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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université M’Hamed Bougara de Boumerdès
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Mémoire de Magister
En vue de l’obtention du diplôme de Magister en Biologie
Option : Biochimie - Microbiologie Appliquées
Thème
Présenté par
Melle
BENSMAIL Souhila
Devant le jury composé de :
Mr NABIEV Mohamed Professeur, (UMBB) Président
Mr RIBA Amar Maître de conférences (A), (UMBB) Examinateur
Mme
BENHADJA Lynda Maître de conférences (A), (U. Blida) Examinatrice
Mme
DJEFAL Assia Maître de Recherche (B), (CRNA) Examinatrice
Mr NOUANI Abd-Elouaheb Maître de conférences (A), (UMBB) Invité
Mme
FAZOUANE Fethia Professeur, (UMBB) Encadreur
Mme
MECHAKRA Aicha Professeur, (U. Constantine) Co-encadreur
Année universitaire : 2011-2012
Optimisation de la production de la protéase acide par Aspergillus
niger sur milieu solide : purification et caractérisation
1
Remerciements
Au terme de ce modeste travail, je tiens à remercier en premier lieu, Dieu tout puissant de
m’avoir donné la force et le courage à fin de réaliser cette étude.
Mes vifs remerciements vont en particulier à Mme FAZOUANE F. de m’avoir proposé ce
sujet et de diriger mon travail par ses précieux conseils et ses encouragements.
J'exprime mes respectueuses reconnaissances à Mme MECHAKRA A. (Co-promotrice) pour
ses aides techniques et ses orientations.
Mes sincères remerciements vont aussi aux membres de jury pour l’honneur qu’ils auront
fait en acceptant de juger ce travail; à Mr. NAVIEV M. d’avoir accepté de présider ce
travail, à Mme BENHADJA L., Mme DJEFAL A. et à Mr. RIBA A. qui ont consacré leur
temps pour l’examination de ce travail.
Que Mr. NOURI E . et tout le personnel du LRTA (Laboratoire de Recherche en
Technologie Alimentaire, UMBB), trouvent ici l'expression de ma profonde gratitude pour
avoir facilité notre tâche.
A Mr. NOUANI A. (Chef de Département de Technologie Alimentaire, UMBB) et toutes
les techniciennes des laboratoires pédagogiques, j'adresse mes sincères remerciements pour
leurs orientations et les innombrables services.
J’exprime ma sincère gratitude à Mr TAZIR M., Directeur de l’institut Pasteur d’Alger,
pour les services qu’il ma toujours rendus.
Je tiens tout particulièrement à remercier les enseignants du laboratoire de biologie
moléculaire pour leurs encouragements et orientations, ainsi que tous les enseignants de
Département de Biologie qui ont contribué à ma formation universitaire.
Je remercie l’équipe des laboratoires de biologie (FS/UMBB) en particulier Melle
RAMDANI M., Melle BOULDJENET F., Melle ZEROUKI F., Melle LONGUO N.
et Melle OUKALI Z. pour leurs aides et leur soutien durant ma période de stage.
C’est avec un réel plaisir que j’adresse mes sincères reconnaissances et ma profonde gratitude
à tous ceux qui ont m’aidé de près ou de loin pour réaliser cette étude.
2
Résumé
La pénurie mondiale en présure à susciter le développement de la recherche des
nouveaux succédanés capables de coaguler le lait, tout en assurant de bons rendements
fromagers.
Dans cet objectif, la production de la protéase acide extracellulaire par l’espèce
fongique Aspergillus niger isolée localement, sur un résidu agroalimentaire peu couteux
fermenté par des cultures solides (SSF), a été optimisée de façon à obtenir la meilleure activité
coagulante. Un essai de purification et une caractérisation biochimique de l’enzyme ont été
également effectués.
Les résultats obtenus montrent que la meilleure production de cette enzyme
(830 US/g avec un rapport AC/AP de 4,25) a été obtenue sur milieu à base de son de blé
(10g), humidifié à un taux de 39,21% par une solution minérale Czapek-Dox à pH 4, incubé à
30°C pendant 72 heures et inoculé par la suspension fongique de 106 spores/ml.
L’application du plan factoriel fractionnaire à l’optimisation de la production de la
protéase acide d’A. niger, a permis de déterminer l’influence significative du taux d’humidité
du substrat et de la quantité en CaCl2 dans le milieu (deux effets contradictoires positif
et négatif respectivement) et d’exclure l’importance des autres facteurs du plan d’expérience
(la quantité du lait écrémé et celle de la caséine). Une activité coagulante de 582 US/g et un
rapport AC/AP de 4,32 ont été obtenus pendant cette étude.
La protéase extracellulaire a été purifiée 8 fois avec un rendement d’environ 10%, en
utilisant la précipitation au (NH4)2SO4 à 80% de saturation et la chromatographie échangeuse
d'ions sur DEAE-A50. La purification était plus efficace dans ces conditions par rapport à
l'utilisation de la chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephadex-G100 comme
l’étape qui suive la précipitation.
L'enzyme a été trouvée sous une forme monomérique, ayant un poids moléculaire de
47,7kDa par SDS-PAGE, résultats confirmés par la zymographie.
Les conditions optimales de l’activité coagulante de l’extrait enzymatique
partiellement purifié ont été déterminées ; elles correspondent aux paramètres suivants:
température de 45°C, pH 5 (protéase acide) et une concentration en CaCl2 de 0,04M. Il
présente une stabilité dans la gamme du pH 3,0-5,0 à 4°C pendant 24 heures dans le tampon
citrate de sodium (0,1M) et une stabilité thermique jusqu’à 45°C pendant 1 heure.
Mots clés : Optimisation, SSF, coagulation du lait, Aspergillus niger, purification.
3
Abstract
The need to overcome the limitation of obtaining rennin has been actively pushed
researches to find new substitutes that ensure high milk-clotting activity and high cheese
production.
In this aim, the production of extracellular milk-clotting enzyme by locally isolated
fungal specie, Aspergillus niger under solid-state fermentation (SSF) using cheep agro-
industrial byproduct (wheat bran), was optimized to achieve the best milk-clotting activity.
A trial of purification and biochemical characterization of the enzyme were also carried out.
The conditions of medium and substrate markedly affected the enzyme production.
The maximum enzyme productivity (830 US/g with a report MCA/PA of 4.25) was obtained
under the optimum conditions of temperature (30°C), spores concentration (106spores/ml),
incubation time (72 hours), moisture content of solid substrate (39.21%) adjusted suitably
with mineral solution (Czapek-Dox) of pH 4.0.
Based on the results of the fractional factorial design, it was concluded that initial
moisture of substrate and the amount of the CaCl2 are the critical factors that affect
significantly the acid protease production by A. niger, where the first has a positive effect but
the second has a negative one. The design exclude the effect of the others factors tested (skim
milk powder and casein). A milk-clotting activity of 582 US/g and a report MCA/PA of 4.32
were obtained in this step.
The extracellular milk-clotting enzyme was purified 8 times with a recovery of 10%
using (NH4)2SO4 precipitation with saturation of 80% followed by ion exchange
chromatography on DEAE-A50. The purification was more effective in this conditions
compared to the use of size exclusion chromatography technique on Sephadex-G100, as the
next step after precipitation.
The enzyme was found to be a monomeric in nature having a molecular weight of
47.7 kDa by SDS-PAGE, which was confirmed by zymography.
High milk-clotting activity of partially purified enzyme was obtained at pH 5.0 (acid
protease), temperature 45°C and in 0.04M CaCl2 concentration. It was stable in the pH range
3.0-5.0 for 24 hours at 4°C in sodium citrate buffer (0.1M) and has a thermal stability up to
45°C for 1 hour.
Key words: Optimization, SSF, milk-clotting, Aspergillus niger, purification.
4
-
-
5
Table des matières
Liste des abréviations .......................................................................................................... i
Liste des figures .................................................................................................................. ii
Liste des tableaux ................................................................................................................ iii
Introduction ....................................................................................................................... 1
Chapitre I : Synthèse Bibliographique
1- Les protéases ................................................................................................................. 3
1.1. Généralités ............................................................................................................. 3
1.2. Propriétés ............................................................................................................... 4
1.3. Classification ......................................................................................................... 5
1.4. Applications des protéases .................................................................................... 9
1.4.1. Industrie alimentaire .................................................................................. 9
1.4.2. Synthèse des peptides ............................................................................... 11
1.4.3. Gestion des déchets industriels et ménagers ............................................. 11
1.4.4. Utilisation médicale ................................................................................... 12
1.4.5. Industrie des détergents ............................................................................. 12
1.4.6. Industrie photographique ........................................................................... 13
2- La coagulation du lait .................................................................................................. 14
2.1. Caractéristiques du lait .......................................................................................... 14
2.2. Les caséines du lait ................................................................................................ 14
2.2.1. Organisation micellaire des caséines .......................................................... 15
2.3. La coagulation du lait ............................................................................................ 18
2.3.1. Coagulation par acidification .................................................................... 18
2.3.2. Coagulation par voie enzymatique ............................................................ 19
2.3.3. La coagulation mixte ................................................................................. 20
2.4. Mécanisme de la coagulation ................................................................................ 21
2.5. Facteurs influençant la coagulation ....................................................................... 23
6
3- Aspergillus niger ........................................................................................................... 26
3.1. Le genre Aspergillus .............................................................................................. 26
3.2. Taxonomie ............................................................................................................. 27
3.3. Morphologie .......................................................................................................... 27
3.4. Habitats .................................................................................................................. 29
3.5. Reproduction ......................................................................................................... 29
3.6. Diverses enzymes produites par A. niger .............................................................. 29
4- La fermentation ............................................................................................................ 32
4.1. Fermentation sur milieu liquide .......................................................................... 32
4.2. Fermentation sur milieu solide .............................................................................. 32
4.2.1. Avantages et inconvénients ....................................................................... 32
4.2.2. Substrats utilisés ........................................................................................ 34
4.2.3. Microorganismes utilisés ........................................................................... 36
4.3. Applications industrielles de la fermentation sur milieu solide ............................ 37
Chapitre II : Matériels et Méthodes
2- Matériels et méthodes .................................................................................................. 38
2.1. Matériel biologique ............................................................................................ 38
2.1.1. Revivification de l’espèce Aspergillus niger............................................ 38
2.1.2. Préparation de l’inoculum ......................................................................... 38
2.1.3. Dénombrement des spores......................................................................... 39
2.2. Méthodes de dosage ............................................................................................ 39
2.2.1. Mise en évidence de l’activité protéolytique ............................................. 39
a). Sur boites de pétri (Plat Agar) ............................................................ 39
b). Sur milieu solide par SSF .................................................................... 39
2.2.2. Mesure de l’activité coagulante ................................................................ 40
2.2.3. Mesure de l’activité protéolytique ............................................................ 41
2.2.4. Dosage des protéines ................................................................................ 42
2.2.5. Activité enzymatique de la protéase d’A. niger sur gel de
poly-acrylamide (Zymography) ........................................................................................... 43
2.2.6. Paramètres de purification ....................................................................... 44
7
2.3. Méthodes d’optimisation ................................................................................... 44
2.3.1. Optimisation de la production de la protéase par la méthode classique .... 44
2.3.1.1. Choix du milieu minéral .............................................................. 45
2.3.1.2. Température d’incubation ........................................................... 45
2.3.1.3. pH initial du milieu minéral ....................................................... 46
2.3.1.4. Taux d’humidité du substrat ........................................................ 46
2.3.1.5. Concentration d’inoculum ........................................................... 46
2.3.1.6. Temps d’incubation ..................................................................... 46
2.3.2. Optimisation à l’aide d’un plan factoriel fractionnaire ............................ 47
2.3.2.1. Forme et caractéristiques du plan ................................................ 47
2.3.2.2. Le plan factoriel fractionnaire appliqué ...................................... 47
2.4. Extraction et purification de la protéase d’A. niger ........................................ 49
2.4.1 Protocole d’extraction ............................................................................... 49
2.4.2. Précipitation au sulfate d’ammonium........................................................ 49
2.4.3. Dialyse ....................................................................................................... 50
2.4.4. Chromatographie d’exclusion moléculaire ............................................... 51
2.4.5. Chromatographie échangeuse d’ions......................................................... 51
2.4.6. Ultrafiltration ............................................................................................. 53
2.4.7. SDS-PAGE ................................................................................................ 54
2.5. Méthodes de caractérisation physico-chimique de la protéase d’A. niger .... 55
2.5.1. Influence du pH du lait sur l’activité enzymatique ................................... 55
2.5.2. Effet de la température du lait ................................................................... 55
2.5.3. Effet de la concentration en CaCl2 ............................................................ 55
2.5.4. Effet de la concentration en enzyme ......................................................... 56
2.5.5. Etude de la stabilité de la protéase d’A. niger .......................................... 56
2.5.5.1. Stabilité thermique ...................................................................... 56
2.5.5.2. Stabilité vis-à-vis du pH .............................................................. 56
2.6. Analyse statistique ............................................................................................... 56
8
Chapitre III : Résultats et Discussion
3- Résultats et discussion ................................................................................................. 57
3.1. Mise en évidence de l’activité protéolytique ..................................................... 57
3.2. Dénombrement des spores .................................................................................. 58
3.3. Optimisation de la fermentation par la méthode classique ............................. 59
3.3.1. Choix du milieu minéral ............................................................................ 59
3.3.2. Température optimale d’incubation .......................................................... 60
3.3.3. pH optimal de la production ...................................................................... 61
3.3.4. Taux d’humidité du substrat ...................................................................... 62
3.3.5. Concentration optimale d’inoculum .......................................................... 64
3.3.6. Temps d’incubation ................................................................................... 65
3.4. Optimisation de la fermentation à l’aide du plan factoriel fractionnaire ...... 67
3.4.1. Traitement statistiques des résultats .......................................................... 68
3.4.2. Effet des facteurs sur l’activité coagulante (AC) ...................................... 68
3.4.3. Effet des facteurs sur l’activité protéolytique (AP) ................................... 70
3.5. Purification partielle de la protéase d’A. niger ................................................. 71
3.5.1. Précipitation d’extrait enzymatique au sulfate d’ammonium.................... 71
3.5.2. Chromatographie d’exclusion moléculaire ............................................... 72
3.5.3. Chromatographie échangeuse d’ions......................................................... 73
3.5.4. SDS-PAGE ................................................................................................ 77
3.5.5. Activité protéolytique sur gel de poly-acrylamide .................................... 79
3.6. Caractérisation physico-chimique de la protéase d’A. niger ........................... 80
3.6.1. pH optimum ............................................................................................... 80
3.6.2. Température optimale d’activité ............................................................... 82
3.6.3. La concentration optimale en CaCl2 .......................................................... 83
3.6.4. La concentration en extrait enzymatique................................................... 84
3.6.5. Etude de la stabilité de la protéase d’A. niger .......................................... 85
3.6.5.1. Stabilité thermique ....................................................................... 85
3.6.5.2. Stabilité vis-à-vis du pH ............................................................... 87
9
Conclusion et Perspectives ................................................................................................ 89
Références Bibliographiques ............................................................................................ 92
Annexes
10
Liste des abréviations
A : Absorbance
AC : Activité Coagulante
AP: Activité Protéolytique
aw: activity of water
BBC : Bleu Brillant de Coomassie
BSA: Bovin Serum Albumin
CYA: Czapek Yeast Extract Agar
DTT: 1,4-Dithiothreitol
DIFP Diisopropylfluorophosphate
E-64: Transepoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino) butane
EDTA: Ethylenediaminetetra-acetic acid
EGTA: Ethyleneglycoltetra-acetic acid
FDA: Food and Drug Administration (USA)
GRAS: Generally Recognized As Safe
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
IgG: Immunoglobulin G
KDa: Kilo Daltons
M-9: Medium 9
MCA: Milk-Clotting Activity
p/v: poids/volume
PBS: Phosphate Buffer Salt
p-CMB: p-Chloromercuribenzoate
PDA: Potato Dextrose Agar
PA: Proteolytic Activity
PM: Poids Moléculaire
PMSF: Phenylmethanesulfonylfluoride
rpm: rotation par minute
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate (laurylsulfate).
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis
SSF: Solid-State Fermentation
TCA: TriChloroacetic Acid
11
Liste des figures
N° Titre des figures Page
1 Micelle de caséine, basée sur le concept original de Slattery et Evard puis
affinée ultérieurement par Schmidt et Holt (1982) (Coultate, 2002). 16
2.(a) La réaction primaire de la coagulation enzymatique du lait (Garnier
et al., 1968; Vignola, 2002). 22
2.(b) La réaction secondaire de la coagulation enzymatique du lait (Garnier
et al., 1968; Vignola, 2002). 23
3 Aspect microscopique (a) et représentation schématique (b) de la
conidiophore d’A. niger (Pasqualotto, 2010). 28
4 Microprocessus qui se produisent pendant la fermentation sur milieu
solide des cultures fongiques (Hölker et Jürgen, 2005). 37
5 Mise en évidence de l’activité protéolytique d’A. niger sur milieu
Czapek-Dox agar (modifié) à base de caséine (AP : anneau de
protéolyse, culture de 5 jours).
57
6 Courbe d’étalonnage de l’absorbance de la suspension fongique
d’A. niger en fonction du nombre de spores. 58
7 Influence de la composition des milieux salins sur la production de la
protéase d’A. niger. 59
8 Influence de la température d’incubation sur la production de la protéase
d’A. niger (solution Czapek-Dox). 60
9 Effet du pH initial du milieu minéral sur la production de la protéase
d’A. niger (solution Czapek-Dox, 30°C). 61
10 Effet du taux d’humidité sur la production de la protéase d’A. niger
(solution Czapek-Dox, 30°C, pH4). 63
11
Influence de la concentration en inoculum sur la production de la protéase d’A. niger (solution Czapek-Dox, 30°C, pH4, TH=39,21%).
65
12
Influence du temps d’incubation sur la production de la protéase
d’A. niger (solution Czapek-Dox, 30°C, pH4, TH=39,21%,
106 spores/ml).
66
13
Profil d’élution sur Sephadex G-100 de l’extrait enzymatique précipité
(80%) d’A. niger [colonne (1,5x30 cm), tampon citrate de sodium (0,1M;
pH 5,2), débit 0,275ml/min].
73
14
Profil d’élution sur DEAE- A50 de l’extrait enzymatique précipité (80%)
d’A. niger [colonne (1,5x15 cm), tampon citrate de sodium (0,1M;
pH 5,2), débit 0,245 ml/min].
