KRIOPRESERVASI DAN TRANSPLANTASI OVARIUM UNTUK MEMELIHARA KESUBURANS.J. Silber*

Transplantasi ovarium segar manusia yang berhasil pertama kali dilaporkan di antara sepasang kembar monozigot (MZ) luar biasa yang diskordan untuk kegagalan ovarium prematur (POF) dengan menggunakan teknik grafting kortikal (Silber dkk, 2005). Auto-graft ovarium beku manusia yang berhasil pertama kali dilaporkan di sekitar waktu yang sama dengan jaringan yang dikriopreservasi untuk pasien kanker sebelum sterilisasi transplantasi sumsum tulang mereka(Donnez dkk, 2004; Meirow dkk, 2005). Hasil serupa ini dijelaskan pada domba lebih dari satu dekade sebelumnya (Gosden dkk, 1994). Teknik ini kemudian disempurnakan pada serial yang lebih besar dengan sembilan transplantasi ovarium segar berturut-turut yang sukses pada kembar identik diskordan untuk POF, plus dua allotransplan segar, dengan kembalinya siklus hormonal normal dan menstruasi dalam semua kasus, yang akhirnya menghasilkan 14 kehamilan dan 11 bayi sehat yang lahir dari 9 resipien kembar identik segar (Silber dan Gosden, 2007; Silber dkk, 2008a, b.; Silber dkk, 2010). Serial yang tidak biasa dari transplantasi kortikal ovarium segar ini juga membantu kami dalam menyempurnakan teknik yang diperlukan untuk keberhasilan memelihara kesuburan untuk pasien kanker dengan menggunakan teknik pembekuan jaringan ovarium, dengan tiga tambahan kehamilan yang sukses dari tiga transplantasi beku. Serial yang tidak biasa ini juga membantu kami untuk membangun sebuah metode untuk membedakanantara kehilangan telur dari waktu iskemia transplantasi versus kehilangan telur dari kriopreservasi. Saat ini kami melaporkan tindak lanjut jangka panjang (hingga 8 tahun) dari serial asli ini, dan menambahkan pengalaman kami yang lebih baru dengan jaringan ovarium yang dikriopreservasi. Hasilnya tampaknya menjadi lebih kuat dari yang semula dimaksud.SERIAL SEGAR DARI KEMBAR IDENTIK DENGAN POFSeluruh ovarium dari donor diangkat dan korteks didiseksi jauh dari medula. Korteks dari ovarium resipien yang tidak berfungsi diangkat seluruhnya, dan irisan korteks donor ditransplantasikan ke medulla yang terekspos dengan menggunakan jahitan terputus nylon 9-0. Sepotong kecil jaringan cadangan dari donor, serta seluruh korteks ovarium atrofi yang direseksi dari resipien diperiksa secara histologis pada semua kasus (Gbr. 1A dan B). Harus diperhatikanbahwa kami menghindari pembentukan mikro-hematoma di bawah graft dengan kauter mikro-bipolar dan jahitan tekanan mikro (micro-pressure). Irigasi pulsatil konstan dengan saline terheparinisasi mencegah adhesi (Gambar. 2A-D). Hanya sepertiga dari korteks ovarium dicangkokkan secara segar dan dua pertiga dibekukan.KRIOPRESERVASI OVARIUM DENGAN TEKNIK PEMBEKUAN LAMBAT ASLI Semua studi klinis transplantasi segar kami melibatkan kriopreservasi jaringan cadangan untuk transplantasi pencairan di masa depan. Semua kasus pembekuan yang ditransplantasikan sejauh ini memanfaatkan pendekatan pembekuan lambat (Gook dkk 1999). Untuk pembekuan lambat, setelah enukleasi jaringan medula dengan diseksi skalpel tajam, korteks dikupas secara manual menjadi kulit transparan ultra-tipis dengan ketebalan 1 mm. Jaringan untuk kriopreservasidibagi menjadi beberapa strip dan ditransfer ke dalam kriovial 1,5 ml setelah equilibrasi dalam 1,5 mol / l 1,2-propanadiol dan 0,1 mol / l sukrosa pada 370C selama 30 menit, dilanjutkan dengan 1,5 mol / l 1,2 propanadiol dan 0,2 mol / l sukrosa selama 5 menit, kemudian didinginkan pada tingkat terkontrol, seperti yang dijelaskan