Penangkapan siklus sel pada sel kanker payudara diobati Metformin melibatkan aktivasi AMPK, downregulation dari

cyclin D1, dan membutuhkan p27 p21 Kip1 atau Cip1

Yongxian Zhuang 1 , 2 dan W Keith Miskimins 1 , 2 *

* Sesuai Penulis: W Keith Miskimins keith.miskimins @ usd.edu

Penulis Afiliasi

1. Pusat Penelitian Biologi Kanker, Sanford Penelitian / USD, 1400 Barat 22nd Street, Sioux Falls, Dakota Selatan, 57105, USA

2. Sanford School of Medicine dari University of South Dakota, Sioux Falls, SD 57197, USA

Jurnal Molekuler, Signaling 2008 3: 18 doi: 10.1186/1750-2187-3-18

Diterima: 22 Agustus 2008 Diterima: 1 Desember 2008 Diterbitkan di: 1 Desember 2008

© 2008 Zhuang dan Miskimins; lisensi BioMed Central Ltd

Abstrak

Latar belakang

Obat metformin antihyperglycemic mungkin memiliki efek menguntungkan pada pencegahan dan pengobatan kanker. Metformin adalah dikenal untuk mengaktifkan AMP-protein kinase diaktifkan (AMPK). Hal ini juga telah ditunjukkan untuk menghambat cyclin D1 dan ekspresi proliferasi beberapa sel kanker berbudaya. Namun, mekanisme aksi dimana metformin menengahi siklus sel penangkapan tidak sepenuhnya dipahami.

Hasil

Dalam studi ini, metformin ditemukan untuk menghambat proliferasi baris sel kanker payudara yang paling berbudaya. Ini adalah independen dari reseptor estrogen,, HER2 atau status p53. Penghambatan proliferasi sel dikaitkan dengan penangkapan dalam fase G0/G1 dari siklus sel. Seperti pada studi sebelumnya, pengobatan metformin menyebabkan aktivasi dari (AMPK) dan downregulation dari cyclin D1. Namun, peristiwa-peristiwa ini tidak cukup untuk penahanan siklus sel karena mereka juga diamati dalam baris sel MDA-MB-231, yang tidak sensitif untuk menangkap pertumbuhan dengan metformin. Dalam garis kanker payudara sensitif, penurunan cyclin D1 menyebabkan pelepasan inhibitor CDK diasingkan, p27 p21 Kip1 dan Cip1, dan asosiasi

dari inhibitor dengan cyclin E/CDK2 kompleks. Metformin-tahan sel line MDA-MB-231 menyatakan tingkat signifikan lebih rendah dari p27 p21 Kip1 dan Cip1 dari garis metformin-sensitif sel, MCF7. Ketika p27 p21 Kip1 atau Cip1 yang diekspresikan dalam MDA-MB-231, sel-sel menjadi sensitif untuk menangkap siklus sel sebagai respon terhadap metformin.

Kesimpulan

Penangkapan siklus sel sebagai respon terhadap metformin membutuhkan inhibitor CDK di samping aktivasi AMPK dan siklin D1 downregulation. Hal ini menarik karena kanker banyak yang berhubungan dengan kehilangan atau downregulation dari inhibitor CDK dan hasilnya mungkin relevan untuk pengembangan reagen anti-tumor yang menargetkan jalur AMPK.

Latar belakang

Metformin hidroklorida (N, N-dimethylimidodicarbonimidic hidroklorida diamide) adalah obat yang biasa diresepkan antihyperglycemic oral yang digunakan dalam pengelolaan diabetes tipe 2. Bukti terbaru mengindikasikan bahwa metformin memiliki efek signifikan terhadap tumorigenesis dan pertumbuhan sel kanker. Dilaporkan bahwa pasien dengan diabetes tipe 2 yang diresepkan metformin memiliki risiko lebih rendah terkena kanker dibandingkan dengan pasien yang tidak mengambil metformin [ 1 , 2 ]. Dalam model xenograft mouse, metformin menekan pertumbuhan tumor p53 negatif HCT116 sel kanker usus besar, tetapi tidak p53 wild type sel [ 3 ]. Pengobatan metformin menurunkan kejadian dan adenokarsinoma mammae ukuran pada tikus HER2/neu [ 4 ] dan mencegah karsinogen-induced kanker pankreas pada hamster [ 5 ]. Dalam budaya, metformin telah terbukti dapat menghambat pertumbuhan sel-sel yang berasal dari kanker payudara, kanker usus, kanker prostat, dan glioma [ 3 , 6 - 9 ]. Namun, mekanisme aksi dimana metformin menengahi efek menguntungkan pada pertumbuhan sel kanker tidak dipahami dengan baik.

Salah satu target intraseluler metformin adalah aktivasi adenosin 5'-monofosfat-diaktifkan kinase (AMPK) [ 10 ]. AMPK terdiri dari tiga subunit, α, β dan γ, dan subunit masing-masing memiliki setidaknya dua isoform [ 11 ]. Aktivasi AMPK melibatkan AMP berikatan dengan situs regulasi pada subunit γ. Hal ini menyebabkan perubahan konformasi bahwa allosterically mengaktifkan enzim dan menghambat defosforilasi Thr172 dalam loop aktivasi subunit α katalitik [ 12 , 13 ]. LKB1 telah diidentifikasi sebagai kinase hulu dan terbukti subunit α memfosforilasi dari AMPK di Thr172 [ 14 - 16 ]. Namun, metformin kemungkinan besar tidak langsung mengaktifkan baik LKB1 atau AMPK dan obat tidak mempengaruhi fosforilasi AMPK oleh LKB1 in vitro [ 14 , 17 , 18 ]. Sebaliknya, ada bukti bahwa aktivasi AMPK dalam respon terhadap pengobatan metformin hilir efek pada 1 kompleks rantai transpor elektron mitokondria [ 19 - 22 ].

