dibanding dengan 69,75%pada penggunaan sulfur. Inkorporasi N masing-masing adalah 8,21 mg/j dibanding dengan 6,36

mg/j yang didukung oleh sintesis protein sebesar 28,04 ml,/j/l00 ml dan 21,00 mg/j/l00 ml.Hasilpcngamatan ini menunjukkan bahwa penggunaan 3 p ternyata lebih efektif dibandingdengan 35S•

TIlE USE OF 32p AND 35S AS MARKER IN TIlE MEASUREMENT OF RUMINA!.MICROBIAL MASS OF BUFF A!.OES. Radioactive phOlphor and sulphur were used as markerto measure the synthesis of microbial mass in the rumen liquors of buffaloes slaughtered ina 'slaughter hOUle. Results indicated no differences in the P and S content of the microbial mass

as wdl as NH3-N concentration in the rumen liquor. However, a comiderable variation amonganimals were found in radioactive P and S incorporation in microbial mass. The radioactiveP recovery was ?6.4()fo_as compared to 69.75% for radioactive S. As the results, the N incor­poration calculated from the two isotopic techniques were 8.21 mg/h and 6.36 mg/h respectivdywhich were in correspond to the rumen microbial protein synthesis of 28.04 mg/h/l 00 ml and

21.00 m~h/l 00 ml. These results suggested that the Ule of 3 2p is more effective compared tothat of 3 S.

PENDAHULUAN

Usaha untuk meningkatkan protein yang berasal dari mikroba dalam rumenmerupakan strategi untuk menanggulangi masalah yang terdapat pada penggunaanbahan pakan dengan kandungan unsur nutrisi yang tidak seimbang. Perkembaganmikroba di dalam rumen merupakan manifestasi dari proses pencernaan ataudegradasi ransum yang dikonsumsi oleh hewan. Setelah terbentuk di dalam rumen,mikroba disalurkan ke usus halus dan setelah dicernakan diserap asam amino (1).

• PUlat Aplikaai Isotop dan Radiasi, BATAN

609

DEMEYER dIck. (2) mengemukakan gambaran komposisi bakteri rumen. Persen­

tase unsur-unsur tertentu dalam komponen bakteri dapat dijadikan dasar untuk

pendugaan kegiatan bakteri tersebut di dalam rumen. Beberapa metode untukmengukur sintesis protein atau massa mikroba telah dikembangkan oleh EL­SHAZLY dan HUNGATE (3), WALKER dan NADER (4), dan VAN NEVEL danDEMEYER (5), walaupun temyata setiap metode memiliki keunggulan maupunkelemahan tertentu/HENDERICKX dIck. (6) menyatakan bahwa produksi ATP

secara teoritis dapat dipengaruhi oleh proses fermentasi pakan di dalam rumensehingga dapat menyebabkan variasi basil pengukuran yang cukup besar.

Metode yang sering digunakan untuk menduga kegiatan mikroba di dalam

rumen adalah metode l.ang dikembangkan oleh VAN NEVEL dan DEMEYER (5)dengan menggunakan 2p dan oleh WALKER dan NADER (4) yang menggunakan35S sebagai penanda. Kedua metode ini menggunakan isotop yang memancarkansinar beta yang dapat dideteksi walaupun terinkorporasi dalam massa mikrobadalam jumlah yang ked!. Unsur P terdapat pada komponen DNA dan RNA didalam inti sel mikroba (2) sedang unsur S terikat langsimg pada asam amino dari

komponen protein mikroba. Sebagai radioisotop, kedua unsur terse but memilikikarakteristik tertentu, yaitu waktu paruh (rn) yang relatif pendek dan energi sinarbeta yang dipancarkan (7, 8).

Dalammakalah ini dilaporkan basil percobaan yang membandingkan keefek·tifan 32p dan 35S sebagai penanda untuk mengikuti perubahan massa mikrobadalam rumen.

BAHAN DAN METODE

Pendugaan sintesis sel mikroba dengan 32p dilakukan melalui inkorporasi32p ke dalam sel. Untuk itu digunakan contoh cairan rumen sebanyak 25 ml yangdirnasukkan ke dalam Erlenmeyer. Contoh dalam Erlenmeyer I digunakan untuk

penetapan N dan P dalam bahan kering mikroba dan kandungan P dalam cairan di

luar sel mikroba ~ex). Contoh dalam labu Erlenmeyer II digunakan untuk penetap·an inkorporasi 3 P ke dalam sel mikroba (C) yang diperlukan untuk menghitungtotal P yang terinkorporasi dalam sel mikroba (Pi) dari hubungan :

Pi = C x PexSt

setelah penambahan NaH32P04 sebanyak 1,2 x 102 cpm (St) yang diinkubasiselama 2 jam pada suhu 390C dan keadaan anaerobik (5).