74
15 Courbe étalon des marqueurs de poids moléculaires.
77
16
Profil électrophorétique des extraits enzymatiques d’A. niger au cours
des étapes de purification sur SDS-PAGE. 78
17
Activité protéolytique de la protéase purifiée d’A. niger par zymography 80
18
Effet du pH du lait sur l’activité coagulante de l’extrait enzymatique brut
et partiellement purifié d’A. niger (température du lait 35°C,
concentration en CaCl2 0,01M).
81
12
19
Influence de la température du lait sur l’activité coagulante de l’extrait
enzymatique brut et partiellement purifié d’A. niger (pH du lait 6,4 ;
concentration en CaCl2 0,01M).
82
20 Influence de la concentration en CaCl2 sur l’activité coagulante de
l’extrait enzymatique brut et partiellement purifié d’A. niger
(température 35°C, pH du lait 6,4).
84
21
Influence de la concentration en extrait enzymatique brut (a)
et partiellement purifié (b) sur l’activité coagulante (température 35°C,
pH du lait 6,4 ; concentration en CaCl2 0,01M).
85
22 Stabilité thermique des extraits enzymatiques brut et partiellement purifié
d’A. niger après 60min d’incubation à pH 5,2. 86
23 Stabilité vis-à-vis du pH des extraits enzymatiques brut et partiellement
purifié d’A. niger après 24h d’incubation à 4°C. 87
A.1 Produits de l’action de la plasmine sur la caséine-β-CN (Fox et al.,
2000). Annexe A
D.1 Courbe d’étalonnage de tyrosine.
Annexe D
E.1 Courbe d’étalonnage de BSA. Annexe E
13
Liste des tableaux
N° Titre du tableau Page
I Classification des protéases (Rao et al., 1998). 6
II Caractéristiques des quatre types de protéinases. 7
III État physicochimique du lait de vache (Chandan, 2006 ; Belitz et al.,
2009). 14
IV Composition moyenne des micelles de caséine bovine (FAO, 1995).
15
V Composition et certaines caractéristiques des caséines (Chandan, 2006 ;
Belitz et al., 2009). 17
VI Comparaison entre un caillé lactique (coagulation par voie acide) et un
caillé présure (coagulation par voie enzymatique) (Vignola, 2002). 21
VII Production des enzymes par Aspergillus niger.
30
VIII La matrice expérimentale utilisée pour mettre en place les expériences du
plan factoriel fractionnaire 24-1
. 48
IX Niveaux expérimentaux des quatre facteurs utilisés dans le plan factoriel
fractionnaire 24-1
. 48
X Mise en évidence de l’activité protéolytique d’A. niger par deux méthodes
57
XI Plan d’expériences et les résultats des activités enzymatiques de la
protéase d’A. niger. 67
XII Analyse de variance des facteurs du plan factoriel fractionnaire 24-1
: le
cas d’activité coagulante 68
XIII Analyse de variance des facteurs du plan factoriel fractionnaire 24-1
: le
cas d’activité protéolytique. 70
XIV Précipitation de l’extrait enzymatique brut d’A. niger au sulfate
d’ammonium 72
XV Paramètres de purification de la protéase d’A. niger. 75
A.I Composition moyenne du lait de vache (Vignola, 2002). Annexe A
A.II Composition moyenne et distribution des protéines du lait de vache (Roe,
2001; Chandan, 2006).
Annexe A
A.III Caractéristiques des micelles de caséine (Fox et al., 2000-2004;
Chandan, 2006). Annexe A
A.IV Composition et certaines caractéristiques des protéines solubles du lait
(Chandan et al., 2006 ; Belitz et al., 2009). Annexe A
A.V Les applications industrielles de la fermentation sur milieu solide (Pandey
et al., 2000 ; Manpreet et al., 2005 ; Wang et Yang, 2007 ; Singh
et Pandey, 2009).
Annexe A
A.VI Composition chimique du son de blé utilisé (Gais, 2011). Annexe A
E.I Préparation de la gamme d’étalonnage de la BSA (1mg/ml). Annexe E
14
Introduction
15
Introduction
La coagulation du lait est l’étape déterminante dans la production fromagère, assurée
par des enzymes protéolytiques possédant des propriétés coagulantes, dont la présure animale
qui renferme essentiellement de la chymosine est le principal agent coagulant appliqué à
l’échelle industrielle. Elle joue également un rôle crucial dans le développement équilibré de
l’odeur et la texture du fromage produit (Kumar et al., 2005; El-Bendary et al., 2007; Sathya
et al., 2009).
En effet, l’extraction de la présure à partir des caillettes des vœux en sevrage,
demanderait des sacrifices trop onéreux. En plus, la demande accrue de la production
mondiale du fromage combinée à l’insuffisance des quantités de caillettes disponibles et leurs
prix élevé ont provoqué une pénurie remarquable de cette enzyme protéolytique.
Afin de remédier à cette situation, plusieurs recherches ont été activement poussées ces
dernières années, visant à la mise en évidence des enzymes de remplacement dites succédanés
de la présure de différentes origines (animale, végétale et microbienne), capables de coaguler
le lait et d’assurer des meilleurs rendements fromagers (Raposo et Domingos, 2008; Shieh
et al., 2009; Vishwanatha et al., 2010; Mohamed Ahmed et al., 2010). L'industrie est à
présent capable de produire, en quantité pratiquement illimitée, ces succédanés à des prix
concurrentiels, où la fabrication des différents types de fromage est déjà réalisée (Bruno et al.,
2010).
De l'ensemble des travaux publiés, il ressort que les recherches menées sur les
substituts d'origine fongique sont jusqu'à présent les plus fructueuses, ayant la capacité de
produire les différents types de fromages avec une haute qualité comparable à celle obtenue
par la caillé présure. La majorité de ces enzymes fongiques sont produites principalement par
des genres d’Aspergillus, Mucor, Entothia, Rhizopus, Penicillium et Fusarium (Yu et Chou,
2005; Vishwanatha et al., 2010).
Ces espèces fongiques sont caractérisées par leur adaptation aux cultures solides à
base des substrats bon marché, facilitant ainsi l’extraction et la récupération des protéases
extracellulaires à partir des milieux de fermentation avec des rendements rentables tout en
réduisant les coûts d’exploitation (Sathya et al., 2009).
16
Selon le ministère de commerce, l’Algérie se considère l’un des plus grands
consommateurs du lait et de ses dérivés au Maghreb avec une moyenne de
110 l/personne/année, reste encore dépendante des entreprises étrangères du point de vue
matière première et agents coagulants (Nouani et al., 2009), où le développement d’une
production fromagère nationale basée sur des enzymes coagulantes extraites à partir des
sources locales, constitue le début du chemin de l’indépendance par la réduction des coûts
d’importation.
L’isolement d’une souche locale d’Aspergillus niger, à partir du sol de la région de
Boumerdès caractérisée par sa capacité de produire une protéase capable de coaguler le lait
(Fazouane et al., 2010), assure pour notre pays une autre source des succédanés de la présure
dont une étude approfondie s’est devenue nécessaire afin d’améliorer sa production et la
qualité des produits obtenus.
Dans cette optique, notre objectif porte essentiellement sur l’étude des quatre points
principaux :
L’optimisation de la production de cette enzyme par fermentation sur milieu
solide (SSF), en utilisant un résidu agroalimentaire peu coûteux (son de blé)
afin d’obtenir une meilleure activité coagulante par rapport à l’activité
protéolytique;
L’application des plans d’expériences à l’optimisation afin d’évaluer
l’influence des facteurs étudiés et de modéliser la production;
La purification de l’extrait enzymatique brut;
La caractérisation physicochimique et l’étude de la stabilité des extraits
enzymatiques brut et purifié.
17
Chapitre I
Synthèse Bibliographique
18
1- Les protéases
1.1. Généralités
Les protéases sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse des protéines, en scindant
la liaison peptidique qui lie deux acides aminés dans une chaine peptidique. Elles sont
normalement générées comme des pro-enzymes inactives (zymogènes) et selon les exigences,
elles seront converties en forme active par une protéolyse limitée (Mukherjee et al., 2008;
Benedykt et Katarzyana, 2008; Reddy et al., 2008; Wilkesman et Kurz, 2009).
Elles représentent la seule classe des enzymes qui occupe une place essentielle dans
les différentes applications industrielle, biotechnologique, médicinale et dans les domaines de
recherche (Coral et al., 2003; Sandhya et al., 2005). Elles ont été utilisées pour la première
fois dans l’industrie alimentaire comme des agents de coagulation pour la production de
fromage (Sandhya et al., 2004).
Les enzymes protéolytiques sont omniprésentes dans tous les organismes vivants vue
leur rôle essentiel dans la croissance cellulaire et dans la différentiation (Gupta et al., 2002;
Sandhya et al., 2005). Cependant, les protéases microbiennes sont plus intéressantes que
celles provenant des sources végétales ou animales depuis qu’elles présentent les
caractéristiques les plus recherchées dans les applications biotechnologiques:
La susceptibilité à la manipulation génétique;
La grande diversité biochimique des produits obtenus (Coral et al., 2002;
Sandhya et al., 2005; Aguilar et al., 2008).
Les microorganismes élaborent une large gamme des protéases, qui peuvent être intra
et/ou extracellulaires :
Les premières sont importantes dans les différents processus cellulaires
et métaboliques, tel que la sporulation, la différentiation, la maturation des
enzymes et la maintenance du réserve cellulaire en protéines.
Tandis que les autres sont essentielles pour l’hydrolyse des sources
nutritionnelles protéiques et pour inhiber la cellule d’absorber ou d’utiliser des
produits hydrolytiques (Gupta et al., 2002).
19
Parmi ces microorganismes, l’utilisation des champignons pour la production des
enzymes, y compris les protéases, est devenue très développée vue les avantages qu’ils
présentent depuis qu’ils sont devenus GRAS :
La production des enzymes extracellulaires, ce qui facilite la récupération à
partir du milieu de fermentation.
La possibilité d’obtenir des rendements importants en enzymes (Laxaman et al.,
2005; Hajji et al., 2008; Barnali et al., 2008).
1.2. Propriétés
Les protéases constituent un groupe très large et complexe contenant des enzymes qui
diffèrent dans leurs propriétés tels que : le site actif, le mécanisme catalytique, les optima du
pH et de température, le profil de la stabilité et la spécificité du substrat (Sumantha et al.,
2006; Vishwanatha et al., 2009).
La spécificité d’action des enzymes protéolytiques est régie par la nature de l’acide
aminé et d’autres groupes fonctionnels (aromatiques, aliphatiques ou la présence de sulfure)
autour de la liaison à hydrolyser (Sumantha et al., 2006; Benedykt et Katarzyana, 2008).
Ces enzymes sont très importantes du fait qu’elles ne contrôlent pas seulement les
réactions protéolytiques, mais aussi elles régulent les diverses cascades enzymatiques
impliquées dans le métabolisme cellulaire tels que la décomposition des lipides et des
glucides.
Les protéases sont capables de modifier les propriétés biologiques des chaînes
polypeptidiques suite à la coupure des liaisons peptidiques (activation, inactivation ou une
protéolyse non spécifique pendant la dégradation). La raison pour laquelle les protéases
peuvent être dangereuses pour les cellules en altérant leur environnement. De ce fait, la
cellule a développé une large gamme des mécanismes pour contrôler l’activité protéolytique.
Cette régulation peut être effectuée à n’importe qu’elle étape de l’expression des gènes (la
transcription depuis l’opéron, la traduction, les modifications post-traductionnels, l’interaction
avec les inhibiteurs et d’autres protéines) (Benedykt et Katarzyna, 2008).
20
1.3. Classification
D’après "The Enzyme Commission of Classification", les protéases appartiennent au
groupe 3 (les hydrolases) et sous groupe 4 (qui hydrolysent les liaisons peptidiques) (Rao
et al., 1998; Sumantha et al., 2006; Wilkesman et Kurz, 2009 ).
Auparavant, la classification a été basée essentiellement sur la source d’enzyme,
l’action de catalyse, le poids moléculaire et la spécificité de substrat ou de la charge.
Cependant, un système plus rationnel s’utilise actuellement basé sur la comparaison des sites
actifs, les mécanismes d’action et sur la structure tridimensionnelle (Aguilar et al., 2008).
Les protéases peuvent être reparties en deux grands groupes en fonction de leur
capacité de couper les liaisons peptidiques N- ou C-terminales (exopeptidases : amino-
peptidases, carboxy-peptidases respectivement), ou les liaisons peptidiques internes
(endopeptidases, appelées également les protéinases) (Tableau I) (Sumantha et al., 2006;
Benedykt et Katarzyna, 2008; Belitz et al., 2009).
Les enzymes protéolytiques sont également distinguées selon la présence ou l’absence
de groupements chargés dans une position relative à la liaison sensible et qui sont classifiées
suivant :
Le pH optimum : protéases acides, alcalines et neutres;
Le substrat spécifique : collagénases, kératinases, élastases,...
L’homologie avec d’autres protéases antérieurement étudiées comme la trypsine, la
pepsine,… (trypsin-like, pepsin-like,…).
Selon "The International Union of Biochemistry", les protéinases sont divisées en
quatre groupes en fonction du groupement fonctionnel au niveau du site actif et la sensibilité
au différents inhibiteurs, dont certaines de ses propriétés sont représentées dans le tableau II
(Sumantha et al., 2006; Aguilar et al., 2008).
21
Tableau I : Classification des protéases (Rao et al., 1998).
Protéases
Mode d’action EC N°
Exopeptidases
Amino-peptidases
Dipeptidyl peptidase
Tripeptidyl peptidase
Carboxy-peptidases
protéase type Sérine
Métallo-protéase
Protéase type cystéine
Peptidyl dipeptidase
Dipeptidase
Omega peptidases
3.4.11
3.4.14
3.4.14
3.4.16-3.4.18
3.4.16
3.4.17
3.4.18
3.4.15
3.4.13
3.4.19
3.4.19
Endopeptidases
Protéase à sérine
Protéase à cystéine
Protéase à acide aspartique
Métallo-protéase
Endopeptidases (mécanisme
catalytique est inconnu)
3.4.21–3.4.34
3.4.21
3.4.22
3.4.23
3.4.24
3.4.99
Ces cercles représentent les résidus d'acides aminés dans la chaîne polypeptidique ;
Les cercles pleins indiquent les acides aminés terminaux ;
Les étoiles signifient les terminus bloqués ;
Les flèches indiquent les sites d'action d'enzyme.
1.3.1. Les protéases à acide aspartique
Les protéases aspartiques appelées également protéases acides, sont des enzymes
protéolytiques dont l’activité catalytique dépend d’un résidu d’acide aspartique présent au
niveau du site actif de l’enzyme. Elles ont été regroupées en trois familles, à savoir, la pepsine
(A1), retro-pepsine (A2), et les enzymes de para-rétrovirus (A3).
La majorité de ces enzymes ont à un pH isoélectrique entre 3 et 4,5 et une activité
maximale à des faibles pH (généralement de 3 à 5) qui est déterminée par la position
et l’orientation de tous les résidus à proximité du site actif (Rao et al., 1998).
22
Tableau II : Caractéristiques des quatre types de protéinases.
23
Les protéases acides sont reconnues par leur inhibition spécifique par le pepstatin, un
pentapeptide produit naturellement par des souches de Streptomyces sp. (Kocabiyik et Özel,
2007). Il contient deux résidus d’acide aminé inhabituel: la statine. L'oxygène de l'hydroxyle
de la première statine forme des liaisons hydrogènes avec les deux résidus catalytiques
d’aspartate, ce qui provoque l’inhibition (Yang et Quail, 1999).
1.3.2. Les protéases à sérine
Les protéases à sérine constituent une sous-classe d’endopeptidases d’un grand intérêt
au niveau industriel. Elles comportent généralement dans leur site actif trois résidus d’acides
aminés essentiels à la catalyse (Ser, His, Asp) formant la triade catalytique (Rawlings, 1998).
Chaque enzyme présente une spécificité particulière plus ou moins étroite vis-à-vis des
résidus après lesquels elle coupe la chaîne peptidique, sur cette base on distingue trois
groupes :
Le type trypsine provoque l’hydrolyse de la protéine après un site chargé
positivement;
Le type chymotrypsine qui hydrolyse les protéines après un résidu hydrophobe
de haut poids moléculaire;
Le type élastase coupe les protéines après un résidu hydrophobe de faible
poids moléculaire.
1.3.3. Les protéases à cystéine
Les protéases à cystéine, ou thiols, sont largement représentées dans le monde
procaryote et eucaryote où elles sont impliquées dans de nombreux processus protéolytiques
intra et extracellulaires, dont la papaïne d’origine végétale est la plus utilisée à l’échelle
industrielle. La plupart de ces enzymes sont activées seulement en présence d’agents
réducteurs comme la cystéine ou l’acide cyanhydrique (HCN). Leur activité est liée à la
présence de Cys et His au niveau du site actif.
Il y’a eu un intérêt croissant pour ces protéases, en particulier pour la modification des
protéines alimentaires et pour la synthèse des peptides biologiquement actifs et leurs
analogues (Rao et al., 1998; Wilkesman et Kurz, 2009).
24
1.3.4. Les métallo-protéases
Les métallo-protéases sont les plus diversifiés de tous les types des protéases,
caractérisées par une activité catalytique qui exige la présence d'un ion métallique divalent au
niveau de leurs site actif habituellement le Zn2+
, bien que dans certains cas, autres métaux de
transition (éléments de groupe B du tableau périodique) peuvent s'y substituer tel que le Mn2+
(cas de la prolidase et la prolinase).
Ces enzymes sont généralement des protéases neutres, dont le pH optimum se situe
près de 7, mais certaines d’entre eux sont des protéases alcalines, avec un pH optimum autour
de 10. La stabilité de ces protéases augmente considérablement en cas d’addition des ions
Ca2+
au milieu et au contraire elle diminue si des agents séquestrants sont ajoutés. Ainsi, ces
protéases sont inactivées en présence d’agents chélateurs forts (ex : EDTA), qui enlèvent le
Zn+2
, alors que l’enlèvement des ions Ca+2
affecte seulement leur thermo-stabilité.
(Wilkesman et Kurz, 2009; Belitz et al., 2009).
1.4. Les applications des protéases
Les protéases sont parmi les trois plus grands groupes des enzymes industrielles
(hydrolases), comptent pour environ 60-65% des ventes totales dans le monde entier des
enzymes en raison de leurs applications dans plusieurs secteurs industriels (Wang et al.,
2005; Chellappan et al., 2006; Barnali et al., 2008 ; Mukherjee et al., 2008).
1.4.1. Industrie alimentaire
a). La fabrication du fromage
Des recherches approfondies ont permis de prouver que la majorité des protéases
microbiennes acides possède une grande capacité à coaguler le lait pour former le caillé,
l’étape clé dans la production fromagère (Neelakantan et al., 1999; Sumantha et al., 2006);
ce qui facilite l'expansion de l'industrie fromagère, dont le développement a été limité par la
pénurie de la présure animale.