Sangat menarik untuk dicatat bahwa LKB1 adalah penekan tumor dikenal dengan baik dan mutasi pada gen pengkodean LKB1 menyebabkan mewarisi langka Peutz-Jeghers sindrom [ 23 ]. Hal ini diyakini bahwa fungsi jalur LKB1-AMPK sebagai sebuah pos pemeriksaan energi penginderaan sel yang mengontrol pertumbuhan sel dan proliferasi sesuai dengan ketersediaan pasokan bahan bakar [ 24 ]. Mengingat peran penting dari jalur LKB1-AMPK dalam pengendalian pertumbuhan sel, itu adalah target potensial untuk pengobatan kanker atau pencegahan. Metformin merangsang jalur ini dan memodulasi pertumbuhan sel tumor, in vitro

dan in vivo, tetapi modus kerjanya masih belum jelas. Dalam laporan ini kami menunjukkan bahwa metformin-sensitif sel-sel kanker payudara penangkapan di G0/G1 karena aktivasi AMPK, downregulation dari cyclin D1, dan mengikat disempurnakan CDK2 oleh p27 p21 Kip1

dan Cip1. AMPK diaktifkan dan siklin D1 adalah menurunkan regulasi dalam garis metformin-tahan sel kanker payudara. Namun, baris ini sel menjadi sensitif terhadap metformin ketika p27 p21 Cip1 Kip1 atau diekspresikan. Jadi, inhibitor CDK sangat penting untuk penangkapan siklus sel sebagai respon terhadap metformin. Hal ini penting karena p27 Kip1 sering menurunkan regulasi dalam sel-sel kanker.

Hasil

Pengobatan metformin memiliki sel line-tergantung efek pada sel kanker payudara

Sementara menjelajahi peran potensial AMPK dalam mengatur ekspresi p27 Kip1, kita mencatat bahwa metformin, aktivator AMPK, menghambat proliferasi sel MCF7 dengan cara tergantung dosis (Gambar 1A ). Kami dieksplorasi lebih lanjut efek metformin terhadap proliferasi dengan memperlakukan sebuah panel jalur sel kanker payudara dengan obat pada konsentrasi 8 mM. Seperti yang ditunjukkan oleh karya Owen dkk [ 21 ], ini merupakan dosis fisiologis yang relevan metformin. Lima dari enam jalur sel kanker payudara, termasuk MCF7, BT20, T47D, MDA-MB-453, dan MDA-MB-474, mengalami penangkapan pertumbuhan setelah pengobatan metformin (Gambar 1B ). Namun, baris sel MDA-MB-231 adalah tahan terhadap efek metformin, menunjukkan hanya sedikit penurunan dalam proliferasi selama empat hari (Gambar 1B ). Data ini menunjukkan bahwa metformin memiliki efek yang berbeda pada proliferasi sel dalam sel kanker payudara garis-tergantung cara. Selain itu, tidak ada korelasi antara kepekaan terhadap metformin dan status dikenal reseptor estrogen (ER) ekspresi, mutasi p53, atau amplifikasi-nya 2 [ 25 , 26 ].

Gambar 1. Metformin menghambat proliferasi sel kanker payudara berbudaya. A. MCF7 sel diobati dengan metformin pada konsentrasi diindikasikan untuk satu hari dan kemudian jumlah sel ditentukan dengan menggunakan suatu hemositometer. Jumlah sel rata-rata dari 3 budaya independen ditampilkan. Error bar mewakili standar deviasi. Menggunakan di tes, semua perlakuan berbeda nyata dari kontrol dengan nilai P kurang dari 0,01. B. Enam garis kanker payudara sel yang berbeda dirawat dengan metformin 8 mM. Pada nomor yang layak ditunjukkan sel kali ditentukan dengan menggunakan hemositometer sebuah. Status dilaporkan reseptor estrogen (ER) ekspresi, amplifikasi HER2, dan ekspresi p53 (Wild-jenis, WT, atau mutan, mt) diindikasikan untuk setiap baris sel. HER2 + menunjukkan HER2 sedangkan amplifikasi HER2 menunjukkan ekspresi HER2 yang normal. Titik

data mewakili jumlah sel rata-rata dari 3 budaya independen dan error bar mewakili standar deviasi.

Efek metformin pada protein siklus sel regulasi di MCF7 sel

Sejak MCF7 sel sensitif terhadap metformin-dimediasi penghambatan proliferasi sel, kami memilih baris ini sel untuk eksperimen lebih lanjut untuk mencirikan mekanisme molekul dengan yang metformin penangkapan siklus sel. Dalam rangka untuk menentukan efek metformin terhadap perkembangan siklus sel, MCF7 sel diobati dengan obat selama 1,5 hari dan kemudian sitometri dilakukan pada sel patri iodida propidium (Gambar 2A ). Pengobatan metformin meningkatkan sel-sel di fase G0/G1 dari 61,4% menjadi 71,7% dan penurunan jumlah sel dalam fase S dari 32.2.54% menjadi 20,6%. Data ini menunjukkan bahwa metformin menghambat perkembangan siklus sel dari fase G0/G1 ke S. Oleh karena itu, barat blotting digunakan untuk menguji efek metformin pada protein siklus sel berbagai peraturan, termasuk cyclin E, cyclin D1, D2 siklin, cyclin A, CDK2, CDK4 dan inhibitor CDK p27 p21 Kip1 dan Cip1

(Gambar 2B ). Perubahan yang paling luar biasa adalah hilangnya protein cyclin D1 setelah pengobatan metformin. Efek metformin pada tingkat mRNA untuk protein siklus sel beberapa peraturan juga diperiksa. MCF7 sel diobati dengan atau tanpa metformin selama 1,5 hari dan kemudian multi-probe assay perlindungan ribonuklease (RPA) dilakukan. Cyclin D1 tingkat mRNA yang terutama lebih rendah dalam sel metformin diperlakukan (Gambar 2C ). Ketika dinormalisasi ke rumah-menjaga gen L32, ada penurunan 36,1% cyclin D1 mRNA setelah pengobatan metformin. Data ini menunjukkan bahwa metformin-dimediasi downregulation dari cyclin D1 terutama karena penurunan tingkat mRNA cyclin D1.

Gambar 2. Pengaruh metformin terhadap perkembangan siklus sel dan protein siklus sel peraturan di MCF7 sel. A. Sel yang tidak diobati (Con) atau sel diperlakukan dengan 8 mM metformin selama 1,5 hari (Met) diwarnai dengan iodida propidium dan kemudian dianalisa dengan sitometri untuk memperkirakan jumlah sel dalam setiap fase dari siklus sel. Percobaan diulang 3 kali dan error mean dan standar untuk setiap fase sel ditunjukkan dalam tabel. B. Jumlah yang sama protein dari sel-sel yang tidak diobati (Con) atau sel diobati dengan metformin selama 1,5 hari (Met) dianalisis dengan menggunakan blotting Barat antibodi yang mengenali protein siklus sel menunjukkan regulasi β-aktin terdeteksi sebagai kontrol C loading.. RNA total diisolasi dari sel yang tidak diobati (C) atau sel diobati dengan metformin (8 mM)

selama 1,5 hari (M) dan perlindungan RNase tes dilakukan untuk mendeteksi mRNA pengkodean siklin ditunjukkan (panel kiri). Cyclin D1 tingkat mRNA dinormalkan dengan menggunakan tingkat mRNA L32 (panel kanan). Rata-rata 3 percobaan independen ditampilkan dan error bar menunjukkan standar deviasi. Dalam pada pengujian nilai untuk sel metformin diperlakukan sangat berbeda dari kontrol dengan nilai P 0,006 D.. MCF7 sel diobati dengan (Met) atau tanpa (Con) metformin (8 mM) dan kemudian ekstrak dipersiapkan untuk immunoprecipitation (IP) baik menggunakan antibodi kontrol (C) atau anti-CDK2 antibodi (CDK2). Protein immunoprecipitated dianalisa oleh Barat blotting menggunakan antibodi yang mengenali CDK2, p27 p21 Cip1 Kip1 atau seperti yang ditunjukkan di sebelah kanan.

