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Identifizierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL
(mTRAIL-R)
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Anne Große-Wilde
aus Aachen
Würzburg 2001
Eingereicht am: ___________________
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Prof. Dr. R. Hedrich
Gutachter: Prof. Dr. P.H. Krammer
Gutachter: Prof. Dr. G. Pflugfelder
Tag des Promotionskolloquiums: ___________________
Doktorurkunde ausgehändigt am: ___________________
i
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................................. i
Zusammenfassung / Summary........................................................................................................ iv
Danksagung..................................................................................................................................... vi
I Einleitung............................................................................................................................... 1
1 Mechanismen des Zelltods ..................................................................................................... 1 1.1 Die Apoptose und die Nekrose ........................................................................................ 1 1.2 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Apoptose................................ 2
2 Signaltransduktionsmechanismen der Apoptose.................................................................... 4 2.1 Initiierung der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose...................................................... 4 2.2 Caspasen .......................................................................................................................... 8 2.3 Der mitochondriale Apoptoseweg ................................................................................... 9
3 Die physiologische Rolle der Todesrezeptor-Systeme......................................................... 10 3.1 Das TNF-System............................................................................................................ 12 3.2 Das CD95-System.......................................................................................................... 13
4 Das TRAIL/TRAIL-Rezeptor-System ................................................................................. 14 4.1 Die TRAIL-Rezeptoren ................................................................................................. 14 4.2 Strukturanalyse der TRAIL/TRAIL-R-Komplexe......................................................... 15 4.3 Die Signaltransduktion bei TRAIL-induzierter Apoptose............................................. 16 4.4 Was ist die physiologische Rolle des TRAIL-Systems?................................................ 17 4.5 Evidenzen für die Funktion von TRAIL als Tumorsuppressor ..................................... 18
5 Ziel der Arbeit ...................................................................................................................... 20
ii
II Material und Methoden....................................................................................................... 21
1 Material................................................................................................................................. 21 1.1 Biologisches Material .................................................................................................... 21 1.2 Chemikalien ................................................................................................................... 23 1.3 Molekularbiologische und proteinbiochemische Materialien........................................ 23 1.4 Puffer, Lösungen und Medien........................................................................................ 27 1.5 Verbrauchsmaterial ........................................................................................................ 31 1.6 Computerprogramme ..................................................................................................... 32 1.7 Firmen ............................................................................................................................ 33
2 Methoden.............................................................................................................................. 34 2.1 Molekularbiologische Methoden ................................................................................... 34 2.2 Proteinbiochemische Methoden..................................................................................... 43 2.3 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen............................................................................. 49 2.4 Blastozysteninjektion von ES-Zellen............................................................................. 55 2.5 Immunbiologische Methoden ........................................................................................ 56
III Ergebnisse............................................................................................................................ 59
1 Klonierung eines murinen Homologs der humanen TRAIL-Todesrezeptoren .................... 59 1.1 Biochemische Charakterisierung von TRAIL-bindenden Oberflächenproteinen.......... 59 1.2 Die Sequenz des murinen TRAIL-Rezeptors mTRAIL-R............................................. 66
2 Funktionelle Analyse von mTRAIL-R................................................................................. 69 2.1 mTRAIL-R besitzt eine funktionelle Todesdomäne...................................................... 69 2.2 mTRAIL-R ist ein funktioneller TRAIL-Rezeptor........................................................ 71
3 Biochemische Charakterisierung von mTRAIL-R............................................................... 72 3.1 Identifizierung von mTRAIL-R als p54 ........................................................................ 72 3.2 Biochemische Untersuchungen zur Orthologie von p54_mTRAIL-R .......................... 73
4 Expressionsanalyse von p54_mTRAIL-R............................................................................ 75
5 Konditionale Inaktivierung des für mTRAIL-R kodierenden Gens tar ............................... 76 5.1 Klonierung und Charakterisierung von tar .................................................................... 77 5.2 Herstellung des Targeting-Vektors ................................................................................ 78 5.3 Erzeugung und Charakterisierung homolog rekombinierter ES-Zell-Klone ................. 84 5.4 Generieren der konditionalen und konstitutiven mTRAIL-R-defizienten ES-Zellen.... 85 5.5 Blastozysteninjektion und Mauszucht ........................................................................... 87
iii
IV Diskussion............................................................................................................................ 90
1 Identifizierung eines TRAIL-Todesrezeptors in der Maus .................................................. 90 1.1 Biochemische Charakterisierung muriner TRAIL-Rezeptoren ..................................... 90 1.2 Funktionelle Analyse und Expressionsanalyse von p54_mTRAIL-R ........................... 93 1.3 Untersuchung der Orthologie von p54_mTRAIL-R...................................................... 96
2 Generieren von konditionalen TRAIL-R defizienten Mäusen ............................................. 98 2.1 Möglichkeiten zur Erforschung der in vivo-Funktion von TRAIL und seiner
Rezeptoren ..................................................................................................................... 98 2.2 Die Knockoutstrategie ................................................................................................... 99 2.3 Das Cre/loxP-System..................................................................................................... 99
3 Ausblick- was ist die physiologische Rolle des TRAIL-Systems? .................................... 100 3.1 Potentielle Funktionen des TRAIL-Systems ............................................................... 101 3.2 Untersuchungen zur Rolle von mTRAIL-R als Tumorsuppressor .............................. 102 3.3 Untersuchungen zur Rolle von TRAIL bei der Virusabwehr ...................................... 105
V Literaturverzeichnis........................................................................................................... 106
VI Abkürzungen...................................................................................................................... 119
VII Lebenslauf.......................................................................................................................... 122
iv
Zusammenfassung
TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein
Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei
humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-
Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von
Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In
präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische
Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an
dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von
TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt.
Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-
Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der
beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden.
Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen
identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner
TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts
p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von
p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den
humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R
ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie
die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von
p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches
p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und
in vitro verwendet werden kann.
Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten
mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R
kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die
Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu
vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale
p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt.
Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc
Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für
die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und
dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.
v
Summary
TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an
apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently
two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor
superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to
induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In
addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL
does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable
interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological
function of TRAIL.
In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to
establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine
homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified.
Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-
gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public
database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its
molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and
functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both
human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of
inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the
human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all
tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used
to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo.
To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient
mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was
cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the
Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R
deficient mice.
The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional
p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of
the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy.
vi
Danksagung
Dr. Henning Walczak danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, Bereitstellung dieses Themas und seine Unterstützung.
Prof. Dr. Peter H. Krammer danke ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die Betreuung dieser Arbeit.
Priv. Doz. Dr. Gert Pflugfelder danke ich für die Bereitschaft, diese Arbeit als Gutachter zu betreuen.
Dr. Erich Greiner danke ich für die stets gewährte Hilfsbereitschaft in allen Fragen der Molekularbiologie und der Betreuung, Planung und Klonierung des Targeting-Vektors.
Danke vor allen Dingen allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern des „WEST“-Labs (Dr. Henning Walczak, Dr. Markus Weigand, Axel Bouchon, Eva Rieser, Heiko Stahl, Dr. Tom Ganten, Martin Sprick, Silke Maier, Michaela Rapp, Daniela Willen, Carl Leonard, Manuela Schader, Alan Punnoose und meinen Azubis Christine Schlösser, Markus (Malex) Stauch, Kerstin Sels, Kai Doberstein und Claudia Rappl) für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre, die die Arbeit oft bis spät in die Nacht und auch die Zeit außerhalb des Labors sehr angenehm gemacht hat.
Danke den ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der Abteilung Krammer, insbesondere Dr. Sabine Kirchhoff, Dr. Ana Martin-Villalba, Elena Ritsou, Dr. Ingo Schmitz, Dr. Carsten Scaffidi, Dr. Kerstin Herzer, Dr. Susanne Müerköster, Frederick Igney und Sven Baumann für ihre stete Diskussions- und Kooperationsbereitschaft.
Prof. Dr. Günther Schütz danke ich für die Möglichkeit, in enger Kooperation mit seinen Mitarbeitern die Knockoutmäuse herzustellen und zu züchten. Insbesondere danke ich den Mitarbeitern der Abteilung Schütz, vor allem Dr. Erich Greiner. Tim Wintermantel danke ich für seine stete Hilfs- und Diskussionsbereitschaft in allen Fragen rund um die Maus, Heidrun Kern und Sandra Fehsenfeld für die große Hilfe bei der ES-Zellkultur, Annette Kleve-Nebenius und Frank van der Hofen für die Blastozysteninjektionen.
Dr. Johannes Coy (Abteilung Poustka, DKFZ) danke ich für seine Hilfe und Kooperation bei den Screens der cDNA- und genomischen Phagenbibliotheken. Dr. Antoaneta Mincheva und Prof. Dr. Peter Lichter (DKFZ) danke ich für die Kooperation zur chromosomalen Lokalisierung von tar mittels FISH-Analyse, Dr. Stefan Wolf (Abteilung Lichter, DKFZ) danke ich für die Hilfe bei den RACE-PCRs. Dr. Andrej Shevchenko und Anna Shevchenko (EMBL, Heidelberg) danke ich für die Kooperation bei der massenspektrometrischen Analyse der TRAIL-bindenden Proteine. Urs Rohrer-Hoffmann (Abteilung Grummt, DKFZ) danke ich für seine Hilfsbereitschaft zu Fragen der Molekularbiologie.
Ich möchte Silke, Tom, Bernd, Urs, Erich, Tim, Daniela, Kerstin, Esat, Ana, Martin, Markus, Carl und Manu für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken.
Schließlich danke ich meinen Eltern für ihre permanente Unterstützung- ihnen möchte ich diese Arbeit widmen.
I Einleitung 1
I Einleitung
1 Mechanismen des Zelltods
1.1 Die Apoptose und die Nekrose
Der Tod aller eukaryontischer Zellen kann zwei unterschiedlichen Mechanismen zugeordnet
werden, der Apoptose oder der Nekrose. Diese beiden Mechanismen können nach
morphologischen und biochemischen Gesichtspunkten voneinander unterschieden werden
(Kerr et al., 1972; Wyllie et al., 1980). Die Apoptose kann durch eine Reihe intra- und
extrazellulärer physiologischer Stimuli induziert werden. Diese umfassen die Aktivierung
sogenannter „Todesrezeptoren“, die zur Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Superfamilie
(TNFR-SF) gehören, UV- und Gammastrahlung, Chemotherapeutika, Entzug von
Wachstumsfaktoren und Überexpression bestimmter Tumorsuppressorgene (Krammer, 1999).
Dagegen erfolgt Nekrose häufig nach irreversiblen Zellschädigungen, wie Einwirkung von
Toxinen oder Verletzungen.
Typische Merkmale der Apoptose sind u.a. Chromatinkondensation und internukleosomäre
Degradation der DNA, die in der charakteristischen „DNA-Leiter“ durch Einwirken spezieller
Endonukleasen resultiert (Wyllie et al., 1980). Desweiteren werden in apoptotischen Zellen
Veränderungen an der Plasmamembran festgestellt. So führt ein Verlust der
Membranstabilität zu blasenförmigen Ausstülpungen der Zelle (Zeiose), was schließlich im
Abschnüren sogenannter „apoptotischer Körperchen“ und in einer Verringerung des
Zellvolumens resultiert (Kerr et al., 1974). Parallel dazu wird ein Verlust der
Membranasymmetrie beobachtet, was zur Exposition von Phosphatidylserin an der
Zelloberfläche führt. Dieses Lipid kann durch Nachbarzellen oder Makrophagen erkannt
werden, die dann diese apoptotischen Zellen aufnehmen und abbauen (Duvall et al., 1985;
Fadok et al., 1992; Savill et al., 1990). Durch diesen Mechanismus kommt es bei der
Apoptose nicht zur Freisetzung von Bestandteilen des Zytoplasmas. Die Apoptose wird daher
nicht von Entzündungsreaktionen begleitet.