Le traitement chimique, par des agents oxydants, appliqué à l’extrait enzymatique
obtenue à partir de Mucor meihei permet d'obtenir une enzyme aux propriétés similaires à
celles de la présure de veaux, en termes de productivité et la qualité du produit final (Aguilar
et al., 2008).
25
Dans l'industrie du lait, les protéases acides, neutres et basiques produites par
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Thermoascus aurantiacus, Irpex lactis, Endothia
parasitica et autres espèces du genre Mucor ont été également utilisées (Channe et Shewale,
1998; Merheb et al., 2007; Aguilar et al., 2008). La plupart de ces préparations engendre
l’apparition des arômes anormaux et un goût amer. La protéase produite par Pseudomonas
fluorescens R098 s’utilise actuellement comme un agent d’amélioration (Koka et Weimer,
2000).
b). Les hydrolysats des protéines
Les protéases jouent un rôle important dans la préparation des hydrolysats de protéines
de haute valeur nutritive à partir de divers substrats protéiques naturels (Gupta et al., 2002):
Dans l'industrie de panification, les protéases d’Aspergillus oryzae (endo et exo-
peptidases) s’utilisent pour modifier le gluten de blé (protéine insoluble) par
protéolyse limitée, ce qui réduit le temps de mélange et augmente le
volume du pain (Sumantha et al., 2006).
Certaines protéases microbiennes (alcalines et neutres) jouent un rôle important
dans le traitement de la sauce de soja, ainsi que dans l'hydrolyse de protéines
de soja (ex : protéase alcaline du Bauveria felina), afin d’améliorer les
propriétés fonctionnelles et réduire l'amertume des préparations (Agrawal
et al., 2005; Aguilar et al., 2008).
D'autres applications, qui exploitent les propriétés hydrolytiques des protéases
sont : l’hydrolyse de la gélatine, la récupération des protéines de viande,
l'hydrolyse des protéines de poissons et des déchets de crustacés pour
produire la chitine par des protéases de Bacillus subtilis (Yang et al., 2000;
Sumantha et al., 2006).
La bromélaïne et la papaïne améliorent la valeur nutritive des aliments. En
plus, cette dernière s’utilise dans la fabrication des extraits de levures et des
POU (Protéines d'Organismes Unicellulaires), dans l'extraction des arômes et
des composés colorés des plantes et dans la production des milieux de culture
microbiologiques (Sumantha et al., 2006).
26
1.4.2. Synthèse des peptides
Dans des milieux aqueux, les protéases catalysent l'hydrolyse des liaisons peptidiques,
mais la réaction se procède en sens inverse (synthèse) dans des médias où l'eau est restreint
(présence des solvants organiques) (Gupta et al., 2005; Mei et Jiang, 2005; Kumar et Bhalla,
2005; Wang et al., 2008).
Récemment, l'application des protéases (principalement des protéases à serine, à acide
aspartique et les métallo-protéases) dans la production de certains oligopeptides
(principalement des di- et tri-peptides) a reçu une grande attention comme une voie
alternative à l’approche chimique en raison de ses avantages. Cependant, l'utilisation de ces
biocatalyseurs est limitée par la spécificité et l'instabilité de l'enzyme en présence des
solvants organiques (Kumar et Bhalla, 2005; Wang et al., 2008).
Par exemple, l'aspartame (L-aspartyl-L-phénylalanine), un édulcorant artificielle à
faible pouvoir calorifique, a été synthétisé par voie enzymatique en utilisant la métallo-
protéase "thermolysine" produite par Bacillus thermoprotelyticus. La protéase provenant de
Pseudomonas aeruginosa PST-01 induit également la synthèse de l’aspartame avec une
grande stabilité en milieux organiques par comparaison avec la thermolysine permettant
d’avoir des meilleurs rendements (Aguilar et al., 2008 ; Ogino et al., 2010).
1.4.3. Gestion des déchets industriels et ménagers
La possibilité de dépuration des déchets issus de différents secteurs, en les utilisant
comme des substrats pour diverses bio-productions d'intérêt économique potentiel, a été
largement développée (Roukas, 1999; Guerra et Pastrana, 2003; Hernandez et al., 2006).
Récemment, l'utilisation des protéases dans la gestion des déchets provenant de
diverses industries agro-alimentaires et activités ménagères, développe un nouvel espace
dans la gestion des déchets.
Les enzymes protéolytiques de Bacillus subtilis, Bacillus amyliquefaciens,
Streptomyces sp. et de différentes souches d'Aspergillus sont actuellement utilisées dans ce
domaine (Gupta et al., 2002; Hernandez et al., 2006).
27
1.4.4. Utilisation médicale
Les enzymes protéolytiques sont également utilisées pour développer des produits
d'importance médicale :
Les protéases d'Aspergillus s’appliquent pour soulager les troubles digestives
gastro-intestinaux tels que la dyspepsie.
La brinase, une protéase acide plasmine-like, hydrolyse la fibrine et le
fibrinogène. Elle est appliquée sur des patients en hémodialyse chronique
avec des canules artério-coagulés.
La collagénase, qui hydrolyse le collagène natif, a été utilisée pour le
débridement des ulcères cutanés et les brûlures, trouve également une
application dans le traitement des cellules pathologiques des disques
intervertébraux.
La protéase alcaline de Bacillus sp. CK 11-4 a une activité fibrinolytique
appliquée comme un agent thrombolytique.
La protéase neutre "dispase" (amino-peptidase) est une enzyme produite par
Bacillus polymyxa, exerce une activité protéolytique douce, ce qui la fait
très utile pour l'isolement de cellules primaires et secondaires (sub-culture), car
elle maintient l'intégrité des membranes cellulaires (Gupta et al., 2002 ;
Sumantha et al., 2006).
1.4.5. Industrie des détergents
Les protéases présentent un grand intérêt dans l'industrie des détergents pour leur
capacité à favoriser l'élimination des taches protéiques vue leur avantage unique qui ne peut
autrement être obtenue avec la technologie des détergents classiques (Gupta et al., 2002).
Maintenant, elles sont ajoutées comme ingrédients clés, ce qui représente environ 25% des
ventes totales dans le monde entier des enzymes.
Parmi les principales conditions préalables pour l'utilisation des protéases dans la
production des détergents sont : l’action sur une large gamme des substrats, l’activité
et la stabilité à des pH et à des températures élevés et en présence des agents
oxydants additionnés.
28
Le premier détergent contenant l'enzyme bactérienne a été introduit sur le marché en
1956 sous le nom commercial Bio-40 (Mukherjee et al., 2008). Aujourd'hui, toutes les
protéases des détergents actuellement commercialisés sont des protéases sérines (subtilisines
et/ou des protéases alcalines) produites par Bacillus sp. (Chellappan et al., 2006; Guo et Ma,
2008).
Récemment, les protéases produites par un petit nombre de sources fongiques telles
que Penicillium sp, Aspergillus parasiticus, Condiobolus coronatus et Engyodontium album
ont été étudiées pour une telle application (Rashbehari et al., 2003; Sandro et al ., 2003;
Chellappan et al., 2006).
1.4.6. Industrie photographique
Les protéases alcalines et neutres jouent un rôle crucial dans le bio-traitement des
films photographiques pour la récupération d'argent (Sumantha et al., 2006). Ce type de films
contient entre 1,5 et 2% d’argent dans leur couche de gélatine, qui peut être utilisé comme
une bonne source d'argent pour des fins variés.
Traditionnellement, cet argent est récupéré par la combustion, ce qui provoque une
pollution environnementale indésirable. En plus, la base du film en polyester ne peut pas être
recouvrée par cette méthode.
De fait que l'argent est lié à la gélatine, il est possible de procéder à une extraction de
la couche protéique par des traitements protéolytiques. L'hydrolyse enzymatique de la gélatine
permet non seulement l'extraction d'argent, mais aussi le recyclage de la base du film (Gupta
et al., 2002).
29
2- La coagulation du lait
2.1. Caractéristiques du lait
Le lait est un milieu aqueux opaque, blanc plus ou moins jaunâtre selon la teneur en
β-carotène de sa matière grasse, la riboflavine (vitamine B2) de la phase aqueuse et les
micelles protéiques, légèrement sucré, d’une saveur douceâtre et d’un pH légèrement acide,
proche de la neutralité (6,6 à 6,8) (Vignola, 2002; Belitz et al., 2009).
Constitué majoritairement d’eau, le lait est un sérum comportant une émulsion de
matière grasse, une suspension de matière protéique caséeuse, du lactose, des sels minéraux,
des protéines solubles et des traces d’éléments divers (Coultate, 2002; Chandan, 2006). Ces
constituants se répartissent en trois phases indiquées au niveau du tableau III (voir la
composition du lait : annexe A).
Tableau III : État physicochimique du lait de vache (Chandan, 2006 ; Belitz et al., 2009).
2.2. Les caséines du lait
Les caséines (groupe protéique qui précipite à pH 4,6 à 20°C) représentent environ
80% des protéines totales du lait. Ce sont des polypeptides phosphorés associés surtout à des
constituants minéraux de manière à former des micelles de phospho-caséinate de calcium
(Roe, 2001 ; Fox et al., 2000-2004; Chandan, 2006). La composition moyenne des micelles
de caséine est donnée dans le tableau IV.
Le compartiment Pourcentage
(%)
Diamètre des
particules (nm)
Types de particules
Phase aqueuse 92,8 0,5 Lactose, sels et d’autres substances
Suspension colloïdale
Solution colloïdale
2,8
0,01
0,6
10-300
10
3-6
Micelles de caséines
Particules lipoprotéiques
Protéines globulaires solubles
Émulsion 3,8 2000-6000 Matières grasses (forme globulaire)
30
Tableau IV : Composition moyenne des micelles de caséine bovine (FAO, 1995).
2.2.1. Organisation micellaire des caséines
La micelle de caséine présente une structure sphérique d’environ 180 nm (valeurs
limites entre 30 à 300nm) constituée de sub-micelles de 8 à 20 nm (dont le nombre varie de
10 à 100). Elle est très hydratée (2-4 g d’H2O/g de protéine) et environ 7% de son extrait sec
est composé de sels dans l’espace inter sub-micellaire (caractéristiques des micelles de
caséine voir tableau A.III, annexe A).
Chaque sub-micelle est constituée de deux compartiments :
Un noyau fortement hydrophobe composé exclusivement des caséines αs
et β, reliées par des ponts salins de phosphate de calcium (avec des résidus
phosphosérine et d’acide glutamique), par des liaisons hydrophobes
et électrostatiques.
Une enveloppe périphérique hydrophile (épaisseur de 5 à 20 nm), contient
majoritairement des caséines-κ, αs et quelques monomères de caséine-β.
Elle se caractérise par une charge négative maintenant les micelles en
suspension (hydrosolubles).
Les sub-micelles les plus riches en caséine-κ sont situées en surface de la micelle, ce
qui la stabilise. Les portions C-terminales de la caséine-κ hérissent la micelle et l’enveloppent
d’une chevelure périphérique particulièrement hydrophile (Coultate, 2002; Fox et al., 2004;
Chandan, 2006; Belitz et al., 2009) (figure 1).
Constituants Moyennes (g/100g d’extrait sec)
Constituants protéiques
Caséine-αs1
Caséine-αs2
Caséine-β
Caséine-κ
Fragments caséiques-γ
92
33
11
33
11
4
Constituants minéraux
Calcium
Magnésium
Ion phosphate
Ion citrate
Autres (minéraux, sucres)
8
2,9
0,1
4,3
0,5
0,4
31
Propriétés des caséines
On distingue les caséines αs1, αs2, β et κ présentent dans le lait de vache avec les
proportions : 40, 10, 35 et 12 % (p/p). La caséine-γ entre également dans la composition de la
micelle de caséine issue comme les protéoses-peptones de la protéolyse de la caséine-β par la
plasmine (voir figure A.1, annexe A). Ce sont de petites protéines dont le poids moléculaire
varie entre 12 et 21 KDa (Tableau V) (Scott et al., 1998; DeMan, 1999; Chandan, 2006;
Belitz et al., 2009).
Figure 1: Micelle de caséine, basée sur le concept original de Slattery et Evard, puis affinée
ultérieurement par Schmidt et Holt (1982) (Coultate, 2002).
(a) Une coupe transversale d'une sub-micelle typique : les trois types de molécules de caséine sont représentés
sous forme de boule de rugby, mais en réalité elles sont plus complexes.
(b) Des liens entre sub-micelles sont constitués de chaînes de phosphate de calcium colloïdal attachées aux
résidus phospho-sérine des caséine-β et α, qui sont absents au niveau des régions dominées par le
tri-saccharide de la caséine-κ.
(c) Formation de la micelle de caséine : une sub-micelle contenant peu ou pas de caséine-κ forme des liens
avec d'autres micelles dans toutes les directions et aura donc tendance à être trouvé dans le centre d'une
micelle. Par contre, une sub-micelle avec une proportion élevée et localisée de la caséine-κ forme des liens
dans un nombre limité de directions et se trouve vers l'extérieur de la micelle. Cela provoque l’augmentation
de la surface de la micelle. L’addition supplémentaire des sub-micelles diminue jusqu'à une taille limite,
définie par la courbure de la surface micellaire plutôt que le diamètre, est atteint.
32
Tableau V : Composition et certaines caractéristiques des caséines (Chandan, 2006 ; Belitz
et al., 2009).
Au pH normal du lait, la charge nette des micelles est négative, ce qui provoque la
répulsion entre eux. De plus, elles ont une grande capacité à absorber l’eau en formant une
enveloppe d’hydratation qui les protège.
Prise individuellement, les caséines-α et β sont sensibles à la présence de calcium
(elles précipitent), mais elles sont très peu sensibles aux enzymes protéolytiques. Par contre,
la caséine-κ n’est pas affectée par la présence de calcium, mais elle est par les protéases.
L’agrégation de ces trois constituants confère à la micelle une grande stabilité dans le lait
et empêche sa coagulation par les ions du calcium grâce à la caséine-κ (Roe, 2001; Vignola,
2002 ; Fox et al., 2004; Belitz et al., 2009).
Cette dernière est la seule caséine glycosylée au niveau d’un ou plusieurs résidus
thréonine (également des résidus sérine) dans sa partie C-terminale par un tri-saccharide :
α-N-acétylneuraminyl-(2→6)-α-galactosyl-(1→6)-N-acétylgalactosamine, dont la fixation à la
thréonine 133 est la position normale d’attachement (les autres positions possibles sont
thréonine 131, 135 et 136). Ces oligosaccharides augmentent la charge négative, les caractères
hydrophile et hydrodynamique de la caséine-κ (Coultate, 2002; Fox et al., 2004; Belitz et al.,
2009).
Caséines αs1
αs2 β
κ
Proportion du total en caséine (%) 38 10 35 13
Résidus d’acides aminés 199 207 209 169
Groupements phosphate 8 10-13 5 1
Résidus cystéine - 2 - 2
Poids moléculaire (Da) 23164 25388 23983 19038
pH isoélectrique 4,1 4,1 4,5-5,3 4,1-4,5
Sensibilité au calcium (précipitation)
(concentration en Ca à 37°C)
++
(3-8mM)
+++
(<2mM)
+
(8-15mM)
-
33
2.3. La coagulation du lait
La coagulation du lait est une étape décisive dans la fabrication de toutes les variétés
de fromage. Il s’agit en général de la transformation du lait liquide en un gel, appelé
coagulum ou caillé qui, après un certain nombre de transformations, deviendra un fromage
(El-Bendary et al., 2007; Shieh et al., 2009; Mohamed Ahmed et al., 2010).
Elle correspond à une déstabilisation de l’état micellaire originel des caséines qui
floculent puis se soudent pour former un caillot lactique ou présure, retient selon le cas plus
ou moins de matière grasse, de minéraux, d’eau et des éléments solubles, ce qui a une
incidence directe sur les rendements fromagers. On peut provoquer la coagulation par
acidification, par l’action d’une enzyme ou encore par l’action combinée des deux (Vignola,
2002; Fox et al., 2004; Belitz et al., 2009).
Le processus de la coagulation est étroitement lié à l’organisation structurale de la
micelle de caséine quelque soit le chemin suivi. De ce fait, provoquer la coagulation du lait
revient à jouer sur les propriétés physicochimiques des micelles de caséines et à modifier
l’équilibre entre la phase soluble et la phase colloïdale (Vignola, 2002; Fox et al., 2004;
Osintsev et Qvist, 2004).
2.3.1. Coagulation par acidification
Pendant la coagulation acide, le pH du lait diminue et les propriétés physicochimiques
des micelles de caséine sont profondément modifiées.
L'abaissement du pH par acidification réduit en effet jusqu'à la neutralisation de la
charge négative des micelles de caséine, due à la fixation des protons H+ libres par certains
acides aminés acides (acide glutamique, acide aspartique et la phospho-sérine). Au pH 5,2
(à 20°C), elles deviennent suffisamment instables pour former un début d'agglomération, alors
qu'au pH 4,6 (point isoélectrique de la caséine) la charge électrique est devenue complètement
neutre, entraînant ainsi la coagulation complète.
De plus, l'acidité du milieu a pour effet d'augmenter la solubilité des minéraux, de
sorte que le calcium et le phosphore organiques de la micelle passent graduellement en
solution dans la phase aqueuse. Il s'ensuit donc un caillé partiellement déminéralisé qui laisse
facilement traverser le lactosérum.
34
Le caractère acide du caillé va autoriser un allongement significatif de la durée de
conservation au froid des produits, en ralentissant la croissance microbienne qui provoque
avec le temps l’altération du produit (Fox et al., 2004; Tamime, 2006; Belitz et al., 2009).
En fromagerie, ce type de coagulation est provoqué généralement par voie biologique
(acidification lente) en faveur de ferments lactiques (Lactococcus, Lactobacillus,
Streptoccocus, Enterococcus, Pediococcus), qui métabolisent le lactose (source d’énergie) en
acide lactique par fermentation, ce qui entraîne une gélification avec une forte capacité de
rétention d’eau (Garg et Johri, 1993; Coultate, 2002; Vignola, 2002; Belitz et al., 2009).
L’addition d’un acidogène, fréquemment le glucono-delta-lactone qui libère l’acide
gluconique après une étape d’hydrolyse, assure également une acidification lente.
Par contre, l’addition directe d’un acide (habituellement l’acide lactique ou
chlorhydrique) provoque une diminution rapide du pH du lait, ce qui stimule l’agrégation et la
précipitation des micelles avec une synérèse importante. Cette méthode de coagulation
s’utilise pour certains types de fromage, quand la texture recherchée du produit est plus
importante que l’odeur (Fox et al., 2000-2004).
