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miguel-angel-carrasco-soler
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Organización espacial dentro del núcleo
Chr 12, 14 y 15 Todos los Chr territorio aislado no
Hepatocito raton fibroblasto humano es sólido.-canales
nucleoplásmicos
Chromosome territories- Meaburn & Misteli- Nature 445:379, 2007
Visualizacion de sitios de transcripcion
RNA naciente se marca por 15 min con biotina-CTP que luego se revela con 1er Ab y proteina A-oro de 9 nm. RNA pol II se marca en el recuadro con Ab con particulas de oro de 15 nm
CONCEPTO DE FABRICAS DE TRANSCRIPCION
Iborra et al. J.Cell Science 109: 1427, 1996
2100-2200 sitios de transcripción/núcleo
Sitios de transcripción vistos por microscopia de fluorescencia
celulas incubadas 15 min con BrUTP-fluoresceina
tinción general de DNA
CONCEPTO DE FABRICAS DE TRANSCRIPCION
2100-2500 sitios por célula
Los principales factores de transcripción están localizados en numerosos dominios pequeños a lo largo del nucleoplasma
BRG1 Oct1
TFIIH GR
E2F-1 TFIIF
Localización de factores de transcripción
Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997
Células HeLa
sitios transcrip: rojo
factor: verde
BRG1
TFIIH
Oct1
E2F1
A
B
C
D
Colocalizacion restringida de los TF con los sitios de transcripcion
Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997
RNA polimerasa II y sitios transcripción
Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997
Br-UTP rojo
RNA pol 0 (fosforilada) verde (A)
RNA pol II verde (B)
RNA pol 0 (phospho) rojo
verde TF
C: BRG1
D: Oct1
E: TFIIH
F: GR (glucocorticoid recep)
Correlacion:
++RNApol con Br-UTP
-- factores transcripcion
A
B
C
D
E
F
Comparación de focos de RNA pol II en tejidos y em MEF
100-300 focos RNA pol
4000 genes siendo transcriptos en células eritroides
E10, embryonic blood; E14, fetal liver erythroid; AS, adult anemic spleen erythroid; Sp, normal adult spleen; Th, adult thymus; Br, fetal brain; MEF: mouse embryonic fibroblasts
Transcription factories are nuclear subcompartments that remain in the absence of transcription- Mitchell & Fraser Genes Dev. 2008 22: 20-25
Figure 2. Punctate localization of RNAPII is maintained in theabsence of transcription. (A) Immunofluorescence of RNAPII in untreatedand DRB- and heat-shock-treated fetal liver nuclei (4H8 orH14 antibody; bar, 4 μm). (B) Average number of foci per opticalsection (4H8) in untreated and DRB- and heat-shock-treated nuclei(n > 45; P = 0.5828; error bars depict SEM). (C) RNAPII was detectedby Western in the saponin supernatant (SS) and pellet (SP) using theARNA-3 antibody. Coomassie staining of histones, retained in thepellet, and globin proteins, extracted by 1% saponin, shows equalloading.
Celulas fetales hepaticas
-sin tratar
- tratadas con DRB (inhibidor elongacion RNApol II)
- tratadas con golpe de calor (inhibidor iniciación)
Conclusión. la RNApol II permanece en compartimentos discretos aun en ausencia de transcripción
Inhibición transcripción genes Hbb
Inhibición por DRB
(5,6-dichlorobenzimidazole)
Chr 7 celulas eritroides de bazo anémico
Genes activos comparten sitios de transcripción
Hbb-b1 globina tipo beta
Eraf : proteina estabilizadora de alfa hemoglobina
Uros: uroporfirinogeno II sintetasa
Igf2: insulin like growth factor 2
Kcnqlot1: long QT intronic transcript
Hba: alpha globina (Chr 11)
Frecuencia de transcripción de genes: RNA FISH (sondas intrónicas)
Uros
Conclusión: Los genes activos pasan por períodos on-off y muchos genes tienen mayores periodos de quiescencia que de actividad. En este caso Hbb-b1 estaria constantemente “activo”
Genes activos comparten sitios de transcripción
Colocalización de genes transcriptos en el Chr 7
Doble RNA FISH -
Hbb-1 Hbb-1Hbb-1Hbb-1 Hbb-1Eraf HbaKcnqlot1Igf2Uros
Conclusión: varios genes activos en una región de alrededor de 40 Mb colocalizan con Hbb-1 a alta frecuencia
células eritroideas de bazo anemico
células eritroideas de bazo anemico
Genes activos comparten sitios de transcripción
Parte 1-Los genes activos se asocian con focos de RNA pol II
RNA inmunoFISH
RNA Hbb-1
RNApol II Ab
células eritroideas de bazo anemico
porcentaje de alelos con señal de transcripción por RNA FISH
´porcentaje de loci que se solapan con RNAP II por DNA FISH
DNA inmunoFISH
DNA Eraf
RNApol II Ab
Conclusión: alelos en activa transcripción están asociados con focos de RNApol II mientras que alelos temporariamente inactivos no lo están
La colocalización entre genes está relacionada con su transcripción?