Bei der Nekrose dagegen wird durch Oncose, einem Anschwellen der Zelle, die
Plasmamembran zerstört und schließlich das Zytosol samt Zellorganellen freigesetzt. Dies
führt zu einer inflammatorischen Reaktion, die weitere Gewebsschädigungen zur Folge hat
(Trump et al., 1997).
I Einleitung 2
1.2 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Apoptose
Wachstum und Teilung von Einzellern wird lediglich durch das Nährstoffangebot limitiert. Im
Gegensatz dazu ist das Wachstum von Zellen eines Vielzellers durch komplexe Mechanismen
reguliert, die sich entwickelt haben, um die optimale Größe, Funktion und das
Zusammenspiel von diversen Organen zu gewährleisten. Die Möglichkeit zur Apoptose, dem
Programm des „geregelten Selbstmords“, trägt daher jede Zelle eines Vielzellers zum Wohl
des Gesamtorganismus in sich. Jedoch können somatische Zellen durch Mutationen die
Fähigkeit zur Apoptose verlieren. Solche entarteten Zellen kehren zu einem weitestgehend
Nährstoff-begrenzten Wachstum zurück. Daraus kann, wenn die mutationsbedingte Entartung
durch das Immunsystem nicht erkannt wird, ein Tumor entstehen.
Die Apoptose ist für die Entwicklung und Funktion eines Organismus so wichtig wie
Zellteilung, Zellwanderung und Differenzierung. So ist die Apoptose als „programmierter
Zelltod“ ein essentieller biologischer Vorgang für die Eliminierung von gealterten und
schädlichen Zellen wie z.B. mutierten und virusinfizierten Zellen sowie autoreaktiven
Lymphozyten. Die fundamentale Bedeutung der Apoptose wird durch den hohen Grad an
Konservierung der an der Apoptose beteiligten Proteine während der Evolution unterstrichen.
So besitzen bereits Protostomier wie der Nematode C. elegans und die Fruchtfliege
D. melanogaster Elemente der apoptotischen Maschinerie von Vertebraten.
Im Immunsystem ist die Apoptose besonders gut charakterisiert. Das Immunsystem stellt eine
Gemeinschaft von interagierenden Zellen dar, bestehend u.a. aus T- und B-Lymphozyten,
natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), Makrophagen und dendritischen Zellen. Es zeichnet
sich durch zwei zentrale, durch Apoptose regulierte Eigenschaften aus: Spezifität und
Homöostase (Krammer, 2000). So erlaubt die Spezifität des enormen Repertoires aus T-
Zellrezeptoren und Antikörpern der B-Zellen einerseits die Erkennung einer Vielzahl von
Antigenen. Andererseits besteht die Gefahr der Autoimmunität (Sebzda et al., 1999). Um die
Homöostase im Immunsystem zu gewährleisten, muss während einer Immunantwort nach der
klonalen Expansion die Zahl der antigenspezifischen Lymphozyten durch Apoptose wieder
reduziert werden (Berzins et al., 1999).
Das im Thymus ausgebildete T-Zell-Repertoire ist das Resultat des konzentrierten
Zusammenspiels von Apoptose und Überlebenssignalen. Zelluläre Marker für die T-Zell-
Entwicklung sind neben dem T-Zell-Rezeptor (TCR) die Korezeptoren CD4 und CD8. Naive
doppelt negative (CD4-/CD8-) Thymozyten wandern vom Knochenmark in den Thymus. Dort
reifen sie zu doppelt positiven (CD4+/CD8+) Thymozyten heran und durchlaufen dann eine
I Einleitung 3
„positive“ und „negative Selektion“. Nur den Thymozyten, die einen T-Zell-Rezeptor
exprimieren und der von körpereigenen MHC-Molekülen (Major Histocompatibility
Complex) präsentierte Antigene erkennen kann, wird in der positiven Selektion durch
Hochregulation antiapoptotischer Gene das Überleben ermöglicht. Ist jedoch die Affinität des
TCRs zu einem körpereigenen, MHC-gebundenen Antigen zu hoch, werden die
entsprechenden Zellen in der negativen Selektion durch Apoptose eliminiert. Dies sichert
Toleranz gegenüber körpereigenen Proteinen und verhindert Autoimmunität (Nossal, 1994).
Anschließend reifen die Thymozyten noch im Thymus zu CD4+-T-Helfer-Zellen oder CD8+-
Killer-T-Zellen heran. Nur mit funktionellem TCR ist es den Thymozyten möglich, den
Thymus zu verlassen und die sekundären lymphoiden Organe zu besiedeln (Sebzda et al.,
1999).
Zu wenig oder zu viel Apoptose ist die Ursache einer Vielzahl schwerer Erkrankungen
(Krammer, 2000). Neben Krankheiten wie Krebs und Autoimmunität, bei denen zu wenig
Apoptose stattfindet, gibt es auch Krankheiten, bei denen ein Übermaß an Apoptose eine
pathologische Situation herbeiführt. Dies ist z.B. bei AIDS und neurodegenerativen
Erkrankungen der Fall.
AIDS ist charakterisiert durch eine Depletion von CD4+-T-Helferzellen, obwohl die Zahl der
tatsächlich infizierten CD4+-T-Zellen sehr gering ist. Durch regulatorische virale
Genprodukte (wie HIV-Tat) können nichtinfizierte T-Zellen für Apoptose sensitiviert werden.
Diese kann z.B. ausgelöst werden durch Todesliganden wie CD95L oder TRAIL (Debatin et
al., 1994; Jeremias et al., 1998; Katsikis et al., 1997; Katsikis et al., 1995; McCloskey et al.,
1995; Westendorp et al., 1995) oder durch Bindung von HIV-gp120 an CD4 (Berndt et al.,
1998).
Massive Apoptose von Neuronen ist für die Entwicklung des Gehirns sehr wichtig. Dies
wurde u.a. durch das Studium von Mäusen verdeutlicht, die gendefizient sind für Caspasen,
welche für die Exekution der Apoptose wichtig sind (Tab. I.2). Übermäßige pathologische
Apoptose kann jedoch zu einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen führen. Bei
Krankheiten wie Morbus Alzheimer, Parkinson und Chorea Huntington begehen spezifische
Neuronen aufgrund einer Toxizität von anomalen Proteinstrukturen oder Proteinaggregaten
Apoptose. Dies resultiert z.B. in irreversiblem Gedächtnisverlust, unkontrollierten muskulären
Bewegungen und Depressionen. Nach neuronalen Verletzungen wie z.B. bei Ischämie kann
man ebenfalls eine gesteigerte Apoptose beobachten (Linnik et al., 1993; Martin-Villalba et
al., 2001; Yuan und Yankner, 2000).
I Einleitung 4
2 Signaltransduktionsmechanismen der Apoptose
2.1 Initiierung der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose
2.1.1 Todesrezeptoren und ihre Liganden
Mit der Entdeckung von CD95 (APO-1/Fas) war es zum ersten Mal gelungen, ein
Oberflächenmolekül zu identifizieren, das in der Lage ist, nach Kreuzvernetzung direkt
Apoptose in der betreffenden Zelle auszulösen (Itoh et al., 1991; Oehm et al., 1992; Trauth et
al., 1989; Yonehara et al., 1989). CD95 ist ein glykosyliertes Typ I-Transmembranprotein
und gehört zur Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor Superfamilie (TNFR-SF, siehe Abb. I.1 und
Tab. I.1) (Baker und Reddy, 1996; Idriss und Naismith, 2000; Smith et al., 1994).
TNFαLTβLTα
CD95L
RANK
OPG
OPGLRANKL
TRANCE
TRAIL-R3DcR1LIT
TRID
TRAIL-R4DcR2
TRUNDDTRAIL-R1
DR4APO-2
TRAIL-R2DR5
KILLERTRICK2
TRAILAPO-2L
APO-1Fas
CD95
TRAMPAPO-3
WslDR-3LARD
TNF-R1
TNF-R2
?
DR6
?LTα
LTβ-RTNFRRP
Abb. I.1 Die Todesrezeptor-Liganden-Systeme Gezeigt ist der für die Apoptoseauslösung relevante Ausschnitt aus TNF- und TNFR-SF. Neben den Todesrezeptoren und –liganden sind weitere, mit diesen interagierende Familienmitglieder gezeigt, die selbst keine Apoptose auslösen können. Die Untergruppe der Todesrezeptoren und ihrer respektiven Liganden ist rot umrandet, die Todesdomäne wird durch ein rotes Rechteck, die cysteinreichen Domänen durch gelbe Rauten markiert.
I Einleitung 5
Rezeptor
TNFR-SF
Alternative
Bezeich-nung
Referenz Ligand
TNF-SF
Alternative Bezeich-nung
Referenz
CD95 Fas APO-1
Itoh et al., 1991 Oehm et al., 1992
CD95L FasL Apo-1L
Suda et al., 1993
TNF-R1 CD120a Loetscher et al., 1990 Schall et al., 1990 Smith et al., 1990
TNFα LTα
Wang et al., 1985
TNF-R2 CD120b Dembic et al., 1990 LTα TNFα
TNFβ Gray et al., 1984
EDAR Headon und Overbeek, 1999
EDA EDA1 Yan et al., 2000
TRAIL-R1 DR4
Pan et al., 1997
TRAIL APO2L Wiley et al., 1995 Pitti et al., 1996
TRAIL-R2 DR5 TRICK2 KILLER
Walczak et al., 1997 MacFarlane et al., 1997 Pan et al., 1997 Screaton et al., 1997 Sheridan et al., 1997 Wu et al., 2000
TRAIL
TRAIL-R3 DcR1 TRID LIT
Degli-Esposti et al., 1997 Pan et al., 1997 Sheridan et al., 1997 MacFarlane et al., 1997
TRAIL
TRAIL-R4 DcR2 TRUNDD
Degli-Esposti et al., 1997 Marsters et al., 1997 Pan et al., 1998
TRAIL
OPG OCIF, TR1 Simonet et al., 1997 Emery et al., 1998
RANKL TRAIL
OPGL TRANCE ODF
Anderson et al., 1997 ; Lacey et al., 1998 ; Takahashi et al., 1999 Emery et al., 1998
RANK TRANCE-R Wong et al., 1997 Anderson et al., 1997
RANKL OPGL TRANCE ODF
Anderson et al., 1997 ; Lacey et al., 1998 ; Takahashi et al., 1999
DR6 TR7 Pan et al., 1998 nicht bekannt
TRAMP DR3 WSL-1 Apo-3 LARD
Chinnaiyan et al., 1996 Bodmer et al., 1997 Kitson et al., 1996 Marsters et al., 1996 Screaton et al., 1997
nicht bekannt
Tabelle I.1 Die Interaktionen zwischen der TNF-Todesrezeptor-Familie und ihren respektiven Liganden der TNF-Familie.
Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch die Anwesenheit von zwei bis sechs
cysteinreichen extrazellulären Subdomänen (cystein rich domain, CRD) aus, die vom N-
Terminus her durchnummeriert werden. Diese etwa 40 Aminosäuren langen Subdomänen
enthalten typischerweise drei Intraketten-Disulfide, die durch sechs hochkonservierte
Cysteine ausgebildet werden. Mittels dieses Gerüsts von Disulfidbrücken erlangen die
Rezeptoren eine gestreckte Form.