Pendugaan sintesis protein mikroba rumen dengan menggunakan 35S dilakukaSmelalui inkorporasi 35S dalam massa sel mikroba. S total yang terinkoorporasi kedalam protein (Si) dihitung dengan menggunakan persamaan yang diajukan olehWALKER dan NADER (4)sebagai berikut:

t. R1 . sex. k

Si •• R~- R~

610

di mana t ialah waktu inkubasi (menit); ~~ yaitu jumlah 35S yang terlnkorporasidalam protein mikroba pada waktu t (cpm); sex ialah kandungan sulfur dalamcairan rumen di luar massa mikroba; k adalah konstante laju pengenceran radioak·

tivitas dalam cairan; sedang R5. dan R~ masing-masing adalah radioaktivitas dalamcairan rumen di luar massa mikroba pada 0 dan t menit. Contoh cairan rumensebanyak 109 digunakan untuk penetapan tiap unsur dalam persamaan ini. yangdimasukkan dalam botol vaksin 50 mI, yang diinkubasi pada suhu 390C se1ama 30menit dalam keadaan anerobik.Pada akhir 30 menit ke dalam botol vaksin dimasuk­

kan 1arutan Na235S sebanyak 1,6 x 106 cpm kemudian diinkubasi lagi selama.

30, 60, 90, dan 120 menit untuk penetapan k, R~ dan R~ sedang pengukuranaktivitas 35S dilakukan menurut BLAIR dan CROFT (9). Selanjutnya Rf ditetap­kan menurut WALKER dan NADER (4) dan JOHNSON dan NISHITA (10). S

ditetapkan pada cairan rumen yang tidak diberi larutan Na235S, dengan mengguna­kan metode RAHIM dkk. (11).

Cairan rumen didapatkan dari 20 ekor kerbau di "jagal" segera setelah dipo­tong pada jam 1.00 dini hari dan setelah rumen dipisahkan dari isi abdomen yanglain. Cairan rumen diambil dan dimasukkan ke dalam termos dan kemudian dibawa

ke laboratorium. Di laboratorium, cairan rumen disaring melalui 4 lapis kasa pem­balut, kemudian diinkubasi pada suhu 390 - 400C dengan aliran gas C02 untukmempertahankan kondisi yang serupa dengan kondisi dalam rumen.

Hasil pengukuran pembentukan massa mikroba dengan menggunakan 32p dan35S diuji dengan uji T.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kandungan fosfor yang terdapat dalam kandungan rumen di luar massa mikroba(Tabel 3) ternyata 1ebih rendah dibanding dengan yang dikemukakan oleh VANNEVE, dan DEMEYER (2) pada domba yang disebabkan karena perbedaan jenishewan ataupun pakan yang dikonsumsi. Kandungan S juga menunjukkan hasil yangberbeda dengan yang didapatkan oleh WALKER dan NADER (4) yang mencapai0,5 - 1,5 mg/100 ml. Kandungan fosfor, sulfur, dan nitrogen yang terdapat dalambahan kering massa mikroba (Tabe13) juga berbeda dcngan hasil yang dikemukakanpeneliti-peneliti terdahulu (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa komposisi unsurmikroba juga dipengaruhi oleh perlakuan yang dialami hewan percobaan. Di lainpihak kandungan fosfor, sulfur, dan nitrogen pad a contoh-<:ontoh pada penelitianini tidak berbeda, yang berarti bahwa komposisi unsur dalam massa mikroba antarkerbau-kerbau ini adalah sarna.

Justru pada inkorporasi 32p maupun 35S terlihat variasi yang cukup besar diantara contoh-<:ontoh yang sarna (Tabe14). Variasi ini dapat disebabkan oleh~

pada mikroba ~ada waktu perlakuan ataupun teknik pengukuran.Recovery 2p pada Tabel 5 ternyata lebih tinggi dibanding dengan 35S karena

mengalarni proses yemisahan secara kimiawi yang lebih sederhana, demikian pulasifat radioisotoi3lp yang dapat dideteksi dengan metode CERENKOV (8).

Recovery 5S pada pengamatan ini adalah 69,75% (Tabel 5) yang juga pernah

611

didapatkan oleh WALKER dan NADER (4) dan merupakan akibat pengaliran dan

penangkapan H2S yang kurang sempuma. Ternyata setelah diadakan penyempurna-

an pada sistem Uu mala rocoyofY dnpat diting1\~t1w\ menj~Q.i~6 - 99% (4). Selainaliran gas juga sifat 3SS sebagai sumber radioisotop pemancar beta berenersi rendah(Tabel 2), memerlukan perlakuan khusus, seperti pemrosesan contoh yang akandicacah dan sangat bergantung pada fasilitas yang tersedia dalam laboratorium(7,8).