Salah satu fungsi dari cyclin D1/CDK kompleks adalah mengikat dan penyerapan p27 p21 Kip1

dan Cip1. Hal ini mencegah protein dari mengikat dan menghambat cyclin kompleks E/CDK2 yang mempromosikan perkembangan dari G0/G1 ke fase S dari siklus sel [ 27 ] Sejak metformin menyebabkan downregulation dari cyclin D1, ini dapat mengakibatkan pelepasan p27 p21 Kip1

dan Cip1, yang memungkinkan mereka untuk mengikat CDK2 dan blok aktivitasnya. Untuk tes ini, co-immunoprecipitation digunakan untuk memantau tingkat p27 p21 Cip1 Kip1 dan terkait dengan CDK2 dalam sel diobati dengan atau tanpa metformin. Immunoprecipitation dilakukan dengan menggunakan antibodi anti-CDK2 serta antibodi kontrol yang tidak berhubungan dari isotipe yang sama. Kemudian western blotting digunakan untuk mendeteksi co-immunoprecipitated p27 p21 Kip1 dan Cip1 (Gambar 2D ). Tingkat CDK2 adalah serupa dalam anti-CDK2 immunoprecipitates dari metformin diobati dan sel yang tidak diobati. Namun tingkat p27 p21 Kip1 dan Cip1 bahwa co-immunoprecipitated dengan CDK2 yang jauh meningkat pada sel metformin diobati. Hasil ini mendukung kesimpulan bahwa metformin blok MCF7 sel berkembang biak dengan mengurangi kadar protein cyclin D1 menyebabkan pelepasan diasingkan p27 p21 Kip1 dan Cip1. Inhibitor CDK dirilis kemudian mengikat dan menghambat cyclin E/CDK2 aktivitas yang kompleks, yang mengarah ke penangkapan di G0/G1.

Downregulation dari cyclin D1 melibatkan aktivasi AMPK

Metformin dapat mempengaruhi berbagai jalur seluler tetapi beberapa dari efek diketahui karena aktivitas AMPK ditingkatkan. Ini karena itu menarik untuk menentukan apakah AMPK diaktifkan dalam sel metformin diobati dan jika hal ini diperlukan untuk downregulation dari cyclin D1. MCF7 sel diobati dengan metformin selama 1,5 hari dan kemudian western blotting digunakan untuk menguji tingkat bentuk terfosforilasi aktif AMPK (phospho-Thr172). Hasil penelitian menunjukkan bahwa metformin meningkatkan phospho-AMPK tingkat dan ini berkorelasi dengan downregulation dari cyclin D1 (Gambar 3A ). Reagen lain yang dikenal untuk mengaktifkan AMPK, termasuk antimycin A (1 M μ) dan AICAR (4 mM), juga diuji. Kedua reagen juga menyebabkan fosforilasi AMPK meningkat dan penurunan tingkat siklin D1 protein (Gambar 3B ). Untuk memeriksa lebih lanjut ini, MCF7 sel pretreated dengan senyawa inhibitor spesifik AMPK-C (20 M μ) atau DMSO (kendaraan) selama 1 hari dan kemudian diobati dengan atau tanpa metformin untuk 1,5 hari tambahan. Sel dipanen dan barat blotting digunakan untuk memeriksa cyclin D1 dan ACC terfosforilasi, sebuah substrat AMPK. Pretreatment dengan blok C senyawa pengurangan cyclin D1 disebabkan oleh metformin pengobatan (Gambar 3C ). Hal ini terkait dengan hilangnya fosforilasi ACC. Hasil ini menunjukkan bahwa downregulation dari cyclin D1 oleh metformin melalui jalur AMPK-dependen.

Gambar 3. downregulation dari cyclin D1 sesuai dengan aktivasi AMP-activated protein kinase. A. MCF7 sel diobati dengan (Met) atau tanpa (Con) metformin selama 1,5 hari dan kemudian barat blotting dilakukan untuk mendeteksi aktif phospho-AMPK, cyclin D1, dan β-aktin. B. MCF7 sel diobati dengan antimycin A (PM, 1 M μ), AICAR (4 mM), atau metformin (8 mM) selama 1,5 hari. Mengontrol sel-sel (Con) diobati dengan kendaraan yang tepat untuk masing-masing pereaksi. Western blotting dilakukan untuk mendeteksi aktif phospho-AMPK, cyclin

D1, dan β-aktin C.. MCF7 sel pra-perawatan dengan DMSO (kendaraan) atau inhibitor spesifik AMPK-senyawa C (20 M μ) selama 1 hari dan kemudian diobati dengan (Met) atau tanpa (Con) metformin selama 1,5 hari. Western blotting dilakukan untuk mendeteksi cyclin D1 atau bentuk terfosforilasi dari substrat AMPK ACC β-aktin digunakan sebagai kontrol loading..