I Einleitung 6
Die biologischen Effekte, die durch Rezeptoren dieser Familie vermittelt werden, umfassen so
vielfältige Ereignisse wie Differenzierung, Proliferation, Aktivierung und Apoptose. Die
meisten TNFR-SF-Proteine werden im Immunsystem exprimiert, wo ihre Fähigkeit zu
schneller und effizienter Signalübermittlung entscheidend für die Koordination der
Proliferation und den Schutz durch pathogenreaktive Zellen ist (Locksley et al., 2001; Smith
et al., 1994).
Aufgrund der Fähigkeit Apoptose auszulösen, werden die TNFR-Familienmitglieder CD95,
TNF-R1, TRAMP, TRAIL-R1, TRAIL-R2 und DR6 zur Untergruppe der „Todesrezeptoren“
zusammengefasst (Peter et al., 1999). Diese zeichnen sich durch eine ca. 80 Aminosäuren
lange, zwischen diesen sechs Rezeptoren stark homologe Domäne im intrazellulären Bereich
aus, die als Todesdomäne (death domain, DD) bezeichnet wird. Die DD ist essentiell für die
Apoptoseinduktion (Itoh und Nagata, 1993; Tartaglia et al., 1993).
Die Aktivierung der Todesrezeptoren wird durch die Bindung spezifischer Liganden
induziert. Ähnlich wie die Rezeptoren bilden auch die Liganden eine Proteinfamilie, die
TNF-Superfamilie (TNF-SF) genannt wird. Einige der TNF-SF-Mitglieder sind in Abbildung
I.1 zusammen mit ihren respektiven Rezeptoren dargestellt. Mitglieder dieser Familie wie
CD95L und TRAIL sind Typ II Transmembranproteine und werden sowohl
membrangebunden als auch in löslicher Form gefunden (Kayagaki et al., 1995; Mariani et al.,
1995; Tanaka et al., 1995). Die Interaktionen zwischen den Mitgliedern der TNFR-SF und
den Liganden der TNF-SF überschneiden sich teilweise und bilden ein regelrechtes Netzwerk
(siehe Abb. I.1). So kann z.B. der Ligand TRAIL an fünf verschiedene Rezeptoren binden.
Der lösliche Rezeptor OPG (Osteoprotegerin), einer dieser TRAIL-Rezeptoren, kann zudem
mit OPGL/RANKL interagieren, welcher wiederum auch an RANK bindet. Ebenso besitzt
z.B. TNF-R1 mit TNFα, dem LTα-Homomer und dem LTα/β-Komplex mehrere Liganden.
Zusätzlich kann ein LTα/β-Heteromer sowohl an TNF-R1, TNF-R2 als auch an LTβ-R
binden.
2.2.2 Die Struktur der Rezeptor-Liganden-Komplexe
Erste Hinweise auf den Ursprung des von den Todesrezeptoren ausgehenden Signals brachten
Untersuchungen zur Struktur von TNFα oder LTα und TNF-R1. Es konnte gezeigt werden,
dass sowohl LTα als auch TNFα in einer trimeren Form kristallisieren (Eck und Sprang,
1989; Eck et al., 1992; Jones et al., 1989). Desweiteren ergab die Strukturanalyse des TNF-
R1 im Komplex mit LTα, dass auch der Rezeptor nach Bindung des Liganden trimerisiert,
wodurch das Signal in das Zellinnere weitergeleitet werden kann (Banner et al., 1993).
I Einleitung 7
Auch die Struktur des ungebundenen TNF-R1 konnte dargestellt werden (Naismith et al.,
1995). Der Rezeptor trat in Form zweier verschiedener Dimere auf, welcher im 3:3-Komplex
des Liganden-Rezeptor-Komplexes nicht auftrat. Es wurde vorgeschlagen, dass die
Rezeptoren möglicherweise in Abwesenheit des Liganden als Dimere vorliegen. So wurde
neuerdings eine konservierte Domäne in der extrazellulären Region von TNF-R1, TNF-R2,
CD95, TRAIL-R1 und CD40 identifiziert, die verantwortlich für die ligandenunabhängige
Rezeptordimerisierung sein soll und daher als PLAD (pre-ligand-binding assembly domain)
bezeichnet wurde (Chan et al., 2000). Die PLAD befindet sich in der CRD1 und ist notwendig
für die Zusammenführung von TNF-Rezeptor/Liganden-Komplexen, die das Signal in die
Zelle weiterleiten, so dass Rezeptoren bereits vor der Ligandenbindung oligomerisieren. Nach
diesem Modell muss man davon ausgehen, dass entweder intrazelluläre Apoptosehemmer
vorliegen, die, wie z.B. SODD (silencer of death domains) im TNF-Signalweg, die
ligandenunabhängige Apoptoseauslösung verhindern, oder dass Ligandenbindung eine
aktivierende Konformationsänderung der intrazellulären Domänen bewirkt (Chan et al., 2000;
Siegel et al., 2000).
2.1.3 Auslösung des Todesrezeptorsignals
Funktionelle Studien des CD95-Systems und des TNF-Systems ergaben, dass ein CD95-
Dimer keine Apoptose auslösen kann, wohingegen ein multimerisierter Rezeptor in der Lage
ist, das apoptotische Signal in die Zelle weiterzuleiten (Dhein et al., 1992). Daraus konnte
gefolgert werden, dass das erste Signal zur Apoptoseinduktion durch CD95 eine
Trimerisierung oder Multimerisierung der Rezeptoren darstellt. Dies kann entweder durch
Bindung des Liganden oder Bindung eines agonistischen Antikörpers wie z.B. anti-APO-1
ausgelöst werden (Trauth et al., 1989). Außerdem kann auch durch Überexpression von
Rezeptoren mit Todesdomänen Apoptose induziert werden (Bodmer et al., 1997; Boldin et
al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996; Marsters et al., 1996; Muzio et al., 1996).
Für die Übermittlung des apoptotischen Signals ist die Todesdomäne essentiell (Itoh und
Nagata, 1993). Diesbezüglich ist die Signaltransduktion des CD95-Rezeptors am besten
untersucht. Nach antikörper- oder ligandenvermittelter Kreuzvernetzung des Rezeptors
kommt es intrazellulär zu einer Rekrutierung von Adaptermolekülen (Kischkel et al., 1995).
Der Komplex zwischen aktiviertem CD95-Rezeptor und den assoziierten Signalmolekülen
wurde „Tod-induzierender Signalkomplex“ genannt (death inducing signalling complex,
DISC). Unter anderem durch massenspektrometrische Analyse konnten die im CD95-DISC
I Einleitung 8
enthaltenen Adaptermoleküle FADD/MORT (Boldin et al., 1995; Chinnaiyan et al., 1995;
Kischkel et al., 1995) und FLICE/Caspase-8 identifiziert werden (Muzio et al., 1996).
FADD besitzt wie die Todesrezeptoren eine Todesdomäne, die sich am C-Terminus des
Moleküls befindet. Über diese Domäne bindet FADD mittels hydrophober Wechselwirkungen
an die Todesdomäne des stimulierten Todesrezeptors. FADD selbst übt keinerlei
enzymatische Aktivität aus, sondern dient als Adapter für die Rekrutierung weiterer
Effektormoleküle wie Caspase 8 und Caspase 10 an den DISC (Kischkel et al., 2000;
Kischkel et al., 2001; Sprick et al., eingereicht). Dies geschieht mittels homophiler
Interaktion der N-terminalen Todeseffektordomäne (death effector domain, DED)
(Chinnaiyan et al., 1996). So konnte durch Mutationsanalysen gezeigt werden, dass die DD
von FADD ohne die DED in der Lage ist, durch Überexpression Zellen vor CD95-vermittelter
Apoptose zu schützen. Diese Mutante wurde FADD-DN (FADD dominant negativ) genannt
(Chinnaiyan et al., 1996). Dagegen kann allein durch Überexpression der DED Apoptose
induziert werden (Chinnaiyan et al., 1996).
2.2 Caspasen
Die im DISC des CD95-Rezeptors enthaltenen Procaspasen 8 und 10 sind Zymogene, also
inaktive Vorstufen von Proteasen, die für die Apoptose eine eminent wichtige Rolle spielen.
Die große Relevanz dieser zur Familie der sogenannten „Caspasen“ gehörigen Enzyme
spiegelt sich in der Tatsache ihrer hohen Konservierung während der Evolution wider. So
findet man sogar in der Hydra (Budihardjo et al., 1999) und in C. elegans (Yuan et al., 1993)
Homologe zu menschlichen Caspasen. Der Name Caspase leitet sich ab vom Cystein im
aktiven Zentrum und der besonderen Spezifität dieser Proteasen, nach einem Aspartat zu
spalten. Die Aktivierung der enzymatisch inaktiven Procaspasen geschieht durch
proteolytische Spaltung nach definierten Aspartatresten, was zur Freisetzung einer
Prodomäne, sowie einer großen (p20) und einer kleinen katalytischen Untereinheit (p10)
führt. Das reife katalytisch aktive Enzym besteht schließlich aus einem Heterotetramer aus
zwei p20- und zwei p10-Untereinheiten (Earnshaw et al., 1999).
Caspasen sind die primären Effektoren der Apoptose, was durch die Tatsache verdeutlicht
wird, dass Inhibition der Caspasen Apoptose blockieren kann (Hengartner, 2000). So besitzen
verschiedene Viren spezialisierte Proteine, die die Funktion der Caspasen inhibieren können.
Die bekanntesten Beispiele sind CrmA (cytokine response modifier A) des Kuhpockenvirus
und das p35-Protein des Baculovirus. Sowohl CrmA als auch BV-p35 können Todesrezeptor-
vermittelte Apoptose inhibieren (Beidler et al., 1995; Tewari et al., 1995). Ihr
I Einleitung 9
Wirkmechanismus ist ähnlich wie der von Serpinen (Schlangengiften), indem sie sich nach
Spaltung durch Proteasen stabil an das aktive Zentrum lagern und somit das Enzym
inaktivieren (Xue und Horwitz, 1995). CrmA inhibiert Aktivierung der Caspasen 1, 5, 8 und 9
(Garcia-Calvo et al., 1998), während BV-p35 ein wesentlich breiteres Wirkspektrum aufweist
(Miller, 1997). Eine andere Klasse von Caspase-Inhibitoren stellen Tri- oder Tetrapeptide dar,
die die Zielsequenz verschiedener Caspasen beinhalten und durch chemische Modifikationen
zu irreversiblen Inhibitoren werden. So blockiert z.B. der in der vorliegenden Arbeit
verwendete Inhibitor zVAD-fmk die Caspasen 3, 6, 7, 8, 9 und 10 (Villa et al., 1997).
Caspasen können nach ihren bevorzugten Substraten, Sequenzspezifitäten und strukturellen
Ähnlichkeiten in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Gruppe I umfasst Caspasen 1,
4, 5, 11 und 13, die häufig bei Entzündungsprozessen aktiviert werden. In Gruppe II werden
Caspasen 2, 3 und 7 und in Gruppe III Caspasen 6, 8, 9 und 10 eingeteilt. In den beiden
letzteren sind sowohl Apoptoseinitiatoren wie auch Apoptoseeffektoren zu finden.