2.3.2. Coagulation par voie enzymatique
Il s'agit dans ce cas d'ajouter au lait une enzyme protéolytique qui a la propriété de
coaguler le complexe caséique, quelque soit son origine (animale, végétale ou microbienne).
La présure d’origine animale, constituée principalement de chymosine (~95% de
l’activité coagulante de l’enzyme) et d’un peu de pepsine, est le coagulant le plus utilisé et le
mieux adapté à la production fromagère. Elle possède une activité très spécifique, car elle
n’hydrolyse que la caséine-κ au niveau de la liaison Phe 105-Met106 (Kumar et al., 2006;
Raposo et Domingos, 2008; Sathya et al., 2009; Mohamed Ahmed et al., 2010; Bruno et al.,
2010).
En plus de la coagulation du lait, la présure joue un rôle très important pendant la
maturation du fromage, un processus complexe permettant le développement équilibré de la
texture et l’odeur (Kumar et al., 2005; Raposo et Domingos, 2008; Sathya et al., 2009).
35
Il est important de noter que le caillé présure n'est pas déminéralisé comme le caillé
acide, c'est la différence fondamentale entre les deux types (tableau VI). Le calcium en
particulier, du même que le phosphore, jouent un rôle important dans le mécanisme de
coagulation et demeurent des éléments constitutifs du gel de caséine. Cette situation lui
attribue des propriétés particulières, qui se répercutent principalement au niveau de
l'égouttage et du raffermissement du caillé et le rendent capable de supporter des interventions
mécaniques au cours de la fabrication (Vignola, 2002).
Cependant, la propriété de coagulation des protéases ne suffit pas de les rendre toutes
aptes à produire des fromages de qualité. Il faut tenir compte de leur activité protéolytique
non spécifique supplémentaire qui provoque l’hydrolyse des caséines α et β avec libération de
peptides. Cette hydrolyse non spécifique peut se produire pendant et après la fabrication
fromagère.
Dans le cas où elle est trop élevée, il peut en résulter plusieurs inconvénients : une baisse du
rendement fromager par perte des protéines dans le lactosérum, incorporation des lipides dans
le coagulum, une texture molle et l’apparition de goût amer et des fragrances anormaux
(Channe et Shewale, 1998; Fox et al., 2000; Kumar et al., 2005; Wu et al., 2008; Bruno et al.,
2010; Vishwanatha et al., 2010).
Certaines enzymes protéolytiques d’origine microbienne sont utilisées à l’échelle
industrielle comme des succédanées à la présure pour la fabrication fromagère; ce cas
concerne les protéases à acide aspartique du Mucor pusillus, Mucor miehei, Endothia
parasitica, Irpex lacteus, Aspergillus niger, Kluyveromyces lactis et d’Escherichia coli du fait
quelles présentent une faible activité protéolytique comparée à celle coagulante (Channe
et Shewale, 1998; Dutt et al., 2009).
2.3.3. La coagulation mixte
Elle est provoquée par action conjointe de la présure et de l’acide lactique où la
formation du coagulum se fait généralement sous l’action dominante de la présure. C’est
ensuite, progressivement, qu’il acquiert des caractères lactiques. Cette coagulation mixte
fournit des caillés aux propriétés intermédiaires, moins caractéristiques que celles des caillés
obtenus par un seul mode de coagulation (Vignola, 2002; Coultate, 2002).
36
Tableau VI: Comparaison entre un caillé lactique (coagulation par voie acide) et un caillé
présure (coagulation par voie enzymatique) (Vignola, 2002).
Paramètres Type de caillé
Lactique Présure
Temps de floculation long (de 6 à 15 heures) court (de 10 à 30 minutes)
pH faible <4,60 élevé (6,5-6,7)
Minéralisation faible (0,1g Ca/100g) élevée (1-1,2g Ca/100g)
Structure micellaire détruite état micellaire modifié
Teneur en eau élevée faible
Pouvoir tampon faible élevé
Teneur résiduelle en
lactose
élevée faible
Type de texture plastique, fragile élastique, solide
Durée de conservation faible (quelques semaines) élevée (plusieurs mois)
2.4. Mécanisme de la coagulation
Le mécanisme d’action de la présure est assez bien établi et comporte deux phases :
2.4.1. Réaction primaire (phase enzymatique)
Elle correspond à une attaque de la coagulase sur la caséine-κ au niveau de la liaison
Phe105-Met106 . La chaîne peptidique se trouve ainsi coupée en deux ségments inégaux :
le ségment 1-105 correspond à la paracaséine-κ liée aux caséines-α et β, reste integrée
à la micelle hydrophobe.
le segment 106-169 (C-terminal du caséine-κ): le caséinomacropeptide (CMP)
hydrophile contenant tous les glucides, est libéré dans le lactosérum (exemples :
l’acide pyroglutamique, l’acide pyrrolidone coarboxylique,...). Ces fragments sont
caractérisés par l’absence des acides aminés aromatiques (Phe, Trp, et Tyr) et l’Arg,
et par des niveaux elevés en acides aminés acides et hydroxyles [figure 2.(a)].
37
Lors de la libération du CMP, il se produit une diminution importante de la charge
électrique des micelles et de leur degré d’hydratation. Deux facteurs de stabilité se trouvent
ainsi modifiés, commence alors la réaction secondaire dont le mécanisme est encore mal
reconnu (Fox et al., 2000-2004; Coultate, 2002; Osintsev et Qvist, 2004; Egito et al., 2007;
Park et al., 2007; Vishwanatha et al., 2010).
2.4.2. Réaction secondaire (phase d’agglomération ou gélification)
Les micelles déstabilisées peuvent se rapprocher et former des liens hydrophobes. Les
ions calcium s’uniraient à la partie chargée négativement des micelles par des ponts salins,
diminuant donc les répulsions électrostatiques auxquelles elles sont soumises et favorisent
ainsi leur agrégation. Cette phase est facilement observable par la formation du coagulum
[figure 2.(b)] (Vignola, 2002; Fox et al., 2004; Osintsev et Qvist, 2004).
Figure 2.(a) : La réaction primaire de la coagulation enzymatique du
lait (Garnier et al., 1968; Vignola, 2002).
(a)
38
Cependant, pour que cette phase débute, il faudrait qu’au moins 85% à 90% de la
caséine-κ soit hydrolysée. De plus, les sites d’agrégation des micelles ne seraient pas répartis
uniformément à la surface, mais seraient très localisés, ce qui explique que la déstabilisation
des micelles ne conduit pas à un précipité dense, mais à un réseau protéique lâche
emprisonnant la totalité de la phase aqueuse (Fox et al., 2000; Vignola, 2002).
2.5. Facteurs influençant la coagulation
En pratique, la coagulation du lait peut se caractériser par trois paramètres et qui sont
influencés par plusieurs facteurs :
le temps de prise (temps de floculation),
le taux (la vitesse) de raffermissement,
la fermeté maximale du coagulum.
Figure 2.(b) : La réaction secondaire de la coagulation enzymatique
du lait (Garnier et al., 1968; Vignola, 2002).
(b)
39
2.5.1. La température
La coagulation du lait par la présure est fortement dépendante de la température :
Au dessous de 10°C, la gélification ne se produit pas (phase secondaire) mais
l’enzyme agit (phase primaire);
Entre 10 et 20°C, la coagulation est lente;
Au-dessus de 30°C, elle est progressive jusqu’à atteindre l’optimum à 42°C;
En plus de 42C°, elle diminue progressivement pour disparaître à 60°C suite à
l’inactivation de l’enzyme (Fox et al., 2000-2004; Vignola, 2002).
2.5.2. Le pH
Le pH joue un rôle primordial dans la coagulation du lait. Lorsque le pH descend
au-dessous du pH du lait (6,6-6,8), le temps de prise est plus court, le taux de raffermissement
augmente et le gel devient plus ferme et atteint un maximum entre 5,8 et 6,0. En revanche, à
des pH supérieurs à 7,0 il n’y a plus de coagulation, la présure étant rapidement inactivée. Le
pH optimal de cette dernière se situe entre 5,0 et 5,5.
La phase secondaire (agglomération) est moins sensible à un abaissement du pH que
la phase enzymatique. En passant du pH 6,7 à 5,6 le taux d’hydrolyse serait multiplié par 7,
alors que l’agglomération serait multipliée par 30. Jusqu’à un pH de 6,0 on peut expliquer
ces effets par l’augmentation du calcium ionisé. Au-dessous de 6,0 la micelle de caséine se
déminéralise et sa structure se désagrège, d’où la chute de fermeté du gel (Fox et al., 2000;
Vignola, 2002).
2.5.3. La concentration en CaCl2
Le calcium joue un rôle positif dans la coagulation du lait par la présure. L’addition
des sels de calcium augmente considérablement la fermeté et la vitesse de formation du caillé,
alors que le temps de coagulation va diminuer jusqu’à des concentrations en chlorure de
calcium d’environ 0,01M.
Ces améliorations sont dues à l’augmentation de la taille des micelles, l’abaissement du pH
et à la dissociation des groupements phosphoriques et carboxyliques des protéines (Vignola,
2002; Mahaut et al., 2000).
40
tc = (K/E) + ta
Cependant, on observe des phénomènes inverses pour chacun des paramètres de
coagulation lorsque la concentration en CaCl2 augmente. Ces observations (augmentation du
temps de coagulation et diminution de la fermeté du caillé présure) peuvent être expliquées
par l’interaction entre l’excès du calcium et les groupements carboxyliques de la para-caséine,
conduisant à une augmentation de la charge positive de la caséine, ce qui la rendre moins
accessible à l’agrégation (Vignola, 2002; Fox et al., 2004).
2.5.4. La concentration en enzyme
Le temps de floculation est inversement proportionnel à la concentration d’enzyme
utilisée selon l’équation empirique suivante :
tc : temps de coagulation (s)
K : inverse de la constante de vitesse (mole*s/l)
E : concentration en enzyme (mole/l)
ta : temps (s) écoulé entre la fin de la réaction enzymatique et le point de coagulation.
En-revanche, si on ajoute plus d’enzyme coagulante au lait de fromagerie, le taux de
raffermissement et la fermeté du gel augmente (Fox et al., 2000-2004; Vignola, 2002; Mahaut
et al., 2000).
41
3- Aspergillus niger
3.1. Le genre Aspergillus
Aspergillus est un genre fongique asexué, décrit pour la première fois en 1729 par
Michelli (mycologue florentin) et qui consiste à plus de 180 espèces officiellement reconnues
réparties en 18 groupes (essentiellement définies d’après les caractères de l’appareil
reproducteur) morphologiquement, génétiquement et physiologiquement proches. Il se
caractérise par des longs hyphes qui se terminent par la formation d’une structure globuleuse,
contenant des spores ressemblant la forme d’un goupillon (an aspergillum en latin) d’où le
nom Aspergillus (Kozakiewicz et Smith, 1994 ; Brakhage et al., 1999; Pasqualotto, 2010 ;
Masayuki et Katsuya, 2010).
La richesse de l’arsenal enzymatique des espèces aspergillaires les fait utiliser
notamment dans la production d’une large gamme des acides organiques (acide citrique,
acide gluconique, acide acétique,..), des enzymes (protéases, lipases, amylases, …) et des
métabolites bioactives tels que les mycotoxines (Abraca et al., 2004 ; Varga et al., 2004 ;
Hölker et al., 2004 ; Bouchet et al., 2005; Heitman et al., 2007), dont la biosynthèse de ces
produits naturels est habituellement associée au développement et différentiation du
champignon (Ward et al., 2006).
Bien que l’Aspergillus niger, l'espèce la plus commune, soit reconnu comme
opportuniste pathogène, sans spécialisation d'hôte, les autres membres de la section Nigri
sont généralement considérés comme des champignons bénins. En outre, les produits
élaborés par A. niger détiennent le label GRAS du FDA aux Etats Unis en dépit du fait que la
capacité de produire l'ochratoxine A (OTA) par cette espèce a été signalée (3 à 10% des
souches connues d’A. niger produisent ces mycotoxines sous certaines conditions
fermentatives) (Mhetras et al., 2009; Masayuki et Katsuya, 2010).
D’autres souches de cette même espèce produisent d’autres métabolites secondaires
qui n’appartiennent pas au groupe des mycotoxines comme la nigragilline, nigerazine B,
malformins (peptides cycliques) et les naphto-γ-pyrones.
De ce fait, l’utilisation d’une souche d’A. niger dans un processus biotechnologique, doit être
toujours précédée par une analyse pour déterminer sa capacité de produire des substances
nocives ou non (Blumenthal, 2004 ; Olempska-Beer, et al., 2006).
42
3.2. Taxonomie
En raison de son importance économique, l’Aspergillus est l'un des genres les mieux
décris du point de vue taxonomique parmi les champignons filamenteux. Al-Musallam,
(1980) a révisé la taxonomie du groupe A. niger en prenant essentiellement les
caractéristiques morphologiques en compte. Elle reconnut sept espèces dans ce groupe
(A. japonicus, A. carbonarius, A. ellipticus, A. helicothrix, A. heteromorphus, A. foetidus
et A. niger) et décrit cette dernière en tant qu’un ensemble d’agrégat composé de six variétés
et deux formes (A. niger var. niger van Tieghem, A. niger var. niger f. hennebergii-
Blochwitz, A. niger var. phoenicis- Corda, A. niger var. phoenicis f. pulverulentus- McAlp,
A. niger var. awamori- Nakazawa, A. niger var. nanus- Mont, A. niger var. usamii- Sakaguchi
et al., A. niger var. intermedius- Speg) (Abraca et al., 2004 ; Varga et al., 2004 ; Masayuki
et Katsuya, 2010).
La position systématique d’A. niger est résumée comme suivant (Chabasse et al.,
1999 ; Meyer et al., 2004) :
Phylum : Tallophyta
Sous-phylum : Fungi (Mycota)
Division de sous-phylum : Eumycota
Subdivision : Deuteromycotina (Fungi imperfecti)
Classe : Hyphomycètes (forme filamenteuse)
Ordre : Moniliales
Famille : Moniliaceae
Sous-famille : Hyalosporae
Tribu : Aspergilleae
Genre : Aspergillus
Espèce : Aspergillus niger
3.3. Morphologie
Les Aspergillus sont caractérisés par la présence de longs filaments perpendiculaires
(stipes) aux hyphes végétatifs. Les stipes se terminent par une vésicule supportant les cellules
de la conidiogenèse : les phialides. Celles-ci, sans collerette, sont soit portées directement par
la vésicule, soit séparées par des pièces intermédiaires ou métules.
Les phialides produisent des spores ou conidies qui caractérisent le mode de
reproduction asexuée du champignon. Ces phialospores sont regroupées en panache, dont la
couleur et la forme varient en fonction de l’espèce. L’ensemble stipe et vésicule constitue le
43
conidiophore et l’ensemble vésicule, phialides et conidies forme la tête aspergillaire (Leyral
et Vierling, 2007; Masayuki et Katsuya, 2010).
Aspect macroscopique : Ce champignon pousse rapidement (2-3 jours) sur les
milieux de culture classiques (géloses au malt et Sabouraud). La température optimale
de croissance varie généralement entre 25 et 30°C, mais A. niger peut se développer
jusqu’à 42°C. Les colonies d’A. niger sont granuleuses, blanches au début, puis
jaunâtres et à maturité elles deviennent noires. Le revers des colonies est incolore ou
jaune pâle montrant parfois des zones concentriques. (Guillaume, 2006). Sur le
milieu Czapek, A. niger forme des colonies à mycélium blanc ou jaune, et revers
souvent incolore.
Aspect microscopique: les têtes conidiennes, bisériées et radiées, sont disposées
en plusieurs colonnes brunâtres à noires. Les conidiophores sont longs atteignant
1,5-3 mm, lisses à stipes non cloisonnés, hyalins ou brunâtres dans leur moitié
supérieure, formés d’une cellule courte appelée cellule podale (footcell) avec un
hyphe fertile. Les vésicules (50-70µm) sont globuleuses avec des têtes aspergillaires
hémisphériques volumineuses, à panache radié. Les phialides (7-10 x 3-3,5 μm) sont
portées par des métules brunâtres, de dimensions variables (10-15µm). Les conidies
sont habituellement globuleuses, parfois légèrement aplaties de couleur brunâtre
et qui mesurent 3,5 à 4,5 µm ; parfois jusqu’à 6 μm de diamètre (figure 3) (Abraca
et al., 2004; Pasqualotto, 2010).
Figure 3: Aspect microscopique (a) et représentation schématique (b)
de la conidiophore d’A. niger (Pasqualotto, 2010).
Conidies
Phialides
Métules
Vésicule
Conidiophore
Cellule podale
Filament
végétatif
100µm
10µm
44
3.4. Habitats
Distribué largement dans tous le sur-monde, A. niger est l'un des champignons les plus
communs dans l’environnement humain, qui vive en saprobiose (Samson, 1994 ; Ward et al.,
2006). Il est très répondu dans les zones sombres et humides, les sols, le compost, pousse à
la surface des matières organiques en décomposition, des denrées alimentaires, des
sous-produits agricoles surtout les céréales et ses dérivés (son de blé, son de riz, bagasse...)
et de nombreux autres substrats, où les acides aminés et les sucres sont initialement
insuffisants. Ce qui a conduit l'organisme d'avoir un certain nombre d'enzymes hydrolytiques,
qui lui permet d’utiliser efficacement les sources nutritionnelles externes pour sa croissance
(Guillaume, 2006 ; Leyral et Vierling, 2007; Pasqualotto, 2010).
3.5. Reproduction
L'état asexuel d'Aspergillus est ce qui attire le plus souvent les bio-technologistes.
Il est en fait caractérisé par la production d'un grand nombre de spores en chaînes.
La sporulation produit des conidies contenant des spores asexuées haploïdes, disséminées
dans l’atmosphère après maturation. La croissance végétative est initiée par la germination
des spores avec formation d’un hyphe tubulaire (extension strictement apicale) donnant
naissance à un réseau mycélien par ramification, qui acquiert les éléments nutritifs de
l’environnement (Meyer et al., 2004 ; Ward et al., 2006).
3.6. Diverses enzymes produites par A. niger
Aspergillus niger est très largement utilisé dans la production des enzymes
commerciales vues les hautes productivités enzymatiques qui peuvent être atteintes (Tableau
VII) (Iwashita, 2002 ; Bakhtiari et al., 2006 ; Aftab et al., 2007 ; Mhetras et al., 2009).