Overekspresi p27 Kip1 stabil di MDA-MB-231 sel mengarah ke sensitivitas metformin

MDA-MB-231 adalah kanker payudara agresif sel line yang tidak mengekspresikan reseptor estrogen dan memiliki bentuk mutasi p53 [ 25 ]. Data kami menunjukkan bahwa pengobatan metformin tidak mencegah proliferasi sel dalam baris sel (lihat Gambar. 1 ). Kurangnya respon terhadap pengobatan metformin pada MDA-MB-231 sel memberikan kami kesempatan untuk menguji apakah penghambatan proliferasi sel dengan metformin tergantung pada cyclin D1 downregulation diikuti dengan mengikat ditingkatkan dari kompleks cyclin E/CDK2 oleh p27 p21 Kip1 dan Cip1 . Seperti ditunjukkan oleh peningkatan tingkat enzim terfosforilasi, pengobatan metformin meningkatkan phospho-AMPK di MDA-MB-231 sel, mirip dengan yang diamati dalam MCF7 sel (Gambar 4A ). Hal ini menunjukkan bahwa MDA-MB-231 adalah menanggapi obat. Juga, cyclin D1 menurun pada MDA-MB-231 sel (Gambar 4A ). MDA-MB-231 sel mengekspresikan p27 p21 Cip1 Kip1 dan protein pada tingkat sangat berkurang dibandingkan dengan MCF7 sel (Gambar 4B ). Hal ini menunjukkan kemungkinan bahwa perlawanan MDA-MB-231 sel adalah karena tingkat rendah dari inhibitor CDK. Jadi, meskipun cyclin D1 adalah menurunkan regulasi dalam respon terhadap pengobatan metformin, ada tingkat tidak cukup diasingkan p27 p21 Cip1 Kip1 dan menghambat aktivitas cyclin E/CDK2. Hal ini didukung oleh temuan bahwa fosforilasi serin 795 Rb di, situs yang ditargetkan oleh CDK2 [ 28 ], menurun dalam MCF7 sel tetapi tidak dalam MDA-MB-231 sel setelah pengobatan metformin (Gambar 4A ). Dalam rangka untuk lebih menguji hipotesis ini, kami menciptakan garis sel stabil, MDA-MB-231-WTp27, yang overexpresses p27 wild type Kip1 (Gambar 4C ). Dibandingkan dengan MDA-MB-231 sel, baris ini sel yang stabil memiliki tingkat jauh lebih tinggi dari p27 Kip1.

Pengobatan metformin MDA-MB-231-WTp27 sangat dihambat proliferasi sel (Gambar 4D ). Kami telah berhasil dalam membangun MDA-MB-231 sel yang stabil p21 overexpress Cip1.

Namun, transfeksi transien ini sejalan dengan ekspresi p21 membangun pengkodean Cip1 juga menyebabkan mereka untuk menjadi lebih sensitif terhadap penghambatan pertumbuhan dalam menanggapi metformin (Gambar 4E ). Tidak ada perbedaan dalam kematian sel antara metformin dirawat dan diobati budaya seperti yang ditunjukkan oleh sel mengambang atau pewarnaan biru tripan (data tidak ditunjukkan). Hasil ini mendukung kesimpulan bahwa downregulation dari cyclin D1, sendirian, tidak cukup untuk menangkap sel sebagai respon terhadap metformin. CDK inhibitor p27 p21 Kip1 atau Cip1 harus diekspresikan pada tingkat yang cukup sehingga pembebasan mereka dan penghambatan berikutnya cyclin E/CDK2 mengarah ke penangkapan siklus sel.

Gambar 4. Ekspresi dari p27 Kip1 di metformin-tahan MDA-MB-231 baris sel mengarah ke sensitivitas metformin. A. (Panel kiri) MCF7 dan MDA-MB-231 sel diobati dengan (Met) dan tanpa (Con) metformin (8 mM) selama 2 hari. Western blotting digunakan untuk mendeteksi phospho-AMPK, total AMPK, p27 Kip1, dan β-aktin. (Panel kanan) Sama dengan A kecuali bahwa ekstrak sel digunakan untuk mendeteksi phospho-Rb (serin 795), cyclin D1 atau β-aktin. B. Ekstrak dari MCF7

tidak diobati dan MDA-MB-231 sel yang digunakan untuk Western blotting dari p27 Kip1, p21 Cip1,

dan β-aktin. C. MDA-MB-231 sel stabil transfected dengan pengkodean membangun p27 Kip1

yang ditandai dengan epitop protein C untuk memperoleh garis sel MDA-MB-231WTp27. Ekstrak dari garis sel induk (231) dan baris sel secara stabil transfected (231WTp27) digunakan untuk Western blotting untuk mendeteksi epitop-tag p27 Kip1 (anti-Protein C epitop), p27 Kip1

(p27), dan β-aktin. D. MDA-MB-231 sel atau MDA-MB-231WTp27 sel diobati dengan (garis putus-putus) atau tanpa (garis padat) metformin (8 mM) sampai 3 hari. Pada jumlah poin sel menunjukkan waktu yang ditentukan dengan menggunakan suatu hemositometer. Setiap titik data menunjukkan jumlah sel rata-rata dari 3 budaya independen dan error bar mewakili deviasi standar. E. MDA-MB-231 sel transiently transfected dengan pengkodean membangun p21 Cip1

atau vektor kosong. Mereka kemudian diobati dengan metformin untuk waktu yang ditunjukkan dan jumlah sel ditentukan sebagai menjelaskan dalam D.

Diskusi

Beberapa publikasi terbaru mengindikasikan bahwa metformin memiliki efek penghambatan pada pertumbuhan sel tumor secara in vitro dan in vivo [ 1 - 9 ] Mekanisme melalui mana metformin mempengaruhi perkembangan sel siklus dan pertumbuhan tumor belum sepenuhnya didefinisikan. Temuan novel disajikan di sini adalah 1) metformin yang menghambat proliferasi baris sel yang paling kanker payudara berbudaya dan bahwa hal ini tidak berkorelasi dengan status ER, Her-2, atau ekspresi p53; 2) siklin D1 tingkat yang tajam menurunkan regulasi dalam menanggapi to metformin but this alone is not sufficient to cause cell cycle arrest; and 3) cell cycle arrest also requires sufficient levels of CDK inhibitors (ie p27 Kip1 or p21 Cip1 ) to bind and inhibit CDK2.

Downregulation of cyclin D1 in response to metformin has been demonstrated in LNCaP prostate cancer cells [ 8 ] but the importance of CDK inhibitors was not addressed in this study. These investigators did observe an small increase in p27 Kip1 levels following metformin treatment of LNCaP cells. We have not observed significant changes in the levels of CDK inhibitors in breast cancer cells. Downregulation of cyclin D1 protein in response to metformin correlated with decreased cyclin D1 mRNA levels. This suggests that metformin could initiate signaling pathways that lead to repression of the cyclin D1 gene. However, we have been unable to show any effect of metformin on the human cyclin D1 promoter (-1063) in luciferase reporter assays (data not shown). It is possible that metformin targets elements outside of the 5'-flanking region we have used for our experiments or that it causes destabilization of the cyclin D1 mRNA.