Apoptoseinitiatoren sind z.B. die durch CD95- und TRAIL-Rezeptor-Oligomerisierung
mittels ihrer DED an den DISC rekrutierten Caspasen 8 und 10. Diese wiederum können in
einer „Caspasenkaskade“ andere Caspasen wie z.B. die Effektorcaspase-3 aktivieren. Solche
Apoptoseeffektoren sind verantwortlich für die Vielzahl der morphologischen Veränderungen
der Zellen während der Apoptose. Zu deren Substraten gehören z.B. der Inhibitor ICAD der
Nuklease CAD/DFF (Nagata, 2000), Cytoskelettproteine wie Gelsolin (Kothakota et al.,
1997) und nukleäres Lamin A (Orth et al., 1996).
2.3 Der mitochondriale Apoptoseweg
Auch den Mitochondrien wird eine zentrale Funktion bei der Apoptose zugeschrieben
(Kroemer, 1998). Apoptotische Aktivierung der Mitochondrien kann durch Ligation von
Todesrezeptoren wie CD95 erfolgen, oder aber durch Behandlung mit Chemotherapeutika,
UV- und Gammastrahlung sowie durch reaktive Sauerstoff-Intermediate und eine Vielzahl
zellulärer Noxen ausgelöst werden. So kann während der Apoptose ein Abfall des
mitochondrialen Membranpotentials (∆Ψm) noch vor der DNA-Fragmentierung beobachtet
werden. Dieser Verlust von ∆Ψm ist nach nahezu allen apoptotischen Stimuli zu verzeichnen
und stellt daher ein universelles Ereignis dar (Kroemer et al., 1997). Dies wird durch einen
Vorgang verursacht, den man „Permeabilitätstransition“ nennt und der durch das Öffnen von
Poren der inneren Mitochondrienmembran gekennzeichnet ist (Bernardi et al., 1994). Dabei
werden verschiedene Faktoren wie Cytochrom c und AIF (apoptosis inducing factor) aus den
Mitochondrien freigesetzt. AIF gelangt schließlich in den Zellkern und verursacht Chromatin-
I Einleitung 10
Kondensierung und DNA-Fragmentierung (Lorenzo et al., 1999). Cytochrom c hat neben
seiner essentiellen Rolle in der mitochondrialen Atmungskette die Funktion, im Cytoplasma
mittels Bindung an das humane CED-4-Homolog Apaf-1, Caspasen zu aktivieren (Zou et al.,
1997).
Der Mechanismus der Freisetzung der proapoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien ist
noch weitestgehend unklar, doch sind Bcl-2-Familienmitglieder an der Regulation beteiligt.
Bcl-2 wurde ursprünglich als Onkogen identifiziert (Tsujimoto et al., 1985) und ist das
kanonische Mitglied einer ganzen Familie pro- und antiapoptotischer Proteine. Die wichtige
Funktion der Bcl-2-Familienmitglieder wird dadurch unterstrichen, dass z.B. CED-9 aus
C. elegans und Bcl-2 homologe Proteine sind, die sogar funktionell austauschbar sind
(Hengartner, 1999). Alle Mitglieder dieser Familie besitzen mindestens eines von vier
konservierten Motiven, die als BH1- bis BH4-Domänen (für Bcl-2-Homologie-Domänen)
bezeichnet werden. Diese dienen als Unterscheidungsmerkmal der drei Subgruppen, nämlich
der antiapoptotischen Bcl-2-Subfamilie mit Bcl-2 und Bcl-xL und der proapoptotischen Bax-
Subfamilie (z.B. Bax, Bok) und BH3-Subfamilie (z.B. Bad, Bid) (Reed et al., 1996).
Bei der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose gibt es sogenannte „Typ II-Zellen“, die trotz
Anwesenheit des CD95-Rezeptors nur einen sehr schwachen DISC bilden. Dennoch kann
nach CD95-Kreuzvernetzung über den mitochondrialen Signalweg Aktivierung von Caspase-
9 und Caspase-3 erfolgen und Apoptose ausgelöst werden. In diesen Zellen werden nach
Stimulation des CD95-Rezeptors im Gegensatz zu „Typ I-Zellen“ nur geringe Mengen an
Caspase-8 aktiviert (Scaffidi et al., 1998), die aber ausreichen, um das proapoptotische BH3-
Subfamilienmitglied Bid zu spalten. Trunkiertes Bid (tBid) verursacht schließlich durch
Anlagerung an die Mitochondrienmembran den Verlust des Transmembranpotentials und
Freisetzung von Cytochrom c (Luo et al., 1998). Durch starke Überexpression von Bcl-2 oder
Bcl-xL kann in Typ II-Zellen CD95-induzierte Apoptose über die Mitochondrien inhibiert
werden (Scaffidi et al., 1998).
3 Die physiologische Rolle der Todesrezeptor-Systeme
Die physiologische Funktion von Genen wurde traditionellerweise durch Beobachtung von
spontanen Mutationen in ganzen Organismen untersucht, wie z.B. die lpr-Mutation bei
Mäusen, die kein CD95 besitzen (siehe unten). Die Entwicklung der Genklonierung und die
in vitro Mutagenese ermöglicht es nun, mittels gezielter Inaktivierung bestimmer Gene („gene
targeting“) Informationen zu erlangen, die dem Verständnis der physiologischen Rolle des
I Einleitung 11
vom inaktivierten Gen kodierten Proteins dienen. Mäuse, in denen gezielt Gene inaktiviert
werden, bezeichnet man als „Knockoutmäuse“. Zusammen mit der Analyse von murinen und
humanen Krankheiten haben Knockoutmäuse wesentlich zum Verständnis der Todesrezeptor-
vermittelten Apoptose beigetragen. Eine Zusammenfassung der Knockout-Modelle der
Rezeptoren, Liganden, einiger Signalmoleküle und der mit bekannten Todesrezeptoren
assoziierten Krankheiten ist in Tabelle I.2 aufgeführt. Durch die Tabelle wird verdeutlicht,
dass den TNF/TNFR-SF-Proteinen eine entscheidende Rolle im Immunsystem, aber auch bei
der Entwicklung, der Gewebshomöostase und im Nervensystem zukommt.
Knockout mit Mutationen assoziierter Phänotyp
CD95/APO-1/ Fas lpr-Mutante
Geringerer AICD in T-Zellen ; Lymphoproliferation, Autoimmunität (ALPS)
TNF-R1 Gestörte Abwehr bakterieller Pathogene; LPS-Resistenz; defekte Bildung der Peyerschen Plaques und der Keimzentren
TNF-R2 Erhöhte Sensitivität gegenüber bakteriellen Pathogenen, geringere Sensitivität für LPS; geringere Antigen induzierte T-Zell Apoptose
LTβR/TNF-RIII Abwesenheit von Lymphknoten; Defekt bei der Bildung von Keimzentren TRAMP/DR3 Beeinträchtigung der negativen Selektion und des αCD3 vermittelten Zelltods von
Thymozyten DR6 Erhöhte CD4+-Proliferation, erhöhte Cytokin-Produktion der Th2-Helferzellen RANK Osteopetrose; Abwesenheit von Osteoklasten und Lymphknoten; anomale B-Zell-
Entwicklung OPG Osteoporose; Arterienveralkung TRAIL Bisher kein Phänotyp beschrieben CD95L gld-Mutante
Geringerer AICD in T-Zellen; Lymphoproliferation, Autoimmunität (ALPS)
TNFα Defekt in Bildung der Keimzentren, erhöhte Empfindlichkeit für mikrobielle Pathogene LTα Abwesenheit von Peyerschen Plaques und Lymphknoten; deorganisierte Mikrostruktur der
Milz; Defekt in Bildung der Keimzentren LTβ Abwesenheit von Peyerschen Plaques und peripheren Lymphknoten; Defekt in Bildung der
Keimzentren OPGL/RANKL Osteopetrose; Abwesenheit von Osteoklasten und Lymphknoten; anomale B- und T-Zell-
Entwicklung FADD Tg FADD-DN
Embryonal letal ; gestörte Herzmuskelentwicklung und Proliferation von Thymozyten sowie peripheren T-Zellen in RAG2-/- Chimären, Embryonal letal ; Überleben der Thymozyten bei Abwesenheit des TCRs, gestörte Proliferation der Thymozyten zwischen doppelt negativem zu doppelt positivem Stadium, Entwicklung von Thymus-Lymphomen in RAG1 -/- Chimären
Caspase-3 Letal; neuronale Hyperplasie; partielle Resistenz reifer T-Lymphozyten für AICD Caspase-8 Embryonal letal ; gestörte Herzmuskelentwicklung; embryonale Fibroblasten resistent
gegenüber Todesrezeptor induzierter Apoptose, normale Sensitivität für UV, Staurosporin, Etoposid, Dexamethason und Serumentzug
Caspase-9 Letal: neuronale Hyperplasie Tabelle I.2 Phänotypen von TNF/TNFR-SF-Knockoutmäusen und Knockoutmäusen involvierter
Signalmoleküle (Locksley et al., 2001; Ranger et al., 2001).
Der große evolutive Vorteil des Immunsystems der Vertebraten beruht auf dem System der
adaptiven oder Antigen-gerichteten Immunität, in welchem TNF/TNFR-Familienmitglieder
I Einleitung 12
eine zentrale Rolle spielen. Diese basiert auf der Rekombination durch die Rekombinase-
aktivierenden Gene RAG-1 und RAG-2 sowie der Mutation der kombinatorischen T- und B-
Zell-Rezeptor-Gene, die eine grosse Zahl verschiedener Antigene erkennen können. Für die
Koordination der Immunantwort benötigen die Lymphozyten TNF/TNFR-SF-Proteine.
Vergleiche zwischen verschiedenen Spezies deuten darauf hin, dass die größte Expansion
neuer Superfamilienmitglieder während der Evolution der adaptiven Immunantwort geschah
(Locksley et al., 2001).
3.1 Das TNF-System
Die effektivsten Immunantworten geschehen innerhalb der sekundären lymphoiden Organe
wie z.B. den Peyerschen Plaques oder Lymphknoten. Diese sind Aggregate von Lymphozyten
und Antigen-präsentierenden Zellen. Mäuse ohne LTβ (Lymphotoxin β) entwickeln z.B.
keine sekundären lymphoiden Organe und haben eine gestörte humorale Immunität (Fu und
Chaplin, 1999). Der Architektur der lymphoiden Organe übergeordnete Strukturen sind
Follikel und Keimzentren. Diese sind zelluläre Aggregate hauptsächlich von B-Zellen, aber
auch von T-Zellen und follikulären antigenpräsentierenden dendritischen Zellen. Die
Interaktionen mit den dort reifenden B-Zellen zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen
stehen unter dem Einfluss der TNF-SF-Mitglieder TNFα, LTα, LTβ, TNF-R1 und LTβR. Für
diese Gene defiziente Mäuse haben schwere Defekte in Keimzentren und Lymphfollikeln (Fu
und Chaplin, 1999).
