PENGARUH JUMLAH SEL TERHADAP SEKRESI INSULIN DAN …

Created by Lemlitbang UHAMKA │ simakip.uhamka.ac.id │lemlit.uhamka.ac.id

LAPORAN

SKEMA KEDOKTERAN

PENGARUH JUMLAH SEL TERHADAP SEKRESI INSULIN DAN UKURAN

KLUSTER SEL PADA KULTUR 3D iGL CELL LINE

Tim Pengusul

Sri Suciati Ningsih, S.Si., M.Biomed. (0326069202)

Rizkyana Avissa, S.Si., M.Biomed.

Nomor Surat Kontrak Penelitian : 325/F.03.07/2020

Nilai Kontrak : Rp. 27.000.000,-

PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN


LEMBAR PENGESAHAN

Penelitian Ilmu Kedokteran

Judul Penelitian

PENGARUH JUMLAH SEL TERHADAP SEKRESI INSULIN DAN UKURAN

KLUSTER SEL PADA KULTUR 3D iGL CELL LINE

Jenis Penelitian : Penelitian Ilmu Kedokteran

Ketua Peneliti :Sri Suciati Ningsih, S.Si., M.Biomed.

Link Profil simakip :http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/1210

Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978

Fakultas : Fakultas Kedokteran

Anggota Peneliti :Rizkyana Avissa, S.Si., M.Biomed.

Link Profil simakip :Click or tap here to enter text.


Anggota Peneliti :Click or tap here to enter text.

Link Profil simakip :Click or tap here to enter text.


Waktu Penelitian : 6 Bulan

Luaran Penelitian

Luaran Wajib :Jurnal Nasional Terakreditasi SINTA 3

Status Luaran Wajib : In Review

Luaran Tambahan : HAKI Cipta

Status Luaran Tambahan: Diusulkan

Mengetahui,

Ketua Program Studi Ketua Peneliti

dr. Endin Nokik Stujanna, PhD. Sri Suciati Ningsih, S.Si., .Biomed.

NIDN. 0306078805 NIDN.0326069202

Menyetujui,

Dekan Fakultas Kedokteran Ketua Lemlitbang UHAMKA

Dr. dr. Wawang S Sukarya, Sp.OG(K), Prof. Dr. Suswandari, M.Pd

MARS, MH.Kes.

NIDN.0030064701 NIDN. 0020116601




ABSTRAK

Diabetes mellitus merupakan salah satu penyakit metabolik dengan jumlah penderita tinggi di seluruh

dunia, termasuk Indonesia. Sebagian besar dari penderita tersebut adalah diabetes mellitus tipe 2

(DMT2). DMT2 sangat erat kaitannya dengan gaya hidup yang tidak sehat. Sehingga, individu usia

produktif yang dengan pola hidup menetap (sedentary lifestyle) sangat rentan terkena penyakit ini.

Akibatnya, secara tidak langsung hal ini akan berpengaruh terhadap kualitas sumber daya manusia dan

performa kerja. DMT2 dapat disebabkan oleh sekresi insulin yang tidak adekuat atau resistensi insulin.

Pemahaman mengenai mekanisme seluler sekresi insulin pada sel β pankreas sangat penting untuk

memahami lebih lanjut mengenai faktor apa saja yang berpengaruh terhadap patofisiologi DMT2. Hal

ini dapat dilakukan secara invitro dengan menggunakan kultur sel iGL (insulin-Gaussie Luciferase)

yang berasal dari sel β pankreas yang telah dsisipkan dengan insulin-GLase (insulin manusia dan

luciferase gaussie. Dengan demikian, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui bagaimana

pengaruh jumlah sel yang dikultur terhadap jumlah sekresi insulin dan ukuran kluster sel yang

terbentuk dari kultur sel iGL secara 3D. Metode yang digunakan adalah uji invitro dengan

menggunakan sel iGL. Sel dikultur dengan medium kultur khusus sel iGL dalam 6 well plate.

Dilakukan penanaman sel dengan variasi jumlah 50, 100, 200, dan 400 sel/µL. Setiap perlakuan

dilakukan duplo. Kemudian sel diinkubasi selama 3 hari. Sekresi insulin diukur dengan metode glucose

stimulated insulin secretion (GSIS). . Pengukuran ukuran spheroid dilakukan dengan program NIS-

Elements Analysis D 5.20.00 64-bit. Hasil yang diperoleh kemudian dianalisis statistik dengan

menggunakan STATA. Hasil penelitian ini menunjukkan spheroid mulai terbentuk sejak hari

pertama dan diameternya semakin meningkat pada hari-hari selanjutnya. Hal tersebut berlaku pada

seluruh variasi konsentrasi sel (p<0,05). Ukuran spheroid berbanding lurus dengan konsentrasi sel

50-200 sel/µL sedangkan pada konsentrasi sel 400 sel/µL ukuran spheroid lebih kecil dengan

jumlah banyak. Bentuk spheroid yang konsisten dan tunggal diperoleh dari konsentrasi sel 50-100

sel/µL. Viabilitas sel yang dikultur secara 3D lebih rendah dan semakin menurun signifikan pada

sejak hari ke-3 dibandingkan dengan kultur 2D (p<0,05;0,01). Penelitian ini menunjukkan

spheroid dengan morfologi yang tunggal dan konsisten dengan viabilitas baik dapat diperoleh dari

konsentrasi sel 50-100 sel/µL dengan lama inkubasi 2 hari.