sebelumnya (Gosden dkk, 1994). Pencairan dilakukan dengan cepat dengan meng-agitasi vial dalam bak air hangat. Jika jaringan menebal oleh kontraksi setelah pencairan, ia dikupas lagi hingga < 1 mm di bawah mikroskop operasi dengan gunting mikro sebelum transplantasi (Newton dkk, 1996).Namun, saat ini kami menggunakan vitrifikasi secara eksklusif untuk kriopreservasi pada manusia karena penelitian analisis kelayakan in vitro kami serta studi transplantasi in vivo pada sapi (Kagawa dkk., 2009). Sebanyak 16 pasien kanker yang meminta pemeliharaan kesuburan dengan ovarian banking menyetujui uji viabilitas oosit dan kajian histologis dari sampel kecil (10%) jaringan segar atau yang diawetkan. Dalam delapan kasus, jaringan telah diawetkan dengan vitrifikasi, enam dengan protokol pembekuan lambat dan hanya dua jaringan segar yang dianalisis. Tujuan dari penelitian in vitro ini adalah untuk menentukan metode mana yang menghasilkan tingkat kelangsungan hidup sel yang lebih tinggi (Silber dkk, 2010). Viabilitas yang tinggi (92%) dari oosit dalam spesimen kontrol (segar) dan spesimen vitrifikasi menunjukkan bahwa disagregasi per se hanya menyebabkan kerusakan minimal pada jenis sel ini (Silber dkk, 2010). Secara keseluruhan, 2.301 oosit diperiksa dari 16 spesimen. Hasil dalam setiap ketiga kelompok mengungkapkan tidak ada perbedaan keseluruhan yang signifikan antara jaringan segar dan vitrifikasi, tapi viabilitas dari jaringan kriopreservasi pembekuan lambat kurang dari setengahnya (42%; P < 0,01). Transmisi mikroskop elektron juga telah digunakan untuk menganalisis jaringan ovarium yang dikriopreservasi dengan pembekuan lambat atau vitrifikasi dengan pembekuan ultra-cepat, yang menunjukkan vitrifikasi lebih superior (Keros dkk, 2009).Akan memakan waktu sebelum kita dapat mengumpulkan pengalaman klinis yang sama dengan transplantasi dari sampel vitrifikasi kami karena diperlukan 15 tahun untuk mendapatkan pengalaman dengan sampel pembekuan lambat (ia butuh waktu yang lama bagi banyak pasien untuk datang kembali untuk transplantasi beku). Namun, bukti in vitro sangat mendukung vitrifikasi.TEKNIK VITRIFIKASI JARINGAN OVARIUM Jaringan korteks dari masing-masing ovarium dipotong menjadi irisan 1 10 10 mm. Ketebalan jaringan 1-mm dipertahankan dengan alat pengiris jaringan yang dirancang secara eksplisit untuk tujuan ini (Kitazato Biopharma, Jepang). Alat pengiris jaringan diletakkan pada permukaan ovarium. Kemudian piringan lainnya ditempatkan pada alat pengiris jaringan, dan ovarium dipotong di antara pemotong dan permukaan ovarium dengan menggunakan blade tajam. Jaringan kortikal ovarium dengan demikian dipotong menjadi potongan 1 10 10 mm. Ketipisan jaringan sangat penting, tidak hanya untuk kriopreservasi, tetapi juga untuk revaskularisasi cepat setelah grafting.Jaringan ovarium awalnya diekuilibrasi dalam 7,5% etilena glikol (EG) dan 7,5% dimetil sulfoksida (DMSO) dalam handling medium (HM: larutan TCM-199 buffer HEPES yang disuplementasi dengan 20% (v / v) pengganti serum sintetis (SSS, Irvine Ilmiah, Santa Ana, CA, USA) selama 25 menit diikuti dengan ekuilibrasi kedua dalam 20% EG dan 20% DMSOdengan 0,5 mol / l sukrosa selama 15 menit. Jaringan ovarium kemudian ditempatkan dalam volume minimum larutan (hampir 'kering') ke dalam strip logam tipis (Cryotissue: Kitazato BioPharma, Fujinomiya, Jepang), dan di tenggelamkan langsung ke dalam nitrogen cair steril (Fuentes dan Dubettier, 2004), setelah strip dimasukkan ke dalam wadah pelindung dan ditempatkan dalam tangki penyimpanan nitrogen cair.Untuk