TNFα- und TNF-R1-defiziente Mäuse zeigen zudem Kontakthypersensitivität auf Irritationen
und eine erhöhte Empfänglichkeit für mikrobielle Pathogene (Erickson et al., 1994;
Pasparakis et al., 1996; Pfeffer et al., 1993; Rothe et al., 1993). TNFα hat somit eine zentrale
Rolle bei der Abwehr von Mikroorganismen inne. Diese beruht auf der schnellen
Rekrutierung vieler inflammatorischer Zelltypen zum Ort der Infektion. Sobald jedoch die
Infektionsgefahr gebannt ist, muss die Entzündung zurückgehen und normale
Gewebshomöostase eintreten. Schnelle Antwort und rasches Abklingen der Entzündung sind
entscheidend, um Schaden vom Wirt durch mikrobielle Infektion oder persistierende
Inflammation abzuwenden. TNF-Sekretion kann durch strukturelle, konservierte Elemente
von mikrobiellen Pathogenen wie LPS (Lipopolysaccharide) oder CpG Motiven bakterieller
DNA hervorgerufen werden (Aderem und Ulevitch, 2000). Der TNFα-Sekretion folgt eine
komplexe biologische Kaskade unter Involvierung von Chemokinen und Cytokinen, die
Aktivierung und Rekrutierung von Granulozyten, Makrophagen und Lymphozyten zum
I Einleitung 13
beschädigten oder infizierten Gewebe zur Folge hat. Lokale Injektion von TNFα rekapituliert
diese Vorgänge.
3.2 Das CD95-System
In der Maus sind mehrere Mutationen beschrieben, die das CD95-System betreffen und
dessen zentrale Rolle im Immunsystem verdeutlichen. Der Phänotyp solcher Mäuse beinhaltet
die unkontrollierte Akkumulation von doppelt negativen (CD4-/CD8-) Thymozyten, was zu
einer Vergrößerung von Milz und Lymphknoten führt und Autoimmunsymptome durch
Bildung von Autoantikörpern zur Folge hat. Die lpr-Mutation (Lymphproliferation) betrifft
den CD95-Rezeptor, dessen Expression durch die Insertion eines Transposons in das zweite
Intron des Gens stark reduziert wird (Adachi et al., 1993; Chu et al., 1993; Mariani et al.,
1994; Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Bei der lprcg-Mutation wird die Signaltransduktion
des CD95-Rezeptors durch eine Punktmutation im Bereich der Todesdomäne verhindert
(Matsuzawa et al., 1990). Bei gld-Mäusen (generalized lymphoproliferative disease) betrifft
der Defekt den CD95-Liganden (CD95L). Hier verhindert ein Aminosäureaustausch im
extrazellulären Bereich des Proteins die Rezeptorbindung (Takahashi et al., 1994). Auch beim
Menschen werden ähnliche Mutationen des CD95-Systems beschrieben (Fisher et al., 1995;
Rieux-Laucat et al., 1995). Sie können zur Ausbildung des Autoimmunlymphoproliferativen
Syndroms (ALPS) führen, welches sich durch massive Lymphadenopathie, der Akkumulation
von nicht-malignen T-Zellen, und Anzeichen von Autoimmunität auszeichnet. Diese
Krankheitsbilder verdeutlichen, dass das CD95-System maßgeblich an der Apoptose im
Immunsystem beteiligt ist. So konnte gezeigt werden, dass die Stimulation des TCRs auf
bereits aktivierten T-Zellen zu einer verstärkten Produktion des CD95-Liganden und damit zu
autokrinem Selbstmord der T-Zellen führt (Alderson et al., 1995; Brunner et al., 1995; Dhein
et al., 1995; Ju et al., 1995). Dieser sogenannte „Aktivierungs-induzierte Zelltod“ (AICD) ist
in vivo an der peripheren Deletion aktivierter T-Zellen nach einer Immunantwort beteiligt und
ist somit für die Homöostase des Immunsystems entscheidend.
Hinweise auf die Beteiligung weiterer Todesrezeptorsysteme bei der T-Zell-Entwicklung
kamen u.a. von FADD-Knockoutmäusen und Mäusen, die eine dominant negative Form von
FADD exprimieren (FADD-DN). FADD ist als DISC-Bestandteil essentieller Vermittler der
CD95- und TRAIL-vermittelten Apoptose (Bodmer et al., 2000; Chinnaiyan et al., 1995;
Kischkel et al., 1995; Kischkel et al., 2000; Sprick et al., 2000) und ist ebenfalls
Konvergenzpunkt der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose bei TNF-R1 und TRAMP
(Chinnaiyan et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996). T-Zellen durchlaufen während ihrer
I Einleitung 14
Entwicklung im Thymus mehrere Kontrollpunkte. Ein Scheitern an diesen Kontrollpunkten
resultiert in Apoptose. Zunächst wird durch die positive Selektion in denjenigen Thymozyten
Apoptose induziert, die ihre TCR-Gene nicht korrekt rearrangieren können. Diese
Thymozyten-Apoptose bleibt jedoch in solchen Mäusen aus, die kein funktionelles FADD
exprimieren (Newton et al., 2000). Überraschenderweise ist in diesen Mäusen ebenfalls die
Antigen-induzierte Proliferation von T-Zellen gestört. Ein weiterer Kontrollpunkt besteht in
der negativen Selektion, wobei in autoreaktiven Thymozyten Apoptose induziert wird.
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass diese in TRAMP-Knockoutmäusen erheblich
beeinträchtigt ist (Wang et al., 2001). Weiterhin können eine Reihe immunologischer und
anderer physiologischer Zelltodprozesse nicht durch eine Beteiligung des TNF- oder des
CD95-Systems erklärt werden. Eine Beteiligung von Todesrezeptorsystemen ist jedoch durch
die Ergebnisse aus den FADD-DN transgenen Mäusen gezeigt. Daher ist die Untersuchung
der anderen Todesrezeptorsysteme notwendig, um die molekularen Mechanismen dieser
Prozesse aufzuklären.
4 Das TRAIL/TRAIL-Rezeptor-System
Mit TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) wurde 1995 aufgrund
seiner Sequenzhomologie zum CD95L ein weiteres Mitglied der TNF-SF gefunden (Wiley et
al., 1995). Interessanterweise induziert TRAIL Apoptose in mehr als 60 % aller
Tumorzelllinien, (Pitti et al., 1996; Thomas und Hersey, 1998; Wiley et al., 1995), nicht
jedoch in den meisten normalen primären Geweben (Walczak et al., 1999).
4.1 Die TRAIL-Rezeptoren
Um die Funktion und Regulation des humanen TRAIL-Apoptose-induzierenden Systems
verstehen zu können, musste zunächst der Rezeptor für TRAIL identifiziert werden (Walczak
und Krammer, 2000). Die Suche nach dem Rezeptor endete mit der überraschenden
Erkenntnis, dass TRAIL an fünf verschiedene Rezeptoren bindet. Damit ist TRAIL das TNF-
Familienmitglied mit den meisten Rezeptoren (Degli-Esposti, 1999).
TRAIL bindet an zwei membranständige Apoptose-induzierende Rezeptoren, TRAIL-R1
(DR4/Apo-2) (Pan et al., 1997) und TRAIL-R2 (DR5/Killer/TRICK2) (MacFarlane et al.,
1997; Pan et al., 1997a; Schneider et al., 1997; Screaton et al., 1997a; Walczak et al., 1997;
Wu et al., 1997), die beide eine Todesdomäne besitzen. Zwei zusätzliche zellgebundene
Rezeptoren TRAIL-R3 (TRID/LIT/DcR1) (Degli-Esposti et al., 1997; Mongkolsapaya et al.,
I Einleitung 15
1998; Pan et al., 1997; Schneider et al., 1997; Sheridan et al., 1997) und TRAIL-R4
(DcR2/TRUNDD) (Degli-Esposti et al., 1997; Marsters et al., 1997; Pan et al., 1998) sowie
ein löslicher Rezeptor OPG (Emery et al., 1998; Simonet et al., 1997) wurden beschrieben,
die keine Todesdomäne besitzen und daher kein apoptotisches Signal vermitteln können.
Zunächst wurde vermutet, dass die Existenz dieser als „Scheinrezeptoren“ (DcR für decoy
receptor) bezeichneten Rezeptoren eine Antwort auf die differentielle Sensitivität gegenüber
TRAIL unter normalen und transformierten Zellen liefern könnte, indem diese mit TRAIL-R1
und TRAIL-R2 um die Bindung an TRAIL konkurrieren (Pan et al., 1997; Sheridan et al.,
1997). Mit Hilfe monoklonaler Antikörper stellte sich jedoch später heraus, dass TRAIL-
Resistenz weniger auf der Ebene der TRAIL-R3- und TRAIL-R4-Expression reguliert wird
als vielmehr durch intrazelluläre Mechanismen. So korrelierte in Melanomzellen der Grad der
TRAIL-Rezeptor-Expression nicht mit einer Sensitivität gegenüber TRAIL (Griffith et al.,
1998; Zhang et al., 1999). Vielmehr ging z.B. in Keratinozyten die TRAIL-Resistenz mit
einer erhöhten Expression von c-FLIP einher (Leverkus et al., 2000), einem die Caspase-
Aktivierung am DISC verhindernden Protein (Krammer, 2000). Auch die in IL-2-stimulierten
primären T-Zellen nach Cycloheximid-Behandlung induzierbare Sensitivität gegenüber
TRAIL-induzierter Apoptose beruht nicht auf veränderter Expression der TRAIL-
Oberflächenrezeptoren (M.Weigand, persönliche Mitteilung).
4.2 Strukturanalyse der TRAIL/TRAIL-R-Komplexe
Die vier TRAIL-Rezeptoren TRAIL-R1 bis TRAIL-R4 besitzen zwei vollständige
membranproximale CRDs (CRD2 und CRD3) und eine nur zwei Cysteine enthaltende N-
terminale CRD (CRD1). Vor kurzem wurde die Kristallstruktur von TRAIL-R2 im Komplex
mit TRAIL aufgeklärt (Hymowitz et al., 1999; Mongkolsapaya et al., 1999). Trotz einer
geringen Sequenzhomologie von lediglich 30% innerhalb der Proteinfamilien ist die grobe
Struktur des TRAIL/TRAIL-R2-Komplexes dem von LTα/TNF-R1 sehr ähnlich. Es konnten
zwei Hauptkontaktstellen in diesem Komplex ausgemacht werden, die mit Patch A und
Patch B bezeichnet wurden. Ein Bereich der CRD2 von TRAIL-R2 wurde „50s-Schleife“
genannt und erwies sich als sehr homolog sowohl in der Struktur zum LTα/TNF-R1-Komplex
als auch in der Sequenz zu den anderen Todesrezeptormitgliedern. Es wurde vorgeschlagen,
dass die 50s-Schleife im Patch A einen Kontakt mit hydrophoben Resten des Liganden
herstellt. Die Spezifität für einen bestimmten Liganden würde dagegen von der sogenannten
„90s-Schleife“ im Patch B erzeugt. Die 90s-Schleife liegt in der CRD3 von TRAIL-R2 und
besitzt eine völlig andere Konformation als die entsprechende Schleife in TNF-R1. Diese
I Einleitung 16
Hypothese wird von der Beobachtung unterstützt, dass in der 90s-Schleife deutlich mehr
Reste der TRAIL-Rezeptoren TRAIL-R1 bis TRAIL-R4 und OPG miteinander
übereinstimmen als bei den anderen TNFR-Familienmitgliedern (Hymowitz et al., 1999).
Eine andere Arbeitsgruppe fand eine weitere nur für die TRAIL-Rezeptoren spezifische
Kontaktstelle zwischen TRAIL-R2 und TRAIL, für die die sogenannte AA‘‘-Schleife des
Liganden TRAIL verantwortlich sein soll. Dieses Segment bildet mit einigen Resten (Y-50,
E-70 und N-81) spezifische polare Interaktionen mit TRAIL-R2 aus, die in den anderen
TRAIL-Rezeptoren gleich oder homolog substituiert sind (Cha et al., 2000).