Keywords: iGL; jumlah sel; Spheroid; Viabilitas;


DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL……………………………………..…...…………….….1

HALAMAN PENGESAHAN………………………………….……...……….…2

SURAT KONTRAK PENELITIAN………………………………….…...….…..3

ABSTRAK…………………………………………………………..……...….…5

DAFTAR ISI……………………………………………………….………....…..6

DAFTAR GAMBAR………………………………………….…………...….….8

BAB 1. PENDAHULUAN……………………………………..…………...……9

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA……………………………………………...…11

BAB 3. METODE PENELITIAN………………………………………………..16

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………...…………..17

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN…………...……………………………..22

BAB 6 LUARAN YANG DICAPAI………………………………………….…23

BAB 7 RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI…...….26

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………...….27

LAMPIRAN…………………………………………………………………..….28


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Spheroid yang dikultur dari 50 sel/µL(A), 100 sel/µL(B), 200 sel/µL(C), dan 400

sel/µL(D) selama 2 hari. (Gambar diambil dengan mikroskop fase kontras dengan

perbesaran 100x)

Gambar 2. Perbandingan ukuran spheroid dari jumlah sel yang berbeda dari hari 1-4. Data

ditampilkan adalah rata-rata ± standar deviasi (SD) dari tiap perlakuan (n=30). Data

dianalisis dengan uji ANOVA factorial (p=<0,01).

Gambar 3. Gambar 3. Viabilitas sel antara kultur 3D dengan 2D dari hari ke 1-4 inkubasi dengan

jumlah sel yang berbeda (A-D 50,100,200, dan 400 sel/µL berturut-turut).


BAB I

PENDAHULUAN

Diabetes merupakan salah satu masalah kesehatan besar di seluruh dunia. Menurut IDF, angka

kejadian diabetes mencapai 9,3% yaitu 460 juta jiwa dari total peduduk dunia pada tahun 2019.

Angka ini diperkirakan akan terus meningkat hingga dekade selanjutnya. Indonesia menempati

peringkat 7 sebagai negara dengan jumlah penderita diabetes terbanyak di dunia dengan kisaran

angka 10,7 juta jiwa. Diabetes tipe-2 (DMT2) merupakan tipe diabetes dengan jumlah penderita

paling banyak (IDF,2019). DMT2 adalah penyakit metabolik yang erat kaitannya dengan gaya

hidup. Pekerja usia produktif dengan pola hidup menetap (sedentary lifestyle) rentan menderita

penyakit metabolik karena rawan terkena stress, pola makan tidak teratur, dan kurangnya aktivitas

fisik. Hal ini akan mempengaruhi potensi pekerja sebagai sumber daya manusia yang harus

memiliki kondisi Kesehatan yang prima untuk meningkatkan kualitas kerja.

DMT2 disebabkan sekresi insulin yang tidak adekuat dan resistensi insulin. Sekresi insulin oleh

sel β pancreas distimulasi oleh glukosa. peristiwa ini melibatkan serangkaian aktivitas intraseluler

mulai dari sintesis hingga translokasi granula insulin melewati membran plasma (Sidarala dan

Anjaneyulu, 2017). Insulin tersebut kemudian dilepaskan ke aliran darah menuju organ target

untuk menjalankan fungsinya. Pemahaman mengenai mekanisme seluler sekresi insulin dapat

pelajari dengan model kultur sel β pancreas secara invitro. Beberapa varian lini sel β pankreas

yang banyak digunakan misalnya RIN-m5F (Lay et al, 2014), EndoC-bH1 (Esguerra et al, 2019),

INS-1 cells (Baidwan et al, 2017), dan iGL (Suzuki et al, (2017).

iGL adalah sel yang berasal dari subkultur sel β pankreas tikus. Sel ini mampu mengekspresikan

insulin-GLase dalam merespon kadar glukosa lingkungan yang tinggi. Sekresi insulin-GLase ini

lah yang kemudian digunakan untuk mengukur aktivitas sekresi insulin . Sel iGL sangat baik

digunakan sebagai model untuk mempelajari mekanisme seluler sekresi insulin sel β pancreas.

Keunggulan sel ini adalah sel dapat dikultur secara 3 dimensi dengan membentuk spheroid dan


pengamatan sekresi insulin dapat dilakukan secara langsung dengan mikroskop fluorescence.

