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Organische Nitrate und experimenteller Diabetes mellitus: Organische Nitrate und experimenteller Diabetes mellitus: Ein Vergleich zwischen Ein Vergleich zwischen
Pentaerithrityltetranitrat und IsosorbiddinitratPentaerithrityltetranitrat und IsosorbiddinitratMatthias Oelze1, Swenja Schuhmacher1, Philip Wenzel2, Christian Hochmuth1,
Sebastian Steven1, Tjebo Heeren1, Eberhard Schulz2, Dirk Stalleicken3,
Thomas Münzel2 und Andreas Daiber1
1Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik, Abteilung für Molekulare Kardiologie, Mainz2Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik und Poliklinik, Mainz3Actavis Deutschland GmbH, Langenfeld
Mit freundlicher Unterstützung von Actavis Deutschland GmbH
16. ExpertentreffenPentaerrithrityltetranitrat
Magdeburg, 17. Okt. 2009
Hintergrund I:Hintergrund I:PETN induziert keine Nitrat- und cross-ToleranzPETN induziert keine Nitrat- und cross-Toleranz
Wenzel, Oelze et al, . Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007
Hintergrund II:Hintergrund II:PETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II BehandlungPETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II Behandlung
In verschiedenen Tiermodellen der Hypertonie unterdrückt PETN im Gegensatz zu ISMN kardialen und vaskulären oxidativen Stress und normalisiert teilweise die Gefäßfunktion
PETN potenziert (tendenziell) und ISMN reduziert die HO-1 Expression
Hintergrund II:Hintergrund II:PETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II BehandlungPETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II Behandlung
Mit
och
on
dri
al R
OS
by
L-0
12 E
CL
[co
un
ts/m
in] N
AD
PH
-oxid
ase activityb
y Lu
cigen
in 5 µ
M E
CL
[co
un
ts/min
]
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
Mitochondrial ROS
NADPH-oxidase activity
*# *# *# *#
*
Heart:
Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN
0
50
100
150
200
250
300
0
50
100
150
200
250
Lucigenin [5µM] ECL
DHE staining
*# *#*
*
*
DH
E s
tain
ing
IOD
[ar
bit
rary
un
its]
Lu
cigen
in 5 µ
M E
CL
[cou
nts/m
in/m
g]
Aorta:
P < 0,05
* vs. Ctr/DMSO
# vs. AT-II + PETN
Hintergrund II:Hintergrund II:PETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II BehandlungPETN vs. ISMN bei chronischer Angiotensin-II Behandlung
0
20
40
60
80
100
-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5
Ctr/DMSO n= 41Ang-II/DMSO n= 57Ang-II+PETN n= 46Ang-II+ISMN n= 36
ACh-response
% r
ela
xa
tio
n
Log M (ACh)
0
20
40
60
80
100
-9 -8 -7 -6 -5
Ctr/DMSO n= 43Ang-II/DMSO n= 53
Ang-II+PETN n= 50Ang-II+ISMN n= 34
GTN-response
% r
ela
xa
tio
n
Log M (GTN)
% r
ela
xa
tio
n
HO-1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Ctr/DMSO AT-II/DMSO AT-II+PETN AT-II+ISMN
HO-1
0
50
100
150
200
250
300
Ctr/DMSO
Ang-II/DMSO
Ang-II+PETN
Ang-II+ISMN
% o
f C
tr/D
MS
O
Ctr AT-II AT-I AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN
**
*#
-Actinin -
HO-1 -
HO-1 ProteinHO-1 mRNA
Ctr AT-II AT-II AT-IIDMSO DMSO +PETN +ISMN
mR
NA
Exp
ress
ion
(Fol
d ch
ange
)
**
#+
P<0.05: * vs. Ctr/DMSO; # vs. AT-II+PETN
Hintergrund III:Hintergrund III:STZ induzierter STZ induzierter Diabetes mellitusDiabetes mellitus Typ 1 im Rattenmodel Typ 1 im Rattenmodel
Deutlich reduzierte Gewichtszunahme
Stark erhöhte Blutzuckerspiegel
Gefäßdysfunktion
Anstieg der NADPH-Oxidase Aktivität
Vaskulärer und kardialer oxidativer Stress
Hintergrund III:Hintergrund III:STZ induzierter STZ induzierter Diabetes mellitusDiabetes mellitus Typ 1 im Rattenmodel Typ 1 im Rattenmodel
entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., Free Radic Biol MedFree Radic Biol Med 20082008
Blood glucose level Weigh gain
0
20
40
60
80
100
-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5
Ctr, n=18
STZ, n=28
ACh-response
% r
elax
atio
n
Log M (ACh)
0
20
40
60
80
100
-9 -8 -7 -6 -5
Ctr, n=18
STZ, n=27
NTG-response
% r
elax
atio
n
Log M (NTG)
ACh response GTN response
Log M (ACh) Log M (GTN)
Hintergrund III:Hintergrund III:STZ induzierter STZ induzierter Diabetes mellitusDiabetes mellitus Typ 1 im Rattenmodel Typ 1 im Rattenmodel
IOD
(ar
bit
rary
un
its)
Vascular O2-. Prod.
