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alfonso-pugliese
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PCR real time nel monitoraggio dell’infezione da BKV
V.Salotti e A.Azzi
BK virus nelle urinedopo ultracentrifugazione
La scoperta di BKV
Gardner SD, Field AM, Coleman DV, Hulme B.
New human papovavirus (B.K.) isolated from urine after renal transplantation.
Lancet 1971
Infezione da BKV
• Infezione primaria
• Latenza
• Riattivazione
Prima infanziaVia respiratoriaRene trapiantato
renelinfociticervello…..
Tratto urinario
viruria
Infezione da BKV: eziopatologia
• Soggetti immunocompetenti
• Trapiantati di midollo• Trapiantati renali
• AIDS
• asintomatica
• Cistite emorragica• Stenosi ureterale
• Meningite, infezione disseminata …..
•Interstitial nephropathy (PVAN)
•Tumori ?
Ricerca del DNA virale PCR qualitativa Nelle urine
• Soggetti sani 17 %• gravidanza 15 %• Trapiantati di midollo 77 %• AIDS 40 %• Trapiantati rene [25 %]
Nei linfociti• Soggetti sani 53 %• Trapiantati di midollo 57.5 %• AIDS 62.5 %
Ricerca del DNA di BKV nel plasma /siero
• La presenza di virus libero in circolo nei trapiantati di rene è considerata un indicatore di patologia renale BKV –associata.
• Livelli significativi da definire
Organizzazione del genoma dei polyomavirus
•
PCR qualitativa per DNA di BKV
PCR quantitativa competitiva per BKV
• L’estrazione dei campioni
• La sintesi del competitore
• La calibrazione del competitore
• La reazione
• La rivelazione
Sintesi del competitore
• Mutagenesi sito-specifica/hot start PCR• NcoII: 5’TATTTTGCCATGGAGATATG 3’
• NcoI: 5’CATATCTCCATGGCAAAATA 3’
• Enzima NcoI• ccatgg• ggtacc•
PEP 1
target TA
sequence
Nco II
Nco I PEP 2Mutagenesis obtained with the primer Nco II G
CGC
Mutagenesis obtained with the primer Nco I
5’5
’ 3’3
’
Denaturation and Rinaturation
Extension with the primers PEP5’ 5
’standard
Fig.. 1 PCR site-directed mutagenesis.
• Mix + Taq gold
• 5 l estratto campione urina
• 40 fg – 200 fg – 1 pg – 5 pg – 25 pg competitore
PCR quantitativa competitiva per DNA di BKV: la rivelazione
Quantificazione dei prodotti della PCR
• Software Molecular Analyst (Bio-Rad)
• y
• .Y= OD banda comp x 1.88
• OD banda campione .• .• .• x• log[conc competitore]
• calcolo retta di regressione e coefficiente di regressione lineare
Trapiantati di midolloCistite emorragica Carica virale nelle urine
PCR quantitativa competitiva
PCR quantitativa competitiva per BKV
• Limiti– Tempi– Costi– Manualità– Sensibilità– riproducibilità