Kultur sel 3D menmungkinkan untuk mempelajari lebih lanjut mengenai efek osilatori dari

sinkronisasi sekresi insulin pada sel β pancreas. Sekresi insulin dipengaruhi oleh banyak faktor

baik intraseluler maupun ekstraseluler, salah satunya jumlah sel. Dengan demikian, tujuan khusus

dari penelitian ini adalah untuk memahami lebih lanjut mengenai pengaruh jumlah sel yang

dikultur dengan jumlah droplet spheroid yang terbentuk hingga pengaruhnya terhadapa kadar

sekresi insulin pada sel iGL. Diharapkan model yang diperoleh dari penelitian ini dapat digunakan

untuk penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme seluler patofisiologi DMT2 dan menemukan

cara yang tepat untuk terapi penyakit tersebut.

1.1.Tujuan

Tujuan penelitian ini adalah untuk memahami lebih lanjut mengenai pengaruh jumlah sel yang

dikultur dengan jumlah droplet spheroid yang terbentuk hingga pengaruhnya terhadapa kadar

sekresi insulin pada sel iGL.

1.2.Urgensi Penelitian

Penelitan dengan menggunakan lini sel iGL masih sangat terbatas. Hingga saat ini belum ada

penelitian mengenai mekanisme seluler sekresi insulin dan hubungannya dengan jumlah sel dan

droplet spheroid sel. Hasil dari penelitian ini diharapkan akan mengahasilkan Teknik kultur 3D sel

iGL dengan sekresi insulin yang optimum merepresentasikan aktivitas sel β pankreas yang

sebenarnya. Sehingga, model ini dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya untuk mempelajari

lebih dalam mekanisme seluler mengenai mekanisme patofisiologi yang terjadi pada β pankreas

pada DMT2 dan celah target terapi untuk penyakit tersebut.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Menurut IDF (2019), angka kejadian diabetes dunia terus naik hingga beberapa decade terakhir.

Pada tahun 2019, jumlah penderita diabetes mencapai 9,3% yaitu 460 juta jiwa dari seluruh

penduduk dunia. Angka ini diperkirakan akan terus meningkat hingga dekade selanjutnya.

Indonesia menempati peringkat 7 sebagai negara dengan jumlah penderita diabetes terbanyak di

dunia dengan kisaran angka 10,7 juta jiwa. Data terbaru riset kesehatan dasar (RISKESDAS)

Indonesia tahun 2018 menunjukkan prevalensi diabetes pada orang dewasa mencapai 8,5%

dengan. Diabetes tipe-2 (DMT2) memilki jumlah penderita paling banyak.

Sel β pankreas mensekresikan insulin sebagai respon terhadap stimulasi glukosa. Glukosa masuk

ke dalam sel melalui GLUT1 dan masuk ke siklus metabolisme seluler dengan cepat dan

menghasilkan peningkatan rasio ATP dan ADP. Akibatnya terjadi depolarisari kanal ATP-

sensitive potassium (KATP) yang membuka kanal voltage-dependent calcium. Terbukanya kanal

tersebut menyebabkan lepasnya sejumlah ion kalsium ke dalam sitoplasma. Kalsium terikat dan

mengaktivasi protein-protein yang yang berperan dalam eksositosis granula insulin menuju

eksraseluler. Tahap selanjutnya terjadi pengumpulan granula insulin intraseluler yang tersimpan

pada membran plasma, proses ini melibatkan reorganisasi protein sitoskeleton filamen aktin (F-

actin) (Kalwat dan Cobb, 2017). Abnormalitas jalur persinyalan kedua tahap tersebut terjadi pada

patofisiologi DMT2 baik dari sintesis maupun proses sekresi insulin.

Mekanisme molekuler sekresi insulin dan faktor apa saja yang mempengaruhinya dapat dipelajari

dengan menggunakan kultur sel secara invitro. Metode ini berkembang pesat dalam kurun waktu

terakhir. Beberapa lini sel β pankreas telah banyak digunakan diantarannya yaitu RIN-m5F (Lay

et al, 2014), EndoC-bH1 (Esguerra et al, 2019), INS-1 cells (Baidwan et al, 2017), dan iGL (Suzuki

et al, (2017). Sel iGL merupakan jenis yang baru dan penelitian yang menggunakan sel tersebut

masih sangat terbatas.


Sel iGL adalah sel yang berasal dari subklonal sel β pankreas tikus. Sel ini mampu

mengekspresikan insulin-GLase dalam merespon kadar glukosa lingkungan yang tinggi. Insulin-

GLase merupakan gabungan protein insulin manusia dan protein GLase yang berfungsi sebagai

protein reporter untuk memonitor sekresi insulin dari sel iGL. Protein GLase merupakan protein

luciferase dari spesies Gaussia yang dapat berpendar jika ditembaki cahaya dengan panjang

gelombang tertentu. Dengan demikian, banyak sedikitnya kadar insulin yang dieksresikan dapat

dipantau dari pendaran protein insulin-GLase tersebut (Suzuki et al, 2011).