Les principales activités protéolytiques d’A. niger semblent être dues à des protéases
extracellulaires acides, ce qui reflète l'adaptation de ce dernier aux milieux de croissance à pH
acide. Grâce aux capacités hydrolytiques importantes d’A. niger et sa tolérance à l'acidité
(pH<3), il permet d’éviter les contaminations bactériennes au cours des processus
biotechnologiques (Jarai et Bouxton, 1994 ; Dekrif-Dakhmouche et al., 2006).
45
Tableau VII : Production des enzymes par Aspergillus niger.
Enzymes
Microorganisme Substrat/ milieu Références
Protéases A. niger
Son de blé
Villegas et al., 1993.
Demain et Davies, 1999.
Ikram -Ul-Haq et al., 2003.
Milieu défini
Singh et al., 1994.
Channe et Shewale, 1998.
A. niger ATCC
13496
Bouillon Batco YM Fang et al., 1998.
Papagianni et al., 2002.
A. niger 91
Grain de soja : son de riz
(7:3 w/w)
Sanchez et Pilosof, 2000.
A. niger Z1
Milieu Czapek-Dox Coral et al., 2003.
A. niger UO-1
Déchets de transformation
de viande + déchets de
brasserie + amidon
Hernandez et al., 2006.
A. niger
Confits, graines de coton en
poudre
Wang et al., 2006.
A. niger AB100 Écaille de poissons Barnali et al., 2008.
Glucoamylase A. niger ATCC
13496
Bouillon Batco YM
Fang et al., 1998.
Papagianni et al., 2002.
A. niger ATCC
1015
Maltose
Metwally, 1998.
A. niger
Manioc, maïs, son de blé Demain et Davies, 1999.
Son de blé+son de
riz+cellulose
Rajoka et Yasmeen, 2005.
Confits, graines de coton en
poudre
Wang et al., 2006.
Les déchets alimentaires Wang et al., 2008.
α-amylase
A. niger UO-1
Déchets de transformation
de viande + déchets de
brasserie + amidon
Hernandez et al., 2006.
A. niger ATCC
16404
Déchets d'orange en poudre Djekrif-Dakhmouche et al.,
2006.
Xylanase A. niger LPB
326
Canne à sucre, tourteau de
soja
Maciel et al., 2008.
A. niger (mutant) La paille de riz Park et al., 2002.
A. niger KK2 La paille de riz+son de blé Kang et al., 2004.
A. niger XY-1 Son de blé
XU et al., 2008.
46
Cellulase A. niger Son de blé Demain et Davies, 1999.
A. niger ATTC
6275
Moulin à l’huile de
palme effluent/gâteau palme
Prasertsan et al., 1997.
A. niger KK2 La paille de riz+son de blé Kang et al., 2004.
A. niger NCIM
1207
La poudre du cellulose-123 Gokhale et al., 1991.
A. niger Confits, graines de coton
en poudre
Wang et al., 2006.
Tannase A. niger ATCC
16620
Tourteau de palmiste
La poudre des graines
de tamarin
Sabu et al., 2005.
A. niger Aa-20 Poudre de Larrea tridentata
Cov. (Gobernadora)
Trevino-Cueto et al., 2007.
Lipase
A. niger L’huile d’olive + la gomme
d’acacia (3%+1%)
Namboodiri et
Chattopadhyaya, 2000.
Son de blé + l’huile d’olive Mahadik et al., 2002.
Phytase A. niger Son de blé + farine de soja Krishna et Nokes, 2001.
A. niger CFR
335
Son de blé/milieu Czapek-
Dox
Gunashree et Venkateswaran,
2008.
A. niger NB2 Déchets secs des olives Vassilev et al., 2007.
A. niger Son de blé + la farine de
soja
Papagianni M. et al., 2001.
Polygalaturonase A. niger Pectine + la bagasse de la
canne à sucre
Maldonado et Strasser de
Sand, 1998.
Son de blé
Fantana et al., 2005.
Pectinase A. niger DMF
27, DMF 45
Tête de tournesol égrainée Patil et Dayanand, 2006
(a,b,c).
α-galactosidase A. niger MRSS
234
Son de blé Srinivas et al., 1994.
Uréase A. niger PTCC
5011
Milieu défini Bakhtiari et al., 2006.
Hemicellulase A. niger Confits, graines de coton
en poudre
Wang et al., 2006.
47
4- La fermentation
La nature de la fermentation, solide ou liquide (submergée), influe divers aspects de
la croissance des micro-organismes ainsi que la production des substances d’intérêt
(Sumantha et al., 2005).
4.1. Fermentation sur milieu liquide
La fermentation sur milieu liquide (en anglais : submerged fermentation, SmF) peut
être considérée comme une violation de l’habitat naturel des microorganismes, en particulier
les champignons. Elle consiste à faire croître les microorganismes sur un substrat nutritif
liquide. Ce type de fermentation a été traditionnellement utilisé pour la production
industrielle des enzymes, en raison de la facilité de contrôle des différents paramètres comme
le pH, la température, l’aération, l’oxygène dissous et l'humidité. La fermentation submergée
est généralement plus facile à exploiter de manière aseptique par rapport à la fermentation
solide et peut être appliquée plus facilement à l’échelle industrielle (Singhania et al., 2009).
4.2. Fermentation sur milieu solide
La fermentation solide (fermentation de substrat solide, culture solide, en anglais :
Solid-State Fermentation, SSF) est généralement définie comme la croissance microbienne
sur des particules solides et humides en absence totale ou presque d’eau libre; une condition
qui assure aux microorganismes, surtout les champignons filamenteux, un milieu pareil à leur
environnement naturel. De façon simplifiée, les microorganismes se développent dans un
système à trois phases : une matrice solide, une phase liquide qui lui est liée et une phase
gazeuse prise au piège dans les particules ou entre celles-ci (Hölker et al., 2004; Hölker
et Jürgen, 2005; Singh et Pandey, 2009).
Le substrat solide peut être soit la source de nutriments et/ou un support imprégné
par les nutriments appropriés, permettant le développement des micro-organismes et la
production des métabolites recherchés (Singhania et al., 2009).
4.2.1. Avantages et inconvénients
La production industrielle des enzymes et d’autres métabolites fait appel aux deux
procédés de fermentation. La décision de choisir l’un ou l’autre est probablement basée
sur le coût et l'efficacité du processus. Il est donc important de connaître les avantages
48
et les inconvénients de la fermentation sur milieu solide par rapport à la fermentation liquide.
Parmi ces avantages on note :
La simplicité de la technique et la diminution des coûts, du fait qu’elle ne
nécessite pas d’équipement sophistiqué pour les contrôles permanents des
paramètres environnementaux (facultatifs).
L’absence d’eau libre permet de réduire considérablement le volume des
fermenteurs et les coûts énergétiques nécessaires pour la stérilisation.
Le peu d’eau disponible favorise la production de certains métabolites, qui
n’apparaissent pas ou peu en culture liquide (Monascus produit dix fois plus de
pigment rouge en milieu solide qu’en fermentation liquide), ainsi il minimise
les contaminations bactériennes qui réclament des taux d’humidité élevés pour
croître (en cas de fermentations fongiques).
En calibrant bien la taille des particules du substrat, l’aération peut être assurée
passivement sans agitation ou par agitation discontinue (croissance en surface
donc contact direct avec l’oxygène). En revanche, les champignons filamenteux
rendent souvent les milieux liquides fortement visqueux; ce qui entraîne des
problèmes d’agitation et du transfert d’oxygène.
La réduction des coûts et du temps consommé pendant l’extraction et la
récupération du produit (moins de techniques à appliquées et volumes réduits en
solvants d’extraction), ainsi que pour le traitement des effluents (en raison de la
faible teneur en eau).
Cependant, cette renommée est largement surfaite, surtout lors du développement
d’applications pilotes ou industrielles. Dans ces conditions et bien d’autres, la fermentation
solide présente de nombreux inconvénients :
Les microorganismes utilisés sont limités. En effet, seuls qui se développent
bien aux basses humidités peuvent être employés, cela s’applique aux
champignons filamenteux et aux certaines bactéries xérophiles.
Les connaissances physiologiques et technologiques de la croissance des
microorganismes sur milieux solides sont faibles.
49
Les problèmes de transfert d’oxygène et de chaleur rendent difficile
l’augmentation d’échelle des procédés. En effet, la faible quantité d’eau ralentit
les échanges de chaleur, pouvant créer des problèmes de surchauffe lorsque des
masses importantes sont mises en fermentation. L’évaporation compense
partiellement cet échauffement, mais en réduisant l’eau disponible.
La nature solide et hétérogène des substrats utilisés compliquent le suivi direct
des paramètres de fermentation. Les sondes utilisées en fermentation liquide ne
sont pas compatibles, même si Bellon-Maurel et al., (2003) proposent des
nouveaux types de sondes adaptées aux cultures solides.
Il est pratiquement difficile d’assurer une distribution parfaitement homogène
des nutriments ajoutés au substrat (milieu de culture); ce qui rend le contrôle
direct des paramètres de culture tels que le pH, l’humidité et la concentration
des nutriments, assez aléatoire.
Les microorganismes étant inséparables du substrat, l’estimation de la biomasse
est délicate.
Étant donnée la forte concentration des métabolites obtenus, les produits
inhibiteurs générés par les microorganismes peuvent s’accumuler en
concentration élevée dans le milieu de culture (Couto et Sanroman, 2006; Wang
et Yang, 2007 ; Aguilar et al., 2008).
4.2.2. Substrats utilisés
Parmi les nombreux facteurs qui influent la croissance et l'activité microbienne
dans un substrat particulier en fermentation sur milieu solide: la taille des particules, le taux
d’humidité et l’activité de l'eau sont les plus critiques.
Le choix du substrat dépend de plusieurs paramètres économiques (coût,
disponibilité) et biologiques. De ce fait, les résidus agro-alimentaires semblent d’êtres les
plus intéressants, en raison de leurs avantages potentiels surtout pour les champignons
filamenteux, qui sont capables de pénétrer à l’intérieur de leurs structure solide. Par contre, les
bactéries et les levures sont caractérisées par un développement superficiel (Manpreet et al.,
2005; Singh et Pandey, 2009).
50
Les résidus agro-industriels utilisés en fermentation sont divisés en trois
catégories : les fécules (le manioc, son de blé, son de riz, graines de sarrasin, farine de maïs,
la farine de banane,…), substrats cellulosiques ou ligno-cellulosiques (paille de blé, de
maïs, la canne de riz, pulpe de betterave sucrière et de bois,…) et ceux avec du sucre soluble
(le marc de raisin, le sorgho à sucre, les déchets d'ananas, gousses de caroube et de la pulpe
du café,…) (Manpreet et al., 2005; Aguilar et al., 2008 ; Graminha et al., 2008).
Généralement, une préparation et un prétraitement du substrat s’avèrent nécessaires
pour convertir le substrat brut en une forme utilisable et qui comprennent:
La réduction mécanique de la taille des particules (par broyage, découpage,...)
afin de favoriser une grande accessibilité à ses constituants et une structure
physique plus sensible à la pénétration du mycélium.
Traitement chimique (par la voie des alcalis, acides, oxydants, gaz et solvants)
ou enzymatique des polymères afin d’augmenter la disponibilité du substrat.
L’enrichissement du milieu par addition des nutriments (sels minéraux, sources
d’azote, facteurs de croissance,…).
Chauffage ou traitement à la vapeur pour dégrader la structure
macromoléculaire et éliminer les contaminants majeurs (Raimbault, 1998;
Assamoi et al., 2009).
Les particules dont la taille est réduite assurent une grande surface à l’attaque
microbienne, mais qui entraînent également l’agglomération du substrat, ce qui engendre des
perturbations au niveau de la croissance, les échanges gazeux et l’extraction du produit. En
revanche, les grosses particules permettent une meilleure aération, toutes en réduisant la
surface de contact avec le microorganisme. De ce fait, la taille optimale des particules
représente souvent un compromis entre l'accessibilité des nutriments et la disponibilité
d'oxygène. Pandey, (1992) a signalé que les productivités sont plus élevées avec le
substrat qui contient des particules de tailles diverses allant de 180 µm à 1,4 mm (Pandey
et al., 2000 ; Couto et Sanroman, 2006).
51
4.2.3. Microorganismes utilisés
Des précautions doivent être prises en considération lors de la sélection des
microorganismes pour la production des métabolites en fermentation sur milieu solide. La
bonne tolérance à la faible activité d'eau, le mode de croissance apical des hyphes fongiques
et les conditions de haute pression osmotique donnent l’avantage aux champignons
filamenteux d’être les mieux adaptés à ce type de processus par comparaison avec les
bactéries et les levures. Ces dernières sont appliquées principalement dans certains processus
tels que le compostage (bactéries thermophiles), l’ensilage (lactobacilles) et dans la
production alimentaire (levures).
Les différents genres fongiques utilisés dans ce processus de fermentation sont :
Aspergillus, Rhizopus, Alternaria, Fusarium, Monilia, Mucor, Trichoderma et certaines
espèces de Penicillium (Raimbault, 1998; Manpreet et al., 2005).
Le mode de croissance des hyphes filamenteux donne le pouvoir de pénétrer dans le
substrat grâce à la structure solide de la paroi cellulaire et la ramification du mycélium. Les
enzymes hydrolytiques sont excrétées à la pointe des hyphes, sans dilution importante
comme dans le cas de la fermentation liquide, exercent de façon très efficace la dégradation
des macromolécules en unités plus petites qui vont servir de nutriments. Le processus est
accompagné par la production des métabolites recherchés, une consommation d’oxygène
et un dégagement de CO2, H2O et de la chaleur. Cette dernière conduit à une augmentation
rapide de la température qui est retirée du substrat non seulement par conduction, mais aussi
par évaporation (figure 4) (Raimbault, 1998; Hölker et Jürgen, 2005).
L'établissement des relations entre la physiologie des microorganismes et les facteurs
physico-chimiques est l'objectif pour la réussite et le développement d’un tel procédé. Ces
facteurs comprennent la température, le pH, l'aération, l'activité de l'eau, l'humidité et la
nature du substrat solide employé.
52
4.3. Applications industrielles de la fermentation sur milieu solide
D’une manière générale, les applications de la fermentation solide concernent
l’alimentation humaine, le compostage et l’ensilage, la bio-filtration des gaz malodorants, la
production des aliments riches en protéines pour l’alimentation animale, la production des
enzymes et des métabolites spécifiques (voir tableau A.V, annexe A).
Figure 4: Microprocessus qui se produisent pendant la fermentation sur milieu
solide des cultures fongiques (l : liquide, g : gaz, Q : dégagement de chaleur,
T : température, S: substrat) (Hölker et Jürgen, 2005).
53
Chapitre II
Matériels & Méthodes
54
2- Matériels et Méthodes
Notre partie expérimentale a été réalisée au sein des locaux suivants:
Laboratoire de la post graduation Biochimie-Microbiologie appliquées (FS,
UMBB);
Laboratoire de Biologie Moléculaire, département de Biologie (FS, UMBB);
Laboratoire de Chromatographie, département de Technologie Alimentaire (FSI,
UMBB);
Laboratoire de Recherche en Technologie Alimentaire (LRTA) (FSI, UMBB).
2.1. Matériel biologique
L’espèce fongique utilisée dans ce travail est Aspergillus niger isolée localement
(Zemmouri, Boumerdès) par Abdelaoui (2007).
Elle a été identifiée par la mycothèque de l’université de Louvain la Neuve en
Belgique. De plus, les résultats d’analyse par la HPLC des extraits obtenus à partir des
cultures d’A. niger sur milieu CYA décomposées dans le méthanol, permettent d’établir que
cette souche est non productrice de l’Ochratoxine A (Fazouane, 2010).
La souche est conservée dans des tubes PDA inclinés à 4°C (voir composition:
annexe C). Un repiquage s’effectue tous les deux mois sur le même milieu afin d’assurer la
préservation de la vitalité de la souche.
2.1.1. Revivification de l’espèce Aspergillus niger
Elle est réalisée par prélèvement de quelques spores ou un fragment mycélien à partir
des tubes PDA inclinés, que l’on transfère sur le même milieu coulé dans des boites de Pétri
sous les conditions d’asepsie. La culture fongique est incubée à 28±2°C pendant 5-7 jours.
2.1.2. Préparation de l'inoculum
La récupération des spores s’effectue à partir des cultures d’A. niger sur milieu PDA
incubées à 28±2°C pendant 5-7 jours, par l’addition d’une solution stérile de Tween 80 à
0,1% (10 ml/boite de Pétri). À l'aide d'une anse de platine stérile, on gratte légèrement la
surface de la gélose afin de mètre en suspension les spores fongiques, qui sont filtrées par
passage sur papier filtre stérile entreposé un entonnoir.
55
2.1.3. Dénombrement des spores
L’estimation du nombre de spores de la suspension fongique est effectuée par la
mesure de l’absorbance à 650nm à l’aide d’un spectrophotomètre de type UV-VIS 9200. Les
lectures photométriques sont transformées en nombre de spores par cellule de Malassez sous
microscope photonique type UKA-Technic Nahita au grossissement (x40), ce qui permet
d’établir la courbe d’étalonnage de l’absorbance (A650nm) en fonction du nombre de spores
d’A. niger. Un ml de la suspension de spores contenant 2x106 spores/ml est utilisé comme
inoculum.
2.2. Méthodes de dosage
2.2.1. Mise en évidence de l’activité protéolytique d’A. niger
Elle s’effectue typiquement, en se basant sur la capacité de la souche fongique isolée
de croître sur des milieux de culture à base de protéines comme la seule source d’azote et de
générer des zones de protéolyse claires autour de la culture ou de liquéfier la gélatine
(Nygren et al., 2007).
a). Sur boites de pétri (Plate Assay) (Agrawal et al., 2005)
La recherche qualitative de l’activité protéolytique de la souche d’A. niger a été
réalisée sur milieu Czapek-Dox Agar à base de caséine (voir composition: annexe C). Après
stérilisation et refroidissement, le milieu coulé est ensemencé par quelques spores au centre
de la boite de pétri, puis incubé à 28±2°C pendant 5 jours.
La détermination qualitative de cette activité est basée sur le calcul du diamètre de
l’anneau de protéolyse qui se forme autour de la colonie fongique.
b). Sur milieu solide par SSF (Sumantha et al., 2005)
Le son de blé a été utilisé comme substrat pour tester quantitativement l’activité
protéolytique d’A. niger.
Dans des Erlenmeyers de 250 ml, on introduit 5g du son de blé supplémenté avec
4ml du milieu minéral, ayant la composition suivante (% p/v): NH4NO3 0,5; KH2PO4 0,2;
MgSO4.7H2O 0,1; NaCl 0,1 dont le pH=4. Après autoclavage (121°C pendant 15 min,
1,5 bar) et refroidissement, on inocule le milieu avec 1ml de la suspension de spores
d’A. niger dont l’A (650 nm) = 0,55 ; ce qui correspond à un inoculum de 2x106 spores/ml par
56
AC (UP) = 10xV1/TxV2
référence à la courbe d’étalonnage. Les milieux ensemencés sont incubés pendant 4 jours à
28±2°C.