pencairan, pelindung diangkat dan strip logam Cryotissue direndam langsung ke dalam 40 ml larutan 370C HM yang disuplementasi dengan 1,0 mol / 1 sukrosa selama 1 menit. Kemudian, jaringan ovarium ditransfer ke dalam 15 ml 0,5 mol / 1 larutan HM sukrosa selama 5 menit pada suhu kamar, dan dicuci dua kali dalam larutan HM selama 10 menit sebelum analisis viabilitas, atau transplantasi. Tidak ada formasi kristal es yang terjadi dalam setiap prosedur vitrifikasi ini(Kagawa dkk., 2009).TEKNIK TRANSPLANTASI JARINGAN KORTIKAL OVARIUM Untuk transplantasi ovarium segar, di bawah anestesi umum, satu ovarium diangkat dari donor dengan menggunakan laparoskopi atau minilaparotomi. Seluruh ovarium ditransfer ke cawan Petri untuk diseksi dengan tangan dengan skalpel dan forsep bergigi. Dirasakan penting untuk mempersiapkan sepotong jaringan kortikal yang tidak lebih tebal dari 1.5 mm untuk memfasilitasi revaskularisasi cepat sambil menjaga jaringan diirigasi secara konstan dengan media Leibovitz L-15 dingin (Gambar. 2A). Saat ini kami merekomendasikan alat pengiris jaringan Kitazato khusus daripada diseksi dengan tangan, untuk mendapatkan irisan tipis. Tapi untuk kasus segar awal ini, korteks yang dikupas dengan tangan dibagi menjadi beberapa bagian dengan ukuran yang kira-kira sama untuk grafting, satu potong untuk setiap ovarium resipien. Dua pertiga dari jaringan kortikal sisanya dikriopreservasi (Newton dkk, 1996; Gook dkk,1999; Oktay dkk, 2004; Rosendahl dkk, 2006). Teknik untuk mentransplantasikan jaringan korteks ovarium yang dicairkan tidak berbeda dari jaringan kortikal segar.Resipien dipersiapkan dengan minilaparotomi melalui insisi 3,5 cm di atas pubis. Untuk transplantasi jaringan kortikal, korteks ovarium resipien direseksi untuk benar-benar mengekspos jaringan medula (Gambar 2B); hemostasis dikontrol dengan forceps mikro-bipolar, dan irigasi dengan saline terheparinisasi dilakukan untuk menghindari pembentukan adhesi atau mikro-hematoma di antara jaringan donor dan resipien. Teknik ini mungkin menjadi alasan yang paling penting untuk kehilangan iskemik minimal dari viabilitas oosit. Jaringan graft dipotong menjadi dimensi dari permukaan yang terekspos dari resipien dan dilekatkan dengan menggunakan jahitan terputus 9-0 di bawah mikroskop operasi (Gbr. 2C). Yang sangat penting, medullar bed juga dijahit ke permukaan bawah dari graft kortikal dengan jahitan 9-0 untuk mempertahankan aproksimasi jaringan yang ketat, sekali lagi untuk menghindari pembentukan mikro-hematoma di bawah graft korteks (Gambar. 2D). Setelah mengangkat korteks yang lama untuk mengakomodasi yang baru, semua jaringan yang dibuang diperiksa secara histologis dan harus ditemukan benar-benar bebas dari folikel. Semua pasien dipulangkan dari rumah sakit pada hari yang sama atau keesokan harinya, dan mengalami pemulihan yang cepat dan lancar. Dalam salah satu kasus dari ketiadaan bilateral dari ovarium dan ampula, graft dilekatkan pada isthmus tuba fallopi daripada ke medula ovarium.TRANSPLANTASI SELURUH OVARIUM INTAKUntuk transplantasi seluruh ovarium intak, ovarium donor diangkat dengan klem ligamentum pelvis infundibular pada dasarnya untuk mendapatkan panjang maksimum. Vena (3-5 mm) mudah diidentifikasi, tetapi arteri ovarium (0,3 mm) sering tidak terlalu terlihat. Seluruh spesimen ditempatkan dalam media Leibovitz pada suhu 4oC dan dua vena dan satu arteri didiseksi dan diisolasi di bawah mikroskop operasi. Ligamentum pelvis infundibular resipien diklem di dasarnya dan ditranseksi dekat dengan ovarium yang tidak berfungsi. Vena ovarium donor kemudian dianastomosis dengan vena resipien dengan jahitan terputus nilon 9-0, dan arteri ovarium dianastomosis dengan jahitan terputus nilon 10-0 (Gambar. 