Di lain pihak, sebagai unsur dalam komponen bahan kering mikroba (Tabell),S terikat sebagai molekul protein sedang P terdapat dalam molekul DNA dan RNApada inti sel. Kandungan N yang merupakan unsur utama dalam molekul proteindapat ditetapkan melalui inkorporasi fosfor maupun sulfur melalui rasio N/P danN/S (Tabel 5).

Inkorporasi N dalam mikroba merefleksikan perubahan yang disebabkan olehperbandingan kandungan protein dan karbohidrat dalam ransum, yang juga digam­

barkan oleh konsentrasi N-NH3 dalam rumen. Ternyata bahwa N-NH3 dalamcontoh-contoh cairan rumen, tidilk banyak bervariasi (Tabel 3), yang menunjukkanbahwa kondisi rumen antar hewan-hewan ini dapat dianggap sarna.

Inkorporasi N dan sintesis protein mikroba yang dihitung melalui inkorporasifosfor dalam sel mikroba ternyata lebih tinggi daripada yang dihitung melaluiinkorporasi sulfur.

KESIMPULAN

Penggunaan 32p dan 35S sebagai penanda, ternyata keduanya mempunyaikelemahan. Sebagai unsur yang berperanan maka S langsung terinkorporasi padaprotein, sedang P tida!c.

Sebagai hasil akhir pengamatan ini ternyata bahwa inkorporasi N yang didapat­

kan dari hasil pengamatan dengan pen~unaan 32p adalah lebih tinggi dibandingyang didapatkan melalui penggunaan 3 S. Demikian pula halnya dengan sintesisprotein mikroba.

UCAP AN TERIMA KASm

Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Nyonya Titin Maryatidan Saudara Hasan Ashari yang telah membantu dalam analisis contoh cairan rumen,

pada pimpinan pejagalan Mampang yang telah mengizinkan digunakan fasilitasnyauntuk mengadakan pengamatan ini.

DAFTAR PUS TAKA

1. LENG, R.A., KEMPTON, TJ., and NOLAN, J.Y., Non-protein nitrogen andbypass protein in ruminal diets, Australian Meat Research Committee33 (1977) 2.

612

2. DEMEYER, D.L, HENDERICKX, H.K., and NEVEL, CJ. van, The nitrogen

metabolism in the rumen, Department of Nutrition and Hygiene (200fHM/FM), Faculty of Agriculture Science, Gent, Belgium (1972).

3. EL-SHAZLY, K., and HUNGATE, RE., Method for measurement diamino­pilemic acid in total rumen contents and its application to the estimationgrowth, Appl. Microbiol. 14 (1977) 27.

4 . WALKER, DJ., and NADAER, C J., Measurement of growth of rumen micro­bes, Appl. Microbiol.16 (1968) 1124.

5. NEVEL, CJ. van. and DEMEYER, D.L, "The use of32p to estimate microbiol

synthesis in the rumen", 6th Symposium on Energy Metabolism of theEAAP, Stuttgart, Gennany (1973).

6. HENDERICKX, H.K., DEMEYER, Dl., and NEVEL, C.J. van, ''Problems inestimating microbial protein synthesis in the rumen", Tracer Studies onNon-Protein Nitrogen for Ruminants (Proc. Panel Vienna, 1971), IAEA,Vienna (1972) 57.

7. FITGERALD, J J., Applied Radiation Protection and Control, Vol. I, Gordonand Breach; London (1969).

8. IAEA, Laboratory Training Manual on the Use of Nuclear Techniques inAnimal Research (Technical Reports Series No. 193), IAEA, Vienna (1979).

9. BLAIR, GJ., and CROFT, T.C., A quantitative and radioactive sulfur (35S)liquid scintillation counting method for determining soil and plant sulfur,Soil Science 107 (1977) 277.

10. JOHNSON, CR., and NISHlTA, H., Microestimation of sulphur in plantmaterials, soils and irrigation waters, Anal. Chern. 24 (1952) 730.

11. RAHIM, SA., SALIM, A.Y., and SHERREF, S., Absorptiometric determina­tion of trace amounts of sulphide ion in water, Analyst 98 (1973) 851.

613

0\-~Tabel 1. Komposisi bahan dalam bakteri rumen.

%DM

0/£%H%0%N%P%S%Ash

Protein

47,953,17,120,218,7 0,9DNA

1,938,13,731,2 .16,910,1RNA

7,635,63,435,216,29,6

NH2 - gula

2,044,76,839,88,7T.G

1,076,512,011,518: 0

0,176,512,011,516: 0

0,176,712,011,3M.G.L

0,269,99,520,6D.G.L.

0,265,59,025,5P.E

0,467,010,017,01,94,1S.P

0,464,411,316,63,74,0Polysacch.