4.3 Die Signaltransduktion bei TRAIL-induzierter Apoptose
Um die komplizierte Regulation von Resistenz und Sensitivität gegenüber TRAIL verstehen
zu können, ist es notwendig, die intrazellulären Vorgänge der Signaltransduktion nach
TRAIL-Bindung an seine Rezeptoren zu verstehen.
Wie der CD95-induzierte DISC enthält auch der TRAIL-induzierte native DISC von TRAIL-
R1 und TRAIL-R2 das Adaptermolekül FADD, Procaspase-8 (Bodmer et al., 2000; Kischkel
et al., 2000; Sprick et al., 2000) sowie Procaspase-10 (Sprick et al., eingereicht). Dabei
können sowohl homomere als auch heteromere (Kischkel et al., 2000; Sprick et al., 2000)
Rezeptorkomplexe gebildet werden. Es wurde in einer dieser Studien gezeigt, dass FADD-
und Caspase-8- defiziente Jurkat-Zellen, die ausschließlich TRAIL-R2 auf ihrer
Zelloberfläche exprimieren, bei Rekonstitution mit den jeweils fehlenden Proteinen wieder
sensitiv für TRAIL-induzierte Apoptose werden (Sprick et al., 2000). Damit war der Beweis
für eine essentielle Beteiligung von FADD und Caspase-8 bei der TRAIL-R2 induzierten
Apoptose erbracht.
TRAIL-induzierte Apoptose führt in Jurkat-Zellen zunächst zu Aktivierung der Caspasen 8
und 3 und anschließend erst zum Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials.
Stabile Transfektion von Jurkat-Zellen mit den antiapoptotischen Molekülen Bcl-2 und Bcl-xL
kann TRAIL-induzierte Apoptose nicht wie CD95-vermittelte Apoptose verhindern. Jedoch
ist in diesen Zellen die durch das Chemotherapeutikum Etoposid induzierte Apoptose stark
reduziert. Damit ist TRAIL-vermittelte Apoptose in Jurkat-Zellen unabhängig von der
proapoptischen Maschinerie der Mitochondrien (Walczak et al., 2000). Im Gegensatz dazu
kann allerdings für Pankreas-Karzinomzellen eine protektive Rolle für das antiapoptotische
Bcl-2-Subfamilienmitglied Bcl-xL gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose gezeigt werden
(Hinz et al., 2000). Es existieren also, wie für CD95-induzierte Apoptose (Scaffidi et al.,
1998), auch für TRAIL-vermittelte Apoptose sowohl Typ I-Signalwege mit später
I Einleitung 17
Involvierung der Mitochondrien sowie auch Typ II-vermittelte mitochondriale Signalwege
(Suliman et al., 2001).
4.4 Was ist die physiologische Rolle des TRAIL-Systems?
Die Expression von funktionellem TRAIL wird an der Oberfläche von verschiedenen
Apoptose-induzierenden Zellen detektiert, deren Mechanismus zuvor unbekannt gewesen
war. Unter ihnen befinden sich Typ II-Interferon (IFNγ)-stimulierte Monozyten (Griffith et
al., 1999), Typ I-Interferon (IFNα und -β) oder TCR-aktivierte T-Zellen (Kayagaki et al.,
1999; Musgrave et al., 1999), Cytomegalie Virus (CMV)-infizierte Fibroblasten (Sedger et
al., 1999), Newcastle-Disease-Virus (NDV)-stimulierte Monocyten (Sennewald et al.,
eingereicht), CD4+-T-Zellen (Mariani und Krammer, 1998; Martinez-Lorenzo et al., 1999;
Thomas und Hersey, 1998), Interferon-stimulierte sowie virusinfizierte dendritische Zellen
(Vidalain et al., 2000) und IFN-, IL-2- und IL-15- stimulierte sowie unstimulierte NK-Zellen
(Johnsen et al., 1999; Kashii et al., 1999; Kayagaki et al., 1999; Zamai et al., 1998).
Interessanterweise wird die funktionelle Expression von TRAIL oft durch Stimulation mit
Interferonen hervorgerufen. In primären T-Zellen geht der IFNα-stimulierten Expression von
TRAIL eine transkriptionelle Induktion voraus. Der für die IFN-induzierte Aktivierung des
TRAIL-Promotors essentielle Promotorbereich konnte bereits identifiziert werden (Grosse-
Wilde et al., in Vorbereitung). Es ist wahrscheinlich, dass der bekannte antitumorale (Griffith
et al., 1999; Kayagaki et al., 1999) sowie antivirale (Sedger et al., 1999) Effekt der
Interferone zumindest teilweise auf TRAIL-vermittelte Apoptose zurückgeht.
Es gibt verschiedene Hinweise, dass TRAIL bei der Pathologie von AIDS eine Rolle spielen
könnte. HIV-Infektion induziert den graduellen Verlust von CD4+-T-Zellen durch Apoptose,
die hauptsächlich die nichtinfizierten CD4+-T-Zellen betrifft (Finkel et al., 1995). So wird
berichtet, dass TRAIL sowohl in den Aktivierungs-induzierten Zelltod (Jeremias et al., 1998;
Katsikis et al., 1997) als auch in den CD4/CXCR4-induzierten Zelltod (Ritsou et al., in
Vorbereitung) von CD4+-T-Zellen involviert ist. Schließlich konnte kürzlich in einem
Transplantations-Mausmodell für AIDS durch Inaktivierung von TRAIL die Apoptose von
nichtinfizierten humanen CD4+-T-Zellen inhibiert werden. (Miura et al., 2001).
Auch in Autoimmunerkrankungen scheint das TRAIL-System involviert zu sein. So wurde in
einem Kollagen-induzierten in vivo-Modell in Mäusen Autoimmun-Arthritis durch Blockade
von TRAIL verschlimmert, wohingegen intraartikulärer TRAIL-Gentransfer die Entzündung
linderte (Song et al., 2000). Dieselbe Gruppe konnte zeigen, dass in einem Tiermodell für
Multiple Sklerose in Mäusen, der experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE),
I Einleitung 18
durch Blockade von TRAIL die Entzündung verstärkt wurde (Hilliard et al., 2001). In beiden
Studien wurde nach Blockade von TRAIL eine verstärkte Proliferation von autoreaktiven
Lymphozyten, aber keine verringerte Apoptose in den entzündeten Bereichen beobachtet. Das
Autoimmun-Lymphoproliferative Syndrom (ALPS Typ II) ist charakterisiert durch
immunregulatorische Defekte und eine gestörte Homöostase von Lymphozyten und
dendritischen Zellen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass einige ALPS Typ II-Patienten
Mutationen in der Caspase-10 aufweisen, die mit CD95L- und TRAIL-induzierter Apoptose
interferieren (Wang et al., 1999).
4.5 Evidenzen für die Funktion von TRAIL als Tumorsuppressor
TRAIL-induzierte Apoptose in Tumorzellen kann durch verschiedene Mechanismen blockiert
werden. Einer davon ist die Mutation der Primärstruktur von TRAIL-R2 (Lee et al., 1999; Pai
et al., 1998) und TRAIL-R1 (Fisher et al., 2001). Interessanterweise wurden Mutationen der
TRAIL-Todesrezeptoren in humanen Tumoren mit häufigen Deletionen des
Chromosomenabschnitts 8p22-21 gefunden, wo die Gene für TRAIL-R1 bis TRAIL-R4
lokalisiert sind. Allelischer Verlust von 8p22-21 wird unter anderem in Tumoren der Lunge,
Prostata, Colon, Brust, Kopf und Hals-Tumoren und hepatozellulären Karzinomen beobachtet
(Mitelman et al., 1997). Außerdem gibt es Hinweise, dass Todesrezeptormutationen sowie
allelischer Verlust der Chromosomen 8p22-21 auch bei der Pathogenese von humanen
Tumormetastasen involviert ist (Anbazhagan et al., 1998; Yaremko et al., 1996). So wurde in
Brustkrebsmetastasen eine signifikant höhere Mutationsrate in den Todesdomänen von
TRAIL-R1 und TRAIL-2 vorgefunden als in nichtmetastasierenden Tumoren (Shin et al.,
2001).
Weitere Hinweise auf eine Funktion von TRAIL-Todesrezeptoren als Tumorsuppressoren
gibt die Tatsache, dass sowohl TRAIL-R1 (Guan et al., 2001) als auch TRAIL-R2 (Wu et al.,
1997) durch den Tumorsuppressor und Transkriptionsfaktor p53 induziert werden. Das p53-
Gen ist das am häufigsten mutierte Gen in humanen Tumoren. Nach DNA-Schädigung führt
Aktivierung von p53 zu Zell-Zyklus-Arrest und zur Induktion von Apoptose (Levine, 1997).
Neben Induktion der proapoptotischen Proteine Bax (El-Deiry, 1998) und CD95 (Muller et
al., 1998) können also auch TRAIL-R1 und TRAIL-R2 als Bindeglied zwischen p53 und der
zu schneller Apoptoseinduktion führenden Caspasen-Kaskade dienen. Chemotherapeutika
und Strahlentherapie benötigen funktionelle Expression des p53-Tumorsuppressorgens.
Jedoch induzieren Todesliganden Apoptose unabhängig von p53 und könnten eine Ergänzung
zur konventionellen Tumortherapie darstellen.
I Einleitung 19
Kürzlich konnte in vivo eine Korrelation von NK-Zell-Aktivierung mit TRAIL-vermitteltem
antimetastatischem Effekt gezeigt werden. In diesen Studien wurden durch Behandlung von
Mäusen mit IFNγ-induzierenden NK-Zell-Aktivatoren Lebermetastasen durch die Induktion
TRAIL-vermittelter Apoptose verhindert (Smyth et al., 2001; Takeda et al., 2001).
Die tumorselektive Zytotoxizität von TRAIL in vitro (Wiley et al., 1995) eröffnete neue
Perspektiven für die Behandlung von Tumoren in vivo (Walczak et al., 1999). Im Gegensatz
zur systemischen Toxizität der Todesliganden TNF und CD95L (Nagata, 1997) ist systemisch
verabreichtes TRAIL weder in Mäusen (Walczak et al., 1999) noch in nichthumanen
Primaten (Ashkenazi et al., 1999) toxisch. Zudem führte wiederholte Behandlung von
Mäusen, die TRAIL-sensitive humane Tumoren besaßen, mit einer aktiven Form von TRAIL
zu aktiv unterdrücktem Tumorwachstum (Walczak et al., 1999). In weiteren Studien konnte
gezeigt werden, dass die beobachtete TRAIL-induzierte Tumorregression in vivo durch
zusätzliche Behandlung mit den Chemotherapeutika 5-FU (Ashkenazi et al., 1999) oder
Camptothecin (CPT-11) (Gliniak und Le, 1999) synergistisch verstärkt wird. Ebenfalls einen
synergistischen Effekt hatten Strahlentherapie und TRAIL bei der Regression etablierter
Brustkrebs-Xenotransplantate, vermutlich weil Brustkarzinomzellen durch Strahlentherapie
für TRAIL-induzierte Apoptose sensitiviert werden können (Chinnaiyan et al., 2000).
Weiterhin konnte TRAIL mittels eines adenoviralen Vektors in humanen Coloncarcinom-
Xenotransplantaten exprimiert werden, wo eine auf Apoptoseinduktion zurückzuführende
Tumorsuppression erreicht werden konnte (Kagawa et al., 2001). Außerdem konnte gezeigt
werden, dass systemische Administration eines rekombinanten Gens kodierend für ein
TRAIL-Fusionsprotein zur Regression eines in SCID-Mäusen etablierten humanen
Brusttumors führte (Wu et al., 2001).