In the studies performed by Sahra et al [ 8 ] using LNCaP prostate cancer cells, inhibition of AMPK expression using siRNAs did not prevent metformin-induced downregulation of cyclin D1 or G0/G1 phase arrest. This is in contrast with our results showing that compound C, a specific inhibitor of AMPK, blocks metformin-induced downregulation of cyclin D1 in MCF7 cells. Zakikhani et al [ 9 ] have also shown that siRNAs targeting AMPK prevent growth inhibition of MCF7 cells in response to metformin treatment. The reasons for the differences are not known but could be related to the different cell types and their specific genetic backgrounds.

The cell line MDA-MB-231 is resistant to the growth inhibitory effects of metformin. It was previously reported that this cell line does not express the AMPK kinase LKB1 [ 29 , 30 ]. It was also shown that MDA-MB-231 cells do not respond to metformin in terms of inhibition of protein translation through the mTOR pathway [ 29 ]. Our data show that the active phosphorylated form of AMPK increases in MDA-MB-231 cells in response to metformin. We also show that cyclin D1 is downregulated in metformin treated MDA-MB-231. Thus MDA-MB-231 cells are capable of responding to metformin and this could be through AMPK kinases other than LKB1. Both calmodulin-dependent protein kinase kinase [ 31 - 33 ] and ATM have been shown to phosphorylate and activate AMPK [ 34 , 35 ]. Further examination of these pathways will be needed to determine if they play a role in AMPK activation in response to metformin.

Even though MDA-MB-231 cells respond to metformin in terms of AMPK phosphorylation and cyclin D1 downregulation, these responses are not sufficient for cell cycle arrest. This cell line expresses very low levels of p27 Kip1 and p21 Cip1 . When p27 Kip1 is overexpressed, these cells stop proliferating following metformin treatment. We also found that overexpression of p21 Cip1

sensitized the cells to cell cycle arrest in response to metformin, indicating that either CDK2 inhibitor is capable of mediating this effect. Thus, CDK inhibitors are important mediators of the observed cell cycle arrest and appear to act downstream of AMPK activation and cyclin D1 loss. Other AMPK activators such as AICAR and antimycin A also caused downregulation of cyclin D1. A previous report showed that the proliferation of metformin-resistant MDA-MB-231 cells is inhibited by AICAR [ 36 ]. Thus, even though both reagents stimulate AMPK activity, the cellular responses to metformin and AICAR are not the same in MDA-MB-231 cells. AICAR is thought to activate AMPK by mimicking AMP, but it has been shown to have AMPK-independent effects on cells [ 37 , 38 ]. For metformin, it is thought that the primary target is complex I of the mitochondrial respiratory chain and that this is upstream of AMPK activation [ 19 - 22 ].

Using mouse embryo fibroblasts, Jones et al [ 39 ] showed that activation of AMPK induces phosphorylation of p53 and that this is required for AMPK-dependent cell cycle arrest. The same group showed, using paired isogenic colon cancer cell lines, that metformin selectively inhibited p53 negative tumor cell growth in vivo [ 3 ] With the panel of cultured breast cancer cell lines used in our experiments, we have not observed any correlation between either cell cycle arrest or cell survival and p53 expression. For example, of the cell lines shown in Fig. 1 , all but MCF7 have been reported to carry p53 mutations [ 26 ], yet only MDA-MB-231 is resistant to the growth inhibitory effects of metformin in culture.

Kesimpulan

Data kami menyediakan mekanisme molekuler yang dapat berkontribusi pada kemampuan metformin memiliki efek menguntungkan pada mencegah atau mengobati kanker. Model kita (Gambar 5 ) adalah bahwa metformin penangkapan proliferasi sel dengan mengaktifkan AMPK. AMPK aktif menyebabkan hilangnya cyclin D1 mRNA dan protein. Penurunan tingkat siklin D1 menyebabkan pelepasan inhibitor CDK diasingkan, p27 p21 Kip1 dan Cip1, yang kemudian mengikat dan menghambat cyclin E/CDK2 kompleks. Hal ini mencegah perkembangan dari G1 ke fase S dan proliferasi sel blok. Resistensi terhadap metformin penangkapan siklus sel

dimediasi diamati ketika sel-sel mengekspresikan tingkat rendah p27 p21 Kip1 atau Cip1. Hilangnya ekspresi p27 Kip1 umumnya diamati pada berbagai jenis kanker dan sering berhubungan dengan prognosis buruk. Oleh karena itu temuan kita mungkin penting untuk pengembangan dan penggunaan obat anti tumor, seperti metformin, bahwa target AMPK sinyal jalur.

Gambar 5. Model Usulan mekanisme yang metformin menengahi sel penangkapan siklus. Pengobatan metformin menyebabkan aktivasi AMPK yang menyebabkan hilangnya mRNA cyclin D1 dan downregulation protein cyclin D1. Penurunan dalam hasil siklin D1 dalam pelepasan inhibitor siklus sel diasingkan p27 p21 Kip1 dan Cip1. Inhibitor CDK dirilis mengikat dan

menghambat cyclin E/CDK2, sehingga mencegah sel perkembangan siklus dari G1 fase S. Dalam metformin-tahan MDA-MB-231 sel, kadar inhibitor CDK tidak cukup untuk memblokir CDK2 meskipun AMPK aktif dan siklin D1 yang menurunkan regulasi.

Metode

Bahan kimia

Bahan kimia berikut digunakan dalam penelitian ini: metformin (1, 1-dimethylbiguanide, Sigma Chemical Co), AICAR (5-aminoimidazole-4-karboksamida-riboside, Sigma Chemical Co), AMPK inhibitor (Senyawa C, Calbiochem), antimycin A (Sigma Chemical Co).

Kultur sel

Semua lini sel kanker payudara manusia yang dibeli dari ATCC dan dipelihara dalam medium Dulbecco yang dimodifikasi Eagle (DMEM) dengan 10% serum janin sapi dilengkapi dengan 100 U / ml penisilin dan 100 μ g / ml streptomisin dalam inkubator CO2 dilembabkan.

Proliferasi sel uji

Sel-sel payudara manusia kanker berlapis ke dalam 35 piring mm. Setelah satu hari dirawat sel dengan metformin pada konsentrasi yang ditunjukkan atau volume air yang sama disterilkan. Setelah inkubasi dengan metformin selama berhari-hari 1, 2 atau 3, sel-sel ekstensif dibilas dengan fosfat Dulbecco yang buffered saline (PBS) untuk menghilangkan sel-sel longgar melekat atau mengambang. Sel-sel kemudian dipanen oleh trypsinization dan jumlah sel ditentukan dengan menggunakan suatu hemositometer.