3A-C). Ketika klem mikro-vaskular dilepaskan, aliran darah dikonfirmasi dengan perdarahan segar dari permukaan ovarium di mana irisan kortikal diambil untuk kriopreservasi sebagai cadangan. Konsep asli di balik transplantasi mikro-vaskular seluruh ovarium intak adalah untuk menghindari kerusakan yang secara salah dikaitkan dengan grafting kortikal (Baird dkk, 1999). Hasil saat ini tampaknyamenghilangkan kebutuhan untuk transplantasi seluruh ovarium, karena graft jaringan kortikal ovarium segar ini kini telah terbukti memiliki durasi fungsi yang panjang.HASIL TRANSPLANTASI OVARIUM SEGAR DAN BEKUHasil dirangkum dalam Tabel I dan pada Gambar 4 dan 5. Kesembilan pasangan kembar identik menjalani isotransplantasi ovarium orthotopik mereka antara April 2004 hingga April 2008. Para resipien, pada sebagian besarnya, terus mengalami siklus dari 2 tahun pada dua pasien yang donornya memiliki cadangan ovarium yang rendah selama lebih dari 6 atau 7 tahun dalam banyak kasus. Dua pasien yang donornya memiliki jumlah folikel antral (AFC) yang rendah yaitu < 10, hanya berfungsi selama 2 tahun. Namun, bahkan dua kasus ini memiliki jaringan kortikal beku cadangan yang masih tersedia untuk transplantasi di masa depan. Siklus menstruasi dimulai dalam waktu 3 bulan dan kadar FSH hari ke-3 kembali normal dalam 4,5 bulan dalam semua kasus (Gambar 4 dan 5). Sebanyak 14 bayi yang sehat dilahirkan dari 12 transplantasi ovarium, 11 dari 9 transplantasi segar dan 3 dari tiga transplantasi beku (Tabel I).Salah satu dari kembar kami menjadi hamil pada usia 39 tahun (perhatikan bahwasaudara donor tentu saja juga berusia 39 tahun) tanpa bantuan medis setelah menstruasi kelima, 8 bulan setelah transplantasi. Ia melahirkan seorang bayi perempuan yang sehat aterm dan kemudian mengandung lagi pada usia 42 tahun, dan melahirkan bayi laki-laki yang sehat saat aterm, 4 tahun setelah ia menjalani transplantasi. Ovariumnya masih berfungsi sampai saat ini setelah 7 tahun, dan ia mengandung lagi pada usia 45 tahun dengan anak laki-laki lain yang sehat, >7 tahun setelah transplantasi-nya. Salah satu kasus transplantasi ovarium adalah kembar identik yang mana POF disebabkan oleh transplantasi sumsum tulang dengan radiasi pelvis untuk leukemia, dengan saudara kembar identik-nya menjadi donor. Ia menjadi hamil secara spontan 5 bulan setelah transplantasi ovarium segar dari adiknya, tapi mengalami keguguran. Kemudian pada 1,5 tahun ia kembali hamil dan memiliki bayi yang sehat, dan pada 5tahun setelah transplantasi, ia kembali hamil, dan memiliki bayi kedua yang sehat. Lebih dari 6 tahun kemudian, transplantasi aslinya masih berfungsi, dan dia masih memiliki dua pertiga dari ovarium yang tetap beku. Tampaknya bukan dari kasus ini atau dari kasus beku dimana radiasi pelvis tidak kompatibel dengan kehamilan yang sehat, dan pada kenyataannya, tampaknya (bertentangan dengan ekspektasi) bahwa transplantasi jaringan kortikal ovarium dengan menggunakan teknik ini adalah prosedur yang sangat kuat.Hanya satu pasien yang gagal untuk hamil, tapi ia memiliki AFC marjinal dan berusia 41 tahun pada saat transplantasi. Namun, ovariumnya terus berfungsi meskipun dengan usianya dan cadangan ovarium yang rendah (dan usia donornya) selama lebih dari 4 tahun, dan ia masih memiliki dua pertiga dari ovarium beku untuk transplantasi di masa depan. Satu kasus menjalani transplantasi