I Einleitung 20
5 Ziel der Arbeit
Die spezifische Inaktivierung von TNF- oder TNFR-Familienmitgliedern in Mäusen hat
wesentlich zur Klärung der physiologischen Rolle der einzelnen Rezeptor-Liganden-Systeme
beigetragen. In Multirezeptorsystemen wie z.B. beim TNF-System mit TNF-R1 und TNF-R2
konnten durch Geninaktivierung der Rezeptoren in Mäusen die spezifischen Rollen der
jeweiligen Rezeptoren bestimmt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung
und Charakterisierung eines murinen TRAIL-Todesrezeptors sowie die Bereitstellung von
Tiermodellen, in denen dieser Rezeptor gezielt inaktiviert ist. Diese Tiermodelle sollen dazu
genutzt werden können, Einblick in die physiologischen Funktionen des TRAIL-
Todesrezeptorsystems zu erhalten.
Zunächst musste ein muriner TRAIL-Todesrezeptor identifiziert, molekular und funktionell
charakterisiert und dessen Orthologie zu den humanen Rezeptoren determiniert werden. Mit
Bestimmung dieses murinen Rezeptors sollte schließlich die Möglichkeit geschaffen werden,
eine gezielte Analyse der in vivo-Funktion des TRAIL-Systems in der Maus durchzuführen.
So sollten zur funktionellen Inaktivierung von TRAIL in vitro und in vivo lösliche murine
Rezeptoren hergestellt werden, die in der Lage sind, TRAIL zu neutralisieren.
Durch Identifizierung des für den murinen TRAIL-Todesrezeptor kodierenden Gens und
dessen gezielter Inaktivierung mittels homologer Rekombination sollten TRAIL-R-
Knockoutmäuse erzeugt werden. Die ubiquitäre, konstitutive Inaktivierung von Genen in
herkömmlichen Knockoutmäusen führt in einigen Fällen zu embryonaler Letalität oder zu
kompensatorischen Effekten während der Ontogenese. Durch eine organspezifische
Inaktivierung eines Gens kann die Bedeutung des kodierten Proteins für physiologische oder
pathophysiologische Prozesse bestimmt werden, die ein bestimmtes Organ betreffen. Mittels
des Cre/loxP-Systems können neben konstitutiven auch konditionale Knockoutmäuse
hergestellt werden, bei denen das jeweilige Gen gewebsspezifisch oder induzierbar inaktiviert
ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Mäuse generiert werden, bei denen mTRAIL-R mittels
des Cre/loxP-Systems entweder konstitutiv oder konditional inaktiviert werden kann. Die
Analyse der konstitutiven TRAIL-R-Knockoutmäuse wird Aufschluss über potentielle
entwicklungsbiologische und physiologische Funktionen dieses TRAIL-Todesrezeptors
geben. Die Untersuchung der konditionalen TRAIL-R-Knockoutmäuse ist im Hinblick auf die
für TRAIL angenommene Rolle bei der Tumorentstehung und dessen potentiellen Einsatz bei
der Tumortherapie von grosser Bedeutung.
II Material und Methoden 21
II Material und Methoden
1 Material
1.1 Biologisches Material
1.1.1 Eukaryontische Zellen
1.1.1.1 Zelllinien
Name Spezies Beschreibung Medium Wachstum Jurkat JA3 Mensch T-Lymphomzelllinie Iscove in Suspension Ag-8 Maus Myelom RPMI + β-ME* in Suspension DC27.1 Maus T-Zelllinie RPMI + β-ME* in Suspension EL4 Maus Lymphom RPMI + β-ME* in Suspension Esb-MP Maus T-Zell-Lymphom, metastasierend RPMI IC-21 Maus Peritoneale Makrophagen, SV40
transformiert RPMI + β-ME* adhärent
L929 Maus Fibroblasten RPMI + β-ME* adhärent L1210 Maus Lymphoblasten DMEM in Suspension P815 Maus Mastocytom DMEM adhärent WEHI Maus Lymphoblasten DMEM in Suspension Yac-1 Maus Lymphom RPMI + β-ME* adhärent CV-1/ EBNA
Affe Nierenepithel-Zellen aus afrikanischem grünen Affen
DMEM-F12 adhärent
* in Verdünnung 1: 2 000 000 (v/v)
1.1.1.2 Zellen für die ES-Zellkultur
ES-Zell-Linie E14/1
Die verwendete embryonale Stamm-(ES-)Zell-Linie ist eine Sublinie der E14-Linie (Kuhn et al., 1991), welche aus Blastozysten von Mäusen des Stammes 129/Ola (einer Sublinie von 129/Sv) stammt.
Feederzellen
Die ES-Zellen wurden auf einem Rasen von Feederzellen (mitotisch inaktiven Maus-Fibroblasten) in Kultur gehalten. Für die normale Kultivierung wurden Mausfibroblasten verwendet, die aus 14,5 Tage alten Embryonen des Stammes NMRI präpariert worden sind. Befanden sich die ES-Zellen jedoch unter G418-Selektion, so mussten Fibroblasten verwendet werden, die ein Allel des neo-Genes tragen und somit unter G418 Selektion nicht absterben. Die G418 resistenten Fibroblasten wurden aus Embryonen gewonnen, die aus der Verpaarung eines GR-/--Männchens mit einem NMRI-Weibchen stammten.
1.1.2 E.coli-Bakterienstämme
zur Vermehrung von Plasmid DNA NM 554 Stratagene XL1-Blue Stratagene
II Material und Methoden 22
zum Absuchen der Phagenbibliotheken C600 MoBiTec BNN132 MoBiTec exprimiert die Cre-Rekombinase unter Kanamycin-Selektionsdruck
zur ET-Klonierung NM-ET
Dieser E.Coli - Stamm wurde für die Klonierung durch homologe Rekombination (ET-Klonierung) verwendet. Er ist von NM 554 abgeleitet und trägt das Plasmid pBADETγ (Zhang et al., 1998) mit einer Tetracyclinresistenz. Nach entsprechender Vorbehandlung (s.u.) lässt er sich durch Elektroporation mit Plasmid-DNA und amplifizierten DNA-Fragmenten transformieren.
MM 294-Flp und MM 294-Cre Diese E.Coli-Stämme tragen das Gen für die Flp- bzw Cre-Rekombinase unter einem autonomen Promotor im lac-Locus. Er kann durch die Hitzeschockmethode mit Plasmiden transformiert werden. Die exprimierte Flp-Rekombinase vermittelt in transformierten Plasmiden die Rekombination zwischen frt0 und frt3-Stellen. Die exprimierte Cre-Rekombinase katalysiert die Rekombination zwischen loxP-Stellen.
1.1.3 Phagenstämme und Genbibliotheken
genomische Bibliothek
PS02 (MoBiTec) stammt aus männlichen ES-Zellen des Mausstammes 129/Sv. Die Bibliothek liegt im λPS-Vektor-System vor. Der Vektor kann DNA von bis zu 20 kB beinhalten, er besitzt in linearer Form zwei loxP-Stellen in gleicher Orientierung, die ein Multi-Copy-Plasmid-Rückgrat und das Insert flankieren. Rekombination der loxP-Stellen wird durch die Cre-Rekombinase vermittelt, welche zur Exzision des Multi-Copy-Plasmids (inklusive des Inserts) aus dem Phagengenom führt. Dies kann durch Infektion des Phagen in den Cre-exprimierenden E.coli-Stamm BNN132 erreicht werden.
cDNA-Bibliothek
MEM15 in Phagenstamm λGT10 von embryonaler Maus, Tag 15 (Clontech)
1.1.4 verwendete Mausstämme
C57BL/6
Dieser Stamm kommt aus dem Jackson-Laboratorium und wird für die Blastozystengewinnung verwendet. Hierzu wurden Männchen und Weibchen miteinander verpaart und am nächsten Morgen auf die Anwesenheit eines vaginalen Pfropfes überprüft. Weibchen, die diesen Pfropf aufwiesen, wurden von den Männchen separiert und befanden sich definitionsgemäß am Tag 0,5 nach der Empfängnis (Tag 0,5 p.c.). Am Tag 3,5 p.c. wurden diese Weibchen für die Blastozystengewinnung getötet. Außerdem wurden Tiere dieses Stammes zum Rückkreuzen der erhaltenen Chimären, sowie ihrer Nachkommen verwendet (Fellfarbe schwarz). Auf diese Weise gelingt es, die Mausmutanten auf nahezu reinem C57BL/6 Hintergrund zu halten. Nach etwa vier Rückkreuzungen kann bereits von weitgehend isogenen Verhältnissen ausgegangen werden, nach 20 Generationen sind die Tiere per definitionem vollständig isogen.
129/Sv, 129/Ola und 129/SvEv
129/Ola ist ein Substamm von 129/Sv. Die verwendeten ES-Zellen stammten aus 129/Ola-Mäusen (Fellfarbe agouti).
II Material und Methoden 23
B6D2F1
Hierbei handelt es sich um einen Hybridstamm aus C57BL/6 und D3H. Die Weibchen wurden in den pseudoschwangeren Zustand gebracht (durch Verpaarung mit vasektomierten Männchen) und als Leihmütter für die injizierten Blastozysten verwendet.
NMRI
Männchen dieses Stammes wurden vasektomiert und für die Verpaarung mit B6D2F1 Weibchen eingesetzt.
1.2 Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien wurden von folgenden Herstellern bezogen: Fluka Roth Sigma Pierce AP-Biotech Zur radioaktiven Markierung von DNA-Sonden wurde verwendet: [α-32P]dCTP (3000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) (AP-Biotech)
1.3 Molekularbiologische und proteinbiochemische Materialien
1.3.1 Enzyme
Restriktionsendonucleasen wurden von den folgenden Herstellern bezogen: New England Biolabs Roche Molecular Biochemicals MBI Fermentas
Weitere Enzyme für die Molekularbiologie Advantage 2 PCR-Enzyme System Clontech Alkalische Phosphatase (SAP) Roche Diagnostics Expand-HighFidelity Roche Diagnostics Klenow- Fragment Roche Diagnostics MuLV Reverse Transcriptase PE-LifeScience Pfu-DNA-Polymerase Promega Pwo-DNA-Polymerase Roche Diagnostics PowerScript Reverse-Transcriptase Clontech Proteinase K Roth RNAse A Qiagen T4-DNA-Ligase Roche Diagnostics Taq-DNA-Polymerasen Roche Diagnostics AP-Biotech
Enzyme für die Proteinbiochemie N-Glykosidase F, rekombinant Roche Diagnostics
II Material und Methoden 24
1.3.2 Reagenziensätze
BCA-Proteinbestimmungs-Kit Pierce Blue Stain Kit NOVEX/ Invitrogen Canine Pancreatic Microsomal Membranes Promega Chemolumineszenz-Kit SuperSignal West Dura Pierce Hybond –N+ AP-Biotech In vitro Translation TNT T7Kit Promega Microspin G50 Columns AP-Biotech QIAgen Maxiprep Kit Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen QIAquick PCR Purification Kit Qiagen QIAshredder Qiagen Redi Prime II-Kit AP-Biotech RNeasy Mini Kit Qiagen SMARTRACE cDNA Amplification Kit Clontech TA Cloning® Kit Invitrogen
1.3.3 Molekulargewichtsmarker
Proteinmarker SeeBlueTM Plus2 Pre-Stained Standards Invitrogen Mark 12 Invitrogen Rainbow Marker AP-Biotech
DNAmarker Smart Ladder von 200 Bp bis 10 kB Eurogentec Smart Ladder SF von 50 Bp bis 3 kB Eurogentec
1.3.4 Vektoren
pBluescript II SK+ Stratagene für Klonierungen genomischer Fragmente und Subklonieren von PCR-Fragmenten pCR 2.1 für TA cloning Invitrogen für „Hotshot-klonierungen“ genomischer Fragmente pcDNA3.1 Invitrogen
1.3.5 Plasmide
pfrt-PGKtkneo-frt (Quelle: Erich Greiner/ Francis Stewart) für Klonierung der 5‘-flankierenden loxP-Stelle im Targeting-Konstrukt, mit einer Ampicillinresistenz und einer Kanamycin-(bzw. Neomycin-)Resistenz. Letztere besitzt zwei Promotoren, den eukaryotischen PGK (Phosphoglyceratkinase)-Promotor und den prokaryontischen Tn5-Promotor.
pKaX (Quelle: Erich Greiner/ Francis Stewart) für Insertion der 3’-flankierenden loxP-Stelle im Targeting-Vektor, mit Ampicillin- und loxP-flankierter Kanamycinresistenz unter Kontrolle des Tn5-Promotors (tn5neo)
pSL301-DTA (Quelle: F. Hilberg/E. Wagner/Erich Greiner) zur Selektion auf homologe Rekombination des Targeting.Konstrukts. Das Genprodukt Diphterie-Toxin-alpha ist toxisch für ES-Zellen.