Western blotting

Sel dalam 35 piring mm dibilas dengan PBS dan segaris dengan penambahan natrium dodecylsulfate (SDS) buffer sampel [2,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), SDS 2,5%, 100 mM dithiothreitol, gliserol 10%, 0,025% pyronine Y]. Jumlah protein yang sama dipisahkan pada 10% SDS-poliakrilamida gel. Protein dipindahkan ke membran Immobilon P (Millipore) menggunakan Bio-Rad Trans-noda aparat dengan buffer 48 mM transfer Tris-HCl dan 39 mM

glisin. Membran diblokir dengan 5% non-lemak susu kering dalam Tris-buffered saline [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] mengandung 0,1% Tween-20 (TBS-T) untuk 15-60 menit di kamar suhu. Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi yang sesuai dalam TBS-T yang mengandung 5% non-lemak susu kering selama 1 jam pada suhu kamar atau semalam pada 4 ° C. Setelah mencuci luas dalam TBS-T membran diinkubasi dengan horseradish peroxidase yang sesuai (HRP)-terkonjugasi antibodi sekunder. Setelah mencuci luas dalam TBS-T, protein terdeteksi menggunakan Sinyal Barat Pico super substrat chemiluminescent (Pierce Biokimia). Antibodi anti-β-aktin monoklonal (A5441, yang digunakan pada 1:10.000) dibeli dari Sigma. Antibodi terhadap cyclin D1 (sc-753, digunakan di 1:2500), cyclin D2 (sc-452, digunakan di 1:2500), cyclin A (sc-751, digunakan di 1:2500), cyclin E (sc-481 , digunakan di 1:2500), CDK2 (sc-163, digunakan di 1:2500), CDK4 (sc-260, digunakan di 1:2500), dan p21 Cip1 (sc-817, digunakan di 1:1000) dibeli dari Bioteknologi Santa Cruz. p27 Kip1 (610241, digunakan di 1:2500) antibodi dibeli dari BD Biosciences. Antibodi terhadap AMPK terfosforilasi terfosforilasi di treonin 172 (2535, digunakan di 1:1000), AMPK (2532, digunakan di 1:1000), dan phospho-ACC (3661, digunakan di 1:1000) yang dibeli dari Teknologi your Signaling. Anti-protein C (1814508, digunakan di 1:500) dibeli dari Roche Sains Terapan. Sekunder peroksidase lobak-terkait anti-tikus (31430, digunakan di 1:5000) dan anti-kelinci (31460, digunakan di 1:5000) IgG antibodi yang dibeli dari Pierce Biokimia.

Immunoprecipitation

Ekstrak sel dipreparasi menggunakan buffer lisis yang terdiri dari 50 mM HEPES, (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM EGTA, gliserol 10%, 0,1% Tween-20, 1 mM DTT, 1 mM NaF, 0,1 mM Na 3 VO 4, 10 μ g / ml leupeptin, 2 μ g / ml aprotinin, dan 0,1 mM PMSF. Ekstrak disonikasi sebentar dan kemudian disentrifugasi pada 14.000 rpm dalam microcentrifuge MicroCL17R didinginkan pada suhu 4 ° C selama 15 menit. Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan uji protein Bio-Rad. Jumlah yang sama dari total protein dari masing-masing ekstrak (0,5 sampai 1 mg) digunakan untuk analisis. Lisat sel diinkubasi dengan 2 g μ antibodi CDK2 semalam pada 4 ° C pada sebuah rotator. Protein A-terkonjugasi agarosa manik-manik (30 l μ) ditambahkan, dan inkubasi dilanjutkan selama 1 jam pada suatu rotator. Manik-manik itu pellet pada 4.000 rpm menggunakan microcentrifuge MicroCL17R didinginkan pada suhu 4 ° C, supernatan dibuang dan manik-manik dicuci lima kali dalam 500 μ l penyangga lisis. Protein diendapkan dilarutkan dalam SDS-sampel penyangga, dipisahkan dengan SDS-PAGE dan kemudian p27 Kip1, p21 Cip1 dan CDK2 terdeteksi oleh Barat blotting.

Ribonuklease perlindungan assay (RPA)

RPAs dilakukan dengan Sistem Multi-Probe RiboQuant Perlindungan RNase Assay (BD Biosciences). Probe manusia diatur hCYC-1 termasuk template untuk cyclin A, cyclin B, cyclin C, cyclin D1, D2 siklin, cyclin D3, dan siklin A1, serta untuk L32 protein ribosom dan GAPDH sebagai kontrol. Probe disintesis pada suhu kamar menggunakan 32 P-UTP dan T7 RNA polimerase. Jumlah seluler RNA diisolasi menggunakan Reagen TRI (Pusat Penelitian Molekuler). Set riboprobe berlabel hibridisasi ke 15 μ g RNA pada 56 ° C selama 12-16 jam Setelah hibridisasi, riboprobes gratis dan RNA beruntai tunggal dicerna dengan A RNase dan RNase campuran T1 pada 30 ° C selama 45 menit. Hal ini diikuti dengan pengobatan dengan proteinase K pada 37 ° C. Para dilindungi tersisa fragmen RNA dimurnikan oleh fenol

kloroform-isoamyl-ekstraksi alkohol diikuti oleh presipitasi etanol. Pelet dikeringkan, dilarutkan dalam 5 penyangga l μ loading, dipanaskan pada 90 ° C selama 3 menit dan kemudian ditempatkan dalam penangas es. Sampel dipisahkan menggunakan gel poliakrilamida 4,75% denaturasi. Probe set tercerna berlabel digunakan sebagai penanda. Setelah elektroforesis RNase dilindungi band divisualisasikan dengan autoradiografi menggunakan Kodak film yang XAR Biomax. Jumlah masing-masing spesies mRNA diperkirakan menggunakan sistem ChemiImager.

Transfeksi dan seleksi jalur sel stabil

MDA-MB-231 sel dalam 35 piring mm transfected dengan membangun pcDNA3.1-p27-protein C menggunakan reagen Lipofectamine (Invitrogen). Setelah satu hari sel-sel berlapis ke dalam 100 cawan mm dan kemudian seleksi dengan higromisin (200 μ g / ml) dimulai dua hari kemudian. Media baru ini dengan higromisin ditambahkan setiap tiga hari. Setelah tiga minggu seleksi, koloni yang dipetik, diperluas, dan kemudian diuji oleh Barat blotting menggunakan anti-protein C dan anti-p27 antibodi.