Sel iGL dapat dikultur secara 3D. Keunggulan dari Teknik kultur 3D yaitu menampilkan fitur yang

lebih dekat dengan kondisi in vivo sehingga dianggap lebih realistis untu ditranlasikan untuk

aplikasi in vivo (Ravi et al, 2014). Hal tersebut dikarenakan pada kultur 3D lebih memungkinkan

untuk terjadinya kontak antar sel baik secara langsung maupun dengan matriks ekstraseluler untuk

melancarkan komunikasi antar sel. Penelitian oleh Suzuki et al (2017) menunjukkan adanya efek

osilasi yang tersinkronisasi lebih intens pada sekresi insulin sebgai respon dari pemberian glukosa

tinggi pada sel iGL yang di kultur 3D.

Salah satu parameter penting dalam kultur sel baik secara 2D maupun 3D adalah jumlah sel yang

ditanam saat pertama ataupun saat pasasi. Hal itu dikarenakan jumlah sel yang ditanam berdampak

pada kecepatan tumbuh sel dan durasi sel mencapai titik konfluensinya. Menurut PhelaN (2016),

jumlah optimum untuk kultur sel manusia adalah ~5 × 104 sel/ml. Akan tetapi hal ini juga

tergantung pada jenis sel nya. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Kojima (2014) yang

mengungkapkan bahwa jumlah dan komposisi sel berpengaruh terhadap kecepatan pembnetukan

argegat dan sekresi insulin pada pembuatan pseudoislet pankreas. Sekresi insulin pada kultur 3D

sel iGL memperlihatkan efek osilasi yang tersinkronisasi pada proses sekresi insulin. Peristiwa ini

menggambarkan bahwa interaksi antar sel sangat berperan penting dalam proses sekresi insulin

sebagai respon terhadap glukosa. Hal ini berbanding lurus dengan jumlah insulin yang


disekresikan.6 Mekanisme osilasi dari sekresi insulin tersebut erat kaitannya dengan gap junction

yang menhubungkan satu sel dengan sel lainnya. Gap junction berperan penting dalam komunikasi

antar sel, persinyalan sel, dan koordinasi fungsi seluler (Umranni et al, 2017).

2.1. Roadmap Penelitian


BAB III

METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium penelitian Fakultas Kedokteran pada bulan Juli

sampai dengan Desember 2020.

1. Persiapan sel dan perbanyakan sel iGL

Proses ini diawali dengan thawing sel. Tahap pertama yaitu memindahkan tabung cryovial

yang berisi sel dari -80⁰C ke waterbath yang telah diatur temperaturnya pada 37⁰C. Lalu

pindahkan suspensi sel ke dalam tabung sentrifuse 50 mL yang telah diisi dengan 9 mL

medium kultur (IGLM). Kemudian sentrifugasi dengan kecepatan 300g selama 5 menit.

Buang supernatan dan resuspensi kembali dengan 10 mL medium. Lalu pindahkan suspensi

sel ke dalam 100mm dish (93100, Corning Incorporated) dan inkubasi sel dalam inkubator

37°C, 5% CO2. Lakukan penggantian medium kultur setiap 3-4 hari. Setelah mencapai

konfluensi 70-90%, dilakukan subkultur untuk perbanyakan sel.

2. Perlakuan sel iGLdikultur dengan jumlah yang berbeda

Dilakukan penanaman sel pada plate 6 well coated with poly-D-lysine (Falcon, Cat. No.

356413). Setiap masing-masing well ditanam dengan jumlah sel yang berbeda yaitu 1, 2, 4,

8, 16, x105 per well, semua perlakuan dilakukan duplo. Kemudian sel dikultur selama 3

hari.

3. Pengukuran jumlah dan ukuran kluster sel

Pengukuran jumlah dan ukuran kluster sel dilakukan dengan perangkat mikroskop inverted

fluorescence (Nikon,Ts2PhFL) yang telah dilengkapi kamera (Nikon, DS-Fi3). Dilakukan

perhitungan terhadap jumlah kluster yang terbentuk. Pengukuran terhadap ukuran kluster

sel dilakukan minimal lima titik dari lima lapang pandang.