2.2.2. Mesure de l’activité coagulante (Arima et al., 1970)
L’activité coagulante des protéases entraîne le décollète des liaisons Phe105-Met106 de
la caséine-κ, ce qui rend les micelles de caséine instables et provoque éventuellement leur
agrégation conduisant à la formation de coagulum (Kumar et al., 2006; El-Bendary et al.,
2007; Bruno et al., 2010).
Principe
L’activité coagulante (AC) de l’extrait enzymatique est déterminée selon la méthode
d’Arima et al., (1970). Elle est basée sur l’évaluation visuelle de l’apparition des premiers
flocons de la coagulation du lait écrémé et qui s’exprime en terme d’unité d’activité
coagulante (UAC). Cette dernière représente la quantité d’enzyme en (ml) qui coagule 10ml
du lait écrémé à 10% préparé dans 0,01M du chlorure de calcium (CaCl2) à pH 6,4 en 100 sec
et à 30°C.
Le temps de coagulation correspond au temps s’écoulant entre l’addition de l’enzyme
coagulante et l’apparition des premières particules du caillé sur la paroi interne de tube incliné
subissant un lent mouvement de rotation (6-8 rpm).
L’activité coagulante exprimée en Unité Présure (UP) est calculée selon l’expression
suivante :
Où
V1 : volume du lait écrémé utilisé;
V2 : volume de l’extrait coagulant utilisé;
T : temps de coagulation (en sec).
L’activité coagulante est également exprimée en force de coagulation, basée sur le
calcul du temps de coagulation sur le même substrat mais à 35°C. Exprimée en Unité Soxhlet
(US), la force de floculation correspond au nombre d’unités de poids ou de volume de lait
coagulable en 40 min par unité de poids ou de volume de la préparation enzymatique.
57
Elle est calculée selon la formule suivante:
Où
2400 : 40 min x 60 sec;
V1 : volume du lait écrémé à coaguler;
V2 : volume de l’extrait coagulant employé;
T : temps de coagulation (en sec).
2.2.3. Mesure de l’activité protéolytique (Anson, 1938 modifiée par Mechakra
et al., 1999)
La protéolyse des caséines est probablement l’événement le plus important sur les
deux plans de la nutrition et de la technologie de la fabrication des produits laitiers.
Il est très connu que la majorité des préparations microbiennes destinées à la
production fromagère possèdent une activité protéolytique à côté de l’activité coagulante
et qui joue un rôle capital dans la détermination de la qualité organoleptique des fromages,
puisqu’elle affecte à la fois la texture, l’odeur et le goût du fromage (Bouton et al., 1993;
Heslot, 1998; Bruno et al., 2010).
De ce fait, la mise en évidence des nouvelles souches microbiennes produisant des
enzymes coagulantes caractérisées par une haute activité coagulante comparée à celle
protéolytique, reste toujours un objectif primordial pendant la recherche (Wu et al., 2008).
Principe
Le dosage de l'activité protéolytique par la méthode d’Anson, (1938) se base sur
l’estimation de la quantité des peptides simples et des acides aminés libres formés par
l’hydrolyse d'une protéine substrat sous l’action d’une protéase ou un mélange de protéases.
La caséine et l'hémoglobine sont très largement utilisées comme des substrats
standards dans ces tests, vue les avantages qu’elles présentent : la non-toxicité, la richesse en
acides aminés aromatiques, la disponibilité et l’approvisionnement facile; en plus elles sont
pratiquement solubles dans les tampons (Mechakra et al., 1999; Wehrle et al., 1999).
F (US) = 2400xV1/TxV2
58
La réaction enzymatique est stoppée par l’addition du TCA, qui fait précipiter les
protéines non attaquées par la protéase, puis les éliminer par différents procédés
(centrifugation, filtration). La mesure de l’absorbance des peptides et des acides aminés libres
restants en solution après coloration au réactif de Folin- Ciocalteau (réaction avec la Tyr
et Trp), permet de mesurer l'activité protéolytique par spectrophotométrie à 750nm (Sidikou
et al., 2005).
Cette activité est exprimée par référence à l'absorption d'une solution de tyrosine de
concentrations connues (0 à 100 µg/ml). En présence d'un substrat protéique, une unité
d’activité protéolytique correspond à la libération de 1µg de tyrosine par heure et par 1ml
d’échantillon testé (voir mode opératoire: annexe D).
2.2.4. Dosage des protéines (Bradford, 1976)
Le dosage des protéines totales de l’extrait enzymatique a été réalisé selon la méthode
de Bradford, (1976) ; c’est une méthode colorimétrique qui permet de déterminer la
concentration d’une solution protéique.
Principe
Elle est basée sur l’interaction en milieu acido-alcoolique entre les protéines et le BBC
G-250. Ce colorant s’adsorbe sur les protéines ce qui provoque un déplacement de son pic
d’absorption maximale qui passe du rouge (464nm, forme cationique) au bleu (595nm, forme
anionique) (Bradford, 1976; Roe, 2001; Walker, 2002; Walsh, 2002). Cette adsorption se fait
principalement et de façon spécifique par des liaisons ioniques avec des acides aminés
basiques (Arg, Lys, His) de la molécule protéique.
La rapidité (maximum d’adsorption au bout de 2-5minutes) et la grande sensibilité de
la méthode qui peut atteindre 1-20µg de protéines déterminent sa haute qualité (Roe, 2001;
Walker, 2002). Elle est aussi assez résistante à la plupart des interférents qui nuisent à la
plupart des autres méthodes. Seuls les détergents (ex : SDS), autres surfactants (ex: Triton)
et des bases fortes interfèrent fortement avec cette méthode (Walker, 2002 ; Walsh, 2002)
(voir mode opératoire: annexe E).
59
2.2.5. Activité enzymatique de la protéase d’A. niger sur gel de poly-acrylamide
(Zymography)
Les techniques électrophorétiques assurent également la détection des activités
enzymatiques spécifiques sur des gels par la technique dite la zymographie (Quesada et al.,
1996). Elle assure la visualisation du nombre et de la taille approximative des enzymes
protéolytiques dans un échantillon donné, sur la base d’hydrolyser un substrat protéique
intégré dans le gel de poly-acrylamide.
La gélatine est largement utilisée comme substrat dans cette technique (un produit bon
marché et valable pour la majorité des protéases). En effet, toute protéine qui est digérée par
la protéinase d'intérêt et qui reste soluble dans les systèmes tampons d'électrophorèse,
peut être utilisée comme une alternative à la gélatine (ex: le collagène, le fibrinogène,
l’hémoglobine, la caséine…) (Troeberg et Nagase, 2005 ; Wilkesman et Kurz, 2009).
Principe
Elle implique la séparation par électrophorèse des protéines dans des conditions
dénaturantes (SDS) et non réductrices sur un gel de poly-acrylamide contenant le substrat
protéique. Après migration, les protéines séparées sont partiellement rénaturées par
élimination du SDS avec un détergent non-ionique, tel que le Triton X-100.
Le gel est incubé dans un tampon approprié qui permet à la protéase de récupérer son
activité. A la fin, la coloration du gel au BBC R-250 permet de visualiser les activités
protéolytiques après la dégradation du substrat comme des bandes claires sur un fond bleu
(Doonan, 1996; Snoek-van Beurden et Von den Hoff, 2005).
Mode opératoire
La mise en évidence de l’activité protéolytique de l’extrait enzymatique d’A. niger sur
gel de poly-acrylamide a été effectuée selon la méthode décrite par Egito et al., (2007)
(modifiée).
Une quantité déterminée de l’extrait enzymatique purifié a été additionnée au tampon
d’échantillon en absence de l’agent réducteur. La migration (à 4°C) a été réalisée sur un gel de
séparation à 10% contenant 0,1% de gélatine et un gel de concentration à 5%. Après la
60
séparation des protéines, le gel est lavé deux fois avec le Triton X-100 à 2,5% pendant
30 min. Un dernier lavage a été effectué par une solution de Triton X-100 à 2,5% dans le
tampon Tris-HCl (0,1M; pH 5).
Par la suite, le gel est incubé dans un bain de tampon Tris-HCl (0,1M; pH 5) à 40°C
pendant 24h, ce qui permet de déclencher la réaction d’hydrolyse de la gélatine à l’intérieur
du gel. La présence des enzymes actives a été révélée comme des bandes translucides (claires)
sur un fond bleu après coloration au BBC R-250 et décoloration par le mélange (méthanol,
acide acétique, eau).
2.2.6. Paramètres de purification
Trois facteurs de purification ont été déterminés afin d’évaluer et interpréter les
différentes étapes de la purification:
L’activité spécifique (AS):
AS (U/mg) = Activité coagulante/concentration en protéines.
Activité totale (AT):
AT (U)= Activité coagulante x volume totale.
Le rendement en activité (R):
R(%)= Activité totale de chaque étape de purification/Activité totale de l’étape
initiale.
Le facteur de purification (FP):
FP= Activité spécifique de chaque étape de purification/Activité spécifique de l’étape
initiale.
2.3. Méthodes d’optimisation
2.3.1. Optimisation de la production de la protéase par la méthode classique
Il est très connu que la production des protéases microbiennes extracellulaires est
fortement influencée par la composition du milieu de fermentation (spécialement la source de
carbone, d’azote et les sels minéraux), les facteurs physicochimiques (température, pH,
l’oxygène dissous, densité d’inoculum) et par le temps d’incubation (Oh et al., 2000; Celik
et Calik, 2004; Rao et al., 2006; Djekrif-Dakhmouche et al., 2006).
61
La méthode adoptée pendant notre étude préliminaire d’optimisation est la technique
d’un facteur à la fois (one factor at a time), basée sur la variation d’un seul facteur pendant
que les autres facteurs sont gardés à des niveaux constants. Ce protocole permet d’évaluer
l’effet individuel d’un paramètre et d’incorporer par la suite sa valeur optimale avant de
passer à l’optimisation du paramètre suivant (Kumar et al., 2003; Wang et Wan, 2009).
Cette stratégie présente l’avantage d’être simple et facile, en plus les effets individuels
des composants de milieu de culture et les conditions de processus de fermentation sont
capables d’êtres visualisés sous forme de graphes. La méthode présente des limitations du fait
qu’elle ignore les interactions entre les paramètres, le temps consommé est important, les
coûts élevés surtout en cas d’un grand nombre de variables, conduisant à une expérimentation
étendue (Panda et al., 2007; Wang et Wan, 2009).
Après chaque étape d’optimisation, le dosage des protéines (Bradford, 1976), la
détermination de l’activité coagulante (Arima et al., 1970) et la mesure de l’activité
protéolytique (Anson, 1938 modifiée par Mechakra et al., 1999) des extraits enzymatiques
sont déterminés dans les conditions standards.
Toutes les fermentations et les dosages sont conduits en double et chaque résultat est la
moyenne de deux essais ± esm (erreur standard à la moyenne).
2.3.1.1. Choix du milieu minéral
L’influence de la composition du milieu minéral sur la production de la protéase
d’A. niger a été évaluée par l’utilisation de quatre milieux minéraux différents : solution du
Czapek-Dox, solution M-9, solution du sulfate d’ammonium à 0,05% (SA) et une solution
minérale (SM) (voir composition : annexe C).
Dans chaque Erlenmeyers de 250ml, on introduit 10g de son de blé caractérisé (voir
tableau A.VI, annexe A) et 10ml du milieu minéral testé, dont le pH initial est ajusté à 4. Le
mélange est ensuite stérilisé à 121°C pendant 15-20min. Après refroidissement, chaque milieu
est inoculé par 1ml de la suspension fongique (2x106
spores/ml), puis incubé à 30°C pendant
3 jours.
2.3.1.2. Température d’incubation
L’effet de la température de fermentation sur la production de la protéase d’A. niger a
été étudié sur des cultures à base de son de blé incubées à des températures allant de 20 à
62
45°C avec un intervalle de 5°C pendant 3 jours, en utilisant le milieu minéral qui assure la
meilleure production.
2.3.1.3. pH initial du milieu minéral
Afin d’étudier l’influence du pH de la solution saline sur la production de la protéase
d’A. niger, des fermentations sont conduites à la température optimale mais à différents pH
variant de 3 à 7 pendant 3 jours. L’ajustement du pH est effectué avec une solution d’HCl
et /ou du NaOH (1N).
2.3.1.4. Taux d’humidité du substrat
La faible teneur en humidité naturelle du son de blé (entre 7-13%) est insuffisante
pour soutenir la croissance des moisissures et par conséquent, le substrat solide doit être
humidifié pendant la préparation, mais de façon à éviter trop d'eau car il affecte la diffusion
d'oxygène dans le substrat et limite la croissance du champignon.
Le taux initial d’humidité du substrat a été optimisé par incubation de la souche
d’A. niger à différents volumes de la solution saline, qui correspondent aux différents taux
d’humidité : 39,21% ; 54,33% ; 62,5% ; 65,34% et 70,85%. La fermentation est conduite à la
température optimale et au pH optimum pendant 3 jours.
2.3.1.5. Concentration d’inoculum
L’effet de la concentration d’inoculum sur la productivité de la protéase d’A. niger a
été élucidé par ensemencement des cultures avec 1ml de la suspension de spores/10g de son
de blé, dont la concentration en inoculum varie de 1 à 5x106
spores/ml (l’intervalle est de
0,5x106
spores/ml). Les cultures sont incubées pendant 3 jours aux conditions optimales de la
production.
2.3.1.6. Temps d’incubation
Le profil de la production de la protéase acide d’A. niger et la détermination du temps
d’incubation optimum, ont été déterminés par incubation des cultures dans les conditions
optimales préalablement établies à différents temps allant de 1 à 7 jours avec un écart de 24h.
63
2.3.2. Optimisation à l’aide d’un plan factoriel fractionnaire
2.3.2.1. Forme et caractéristiques du plan
Un plan d'expérience (plan expérimental) est un ensemble des modalités selon
lesquelles un programme expérimental doit être réalisé avec choix des variantes (niveaux)
d'un ou de plusieurs facteurs, ou des combinaisons de facteurs, à introduire dans l'expérience
(Dagnelie, 2000). Ces plans permettent d'organiser au mieux les essais qui accompagnent une
recherche scientifique ou des études industrielles. Ils sont applicables à des nombreuses
disciplines et à toutes les industries prospectant le lien qui existe entre une grandeur d’intérêt,
y et des variables xi où : y = f (xi) (Goupy, 2006).
Avec les plans d'expériences on obtient le maximum de renseignements avec le
minimum d'expériences. Pour cela, il faut suivre des règles mathématiques et adopter une
démarche rigoureuse. Il existe de nombreux plans d'expériences adaptés à tous les cas
rencontrés par un expérimentateur (Sporta, 2006 ; Tinsson, 2010).
Un plan fractionnaire à deux niveaux (2n-p
) permet de réduire de manière très
significative le nombre des essais à effectuer qui correspond à la moitié d’un plan factoriel
complet (2n). Il est donc d’un grand intérêt pratique puisqu’il combine à la fois un nombre
minimal d’expériences (coût optimal) et un nombre minimal de niveaux (facilité dans les
changements de niveaux des différents facteurs). En plus, il permet d’identifier les facteurs
ayant une grande influence sur la réponse ainsi que les interactions entre eux (Wang
et Wan, 2009).
Néanmoins, ce type de plans nécessite une phase de conception plus longue car
l'interprétation des résultats dépend essentiellement du choix de p, où son augmentation
diminue la charge expérimentale mais d’un autre coté réduit la qualité des informations tirées
du plan. Il faudra donc évaluer les risques avant de démarrer l'expérimentation et les
minimiser en construisant le plan fractionnaire adéquat.
2.3.2.2. Le plan factoriel fractionnaire appliqué
Dans notre travail, le plan factoriel fractionnaire 24-1
à deux niveaux est utilisé
pendant l’expérimentation afin de mettre en évidence l’influence de quatre facteurs sur la
production de la protéase d’A. niger : la poudre du lait écrémé (x1), la caséine (x2), le CaCl2
(x3) et le taux d’humidité (x4).
64
Cette façon d’écrire 24-1
est très commode, où le 2 signifie que chaque facteur prend
deux niveaux (les signes – et + indiquent respectivement le niveau inférieur (-1) et le niveau
supérieur (+1) des facteurs), le 4 indique quatre facteurs qui sont étudiés et le 1 signifie que le
nombre des essais à effectuer est divisé par 21 par rapport au plan factoriel complet. On
constate également que cette notation indique le nombre des expériences à réaliser : 24-1
= 8.
La matrice expérimentale du plan factoriel fractionnaire 24-1
est donnée par le tableau
VIII, où le quatrième facteur (taux d’humidité) peut être étudié sur l’interaction x1x2x3 et l’on
écrira x4= x1x2x3.
Tableau VIII: La matrice expérimentale utilisée pour mettre en place les expériences du plan
factoriel fractionnaire 24-1
.
Facteurs
N° Expériences
x1
(Lait écrémé)
x2
(Caséine)
x3
(CaCl2)
x4
(Taux d’humidité)
1 -1 -1 -1 -1
2 -1 +1 -1 +1
3 -1 +1 +1 -1
4 -1 -1 +1 +1
5 +1 -1 -1 +1
6 +1 +1 -1 -1
7 +1 -1 +1 -1
8 +1 +1 +1 +1
Tableau IX: Niveaux expérimentaux des quatre facteurs utilisés dans le plan factoriel
fractionnaire 24-1
.
Niveau bas (-1) Niveau haut (+1)
Lait écrémé (g) 1 2
La caséine (g) 1 2
CaCl2 (g) 0,5 1
Le taux d’humidité (%) 35,70 49,70
65
2.4. Extraction et purification de la protéase d’A. niger
2.4.1. Protocole d’extraction
À la fin de la fermentation, la protéase d’A. niger est extraite à l’eau distillée. Le son
de blé fermenté est repris dans 50 ml d’eau distillée, ce qui correspond à un rapport de
1:5 (p/v). Après agitation à 160 rpm pendant 2 heures à 30°C, le mélange est centrifugé à
4000 rpm pendant 30 min à 4°C, dont le surnageant récupéré représente l’extrait enzymatique
brut (Tunga et al., 1999 ; Tunga et al., 2003 ; Sandhy et al., 2005).
2.4.2. Précipitation au sulfate d’ammonium
Les protéines sont des molécules très sensibles à leur environnement et peuvent
facilement perdre temporairement ou définitivement leurs propriétés biologiques. La
précipitation différentielle (fractionnée) est l’une des méthodes les plus rapides qui permet de
récupérer les protéines sous forme concentrée tout en gardant leurs activités biologiques
(Walsh et Headon, 1997).