Arus cytometry

MCF7 sel diobati dengan atau tanpa metformin selama 1,5 hari. Sel (1 × 10 6) trypsinized dan tetap dalam etanol 70% dalam semalam. Sel tetap diwarnai dengan iodida propidium (50 μ g / ml) selama 30 menit pada suhu kamar. Sel tersebut disaring menggunakan 5 ml polystyrene bulat bawah tabung dengan sel-saringan topi (BD Falcon) sebelum sitometri. Pengukuran aliran cytometry Semua itu dilakukan dengan menggunakan FACSVantage SE sel penyortir (Becton Dickinson). Analisis siklus sel dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak ModFit LT.

Bersaing kepentingan

Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan bersaing.

Penulis 'kontribusi

YZ melaksanakan semua prosedur eksperimental, berpartisipasi dalam desain penelitian, dan dibantu dengan persiapan naskah. WKM berpartisipasi dalam desain dan koordinasi penelitian dan membantu untuk menyusun naskah. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.

Ucapan Terima Kasih

Karya ini didukung oleh hibah dari US Public Health Service, National Cancer Institute R01CA084325.

Referensi

1. Evans JM, Donnelly LA, Emslie-Smith PM, Alessi DR, Morris AD: metformin dan mengurangi risiko kanker pada pasien diabetes.

BMJ 2005, 330:. 1304-1305 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text | Teks PubMed Central Kendali

2. Bowker SL, Majumdar SR, Veugelers P, Johnson JA: Peningkatan kematian terkait kanker untuk pasien dengan diabetes tipe 2 yang menggunakan sulfonilurea atau insulin.

. Diabetes Care 2006, 29: 254-258 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

3. Buzzai M, RG Jones, Amaravadi RK, Lum JJ, DeBerardinis RJ, Zhao M, Viollet B, Thompson CB: Pengobatan sistemik dengan obat antidiabetes metformin selektif mengganggu p53-kekurangan pertumbuhan sel tumor.

. Kanker Res 2007, 67: 6745-6752 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

4. Anisimov VN, Berstein LM, Egormin PA, Piskunova TS, Popovich IG, Zabezhinski MA, Kovalenko IG, Poroshina TE, Semenchenko AV, Provinciali M, et al: Pengaruh metformin terhadap rentang kehidupan dan perkembangan tumor mammae spontan dalam DIA. -2/neu tikus transgenik.

Exp Gerontol 2005, 40:. 685-693 PubMed Abstrak | Penerbit Teks Penuh

5. Schneider MB, Matsuzaki H, J Haorah, Ulrich A, Standop J, Ding XZ, Adrian TE, Tuangkan PM: Pencegahan induksi kanker pankreas pada hamster dengan metformin.

. Gastroenterologi 2001, 120: 1263-1270 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

6. Isakovic A, Harhaji L, D Stevanovic, Markovic Z, Sumarac-Dumanovic M, Starcevic V, Micic D, Trajkovic V: antiglioma tindakan Dual metformin: siklus sel penangkapan dan mitokondria-tergantung apoptosis.

. Your Mol Hidup Sci 2007, 64: 1290-1302 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

7. Phoenix KN, Vumbaca F, Claffey KP: Terapi metformin / AMPK aktivasi mempromosikan fenotipe angiogenik dalam ERalpha negatif MDA-MB-435 Model kanker payudara.

Res Mengobati Kanker Payudara 2008. PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

8. Sahra IB, Laurent K, Loubat A, Giorgetti-Peraldi S, Colosetti P, Auberger P, Tanti JF, Le Marchand-Brustel Y, Bost F: Para metformin obat antidiabetes mengerahkan efek antitumoral in vitro dan in vivo melalui penurunan cyclin tingkat D1.

Onkogen 2008, 27: 3576-3586. PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

9. Zakikhani M, Dowling R, Fantus IG, Sonenberg N, Pollak M: Metformin adalah AMP kinase-bergantung pertumbuhan inhibitor untuk sel-sel kanker payudara.

. Kanker Res 2006, 66: 10269-10273 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

10. Zhou G, R Myers, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, Wu M, Ventre J, Doebber T, Fujii N, et al: Peran AMP-protein kinase diaktifkan dalam mekanisme aksi metformin..

J Clin Invest 2001, 108:. 1167-1174 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text | Teks PubMed Central Kendali

11. Kemp BE, Stapleton D, Campbell DJ, Chen ZP, Murthy S, Walter M, Gupta A, JJ Adams, Katsis F, van Denderen B, et al:. AMP-protein kinase diaktifkan, pengatur metabolisme super.

. Biochem Soc Trans 2003, 31: 162-168 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

12. Sanders MJ, Grondin PO, Hegarty BD, Snowden MA, Carling D: Investigasi mekanisme untuk aktivasi AMP dari kaskade-AMP kinase protein diaktifkan.

Biochem J 2007, 403: 139-148. PubMed Abstrak | Penerbit Full Text | PubMed Tengah Full Text

13. Xiao B, Heath R, Saiu P, Leiper FC, Leone P, Jing C, Walker PA, Haire L, Eccleston JF, CT Davis, et al: Struktural dasar untuk AMP mengikat mamalia AMP-activated protein kinase..

. Alam 2007, 449: 496-500 PubMed Abstrak | Penerbit Full Text

14. Hawley SA, Boudeau J, Reid JL, Mustard KJ, UDD L, Makela TP, Alessi DR, Hardie DG: Kompleks antara supresor tumor LKB1, STRAD alpha / beta dan alpha MO25 / beta kinase hulu dalam protein kinase AMP-diaktifkan kaskade.

J Biol 2003, 2:. 28 PubMed Abstrak | BioMed Central Full Text | Teks PubMed Central Kendali

15. Shaw RJ, Kosmatka M, Bardeesy N, Hurley RL, Witters LA, DePinho RA, Cantley LC: The tumor suppressor LKB1 kinase directly activates AMP-activated kinase and regulates apoptosis in response to energy stress.

Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101 : 3329-3335. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

16. Woods A, Johnstone SR, Dickerson K, Leiper FC, Fryer LG, Neumann D, Schlattner U, Wallimann T, Carlson M, Carling D: LKB1 is the upstream kinase in the AMP-activated protein kinase cascade.

Curr Biol 2003, 13 : 2004-2008. PubMed Abstract | Publisher Full Text

17. Hawley SA, Gadalla AE, Olsen GS, Hardie DG: The antidiabetic drug metformin activates the AMP-activated protein kinase cascade via an adenine nucleotide-independent mechanism.