4. Glucose Stimulated Insulin Secretion Assay (GSIS ASSAY)

Ekspresi insulin-GLase pada sel iGL akan di stimulasi dengan metode GSIS ASSAY. Pertama,

dilakukan dua kali pencucian dengan 2 mL of 2 mM glucose KRH buffer. Kemudian lakukan

praperlakuan dengan kadar glukosa rendah yaitu dengan menginkubasi sel dalam 2 ml of 2 mM

glucose KRH buffer selama 1 jam dalam incubator. Lalu lakukan Kembali 2 kali pencucian

dengan 2 mL of 2 mM glucose KRH buffer. Selanjutnya inkubasi sel dengan 2 ml of 20 mM

glucose KRH buffer selama 1 jam di incubator. Setelah inkubasi, pindah kan medium ke dalam

tabung mikro untuk pengukuran insulin yang disekresikan. Sebelumnya, perlu disentrifugasi

dengan kecepatan 300g selama 5 menit pada temperature 4°C untuk menghilangkan

kemungkinan sel yang ikut terbawa. Untuk pengukuran insulin intraseluler, dilakukan lisis sel

dengan menambahkan 200 μL of 1 × Passive Lysis Buffer (5×,E1941, Promega

Corporation).

5. Penukuran ekspresi insulin dengan metode sandwich ELISA.

Medium, lisat sel, dan standar insulin sebanyak 100 µL ke dalam sumur yang berlapis

antibodi spesifik untuk insulin. Pada sumur yang telah ditentukan untuk membuat kurva

standar, dimasukkan 100 µL larutan standar insulin yang telah dilakukan pengenceran

berseri. Ke dalam sumur yang telah ditentukan untuk menghitung kadar protein insulin pada

sampel dimasukkan 100 µL sampel dengan konsentrasi tertentu sesuai hasil optimasi (kadar

protein yang tercakup dalam kurva standar). Setelah itu tutup dan inkubasi pada 37°C

selama 2 jam. Buang, lalu dilakukan pencucian dengan 250 µL buffer pencuci 3 kali.

Kemudian masukkan 100 µL antibodi spesifik insulin yang terkonjugasi biotin ke dalam

sumur. Tutup dan inkubasi 1 jam pada 37°C. Buang lalu cuci 3 kali dengan 250 µL buffer.

Tambahkan 100 µL Streptavidin-HRP lalu tutup dan inkubasi 1 jam, 37°C. Buang lalu cuci

5 kali dengan 250 µL buffer. Kemudian tambahkan 100 µL larutan substrat. Tutup dan

inkubasi selama 15-20 menit pada 37°C. Sebanyak 50 µL stop solution ditambahkan

sehingga warna larutan dalam sumur akan berubah dari biru menjadi kuning. Absorbans


kemudian dibaca dengan ELISA reader pada 450 nm. Nilai absorbans dari larutan standar

insulin akan diplot membentuk kurva standar dengan menggunakan microsoft Excell.

Persamaan kurva yang didapat digunakan untuk mendapatkan kadar protein insulin. Kadar

protein akhir pada sampel kemudian disesuaikan dengan pengenceran yang dilakukan. Uji

ini dilakukan duplo. Hasil yang diperoleh kemudian dianalisis statistik dengan

menggunakan STATA.12.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Parameter yang digunakan pada penelitian ini adalah ukuran spheroid dan sekresi insulin dari

sel iGL yang dikultur secara 3D dan membentuk spheroid. Selain itu juga dibandingkan dengan

sel yang dikultur secara 2D sebagai standar kultur sel normal. Akan tetapi, terdapat masalah

ketika dilakukan analisis sekresi insulin dengan metode ELISA sehingga data tersebut tidak

layak untuk digunakan. Oleh karena itu, peneliti hanya mampu menampilkan data analisis

ukuran spheroid dan ditambah dengan viabilitas sel yang dikultur dari hari 1-4 inkubasi.

4.1. Morfologi dan Ukuran Spheroid

Berdasarkan hasil yang diperoleh, spheroid sudah mulai terbentuk sejak hari pertama kultur.

Hal tersebut terjadi pada setiap variasi jumlah sel. Semakin besar konsentrasi sel, semakin besar

pula diameter spheroid yang dihasilkan (Gambar 1). Akan tetapi, hal tersebut hanya berlaku

pada perlakuan jumlah sel 50-200 sel/µL saja. Pada konsentrasi sel yang lebih tinggi yaitu 400

sel/µL, diameter spheroid berukuran kecil tetapi dalam jumlah yang lebih banyak. Spheroid

yang terbentuk paling banyak menyerupai bola bulat atau lonjong. Bentuk ini ditemukan pada

spheroid yang berasal dari semua variasi kecuali 200 sel/µL. Banyak ditemukan spheroid yang

memiliki bentuk tidak simetris pada konsentrasi sel tersebut.

Gambar 1. Spheroid yang dikultur dari 50 sel/µL(A), 100 sel/µL(B), 200 sel/µL(C), dan 400 sel/µL(D)

selama 2 hari. (Gambar diambil dengan mikroskop fase kontras dengan perbesaran 100x)


Perbedaan ukuran spheroid diamati dari hari pertama hingga hari keempat setelah kultur

(Gambar 2). Spheroid mulai terbentuk semakin besar dan memadat dari hari ke hari.