Principe
La plupart des électrolytes (généralement des sels très solubles en milieu aqueux)
combinent à la fois la déshydratation et la neutralisation des protéines. Ce type de
précipitation est basé sur le fait que les conditions ioniques qui rendent les protéines
insolubles varient pour chaque type de ces biomolécules et donc on peut ajuster les
concentrations du sel pour isoler la protéine désirée (Walsh, 2002; Janson, 2011).
La solubilité d’une protéine varie en fonction de la force ionique du sel en solution.
À des faibles concentrations en sels, la solubilité de la protéine augmente (salting-in) ainsi
que le risque de sa dénaturation. Par contre, quand la concentration en sel est assez élevée
pour priver la protéine des molécules d'eau qui l'hydratent, celle-ci sorte de la solution
et précipite, c’est le phénomène de relargage salin (salting-out) qui permet de stabiliser la
structure native de la protéine et diminuer au maximum la dénaturation (Sine, 2003; Coulon
et al., 2004; Culter, 2004; Voet et al., 2005; Koolman et Rohm, 2005). La principale méthode
de précipitation différentielle est celle qui utilise le sulfate d'ammonium (NH4)2SO4.
66
Mode opératoire
La précipitation au sulfate d’ammonium de l’extrait enzymatique brut a été effectuée
à 40%, 60% et 80% de saturation. À 50 ml d’extrait brut on ajoute 14g, 21g et 28 g du sulfate
d’ammonium, sous agitation lente à 4°C pour atteindre les 40%, 60% et 80% de saturation
respectivement.
Les solutions saturées ainsi obtenues sont mises à décanter pendant 16-18 heures à
4°C. Après centrifugation (4000rpm, 1h, 4°C), la présence de l’enzyme coagulante est
recherchée dans le surnageant et le culot. Ce dernier est mis en suspension dans un volume
réduit du tampon citrate de sodium (0,1M ; pH 5,2) (voir composition : annexe C), pour être
dialysé par la suite afin d’éliminer le sulfate d’ammonium résiduel.
2.4.3. Dialyse
Principe
La dialyse est une méthode de séparation basée sur le mouvement des molécules à
travers une membrane semi-perméable du milieu plus concentré au moins concentré.
Seules les molécules possédantes une taille inférieure au diamètre des pores de la
membrane sont capables de diffuser de part et d’autre et d’atteindre l’équilibre avec le volume
total de la solution dans le système, telles que celles du solvant, des sels et de petits
métabolites. Par contre, les macromolécules comme les protéines ne sont pas diffusables où
elles seront retenues dans le même compartiment de la membrane comme au début de
l’expérience (Voet et al., 2005; Hames et al., 2006; Sheehan, 2009; Janson, 2011).
Mode opératoire
Les protéines précipitées mises en suspension dans un volume réduit du tampon citrate
de sodium (0,1 M; pH 5,2) sont dialysées contre le même tampon, en utilisant une membrane
semi-perméable (Sigma-Aldrich 25mm, 1.0 in) sous une faible agitation à 4°C pendant 24h.
Par la suite, la fraction protéique diluée est concentrée en recouvrant le boudin avec une
solution de saccharose à 50% pendant 2h.
67
2.4.4. Chromatographie d’exclusion moléculaire
Principe
La chromatographie d’exclusion moléculaire diffère des méthodes adsorbantes, au
niveau du qu’elle les interactions protéines - matrice chromatographique ne sont pas
exploitées mais réduites. Elle sépare les protéines en fonction de leur poids moléculaire, où
les petites molécules entrent dans la structure poreuse de la matrice (résine) ce qui engendre
leur retard, alors que les grosses sont progressivement exclues de la phase stationnaire
et laissent la colonne rapidement (Demain et Davies, 1999; Palmer, 2001; Balasubramanian
et al., 2004; Miller, 2005; Koolman et Rohm, 2005).
Mode opératoire
Le gel Sephadex G-100 a été utilisé comme une phase stationnaire (matrice) pendant
la purification de l’extrait enzymatique concentré par chromatographie sur gel de filtration. Ce
gel est formé de dextran: un polymère glucidique constitué de fibres réticulées sous forme de
microbilles poreuses, qui se gonflent considérablement dans l’eau. Il possède un domaine de
fractionnement varie de 4 à 150 kDa.
Une quantité suffisante du gel Sephadex G-100 est gonflée dans un excès de tampon
citrate de sodium (0,1M; pH 5,2) pendant 72h et dégazée à l’aide d’une pompe à vide. Le gel
est ensuite coulé dans une colonne de type Spectra/ChromTM
LC Column (30 x 1,5 cm),
équilibré par la suite avec le même tampon.
Un volume de 0,6ml d’extrait enzymatique concentré est déposé délicatement à la
surface du gel à l’aide d’une baguette en verre. L’élution est réalisée par le tampon citrate de
sodium (0,1M; pH 5,2) à un débit de 16,5 ml/h assuré par une pompe péristaltique. Les éluas
sont recueillis dans un collecteur de fraction à raison de 2 ml/tube. Après le dosage des
protéines par lecture des absorbances à 280 nm, la recherche de l’activité coagulante a été
faite au niveau de chaque tube.
2.4.5. Chromatographie échangeuse d’ions
La chromatographie d’échange d'ions assure la séparation des molécules ionisables,
sur la base des différences dans les propriétés de charge (Culter, 2004 ; Cummins et al.,
2011). Un échangeur d’ions est un polymère insoluble (dextran réticulé, les gels d’agarose,
68
cellulose, polystyrène, …) renferme des groupes ionisables qui lui sont chimiquement liés. On
distingue deux types d’échangeurs d’ions ; les échangeurs cationiques et les échangeurs
anioniques.
Il y a deux manières d’éluer les molécules fixées sur l’échangeur (procédés appelés :
élution par paliers ou par gradient):
Modification du pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui
sont chargées ne le soient plus ou qu’elles portent une charge du même
signe que l’échangeur d’ions. Il n’y a plus alors d’interaction
électrostatique entre les deux compartiments et les molécules sont éluées.
Addition d’un sel à une concentration croissante qui apporte forcément un
ion de même charge que les molécules fixées, cet ion s’appelle un contre
ion (Sine, 2003 ; Voet et al., 2005).
Mode opératoire
Le Sephadex DEAE-A50 a été utilisé comme une phase stationnaire pendant la
purification de l’extrait enzymatique concentré par chromatographie d’échange d’ions. C’est
un faible échangeur anionique de nature organique à base de polysaccharides réticulés
(dextran), comporte un groupement fonctionnel : le diéthylaminoéthyl –O-C2H4-N-(C2H5)2.
Il est préparé à partir de Sephadex G-50, présente une grande porosité ce qui le rend très
compatible pour la séparation des molécules dont le PM>30 kDa et possède une grande
stabilité de fonctionnement dans la gamme du pH compris entre 2-9 (Doonan, 1996).
Le DEAE-A50 gonflé dans le tampon citrate de sodium (0,1M; pH 5,2) est dégazé
puis coulé dans une colonne Omnifit (15 x 1,5 cm), équilibré par la suite avec le même
tampon. 0,5ml d’extrait enzymatique concentré est appliqué à la surface de la colonne.
Il est connu que le point isoélectrique des protéases acides est compris entre un pH de
3 et 4,5 (Rao et al., 1998). Dans ce cas là, la protéase d’A. niger dans le tampon citrate de
sodium (0,1M; pH 5,2) sera chargée négativement (pH du tampon>pI de la protéase), alors
que l’échangeur sera chargé positivement (pH du tampon<pKa DEAE-A50= 9,5) (Cummins
et al., 2011).
69
Les protéines très négativement chargées seront fortement retenues sur cet échangeur,
les moins chargées seront moins retenues, tandis que les protéines positivement chargées
et neutres seront exclues pendant le premier lavage de la colonne.
Après élimination des protéines non fixées à l’échangeur, les protéines adsorbées sont
éluées en utilisant un gradient linéaire du NaCl allant de 0 à 1M (contre ion est le Cl-). Le
débit d’élution est maintenu constant à 14,7ml/heure. La lecture de l’absorbance des éluas
recueillis est effectuée toujours à 280 nm et l’activité coagulante a été recherchée au niveau de
chaque tube.
2.4.6. Ultrafiltration
Principe
L’ultrafiltration est une méthode de séparation des molécules dissoutes ou en
suspension dans un solvant en fonction de leur taille. Elle utilise des membranes à
perméabilité sélective, qui permettent à toute substance d’une taille inferieure à celle des
pores de la membrane (généralement entre 1 à 20 nm) de passer, alors que les grandes seront
retenues. Une pression est exercée sur la solution à ultrafiltrer par un gaz (généralement
nitrogène ou l’azote) ou par centrifugation.
L’ultrafiltration à petite échelle peut être effectuée dans des concentrateurs à
centrifuger. L’échantillon à concentrer (0,1-1,5ml) est centrifugé dans un tube à filtre qui
retient les molécules dont la taille est plus grande que le diamètre des pores du filtre. La
membrane est conçue pour conserver un petit volume minimum (~10µl), ce qui empêche les
macromolécules de perdre la totalité du tampon et de devenir ainsi dénaturées (Walsh, 2002 ;
Sheehan, 2009; Janson, 2011).
Mode opératoire
Les fractions présentant une activité coagulante sont rassemblées et concentrées par
ultrafiltration dans un tube millipore, ayant une membrane de 10 kDa (laisse passer les
molécules dont le poids moléculaire est inférieur à cette valeur) avec centrifugation
(4000rpm) à 4°C. Le concentré obtenu est conservé jusqu’à une utilisation ultérieure.
70
Rf= Distance parcourue par la protéine/ Distance de migration du bleu de bromophénol
2.4.7. SDS-PAGE (Laemmli, 1970)
Principe
De la même façon qu’un ion est accéléré dans un champ électrique, les protéines, qui
ont une densité de charge non nulle à un pH autre qu’à leur point isoélectrique, vont aussi
déplacer à une vitesse proportionnelle à leur densité de charge. Si on applique un champ
électrique à une solution protéique, les protéines vont migrer à des vitesses différentes vers
l’une ou l’autre des électrodes tout dépend de leurs taille, forme et charge électrique (Skoog
et al., 2003; Hames et al., 2006; Janson, 2011).
Dans les conditions dénaturantes en présence d’un excès en SDS (détergent anionique
puissant), il se fixe sur les protéines et les transforme en poly-anions linéaires due au
dépliement des protéines provoqué par la répulsion électrostatique des molécules de l’agent
dénaturant; éliminant donc les facteurs de séparation basés sur la différence de formes et de
charges. En plus, le β-mercaptoéthanol (agent réducteur) en combinaison avec la chaleur
coupe les ponts disulfures internes des protéines établis par les résidus Cys (structure
quaternaire) (Karp, 2004 ; Koolman et Rohm, 2005; Rosenberg, 2005).
Il existe une relation linéaire entre le logarithme de la masse moléculaire d’une
protéine et sa mobilité électrophorétique dans un gel de poly-acrylamide. Un courbe étalon est
établie afin de déterminer le poids moléculaire de la protéine étudiée avec Log (PM)= f(Rf)
dont le Rf représente le rapport frontal de la protéine considérée:
Mode opératoire
Afin de déterminer le poids moléculaire et la pureté de l’extrait enzymatique
d’A. niger au cours des différentes étapes suivies pendant l’essai de purification,
l’électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) sur un gel discontinu a été
appliquée. Les échantillons et les marqueurs de PM, repris deux volumes à un volume dans
le tampon d’échantillon, sont séparés sur un gel de poly-acrylamide constitué d’un gel de
séparation à 10% et d’un gel de concentration à 5%.
71
La migration électrophorétique est réalisée grâce à la cuve d’électrophorèse «Consort
N.V, Maxwell». La révélation des protéines séparées est faite après coloration du gel au
BBC R-250 suivie d’une décoloration par le mélange (méthanol, acide acétique, eau) (voir la
préparation des solutions et des gels : annexe F).
2.5. Méthodes de caractérisation physico-chimique de la protéase d’A. niger
La caractérisation de l’extrait enzymatique consiste à optimiser les paramètres qui
influent sur le lait. Ce sont la température et le pH du lait, la concentration en CaCl2 dans le
lait et la concentration en enzyme.
La mesure de l’activité coagulante est déterminée par la mesure du temps de
coagulation, en faisant varier les valeurs des paramètres étudiés selon les conditions
standards. L’activité coagulante est exprimée en pourcentage (activité relative) par rapport à
la plus forte activité obtenue (temps de coagulation le plus court).
2.5.1. Influence du pH du lait sur l’activité enzymatique
Le pH optimum de l’activité coagulante est déterminé par la mesure du temps de
coagulation du mélange réactionnel à des pH du lait variant de 5 à 8 (écart de 0,5) ajustés par
une solution d’HCl et/ou du NaOH 1N.
2.5.2. Effet de la température du lait
La détermination de la température optimale d’activité enzymatique de l’extrait brut
et partiellement purifié est obtenue par mesure du temps de coagulation du lait incubé à des
températures variant de 30 à 65°C et cela dans les conditions standards de mesure de l’activité
coagulante.
2.5.3. Effet de la concentration en CaCl2
Le calcium est ajouté au lait sous forme du chlorure de calcium ce qui provoque une
baisse de son pH. Il s'agit probablement d'un échange d'ions H+ par Ca
2+ sur les micelles de
caséine. Pour étudier l’influence du calcium ionique seul, on a ramené le lait à un pH fixe de
6,4 ; en modifiant par la suite la concentration du CaCl2 dans le lait du 0,005M à 0,05M avec
un intervalle de 0,01M.
72
2.5.4. Effet de la concentration en enzyme
L’influence de la concentration enzymatique sur l’activité coagulante a été déterminée,
en variant la concentration en protéines de l’extrait enzymatique brut de 58 à 464µg/µl et de
13 à 78µg/µl pour l’extrait enzymatique partiellement purifié.
2.5.5. Etude de la stabilité de la protéase d’A. niger
L’étude de la stabilité des extraits brut et partiellement purifié est déterminée en
fonction des paramètres suivants : la température et le pH, où l’activité coagulante résiduelle
exprimée en pourcentage par rapport à l’activité initiale, est déterminée selon les conditions
standards de mesure.
2.5.5.1. Stabilité thermique
Cette étude est réalisée, en incubant les extraits enzymatiques à des températures
variant de 30 à 65°C dans le tampon citrate de sodium (0,1M; pH 5,2) pendant 60min.
2.5.5.2. Stabilité vis-à-vis du pH
La stabilité vis-à-vis du pH est déterminée par la mesure de l’activité coagulante
résiduelle des extraits enzymatiques brut et partiellement purifié maintenus pendant 24h à
4°C dans le tampon citrate de sodium (0,1M) à des pH variant de 2 à 8.
2.6. Analyse statistique (Gogue, 2004)
2.6.1. Moyenne arithmétique (Χ¯) des valeurs individuelles
Cette fonction mesure la tendance centrale qui représente le centre d'un groupe de
nombres dans une distribution statistique. Elle est calculée selon la formule suivante :
Χ¯= Σxi /n avec Σxi : somme des valeurs individuelles; n : nombres des valeurs.
2.6.2. Ecart type et l’erreur standard à la moyenne (esm)
Pour une distribution donnée, l’écart-type représente la mesure de la dispersion des
données autour de la moyenne. Lorsque cette distribution concerne un échantillon prélevé au
sein d’une population, l’expression correcte de l’écart-type de la moyenne est:
avec esm = σ/ (n : l’effectif d’échantillon) σ =
73
Chapitre III
Résultats & Discussion
74
3- Résultats et discussion
Cette partie expose l’ensemble des résultats obtenus portant sur l’optimisation de la
production de la protéase d’A. niger, la procédure de purification ainsi que l’étude physico-
chimique des extraits enzymatiques brut et partiellement purifié.
3.1. Mise en évidence de l’activité protéolytique
Après revivification et vérification de la souche d’Aspergillus niger, la mise en
évidence de son activité protéolytique a été effectuée par culture sur milieu Czapek-Dox Agar
(modifié) à base de caséine (figure 5) et par fermentation sur milieu solide à base de son de
blé humidifié par une solution minérale (tableau X).
Tableau X : Mise en évidence de l’activité protéolytique d’A. niger par deux méthodes.
Méthode Sur boite de pétri
(Plat Agar) (mm)
Sur milieu solide
(son de blé)
Zone de protéolyse
27
-
Activité protéolytique (µg/h/ml) -
1253,01 ± 145,07
Activité coagulante (US/ml) -
35,7± 3,8
AP
Figure 5: Mise en évidence de l’activité protéolytique d’A. niger sur milieu
Czapek-Dox agar (modifié) à base de caséine (AP : anneau de protéolyse,
culture de 5 jours).
75
y = 0,2102x + 0,1164
R² = 0,989
0
0,15
0,3
0,45
0,6
0,75
0,9
1,05
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Ab
sorb
an
ce (
650 n
m)
Nombre de spores (x106)/ml
L’apparition des zones de protéolyse (anneau clair) autour de la colonie d’A. niger est
le résultat de la réaction d'hydrolyse de la caséine qui donne des acides aminés solubles
utilisables. Le diamètre de cette zone est lié à la quantité des protéases extracellulaires
produite par le champignon.
3.2. Dénombrement des spores
La figure 6 représente la courbe d’étalonnage de l’absorbance à 650nm de la
suspension fongique d’A. niger en fonction du nombre de spores. L’équation de la droite nous
permet de calculer le nombre de spores/ml selon l’expression suivante:
Où Y: absorbance de la suspension fongique à 650nm.
X: nombre de spores/ml.
Un inoculum de 2x106
spores/ml a été utilisé durant les premières étapes
d’optimisation ayant une A650nm= 0,55 ; ce qui nous aide à diminuer le temps des expériences
sans recours à chaque fois à la méthode classique de dénombrement des spores sous le
microscope photonique.
Y = 0,2102X + 0,1164
Figure 6: Courbe d’étalonnage de l’absorbance de la suspension
fongique d’A. niger en fonction du nombre de spores.
76
0
20
40
60
80
100
120
140
SA M-9 SM C. Dox
Act
ivit
é co
agu
lan
te (
US
/ml)
Milieu salin
3.3. Optimisation de la fermentation par la méthode classique
3.3.1. Choix du milieu minéral
L’influence de la composition du milieu minéral sur la production de la protéase
d’A. niger a été évaluée par l’utilisation de quatre milieux minéraux différents : solution du
Czapek-Dox (C. Dox), solution M-9, solution du sulfate d’ammonium à 0,05% (SA) et une
solution minérale (SM).