33,444,56,249,3Ash

4,8

Total D, M

100,046,166,3230,6610,720,940,40 4,80

93,86% of D. M consists ofC6H9, 850 2,99N I ,20 VAN NEVEL dan DEMEYER (2)

Tabel 2. Ciri-ciri radionuklida

Radio-

Waktu paruh (hart)Energy yangOrgannuIdida

dipancarkansasaranFisika

Bio1ogiEfektif

Tp

TbTeTIpeMeV

35S

87.1 9,044,4f30,167Seluruh

16tubuh

87,1600,076,10,167Tulang

32p

14,3257,013,5t31,710Seluruh

15tubuh

14.3Tulang

FITGERALD (7) dan IAEA (8)

Tabel g. Kandungan fosfor, sulfur, nitrogen dalam bahan kering mikroba dan kandungan

fosfor. sulfur, dan N-NHg dalam cairan lUIJIen.

Bahan kering mikroba (9 mg/ 100 ml) mg/l00 mlKoefisien

variasi

Bahan kering mikroba

403,004,0%Sulfur

1,076,6%Fosfor

2,498,8%

Nitrogen

29,842,7%

Cairan rumen: Fosfor27,008,8%

Sulfur0,387,8%

N-NH3

8,629,3%

615

Tabel 4. 32p dan 35S dalam mana rnikroba dan dalam cairan di luar massa rnikroba.

32p dalam mikroba (C)

NaH232P0435S dalam mikroba (Rr)

35S dalam cairan di lual mikroba (~O)Na235S

cpm x 10-4

3,2123,6

6,952,4

164,6

Koeeflsienvariasi

10,76,18,7

13,75,8

Tabd 5. Inkorporasi P dan S dalam massa rnikroba. recovery 32p dan 35S• inkorporasi Ndalam rnikroba, dan sintesis protein mikroba.

PS-Inkorporasi dalam massa mikroba0,69aO,23bP<O,O 1

(mg/loo ml) Recovery radioaktif (%)

76,40a69,75bP<0,05Inkorporasi N dalam mikroba

8,21a6,36bP< 0,0 1(mg/j/l00 ml) Sintesis protein mikroba

28,04a21,00bP<O,OI(mgfj/l00 ml)

616

DISKUSI

L.A. SOFY AN :

Menurut Anda metode 355 lebih tepat dari metode dengan menggunakan 32p, akantetapi hasil penelitian Anda menunjukkan bahwa metode dengan menggunakan 32plebih baik. Apa sebabnya demikian?

C. HENDRA lNO :

Memang menggunakan 5 untuk mengukur terutama sintesis protein mikroba adalah

tepat karena 5 lan~ung terikat pada protein, sedanJ P hanya merupakan unsur dariinti bakteri, DNA-RNA. Tetapi pada penggunaan 55 terdapat beberapa kesulitan,yaitu : proses pemisahan 5 secara kimiawi, penangkapan H25, dan pada persiapanuntuk pencacahan aktivitas radiasi.

B. SUDARYANTO:

Mohon penjelasan tentang analisis statistiknya, yang mana yang dimaksud denganperlakuan dalam penelitian ini?

. C. HENDRAlNO :

Perlakuan dalam penelitian ini adalah f:ngukuran massa mikroba dengan dua cara,dengan metode yang menggunakan 3 5. Hasil pengukuran dengan kedua cara itudibandingkan dan diuji dengan uji T.

L. BATUBARA :

Diduga bahwa dengan menggunakan teknik in ~ terjadi akumulasi produkfermentasi, apakah dengan demikian kecepatan pembentukan massa mikrobadengan menggunakan 32p dan 355 tidak dipengaruhi?

C. HENDRA lNO :

Pendugaan Anda adalahbenar, untuk mencegah perubahati dari ekosistem rumen,maka perlu diusahakan adanya pengeluaran hasil produk fermentasi dalam sistemin vitro. Di samping itu waktu pengamatan in!!!!2. dibatasi.

K. MA'SUM :

Dalam rumen terdapat beberapa jenis mikroorganisme (bakteri dan protozoa)manakah yang 1ebih responsif penggunaan 32p dan 355 ini pada mikroorganismetersebut?

617

C. HENDRA1NO :

M\\\IQQij~~my temyata sanrt responsif terhadap penambahan atau penguranganunsur P dan S, karena keduanya merupakan unsur yang terdapat dalam mikroorga­nisme itu dan diperlukan untuk pembentukannya. Bakteri terutama sangatdipengaruhi oleh perubahan kadar unsur dalam lingkungannya, karena waktuperkembangannya adalah lebih cepat dibanding dengan protozoa. Di dalam cairanrumen, protozoa dapat dipisahkan dengan cara bertingkat, 3000 rpm untukpemisahan protozoa setelah itu 12000 rpm untuk bakteri.

618