Diabetes 2002, 51 : 2420-2425. PubMed Abstract | Publisher Full Text

18. Lizcano JM, Goransson O, Toth R, Deak M, Morrice NA, Boudeau J, Hawley SA, Udd L, Makela TP, Hardie DG, Alessi DR: LKB1 is a master kinase that activates 13 kinases of the AMPK subfamily, including MARK/PAR-1.

Embo J 2004, 23 : 833-843. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

19. Hinke SA, Martens GA, Cai Y, Finsi J, Heimberg H, Pipeleers D, Casteele M: Methyl succinate antagonises biguanide-induced AMPK-activation and death of pancreatic beta-cells through restoration of mitochondrial electron transfer.

Br J Pharmacol 2007, 150 : 1031-1043. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

20. Leverve XM, Guigas B, Detaille D, Batandier C, Koceir EA, Chauvin C, Fontaine E, Wiernsperger NF: Mitochondrial metabolism and type-2 diabetes: a specific target of metformin.

Diabetes Metab 2003, 29 : 6S88-94. PubMed Abstract | Publisher Full Text

21. Owen MR, Doran E, Halestrap AP: Evidence that metformin exerts its anti-diabetic effects through inhibition of complex 1 of the mitochondrial respiratory chain.

Biochem J 2000, 348 : 607-614. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

22. Zou MH, Kirkpatrick SS, Davis BJ, Nelson JS, Wiles WGt, Schlattner U, Neumann D, Brownlee M, Freeman MB, Goldman MH: Activation of the AMP-activated protein kinase by the anti-diabetic drug metformin in vivo. Role of mitochondrial reactive nitrogen species.

J Biol Chem 2004, 279 : 43940-43951. PubMed Abstract | Publisher Full Text

23. Katajisto P, Vallenius T, Vaahtomeri K, Ekman N, Udd L, Tiainen M, Makela TP: The LKB1 tumor suppressor kinase in human disease.

Biochim Biophys Acta 2007, 1775 : 63-75. PubMed Abstract | Publisher Full Text

24. Hardie DG: New roles for the LKB1-->AMPK pathway.

Curr Opin Cell Biol 2005, 17 : 167-173. PubMed Abstract | Publisher Full Text

25. Neve RM, Chin K, Fridlyand J, Yeh J, Baehner FL, Fevr T, Clark L, Bayani N, Coppe JP, Tong F, et al .: A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes.

Cancer Cell 2006, 10 : 515-527. PubMed Abstract | Publisher Full Text

26. Wasielewski M, Elstrodt F, Klijn JG, Berns EM, Schutte M: Thirteen new p53 gene mutants identified among 41 human breast cancer cell lines.

Breast Cancer Res Treat 2006, 99 : 97-101. PubMed Abstract | Publisher Full Text

27. Sherr CJ, Roberts JM: CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression.

Genes Dev 1999, 13 : 1501-1512. PubMed Abstract | Publisher Full Text

28. Zarkowska T, Mittnacht S: Differential phosphorylation of the retinoblastoma protein by G1/S cyclin-dependent kinases.

J Biol Chem 1997, 272 : 12738-12746. PubMed Abstract | Publisher Full Text

29. Dowling RJ, Zakikhani M, Fantus IG, Pollak M, Sonenberg N: Metformin inhibits mammalian target of rapamycin-dependent translation initiation in breast cancer cells.

Cancer Res 2007, 67 : 10804-10812. PubMed Abstract | Publisher Full Text

30. Shen Z, Wen XF, Lan F, Shen ZZ, Shao ZM: The tumor suppressor gene LKB1 is associated with prognosis in human breast carcinoma.

Clin Cancer Res 2002, 8 : 2085-2090. PubMed Abstract | Publisher Full Text

31. Hawley SA, Pan DA, Mustard KJ, Ross L, Bain J, Edelman AM, Frenguelli BG, Hardie DG: Calmodulin-dependent protein kinase kinase-beta is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase.

Cell Metab 2005, 2 : 9-19. PubMed Abstract | Publisher Full Text

32. Hurley RL, Anderson KA, Franzone JM, Kemp BE, Means AR, Witters LA: The Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinases are AMP-activated protein kinase kinases.

J Biol Chem 2005, 280 : 29060-29066. PubMed Abstract | Publisher Full Text

33. Woods A, Dickerson K, Heath R, Hong SP, Momcilovic M, Johnstone SR, Carlson M, Carling D: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase-beta acts upstream of AMP-activated protein kinase in mammalian cells.

Cell Metab 2005, 2 : 21-33. PubMed Abstract | Publisher Full Text

34. Sun Y, Connors KE, Yang DQ: AICAR induces phosphorylation of AMPK in an ATM-dependent, LKB1-independent manner.

Mol Cell Biochem 2007, 306 : 239-245. PubMed Abstract | Publisher Full Text

35. Suzuki A, Kusakai G, Kishimoto A, Shimojo Y, Ogura T, Lavin MF, Esumi H: IGF-1 phosphorylates AMPK-alpha subunit in ATM-dependent and LKB1-independent manner.

Biochem Biophys Res Commun 2004, 324 : 986-992. PubMed Abstract | Publisher Full Text

36. Swinnen JV, Beckers A, Brusselmans K, Organe S, Segers J, Timmermans L, Vanderhoydonc F, Deboel L, Derua R, Waelkens E, et al .: Mimicry of a cellular low energy status blocks tumor cell anabolism and suppresses the malignant phenotype.

Cancer Res 2005, 65 : 2441-2448. PubMed Abstract | Publisher Full Text

37. Guigas B, Bertrand L, Taleux N, Foretz M, Wiernsperger N, Vertommen D, Andreelli F, Viollet B, Hue L: 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside and metformin inhibit hepatic glucose phosphorylation by an AMP-activated protein kinase-independent effect on glucokinase translocation.

Diabetes 2006, 55 : 865-874. PubMed Abstract | Publisher Full Text

38. Guigas B, Taleux N, Foretz M, Detaille D, Andreelli F, Viollet B, Hue L: AMP-activated protein kinase-independent inhibition of hepatic mitochondrial oxidative phosphorylation by AICA riboside.

Biochem J 2007, 404 : 499-507. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text

39. Jones RG, Plas DR, Kubek S, Buzzai M, Mu J, Xu Y, Birnbaum MJ, Thompson CB: AMP-activated protein kinase induces a p53-dependent metabolic checkpoint.

Mol Cell 2005, 18 : 283-293. PubMed Abstract | Publisher Full Text