Konsentrasi dan lama inkubasi berpengaruh signifikan terhadap ukuran spheroid yang

terbentuk (p<0,01). Diameter spheroid meningkat signifikan dari hari pertama hingga hari ke-

4 (R2=<0,093).

Gambar 2. Perbandingan ukuran spheroid dari jumlah sel yang berbeda dari hari 1-4. Data

ditampilkan adalah rata-rata ± standar deviasi (SD) dari tiap perlakuan (n=30). Data dianalisis

dengan uji ANOVA factorial (p=<0,01).

3.2. Viabilitas Sel Penyusun Spheroid

Viabilitas sel iGL yang dikultur secara 3D lebih tidak stabil dibandingkan kultur 2D. Hampir

seluruh kultur 2D mampu mempertahankan viabilitasnya >80% untuk semua variasi

konsentrasi sel hingga hari keempat. Sedangkan pada kultur 3D yang membentuk spheroid,

viabilitas sel mulai turun signifikan sejak hari ketingga hingga hari keempat. Gambar 3

menunjukkan viabilitas sel yang dikultur secara 3D berbeda signifikan dengan 2D hampir di


seluruh masing-masing konsentrasi sel (p<0,05;0,01). Hanya kultur pada hari ke-2 dengan

konsentrasi sel 50,100, dan 200 sel/µL yang memiliki viabilitas sel yang tidak signifikan antara

2D dan 3D.

Gambar 3. Viabilitas sel antara kultur 3D dengan 2D dari hari ke 1-4 inkubasi dengan jumlah

sel yang berbeda (A-D 50,100,200, dan 400 sel/µL berturut-turut).

Diskusi

Pada penelitian ini dibuktikan bahwa sistem kultur 3D dengan Teknik Hanging Drop dapat

menghasilkan spheroid dari sel iGL. Ukuran spheroid dipengaruhi oleh konsentrasi sel dan

lama inkubasi. Ukuran spheroid berbanding lurus dengan jumlah awal sel ditanam pada

konsentrasi 50-200 sel /µL. Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya dengan menggunakan

beragam jenis lini sel dengan jumlah sel yang berbeda, diantaranya sel HIEC-6 (Flampouri et

al., 2019), MCF-7 (Gong et al., 2015), HCT-116, UM-UC-3, dan HeLa (Pereira et al., 2017).

Bentuk spheroid cenderung stabil dan konsisten pada kelompok 50 dan 100 sel/µL dengan

bentuk bulat atau lonjong dan Sebagian besar tunggal. Berbeda dengan kelompok 200 sel/µL

yang memiliki bentuk asimetri dan dikelilingi oleh sejumlah spheroid dengan ukuran yang


lebih kecil. Hasil berbeda ditemukan pada kelompok sel 400 sel/µL. Ukuran diameter spheroid

dari kelompok ini cenderung lebih kecil, bahkan lebih kecil dari kelompok 50 sel/µL. Namun,

berbeda dengan kelompok lain yang memiliki jumlah tunggal atau satu spheroid dominan yang

besar, pada kelompok ini ditemukan spheroid-spheroid kecil dengan jumlah yang lebih banyak.

Hal ini diduga disebabkan karena perbedaan lingkungan mikro antar kelompok. Formasi

agregat sel yang membentuk spheroid merupakan proses kompleks yang dipengaruhi oleh

lingkungan mikro di sekitarnya misalnya matriks ekstraseluler, cell junction, dan protein-

protein terlarut di dalam medium. Selain itu, pembentukan spheroid juga ditentukan oleh

fenotipe jenis sel yang digunakan (Repin et al., 2014). Spheroid dapat dibentuk oleh fusi dari

sel tunggal atau agregat sel sehingga membentuk agregat sel yang lebih besar dan padat. Setiap

sel memiliki kecepatan dan model fusi yang berbeda (Kosheleva et al., 2020).

Viabilitas sel spheroid hampir selalu lebih rendah dibandingkan kultur 2D monolayer. Hal

tersebut disebabkan sel pada kultur 2D memiliki akses nutrisi dan oksigen lebih baik

dibandingkan 3D. Spheroid terdiri atas tumpukan berlapis-lapis sel yang membentuk dua zona

yaitu zona tengah dan perifer. Sel yang berada di tengah spheroid cenderung kekurangan nutrisi

dan oksigen sehingga akan mengalami fase quiescent atau kematian sel baik secara apoptosis

maupun nekrosis. Zona ini terlihat lebih gelap pada pengamatan dengan mikroskop inverted

fase kontras (Zanoni et al., 2016). Pada penelitian ini ditemukan zona gelap pada spheroid

mulai dari hari ke-2 pengamatan. Namun, zona gelap tersebut masih berupa bitnik-bintik kecil

saja. Zona gelap cenderung membesar sejak hari ke-3 dan seterusnya dan hampir melingkupi

semua spheroid pada hari ke-5 (data tidak ditunjukkan). Hal ini sebanding dengan data

viabilitas sel yang diperoleh. Viabilitas sel spheroid menurun drastis pada kultur mulai hari ke-

3 inkubasi dibandingkan kultur 2D.