mikrovaskuler seluruh ovarium intak dan terus mendapatkan siklus secara teratur. Dia menjadi hamil dan melahirkan bayi yang sehat 2 tahun kemudian. Tapi tampaknya bahwa prosedur dirinya yang lebih sulit (transplantasi mikrovaskuler seluruh ovarium) tidak perlu, karena dia akan mengalami hal yang sama dengan graft kortikal rawat jalan sederhana. Pengalaman baru yang menguntungkan dengan grafting korteks ovarium ini tidak hanya terbatas pada pusat kami (Donnez dkk, 2011). Hasil yang sama kuatnya dialami di Brussels, Paris, Spanyol, Denmark dan Israel. Graft ovarium beku (bahkan dengan teknik pembekuan lambat) di Denmark berlangsung lebih dari 5 tahun dan banyak kehamilan spontan yang telah dilaporkan tanpa kebutuhan akan IVF atau pengobatan tambahan lainnya. Pada saat penulisan ini, 28 bayi sehat telah lahir dari grafting jaringan ovarium, dan sebagian besar tidak mencakup IVF, dan dihasilkan hanya dari hubungan biasa tanpa terapi khusus (lihat Tabel II).TRANSPLANTASI KORTIKAL OVARIUM BEKUManfaat yang paling umum dari transplantasi ovarium bukanlah kasus grafting segar yang tidak biasa ini melainkan untuk melindungi kesuburan dan fungsi endokrin di masa depan dari perempuan muda yang menjalani pengobatan kanker (Bleyer, 1990; Ries, 1999; Larsen dkk, 2003; Anderson dkk, 2006; Lee dkk., 2006; Anderson dan Cameron, 2007; Jeruss dan Woodruff, 2009; Kagawa dkk, 2009.; Siber dkk., 2010). Sejak tahun 1996, kami memiliki jaringan ovarium beku untuk 62 perempuan muda dengan kanker organ padat, atau dengan risiko yang besar untuk POF, 16 di antaranya memiliki jaringan beku cadangan yang diarahkan untuk menjalani pengujian viabilitas rinci sebelum kriopreservasi dan setelah pencairan. Sebanyak 62 menjalani tinjauan histologis oleh berbagai ahli patologi. Hanya satu yang memiliki metastasis ovarium, seorang wanita muda dengan metastasis kanker payudara luas di seluruh tubuhnya. Sebaliknya,tidak ada 61 kasus kami lainnya yang memiliki sel-sel tumor apapun dalam ovarium mereka. Andersen juga memperhatikan kekurangan lengkap dari metastasis ovarium, bahkan pada sebagian besar kasus leukemia (Gbr. 6). Alasan untuk ketiadaan yang luar biasa dari metastasis ovarium mungkin saja karena sifat avaskular fibrosa dari korteks ovarium (Profesor Claus Andersen, komunikasi pribadi). Bahkan, alasan mengapa tubulus ovarium janin (yang pada janin laki-laki menjadi tubulus seminiferus) menginvasi korteks fibrosa dan menjadi folikel, adalah bahwa jaringan fibrosa padat dari korteks (yang dalam testis janin dan dewasa hanya berupa tunika albuginia) diperlukan untuk mensupresi folikel yang beristirahat untuk berkembang sekaligus secara prematur.Dengan teknik pembekuan lambat klasik, pengujian viabilitas in vitro kami menunjukkan hanya 41% dari oosit yang selamat (Newton dkk, 1996;. Gook dkk, 1999; Kagawa dkk, 2009.; Silber dkk, 2010). Namun, dengan vitrifikasi dari jaringan ovarium tidak ada perbedaan antarakontrol segar dan jaringan beku. Tampaknya, oleh karena itu, jaringan ovarium yang divitrifikasi akan memberikan hasil yang lebih baik setelah transplantasi daripada jaringan yang dikriopreservasi dengan pembekuan lambat, tetapi terlalu dini untuk menyatakan dengan pasti.Sejauh ini, hanya tiga dari pasien kami telah mendapatkan jaringan beku yang ditransplantasikan kembali. Dalam ketiga kasus, jaringan dikriopreservasi dengan pembekuan lambat karena ini adalah sebelum kami mengadopsi vitrifikasi sebagai metode standar kami pada tahun 2009. Selain 62 kasus patologis ini, 7 wanita menjalani pembekuan jaringan ovarium