DHE staining
Ctr STZ
Lu
cig
enin
[5
µM
] C
LC
ou
nts
/mg
/min
Cardiac NADPH oxidase activity
Ctr STZ
Cardiac mitochondriaROS detection
L-0
12 [
100
µM
] C
LC
ou
nts
/mg
/min
Ctr STZ
entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., entnommen aus: Wenzel, Schulz et al., Free Radic Biol MedFree Radic Biol Med 20082008
FragestellungFragestellung
I. Zeigt eine Therapie mit PETN positive
Effekte in einem Tiermodel eines
Streptozotozin (STZ) induzierten
Diabetes mellitus Typ 1
II. Welche Effekte zeigen sich im
Vergleich dazu bei einer Therapie mit
Isosorbiddinitrat (ISDN)
TiermodelTiermodel
Männliche Wistar Ratten (230-250 g)
Diabetes Induktion über eine einmalige i.v. Injektion
(STZ: 60 mg/kg) 8 Wochen vor Versuchsbeginn
Behandlung mit PETN (15 mg/kg/d) oder ISDN (10
mg/kg/d) über Futterbeimischung 7 Tage nach STZ-
Injektion für 7 Wochen
TiermodelTiermodel
Männliche Wistar Ratten (230-250 g)
Diabetes Induktion über eine einmalige i.v. Injektion
(STZ: 60 mg/kg) 8 Wochen vor Versuchsbeginn
Behandlung mit PETN (15 mg/kg/d) oder ISDN (10
mg/kg/d) über Futterbeimischung 7 Tage nach STZ-
Injektion für 7 Wochen
Behandlung mit ISMN (75 mg/kg/d) über Trinkwasser
7 Tage nach STZ-Injektion für 7 Wochen
TiermodelTiermodel
Männliche Wistar Ratten (230-250 g)
Diabetes Induktion über eine einmalige i.v. Injektion
(STZ: 60 mg/kg) 8 Wochen vor Versuchsbeginn
Behandlung mit PETN (15 mg/kg/d) oder ISDN (10
mg/kg/d) über Futterbeimischung 7 Tage nach STZ-
Injektion für 7 Wochen
Behandlung mit ISMN (75 mg/kg/d) über Trinkwasser
7 Tage nach STZ-Injektion für 7 Wochen
Insulin (2,5 U/d) über subcutane osmotische
Minipumpen für 14 Tage (Woche 7 u. 8)
Ergebnisse I: STZ+Insulin Ergebnisse I: STZ+Insulin Gewicht und BlutzuckerGewicht und Blutzucker
weight gain
0
50
100
150
200
250
Ctr STZ +Insulin
[g]
Ctr STZ +Ins
*#
*
weigh gain BZ
0
200
400
600
800
1000
Ctr STZ +Insulin
[mg
/dl]
Ctr STZ +Ins
#
*
blood glucose
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ
Ergebnisse I: STZ+Insulin Ergebnisse I: STZ+Insulin AortaAorta
0
20
40
60
80
100
-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5
Ctr n= 40STZ n= 39
STZ+Insulin n= 38
ACh-response
% r
elax
atio
n
Log M (ACh)
0
20
40
60
80
100
-9 -8 -7 -6 -5
Ctr n= 43
STZ n= 40
STZ+Insulin n= 32
GTN-response
% r
ela
xa
tio
nLog M (GTN)
0
20
40
60
80
100
-10 -9 -8 -7 -6 -5
Ctr n= 36
STZ n= 33
STZ+Insulin n= 26
DEANONOate-response
% r
ela
xa
tio
n
Log M (DEANONOate)
% r
elax
atio
n ACh-response GTN-response DEANO-response
Log M (ACh) Log M (GTN) Log M (DEANO)
Ctr STZ +Ins
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ
020406080
100120
Ctr STZ +Ins
arbi
trary
uni
ts[IO
D]
*
#
Ctr STZ +Ins
DHE staining of rat aortic rings
arb
itra
ry u