Semua kelompok konsentrasi sel yang dikultur dengan waktu inkubasi dua hari menunjukkan

hasil yang sama dengan kultur 2D, kecuali kelompok 400 sel/µL yang cenderung memiliki


viabilitas lebih tinggi. Kultur 3D sel iGL dengan metode Hanging Drop dengan volume 25 µL

per droplet memungkinkan kondisi lingkungan mikro yang kondusif hingga hari ke-2 inkubasi.

Semakin bertambahnya waktu inkubasi mengakibatkan menurunnya nutrisi dan meningkatnya

metabolit yang berbahaya bagi sel (Ryu et al., 2019). Salah satu kelemahan metode kultur

Hanging Drop adalah sulitnya dilakukan proses penggantian medium (Bresciani et al., 2019).

Terdapat beberapa keterbatasan dalam penelitian kali ini. Pertama, sel iGL harus memiliki

medium dan reagensia khusus yang relative lebih mahal dibandingkan medium racikan biasa.

Peneliti belum mampu memaksimalkan potensi sel iGL yang sekresi insulin dapat dideteksi

langsung dari pendaran di bawah mikroskop fluorescent. Oleh karena itu perlu dilakukan

penelitian lanjutan untuk lebih mengeksplorasi potensi sel iGL sebagai model invitro utnuk

mempelajari DMT2 khususnya dalam hal mekanisme seluler sekresi insulin.


BAB VI

LUARAN YANG DICAPAI

Luaran yang dicapai berisi Identitas luaran penelitian yang dicapai oleh peneliti sesuai dengan

skema penelitian yang dipilih.

Jurnal

IDENTITAS JURNAL

1 Nama Jurnal Indonesian Journal of Biotechnology

2 Website Jurnal https://jurnal.ugm.ac.id/ijbiotech

3 Status Makalah In Review

4 Jenis Jurnal Jurnal Nasional terakreditasi Sinta 1

Terindeks Scopus Q4

4 Tanggal Submit

5 Bukti Screenshot submit

Luaran Tambahan

IDENTITAS HAK KEKAYAAN INTELEKTUAL

1 Nama Karya Protokol Kultur 3D untuk Membentuk Spheroid Dari

Sel iGL dengan Teknik Hanging Drop

2 Jenis HKI HAKI Cipta

3 Status HKI Submited

4 Tanggal Submit 19 Februari 2021


BAB VII

RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI

Minimal mencakup 2 hal ini.

Hasil Penelitian Penelitian ini membuktikan adanya pengaruh konsentrasi sel

dan lama inkubasi terhadap ukuran dan viabilitas sel

spheroid dari sel iGL. Selanjutnya dihasilkan waktu

inkubasi dan konsentrasi sel optimal yang

direkomendasikan untuk menghasilkan spheroid dari sel

iGL dengan ukuran dan viabilitas yang baik

Rencana Tindak

Lanjut

Rencana tindak lanjut dari penelitian ini adalah eksplorasi

lebih jauh mengenai karakteristik dari sel iGL baik dari sisi

seluler, matriks ekstraseluler, dan factor-faktor yang

mempengaruhi sekresi insulinnya. Selanjutnya

direncanakan dapat diteliti mengenai pengaruh ukuran

spheroid terhadap sekresi insulin yang dari kultur sel iGL.

Pemahaman menyeluruh mengenai karakteristik sel iGL

diharapkan dapat menghasilkan model in vitro yang baik

untuk mempelajari aspek seluler dan molekuler mellitus tipe

2 baik dari sisi patofisiologi hingga terapi.


DAFTAR PUSTAKA

1. International Diabetes Federation. (2019). IDF DIABETES ATLAS Ninth edition

2019. www.diabetesatlas.org

2. Sidarala V, Anjaneyulu K. (2017). The Regulatory Roles of Mitogen-Activated Protein

Kinase (MAPK) Pathways in Health and Diabetes: Lessons Learned from the

Pancreatic β-Cell. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov, 10, 2,76–84.

3. Lai X, Xincong K, Luman Z, Jian L, Yan Y, and Dongbo L. (2014). The protective

effects and genetic pathways of thorn grape seeds oil against high glucoseinduced

apoptosis in pancreatic β-cells. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14,

10, 2-7.

4. Esguerra JLS., Jones K. Ofori, Mototsugu N, Yuki S, Alexandros K, Joao F, Hitoshi S,

Leif G, Lena E. (2019). Glucocorticoid induces human beta cell dysfunction by

involving riborepressor GAS5 LincRNA. Molecular Metabolism, 32, 160-167.