hanya untuk memungkinkan mereka untuk memiliki anak pada usia yang lebih tua karena mereka harus menunda untuk melahirkan karena alasan pribadi dan ekonomi yang kuat. Semua perempuan ini merupakan kasus yang lebih baru, dan menjalani pembekuan jaringan ovarium mereka dengan vitrifikasi (Kagawa dkk, 2009;. Silber dkk, 2010).Dari ketiga kasus jaringan transplantasi beku kami sejauh ini, bahkan dengan pembekuan lambat, semuanya mendapatkan kembali siklus menstruasi ovulatorik dalam waktu 4 bulan dengan kehamilan spontan pada akhirnya. Secara umum, resipien dari autografts kortikal ovarium yang dicairkan memiliki pola pengembalian fungsi yang sama seperti yang kita lihat dengan graft segar (Gbr. 5). Namun, durasi fungsi untuk graft pembekuan lambat ini kurang dari 2 tahun, sekitar sepertiga atau kurang dari graft segar kami. Hal ini bisa menjadi masalah intrinsik dari pembekuan lambat, atau masalah dengan teknik pembekuan lambat kami. Kami berharap bahwa dengan vitrifikasi, karena kami tidak menemukan kehilangan viabilitas oosit, bahwa graft bekuakan bertahan sama lamanya dengan yang segar. Hal ini jelas dalam graft segar kami bahwa dengan teknik bedah mikro yang tepat, waktu iskemia bukanllah masalah dalam grafting kortikal. Satu-satunya masalah yang tersisa adalah apakah metode yang optimal untuk kriopreservasi?GENETIKA DARI POF NON-KANKER, DAN CADANGAN OVARIUM YANG RENDAHTak satu pun dari riwayat medis yang memberikan penjelasan untuk POF dengan ovarium afollikular pada resipien, kecuali orang yang telah menerima kemoterapi, dan transplantasi sumsum tulang untuk leukemia. Riwayat klinis POF dalam sembilan kasus MZ lainnya adalah idiopatik dan konsisten dengan defisiensi kongenital dari sel germinal. Menurut model matematika (Faddy dkk, 1992), cadangan folikel saat lahir haruslah sangat kecil untuk menjelaskan POF saat remaja atau dewasa muda.Kembar identik diskordan untuk fungsi ovarium menyajikan teka-teki genetik sejati. Sebagian besar perempuan memasuki menopause dalam dekade kelima atau keenam kehidupan, dengan rata-rata berusia 51 tahun, tapi 1% mengalami menopause yang cukup prematur, yaitu sebelum 40 tahun (Coulam dkk, 1986; Riboli dkk, 2002; Luborsky dkk, 2003). POF sering memiliki etiologi genetik dan usia menopause biasanya diwariskan yang dilihat dari kesesuaian yang lebih besar antara kembar MZ daripada dizigotik (Snieder dkk, 1998; De Bruin dkk, 2001; Van Asselt dkk, 2004; Goswami dan Conway, 2005). Sangat luar biasa untuk mengidentifikasi pasangan kembar MZ dimana salah satunya telah menjalani menopause dengan alasan yang tidak dapat dijelaskan pada usia yang sangat dini yaitu 14-22 tahun, sedangkan yang lainnya, masih subur dengan mengandung anak-anaknya secara alami, serta siklus ovulasi dan cadangan ovarium yang normal (Silber dkk, 2005; Silber dan Gosden, 2007; Silber dkk, 2008a, b). Kami belum mendapatkan keuntungan dari kesempatan unik yang kembar ini tawarkan untuk mempelajari asal genetik dari cadangan ovarium, tapi DNA genomik dan baris sel lymphoblastoid disiapkan dan secara hati-hati disimpan untuk studi genetik dan epigenetik di masa depan. Rincian catatan obstetrik mengenai korionisitas asli saat lahir dari saudara kembar identik ini mengungkapkan bahwa 50% adalah monokorionik-monoamniotik, yang sangat tinggi karena insidensi mono / mono biasanya hanya 2% (P< 0,0005). Jelas bahwa pembelahan lambat, untuk apa pun alasannya, menjadi predisposisi bagi kembar identik terhadap defisiensi sel germinal diskordan (Su, 2002; Gosden, dkk, 2007;. Silber dkk, 2008a.).