nits
[IO
D]
Ergebnisse I: STZ+InsulinErgebnisse I: STZ+Insulin Herz und BlutserumHerz und Blutserum
0
2000
4000
6000
8000
[co
un
ts/3
0s]
NADPH-oxidase activityby Lucigenin 5 µM ECL in heart
Ctr STZ +Ins
*#
-0,03
-0,025
-0,02
-0,015
-0,01
-0,005
0
Decre
ase in
DP
P R
ad
ical [5
17 n
m]
*
*#
Ctr STZ +Ins
Reduction of DPP-radicalîn blood serum
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
[co
un
ts/3
0s]
Mitochondrial ROSby L-012 ECL in heart
*#
Ctr STZ +Ins
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ
Ergebnisse I: STZ+InsulinErgebnisse I: STZ+Insulin Proteine Proteinexpression in Aorta (WB)xpression in Aorta (WB)
0
50
100
150
200
Ctr STZ +Insulin
% o
f C
tr
Nox1
Ctr STZ +Ins-Act.
Nox1
*
#
Nox2
0
50
100
150
200
250
Ctr STZ +Insulin
% o
f C
tr
Nox2
Ctr STZ +Ins-Act.
*
#
0
50
100
150
200
250
Ctr STZ +Insulin
% o
f C
tr
eNOS
Ctr STZ +Ins
-Act.
eNOS
*#
0
50
100
150
Ctr STZ +Insulin
% o
f C
trGCH-1
Ctr STZ +Ins-Act.
GCH-1
*#
0
50
100
150
200
Ctr STZ +Insulin
% o
f C
tr
DHFR
Ctr STZ +Ins-Act.
DHFR
*
#
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ
Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate Gewichtsveränderungen und BlutzuckerGewichtsveränderungen und Blutzucker
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ
weight gain
0
50
100
150
200
250
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
[g]
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
**
* *
weigh gain BZ
0
200
400
600
800
1000
1200
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
[mg
/dl]
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
*
*#
**
blood glucose
Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate HerzHerz
NADPH-oxidase activity by Lucigenen 5 µM ECL
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000[c
ou
nts
/30
s]
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
**+^
# *+
Mitochondrial ROS by L-012 ECL
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
[co
un
ts/3
0s
]
n.d.
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
#*
*
n.d.
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
NADPH-oxidase activity by 2-HE HPLC
0
20
40
60
80
100
120
140
160
De
cre
as
e in
DP
P R
ad
ica
l[5
17
nm
]
n.d.
#
**+
n.d.
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ; + vs. STZ+PETN; ^ vs. STZ+ISDN
Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate BlutserumBlutserum
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ; + vs. STZ+PETN
Reduction of DPP radical in serum
-0,030
-0,025
-0,020
-0,015
-0,010
-0,005
0,000
De
cre
as
e i
n D
PP
Ra
dic
al
[51
7 n
m]
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
*+*
*
*#
Xanthine oxidase activity in serum- cytochrome c reduction at 550 nm
0,00
0,01
0,01
0,02
0,02
0,03
n.d.