II Material und Methoden 25
pBS-mTR_DD (diese Arbeit) Mit den Oligonukleotiden 5’mTR_DD-Hind3.for und 3’mTR_DD-EcoR1.rev wurde in einer RT-PCR von RNA von EL-4-Zellen und Esb-Zellen ein PCR Fragment hergestellt, welches mit den indizierten Restriktionsenzymen gespalten wurde und in den Vektor pBluescript II KS(-) ligiert wurde.
pcDNA3.1-mTRAIL-R (diese Arbeit) Mittels der Oligonukleotide 5‘mTR-Hind3.for und 3‘mTR-Not1.rev wurde in einer RT-PCR von RNA von EL-4-Zellen ein PCR-Fragment hergestellt, welches mit den indizierten Restriktionsenzymen gespalten wurde und in den Expressionsvektor pcDNA3.1 ligiert werden konnte.
pcDNA3.1-mTRAIL-R:Fc (diese Arbeit) Mit den Oligonukleotiden 5‘mTR-Sal1.for und 3‘mTR-BamH1.rev wurde ein PCR-Fragment hergestellt, das die extrazelluläre Domäne von mTRAIL enthielt. Dies wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI gespalten. Das Plasmid pcDNA3.1-TRAIL-R2:Fc wurde mit SalI und BglII aufgeschnitten, wobei das TRAIL-R2-spezifische Fragment herausfiel. Schließlich wurde das PCR-Fragment in den linearisierten Vektor eingesetzt.
pBS-mTR5‘-probe (diese Arbeit) Mit den Oligonukleotiden mTR5'-probe.for und mTR5'-probe.rev wurde mit GTR1 als Template ein PCR-Fragment generiert, welches direkt mit dem TA-cloning Kit in den Vektor pCR2.1 ligiert wurde.
pBS-mTR3‘-probe3 (diese Arbeit) Klonierung wie pBS-mTR5‘-probe, verwendete Oligonukleotide mTR3'-probe3.for und mTR3'-probe3.rev.
pBS-mTRint-Exon 2 (diese Arbeit) Klonierung wie pBS-mTR5‘-probe, verwendete Oligonukleotide mTRint-probe_ex2.for und mTRint-probe_ex2.rev.
1.3.6 Oligonukleotide
Oligonukleotide für die ET-Klonierungen (Fa. Interactiva) Name Sequenz KOa01
CTGGATCCAAGCTAGGGCCTCACTCATGGTAGACACGCACATTACCACTGAGCTATAGGCtgccaagctactcgcgaccatggt
KOb02(HindIII)
CGTAGGGCACCCAGAATTCACATAGTGAACAGTATCTGTAGCTGGGCTAGCAGAGCTGG gaagctt cactaacaaccggtacagttcgaa
KOc03(EcoRV)
GCAAGTGTATTTATCCACAGAGCCATCTTTTTAAGTCTTGACTGCATTTTTACAAACTGG gatatc aataggcgtatcacgaggccctgc
KOd04 CTGTCTTGTTTCCTGTGTGACCAATTAATCATGTGGGTGACTATTTCTGCCCCTTACCCaggaaacagctatgaccatgattac
Andere Oligonukleotide (Fa. ARK) Name Sequenz Zweck 5’mTR_DD-Hind3.for aaa gaa gct tgc tgg ttc cgg taa acg ga EST-Klonierung 3’mTR_DD-EcoR1.rev cat cga att cgg cgc cac ttg agc agc at EST-Klonierung mTR_85.for agc gca gac ttc tat ata gc Intronklonierung mTR_164.rev gct ggg tta gct gtt act g Intronklonierung mTR_184.for cta cag cgg ccg gag gag Intronklonierung mTR_271.rev ctc tct gca agg ctt gca gt Intronklonierung
II Material und Methoden 26
mTR_288.for cca ttc caa cca ttc tct gg Intronklonierung mTR_389.rev cga cac acc gta ttt gtg gt Intronklonierung mTR_410.rev tca aag gtg cct ggt ttg ca Intronklonierung mTR_462.for gga aga gga act gac ttc ct Intronklonierung mTR_462.for gga aga gga act gac ttc ct Intronklonierung mTR_557.rev cct atc cag agg cct agc t Intronklonierung mTR_580.for ctg att gga gct ctg ctt gt Intronklonierung mTR_681.rev cac aga gtt cgc act ttc gg Intronklonierung mTR_689.for ctc tct tgg acc gac aga ca Intronklonierung mTR_766.for gga aag aag ttg ctg gtt cc Intronklonierung mTR_785.rev gg aac cag caa ctt ctt tcc Intronklonierung mTR_786.rev gg aac cag caa ctt ctt tcc Intronklonierung mTR_860.rev gag tca aag ggc act atg tc Intronklonierung β-Actin.for gcg acg agg ccc aga gca RT-PCR β-Actin.rev ccc ggc cag cca ggt cca g RT-PCR mTR-a.for gag cca tct ttt taa gtc ttg act g PCR-Knockout mTR-b.rev ga cga tta tgg gct ggg tta gct g PCR-Knockout mTR-c.rev gga act tcc tga cta ggg gag g PCR-Knockout mTR-d.rev cg aac aca gct ggt ttc cat gg PCR-Knockout 5‘mTR-Sal1.for catc gtcgac gcc acc atg gag cct cca gga RT-PCR 3‘mTR-BamH1.rev catc ggatcc ctt atg cca aga tgc cca ag RT-PCR 5‘mTR-Hind3.for cat caa gct tgc cac cat gga gcc tcc agg a RT-PCR 3‘mTR-Not1.rev catc gcggccgc tca aac gca ctg aga tcc tc RT-PCR mTR5'-probe.for cat aca cga tcg acc agt gtg Southern-Blot-Sonde mTR5'-probe.rev caa ggc cat aga cca tgc tg Southern-Blot-Sonde mTR3'-probe3.for ctg cac tga cgg gga aga Southern-Blot-Sonde mTR3'-probe3.rev gag gct aga ggc ttc cag Southern-Blot-Sonde mTRint-probe.ex2.for ggt aag ggg cag aaa tag tc Southern-Blot-Sonde mTRint-probe.ex2.rev tca gca aag aaa tgg gaa ctg Southern-Blot-Sonde GSP1b t gtg acc agt gtt tcg gct ttg acc at RACE GSP1c cga aga taa act tca ggt cgt cag ctg RACE GSP2b cag ctg acg acc tga agt tta tct tcg RACE NGSP1b acc agt gtt tcg gct ttg acc att tgg RACE NGSP1c gt cag ctg agt cgt ttc cgt tta ccg g RACE NGSP2b tcg agt att gtt cgg aca tag tgc cct RACE
1.3.7 Moleküle zur Proteindetektion
Primärantikörper Name Serum/Isotyp Zielstruktur Quelle/Referenz α mClusterin M-18 Ziege C-Terminus von
mClusterin Santa Cruz
αLZ-M15 IgG1 LeucinZipper Immunex αLZ-HS601 IgG1 LeucinZipper eigene Herstellung αFLAG-M2 IgG1 FLAG Sigma
II Material und Methoden 27
Sekundärantikörper Name Serum Zielstruktur Quelle/Referenz αmIgG1-HRP Ziege m-IgG1 Biozol αmIgG2a-HRP Ziege m-IgG2a Biozol αmIgG2b-HRP Ziege m-IgG2b Biozol αZiegeIgG-HRP Kaninchen Ziege IgG Santa Cruz
gekoppelte Moleküle Basisprotein Farbstoff Zielstruktur Quelle/Referenz Streptavidin (SA) PE Biotin Pharmingen Streptavidin (SA) HRP Biotin Pharmingen
Beads Name Matrix Zielstruktur Quelle/Referenz C4-Agarose Agarose - Roche Diagnostics Protein-G-Agarose Agarose IgG Roche Diagnostics
1.4 Puffer, Lösungen und Medien
Im Folgenden sind nur die häufig benutzen Puffer und Medien der Standardtechniken aufgeführt, die spezielleren Puffer sind im jeweiligen Methodenabschnitt aufzufinden.
1.4.1 Puffer für die Molekularbiologie
1.4.1.1 Puffer und Medien für Bakterien
LB-Medium (Luria/Bertani) 10 g/L Trypton 5 g/L Hefeextrakt 5 g/L NaCl
mit NaOH auf pH = 7,0 einstellen und autoklavieren, Lagerung bei RT LB-Agar Platten und LB/Agar-Platten mit Antibiotika wurden nach einem Protokoll in
Sambrook et al. (1989) hergestellt. Antibiotika Kanamycin Stocklösung 25 mg/mL, Gebrauchskonzentration 25 µg/mL Ampicillin Stocklösung 100 mg/mL, Gebrauchskonzentration 50-100 µg/mL Tetracyclin Stocklösung 5 mg/mL, Gebrauchskonzentration 10 µg/mL
1.4.1.2 Puffer zur Isolierung und Aufbewahrung von DNA und RNA
TE-Puffer TE-Puffer pH 8 (für Plasmid-DNA) 10 mM Tris/HCl pH 8,0 1 mM EDTA, pH 8,0 TE-Puffer pH 7,4 (für genomische DNA) 10 mM Tris/HCl pH 7,4 1 mM EDTA, pH 8,0
II Material und Methoden 28
Tail-Puffer: Lysepuffer zur Isolation genomischer DNA aus embryonalen Stammzellen 50 mM Tris/ HCl pH 8,0 100 mM EDTA 100 mM NaCl 1 % SDS 1 mg/mL Proteinase K
NID-Puffer: Lysepuffer zur Isolation genomischer DNA aus Schwanzspitzen und Zehen 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 2 mM MgCl2 0,1 mg/mL Gelatine 0,45 % NP-40 0,45 % Tween 0,2 mg/mL Proteinase K
Puffer für Miniprep zur Isolation von Plasmid-DNA im analytischen Maßstab Puffer P1/P2/P3 nach Anleitung aus Qiagen Maxiprep-Kit (s.u.) und nach dem
von Nelson und Krawetz (1992) beschr