Genes activos comparten sitios de transcripción
La colocalización entre genes está relacionada con su transcripción?
Parte 2- Los genes en activa transcripcion colocalizan en fábricas transcripcionales
Triple marca DNA-inmunoFISH
Hbb DNA FISH
Eraf DNA FISH
RNA pol II Ab
Triple marca RNA-inmunoFISH
Hbb RNA FISH
Eraf RNA FISH
RNA pol II Ab
Alejamiento de un gen activo de su territorio
DNA FISH
-verde territorio chr 7
- rojo: Hbb
En el caso de Eraf que solo es activo el 29% del tiempo, se encuentra fuera de su territorio el 79% de los casos.
Conclusión: Genes con potencial para ser transcriptos están ubicados preferencialmente fuera de sus territorios, pero esto solo no es sufienciente para ser transcriptos
Tecnología 3C (Capturing Chromosome Conformation)
Análisis de proximidad entre los genes determinada por 3C
Comparación de una célula eritoidea E con cerebro B
Modelo de ocupancia de genes en fabricas de transcripción en presencia y en ausencia de transcripción
Figure 1 4C technology. (a) Outline of 4C procedure. Briefly, 3C analysis is performed as usual, but thePCR step is omitted. The 3C template contains bait (for example, a restriction fragment encompassinga gene) ligated to many different fragments (representing this gene’s genomic environment). The ligatedfragments are cleaved by a frequently cutting secondary restriction enzyme and are subsequentlyreligated to form small DNA circles that are amplified by inverse PCR (30 cycles) using bait-specificprimers facing outward. (b) PCR results separated by gel electrophoresis from two independent fetalliver (L1, L2) and brain (B1, B2) samples. (c) Schematic representation of the location of themicroarray probes. Probes were designed within 100 bp of HindIII sites. Thus, each probe analyzesone possible ligation partner
Tecnologia 4C
Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by 4C- Simonis et al. Nature Genetics 38: 1348, 2006
Los patrones de bandas amplificadas por PCR son similares en distintas muestras del mismo tejido y diferentes a los de otro tejido
Interacciones de largo alcance intracromosomales del gen de beta-globina activa (celulas eritroides E14.5 ) e inactiva (cerebro E 14.5)
El patrón del conjunto de genes con los cuales interactua Hbb en células donde se expresa es completamente distintos del de células en que está inactivo
Gen beta-globina activo interactúa con zonas de genes activos y beta-globina inactiva con zonas de genes inactivo
Ejemplo de interacciones intracromosomales del gen Rad23a de expresión constitutiva en todos los tejidos
Conclusión: semejante patron de interacciones en los dos tejidos.
La interacción se da con zonas de genes activos
Interacción intercromosomal de Rad23a
Conclusión
a- las interacciones intercromosomales en distintos tejidos se conservan mayormente
b- La gran mayoria de las interacciones intercromosomales con Rad23a corresponde a genes activos en higado y en cerebro embrionarios
c-d: los valores de interacción más significativos se dan en zonas de alta densidad de genes
Similar active gene cluster in specialized transcription factories- Xu & Cook- J.Cell. Biol. 181: 615-623, 2008
Abordaje
Objetivo: estudiar si la transcripción ocurre en sitios discretos (fábricas) conteniendo la maquinaria especializada y si esos sitios se especializan en transcribir diferentes tipos de genes
Los minicromosomas replicados se concentran en unos pocos focos
A las 24 h hay unos 8000 minicrosomas, y unos 20 focos
Minicromosomas con promotores idénticos son dirigidos a las mismas fábricas mientras que distintos promotores van mayormente a diferentes fábricas
Los minicromosomas organizarán sus propias fábricas o comparten las fábricas que transcriben idénticos genes del huésped?
Cells were transfected, grown for 8 h (rows 1 – 6), and treated with or without cross-linker. Active and inactive chromatin was separated by ChIP (using an antibody against trimethyl K4 in H3) and the proximity between selected genes was assessed by 3C.
II U2 , U2G ,3 box (II U2 ) II CMV , EGFP ,pA (II CMV )
Genes similares del minicromosoma y del huésped comparten fábricas
Modelos