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
#
n.d.
*
#
[µM
Sup
erox
id/3
0s]
Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate AortaAorta
*
0
20
40
60
80
100
120
arb
itra
ry u
nit
s [
IOD
]
*+
*#
*
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
ROS production: DHE staining of aortic cryosections
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ; + vs. STZ+PETN; ^ vs. STZ+ISDN
0
20
40
60
80
100
-9 -8,5 -8 -7,5 -7 -6,5 -6 -5,5
Ctr n= 57
STZ n= 60
STZ+PETN n= 38
STZ+ISDN n= 50
STZ+ISMN n= 12
ACh-response
% r
ela
xa
tio
n
Log M (ACh)
0
20
40
60
80
100
-9 -8 -7 -6 -5
Ctr n= 77
STZ n= 74
STZ+PETN n= 47STZ+ISDN n= 59
STZ+ISMN n= 10
GTN-response
% r
ela
xa
tio
n
Log M (GTN)
0
20
40
60
80
100
-10 -9 -8 -7 -6 -5
Ctr n= 66
STZ n= 72
STZ+PETN n= 41STZ+ISDN n= 56
STZ+ISMN n= 12
DEANO-response
% r
ela
xa
tio
n
Log M (DEANO)Log M (ACh) Log M (GTN) Log M (DEANO)
Ergebnisse II: STZ + NitrateErgebnisse II: STZ + Nitrate Proteinexpression in Aorta (WB)Proteinexpression in Aorta (WB)
P<0.05: * vs. Ctr; # vs. STZ; + vs. STZ+PETN; ^ vs. STZ+ISDN
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
eNOS
0
100
200
300
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
% o
f C
tr * ***+
eNOS –-Actin -
GCH-1
0
50
100
150
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
% o
f C
tr
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
*
# #
-Actin -GCH-1 -
DHFR
0
50
100
150
200
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
% o
f C
tr
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
* *#+^
*
-Actin -DHFR -
Nox1
0
50
100
150
200
250
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
% o
f C
tr
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
* **
*
Nox1 –-Actin -
Nox2
050
100150200250300
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
% o
f C
tr
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
* *+*
*#
Nox2 –-Actin -
HO-1
0
100
200
300
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
% o
f C
tr
Ctr STZ +PETN +ISDN +ISMN
* **+
*
-Actin -HO-1 -
ZusammenfassungZusammenfassung
Eine Behandlung mit PETN zeigt im Tiermodell des Diabetes mellitus Typ 1 in der Mehrzahl der gemessenen Parameter positive Effekte auf die Funktion des karidio-vaskulären Systems
Gegenüber einer ISDN-Co-Behandlung sind die antioxidativen Effekte von PETN deutlich ausgeprägter
Für die vaskuläre Funktion konnte für beide Nitrate eine analog positive Wirkung beobachtet werden
In Übereinstimmung mit vorangegangenen Studien zeigte eine Behandlung mit dem Mononitrat ISMN keine protektiven Effekte
Die Verabreichung von Insulin normalisierte alle gemessenen Parameter und identifiziert die kardio-vaskulären Beeinträchtigungen als Folge eines Diabetes mellitus
Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit
Direktor II Med. Klinik:Thomas Münzel2, Prof. Dr. med.
Leiter der Arbeitsgruppe Molekulare Kardiologie: Andreas Daiber1, Prof. Dr. rer. nat. et med. habil.
Wissenschaftler:Swenja Schuhmacher1, Dipl. Biologin
Philip Wenzel2, Dr. med.
Eberhard Schulz2, Dr. med.
Doktoranden:Christian Hochmuth1, Sebastian Steven1, Tjebo Heeren1
1Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik, Abteilung für Molekulare Kardiologie, Mainz2Universitätsklinikum Mainz, II. Med. Klinik und Poliklinik, Mainz