5. Baidwan S, Anil C, DiAnna LH, and Anjaneyulu K. (2017). Glucotoxicity promotes

aberrant activation and mislocalization of Ras-related C3 botulinum toxin substrate

1[Rac1] and metabolic dysfunction in pancreatic islet β-cells: Reversal of such

metabolic defects by metformin. Apoptosis, 22, 11, 1380–1393.

6. Suzuki T, Takao K, Satoshi I. Quantitative visualization of synchronized insulin

secretion from 3D-cultured cells. (2017). Biochemical and Biophysical Research

Communications, 486, 886-892.

7. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. (2018). Hasil Utama RISKESDAS 2018.

Kementrian Kesehatan RI, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan.

8. Kalwat, M.A. & Cobb, M.,.(2017),Mechanisms of the Amplifying Pathway of Insulin

Secretion in the β Cell, Pharmacology and Therapeutics, 1-39

9. Suzuki T, Chihiro K, Takao K, Satoshi I. (2011). Video rate bioluminescence imaging

of secretory proteins in living cells: Localization, secretory frequency, and

quantification. Anal. Biochem, 4, 15,182–189.

10. Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E and Solomon F D Paul. (2014). 3D Cell

Culture Systems - Advantages and Applications. Journal of Cellular Physiology, 1-32.

11. Phelan K and Kristin MM. (2016). Basic Techniques in Mammalian Cell Tissue

Culture. Curr. Protoc. Toxicol. 70:A.3B.1-A.3B.22.

12. Kojimaa N, S. Takeuchi, and Y. Sakai. (2014). Engineering of Pseudoislets: Effect on

Insulin Secretion Activity by Cell Number, Cell Population, and Microchannel

Networks. Transplantation Proceedings, 46, 1161-1165.

13. Umrani MR., Mugdha VJ Ella SG, Wilson W, and Anandwardhan AH. (2017).

Connexins and microRNAs: Interlinked players in regulating islet function? ISLETS,

9, 5, 99–108.

14. Flampouri, E., Imar, S., Oconnell, K., & Singh, B. (2019). Spheroid-3D and

Monolayer-2D Intestinal Electrochemical Biosensor for Toxicity/Viability Testing:

Applications in Drug Screening, Food Safety, and Environmental Pollutant Analysis

[Research-article]. ACS Sensors, 4(3), 660–669.

15. Zanoni, M., Piccinini, F., Arienti, C., Zamagni, A., Santi, S., Polico, R., Bevilacqua,

A., & Tesei, A. (2016). 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A


systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific

Reports, 6(November 2015), 1–11. https://doi.org/10.1038/srep19103

16. Pereira, P. M. R., Berisha, N., Bhupathiraju, N. V. S. D. K., Fernandes, R., Tomé, J. P.

C., & Drain, C. M. (2017). Cancer cell spheroids are a better screen for the

photodynamic efficiency of glycosylated photosensitizers. PLoS ONE, 12(5), 1–21.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177737

17. Kosheleva, N. V., Efremov, Y. M., Shavkuta, B. S., Zurina, I. M., Zhang, D., Zhang,

Y., Minaev, N. V., Gorkun, A. A., Wei, S., Shpichka, A. A., Saburina, I. N., &

Timashev, P. S. (2020). Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific

Reports, 10(1), 1–15. https://doi.org/10.1038/s41598-020-69540-8

18. Repin, V. S., Saburina, I. N., Kosheleva, N. V., Gorkun, A. A., Zurina, I. M., &

Kubatiev, A. A. (2014). 3D-Technology of the Formation and Maintenance of Single

Dormant Microspheres from 2000 Human Somatic Cells and Their Reactivation In

Vitro. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 158(1), 137–144.

https://doi.org/10.1007/s10517-014-2709-4

19. Shi, W., Kwon, J., Huang, Y., Tan, J., Uhl, C. G., He, R., Zhou, C., & Liu, Y. (2018).

Facile Tumor Spheroids Formation in Large Quantity with Controllable Size and High

Uniformity. Scientific Reports, 8(1), 1–9. https://doi.org/10.1038/s41598-018-25203-3

20. Gong, X., Lin, C., Cheng, J., Su, J., Zhao, H., Liu, T., Wen, X., & Zhao, P. (2015).

Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds

for drug testing. PLoS ONE, 10(6), 1–18. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130348

21. Bresciani, G., Hofland, L. J., Dogan, F., Giamas, G., Gagliano, T., & Zatelli, M. C.

(2019). Evaluation of Spheroid 3D Culture Methods to Study a Pancreatic

Neuroendocrine Neoplasm Cell Line. Frontiers in Endocrinology, 10(October), 1–10.

https://doi.org/10.3389/fendo.2019.00682

22. Ryu, N. E., Lee, S. H., & Park, H. (2019). Spheroid Culture System Methods and

Applications for Mesenchymal Stem Cells. Cells, 8(12), 1–13.

https://doi.org/10.3390/cells8121620

Documents

PENGARUH JUMLAH SEL TERHADAP SEKRESI INSULIN DAN …