Les résultats illustrés dans la figure 7 montrent que l’addition des sels inorganiques a
un effet distinct sur la production d’enzyme. Les résultats obtenus révèlent que la solution du
Czapek-Dox additionnée au son de blé assure une meilleure production de la protéase
d’A. niger avec une activité coagulante de l’ordre de 112,67±4,95 US/ml et un AC/AP de
2,70. Par contre, la solution du sulfate d’ammonium à 0,05% donne la plus faible activité
(32,736±0,816 US/ml). Tunga et al., (1998) ont trouvé que la solution M-9 permet d’avoir le
maximum d’activité protéolytique de la protéase alcaline produite par Rhizopus oryzae sur
son de blé.
Selon la littérature, des concentrations faibles ou élevées, ainsi que la combinaison
des sels ont des effets remarquables sur les activités métaboliques des microorganismes
puisqu’ils augmentent les rendements de production des métabolites et favorisent la
croissance microbienne (Tunga et al., 1998).
Figure 7: Influence de la composition des milieux salins sur la
production de la protéase d’A. niger.
77
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50
Act
ivit
é co
agu
lan
te (
US
/ml)
Température ( C)
3.3.2. Température optimale d’incubation
L'effet de la variation de la température d’incubation sur la production de la protéase
d’A. niger est représenté dans la figure 8. La fermentation réalisée à 30°C représente
l’optimum de la production d'enzyme avec une activité coagulante de 104±1,7 US/ml et un
AC/AP 3,67 ; ce qui reflète la nature mésophile de l’espèce utilisée. Une production plus
faible a été observée à des températures plus basses et plus élevées, associée à une moindre
production de la biomasse et qui s’annule à 45°C.
Cette température optimale est similaire à celles décrites pour Rhizomucor (Preetha
et Banarjee, 1994), Penicillium griseoroseum (Haq et al., 2004), Rhizopus oryzae (Kumar
et al., 2005), A. niger (Wang et al., 2006; Moosavi-Nasab et al., 2010 ) et A. oryzae (Shata,
2005; Vishwanatha et al., 2010) produisant des protéases par fermentation sur milieu solide à
base du son de blé. Du même, d’autres enzymes coagulantes extraites à partir d’Amylomyces
rouxii, Mucor pusillus et Mucor J20 possèdent la même température optimale de production
(Shieh et al., 2009).
La température d’incubation affecte les performances de la fermentation sur milieu
solide ; en raison de son importance dans la croissance des microorganismes et la production
des métabolites (accélère la vitesse de toutes les réactions enzymatiques).
Figure 8 : Influence de la température d’incubation sur la
production de la protéase d’A. niger (solution Czapek-Dox).
78
0
20
40
60
80
100
120
140
2 3 4 5 6 7 8
Act
ivit
é co
agu
lan
te (
US
/ml)
pH initial du milieu
La production de la protéase d’A. niger à plus basse température est plus avantageuse,
car elle entraîne une baisse des taux d'évaporation ce qui évite l’augmentation de la
température de fermentation pendant la période d’incubation. Mais, des phénomènes inverses
se produisent à des températures élevées: l’élévation de la température dans la masse
fermentable due à un dégagement de la chaleur métabolique, provoque un assèchement de la
culture, une baisse de l’activité de l’eau (aw) et de la disponibilité des éléments nutritifs ce qui
limite l’aération et induit une croissance limitée voir impossible.
3.3.3. pH optimal de la production
Afin d’étudier l’influence du pH initial de la solution saline du Czapek-Dox sur la
production de la protéase d’A. niger, des fermentations sont conduites à la température
optimale mais à différents pH variant de 3 à 7 pendant 3 jours.
La figure 9 montre que la production de la protéase d’A. niger est maximale à
pH 4. Une baisse de la productivité en enzyme est observée si le niveau du pH est supérieur
ou inférieur par rapport à cette valeur. On remarque également que la variation du pH du
milieu minéral (intervalle du pH 5-7) ne provoque pas une grande différence dans les
rendements de production, qui peut être expliquée par l’excellente capacité tampon du son de
blé (ainsi que quelques autres résidus agro-industriels) et par l'utilisation de petites quantités
expérimentales (Sandhya et al., 2005; Chutmanop et al., 2008).
Figure 9: Effet du pH initial du milieu minéral sur la production de
la protéase d’A. niger (solution Czapek-Dox, 30°C).
79
Des résultats similaires ont été trouvés par Singh et al., (1994), utilisant la
fermentation sur milieu liquide pour produire la protéase acide d’A. niger. Du même
Mashaly et al., (1981) mentionnent que le maximum de production de la protéase coagulante
de Mucor pusillus s’effectue dans un milieu à pH 3,7.
Par ailleurs, Negi et Banergee, (2010) trouvent que l’optimum de production de la protéase
d’A. awamori est obtenu sur le même substrat humidifié par la solution du Czapeck-Dox à
pH 5,5. De plus, Vishwanatha et al., (2010) et Gais, (2011) rapportent que les optimums du
pH de la production des protéases d’A. oryzae MTTC 5341 et de Rhizopus stolonifer sont 5
et 6 respectivement.
En effet, les activités métaboliques des microorganismes sont très sensibles à la
variation de pH, car il influe fortement sur des nombreux processus enzymatiques ainsi que le
transport de différents éléments nutritifs à travers la membrane cellulaire assurant la
croissance et la production des métabolites (Sandhya et al., 2005; Lazim et al., 2009;
Paranthaman et al., 2009). Ces activités métaboliques conduisent inévitablement à un
changement dans l'équilibre des ions hydrogène et donc du pH du milieu de culture (Elibol
et Moreira, 2005).
3.3.4. Taux d’humidité du substrat
Un niveau d'humidité de 39,21% a été trouvé optimal pour la production de l’enzyme
coagulante d’A. niger sur son de blé (160±3,512 US/ml). La figure 10 montre qu’à des
quantités en eau supérieures à l'optimum souhaité, l’activité d’enzyme est affectée de manière
significative.
Selon les travaux de Battaglino et al., (1991), un taux d’humidité compris entre
35-40% est optimal pour la production de la protéase d’A. oryzae sur le son de riz. Moosavi-
Nasab et al., (2010) ont trouvé que les meilleures activités coagulantes des extraits
enzymatiques produites par A. niger et A. oryzae s’effectuent à un taux d’humidité de 30%
sur son de blé. Un taux plus faible que ces valeurs déjà mentionnées, a été utilisé pour
produire la protéase du Mucor circinelloides (un taux d’humidité de 20%) (Sathya et al.,
2009). D’après les résultats obtenus par Chutmanop et al., (2008) et Sumantha et al., (2006),
les deux espèces fongiques A. oryzae et Rhizopus microsporus recommandent des taux
d’humidité de l’ordre de 44,44% et 50% afin d’avoir les meilleures productivités en protéases.
80
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
35 40 45 50 55 60 65 70 75
Act
ivit
é co
agu
lan
te (
US
/ml)
Taux d'humidité (%)
La teneur initiale d’humidité en SSF est un facteur crucial qui affecte à la fois la
croissance microbienne et les rendements en produits. Elle se varie pendant la fermentation
suite à l’évaporation causée par la chaleur métabolique, à l’hydrolyse du substrat et à la
production d’eau métabolique (Sumantha et al., 2006; Mukherjee et al., 2008).
L’eau est impliquée dans la croissance cellulaire, les réactions métaboliques, les
activités enzymatiques, le transport des éléments nutritifs, des métabolites extracellulaires
et des gaz au cours de la fermentation solide (milieu de diffusion) et entre également dans la
constitution du matériel biologique (Assamoi et al., 2009).
La faible teneur en eau des cultures solides provoque la diminution de la solubilité du
substrat et son degré de gonflement, ce qui réduit son accessibilité au champignon, mais qui
évite en même temps les contaminations bactériennes exigeant des taux d’humidité plus
importants.
D’autre part, à des teneurs plus élevées, plusieurs phénomènes ont été signalés : la
diminution de la porosité du substrat, la perte de la structure des particules, le développement
de la rigidité ce qui provoque la diminution des échanges gazeux (transfert d’O2 et de CO2)
et l’augmentation de développement du mycélium aérien (Sandhya et al., 2005; Sharma
et al., 2008; Chutmanop et al., 2008; Mahanta et al., 2008; Lazim et al., 2009).
Figure 10: Effet du taux d’humidité initial sur la production de la
protéase d’A. niger (solution Czapek-Dox, 30°C, pH4).
81
3.3.5. Concentration optimale d’inoculum
D’après les résultats présentés dans la figure 11, on constate que le maximum de
production de la protéase d’A. niger (AC=149,5±0,27US/ml ; AC/AP=3,81) est obtenu
lorsqu’un inoculum de 106
spores/ml a été ajouté à la culture. Un niveau d'inoculum plus
élevé que l’optimum provoque une diminution de la productivité en enzyme.
Les optimums de production de la protéase alcaline de Rhizopus oryzae (Tunga et al.,
1998) et de l’enzyme coagulante de Rhizopus stolonifer (Gais, 2011) ont été obtenus avec une
taille d’inoculum de 2x106 spores/ml. Selon les travaux d’Ikram-Ul-Haq et al., (2003)
et de Pushpa & Madhava, (2010) ; une concentration d’inoculum varie de 0,5 à 3x106
spores/ml est optimale pour produire la protéase de Rhizopus oligosporus IHS13 par SmF
et d’A. oryzae en SSF respectivement.
Par ailleurs, Sandhya et al., (2005) ; Sathya et al., (2009) mentionnent que la production de la
protéase d’A. oryzae et de Mucor circinelloides est optimale lorsque des concentrations
d’inoculum de l’ordre de 8x108 spores/ml et de 3x10
9 spores/ml ont été appliquées
respectivement.
L’inoculation des cultures solides se fait le plus souvent à partir d’une suspension de
spores qui offert plusieurs avantages par rapport aux cellules végétatives : elles restent viables
plus longtemps que le mycélium, sont moins sensibles aux conditions externes et se
conservent plus facilement.
La taille d'inoculum est un facteur biologique important, qui détermine la production
de biomasse en fermentation. Un inoculum très concentré peut produire une biomasse
excessive conduisant à l’épuisement rapide des nutriments nécessaires à la croissance rapide
de la culture et à la production des métabolites, alors qu’une densité en inoculum plus faible
peut donner une biomasse insuffisante induisant des faibles rendements en produits (Sandhya
et al., 2005; Sabu et al., 2006; Sharma et al., 2008).
82
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5
Act
ivit
é co
agu
lan
te (
US
/ml)
Concentration d'inoculum (x106 sp/ml)
3.3.6. Temps d’incubation
Le profil de la production de la protéase d’A. niger et la détermination du temps
d’incubation optimum ont été déterminés par incubation des cultures fongiques dans les
conditions optimales préalablement établies à différents temps allant de 1 à 7 jours.
Le maximum de la production d'enzyme a été observé après 72h de la fermentation
(figure 12). Le même résultat a été obtenu avec A. niger (Moosavi-Nasab et al., 2010)
et A. oryzae (Shata, 2005) sur son de blé, Rhizopus microsporus sur son de riz (Sumantha
et al., 2006) et avec A. clavatus sur milieu liquide (Tremacoldi et al., 2004).
Une diminution progressive de l’activité coagulante a été signalée avec l'augmentation
du temps d'incubation, suggérant clairement le rôle d’enzyme en tant qu’un métabolite
primaire, produit pendant la phase logarithmique de la croissance du champignon afin
d'utiliser les nutriments (protéines) présents dans le substrat solide.
L’incubation au-delà de cette période optimale a montré un déclin rapide dans le
rendement d’enzyme:
Cette diminution était probablement due à l'épuisement des éléments nutritifs à la
disposition des microorganismes;
Figure 11: Influence de la concentration en inoculum sur la production de la
protéase d’A. niger (solution Czapek-Dox, 30°C, pH4, TH=39,21%).
83
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Act
ivit
é co
agu
lan
te (
US
/ml)
Temps d'incubation (h)
L’inactivation d’enzyme par d'autres métabolites toxiques libérés dans le milieu;
La croissance active du mycélium, étroitement liée à la période d'incubation et des
conditions de culture, est essentielle pour la production des enzymes extracellulaires
(Sumantha et al., 2006; Paranthman et al., 2009; Lazim et al., 2009).
Conclusion 1
De l’ensemble des résultats obtenus, on déduit que la meilleure production de
l’enzyme coagulante d’A. niger (AC=166 ± 6,3 US/ml ; AC/AP=4,25) a été obtenue en SSF
sous les conditions optimales suivantes:
Solution minérale du Czapek-Dox à pH 4 ;
Taux d’humidité 39,21% ;
Température de la fermentation 30°C ;
La concentration d’inoculum 106 spores/ml ;
Temps d’incubation 72 heures.
Ces conditions expérimentales ont été utilisées pour l’optimisation de la production d’enzyme
coagulante d’A. niger par le plan d’expériences (sauf le cas du taux d’humidité).
Figure 12: Influence du temps d’incubation sur la production de la
protéase d’A. niger (solution Czapek-Dox, 30°C, pH4, TH=39,21%,
106 spores/ml).
84
3.4. Optimisation de la fermentation à l’aide du plan factoriel fractionnaire
Les résultats du plan factoriel fractionnaire 24-1
, élaboré afin de déterminer les
conditions expérimentales assurant une meilleure activité coagulante de la protéase d’A. niger
produite par SSF, sont donnés dans le tableau XI.
Tableau XI: Plan d’expériences et les résultats des activités enzymatiques de la protéase
d’A. niger.
x1 x2 x3 x4 Réponses (variables mesurées)
Facteurs
Expériences
Lait
écrémé
(g)
Caséine
(g)
CaCl2
(g)
Taux
d’humidité
(%)
y1 : AC
(US/ml)
y2 : AP
(μg/h/ml)
AC/AP
1 -1 -1 -1 -1 21,903 731,699 1,8
2 -1 +1 -1 +1 79,189 1514,164 3,14
3 -1 +1 +1 -1 8,823 259,735 2,04
4 -1 -1 +1 +1 30,04 818,639 2,2
5 +1 -1 -1 +1 116,44 1615,078 4,32
6 +1 +1 -1 -1 13,263 467,772 1,7
7 +1 -1 +1 -1 7,957 98,274 4,86
8 +1 +1 +1 +1 52,655 1192,795 2,65
Niveau (-1) 1 1 0,5 35,7
Niveau (+1) 2 2 1 49,7
De ces résultats, on déduit que le maximum d’activité coagulante de la protéase
d’A. niger (116,44 US/ml) a été obtenu dans l’expérience n°5, où la caséine et le CaCl2 sont
dans leur niveau inférieur (1g et 0,5g respectivement), alors que le taux d’humidité du substrat
et la poudre du lait écrémé sont dans leur niveau supérieur (49,7% et 2g respectivement).
La plus faible production a été observée dans l’expérience n°7 (7,957 US/ml),
probablement due au faible taux d’humidité utilisé mais aussi à la quantité du CaCl2 dans le
milieu. Les mêmes observations concernent l’activité protéolytique de l’enzyme.
Vue l’intervalle de la réponse obtenu (7,957 US/ml - 116,44 US/ml), on constate que
l’ensemble des facteurs choisis affecte la production de la protéase d’A. niger. Mais, afin de
déterminer quels sont les facteurs qui présentent une influence significative ou non, il est
nécessaire de traiter de manière statistique les résultats obtenus (calcul de la variance).
85
3.4.1. Traitement statistique des résultats
L’analyse statistique et la modélisation des résultats expérimentaux à l’aide du logiciel
« Minitab 15 » ont permis de mesurer l’effet de chaque facteur par le calcul du coefficient de
corrélation et son niveau de signification sur chaque réponse par la mesure de la probabilité
(P):
1). Le principe d’exploitation consiste à calculer les coefficients du modèle
polynomial (coefficient de corrélation); plus sa valeur absolue est élevée, plus le terme
correspondant (facteur simple ou interaction) a une influence importante sur la réponse
étudiée. S’il est faible, il a peu ou pas d’effet. S’il est négatif, dans ce cas l’augmentation de la
valeur du facteur entraîne une diminution de la réponse.
2). La signification statistique est déterminée grâce au test de probabilité (P):
P<0,3: le résultat est significatif, donc le facteur est retenu;
P>0,3: le résultat est non significatif, donc le facteur ne présente pas un effet
important sur la réponse ce qui l’exclue de l’étude.
3.4.2. Effet des facteurs sur l’activité coagulante (AC)
La modélisation permet d’exprimer l’effet des 4 facteurs testés sur la production
d’enzyme coagulante traduite par la mesure de l’activité coagulante, sous forme d’un modèle
mathématique; la régression linéaire multiple (modèle complet) suivante:
Tableau XII: Analyse de variance des facteurs du plan factoriel fractionnaire 24-1
: le cas
d’activité coagulante.
Variables Coefficient de
corrélation
Somme des
carrés
ddl T P Significativité
Constante 41,3 - - 4,87 0,017 -
Lait écrémé (A) 6,295 317,0 1 0,74 0,512 Non
Caséine (B) -2,801 62,8 1 -0,33 0,763 Non
CaCl2 (C) -16,415 2155,6 1 -1,94 0,148 Oui
Taux d’humidité (D)
28,297 6405,8
1 3,34 0,044 Oui
AC (US/ml) = 41,3 + 6,30 A - 2,80 B - 16,4 C + 28,3 D…..[1]
86
Du tableau XII, on constate que:
Le taux d’humidité (D): ce facteur a un coefficient de corrélation de +28,297 ;
ce qui reflète l’influence importante sur la production de la coagulase
d’A. niger, traduite par son effet significatif (PD=0,044 < 0,3).
Le CaCl2 (C): il présente un coefficient de corrélation négatif -16,415, où
l’augmentation de sa quantité dans le milieu provoque une diminution de la
production d’enzyme. Cette influence est significative du fait que
PC=0,148 < 0,3.
La poudre du lait écrémé (A) et la caséine (B) possèdent des coefficients de
corrélation faibles (6,295 et -2,801 respectivement), donc ces deux facteurs
n’ont pas des effets sur la réponse ou ils sont très faibles. Une conclusion
confirmée par le test de probabilité (PA=0,512 et PB=0,763 > 0,3) ; une
influence non significative sur la réponse ce qui les exclut de l’étude.
La modélisation confirme les résultats du tableau XI; le milieu optimal pour
l’activité coagulante correspond à celui utilisé dans l’expérience n°5. Le
modèle complet est significatif (P=0,147).
Il est connu que la caséine et la poudre du lait écrémé sont des inducteurs de la
synthèse des enzymes coagulantes (Silveira et al., 2005; Dutt et al., 2009). De ce fait,
l’obtention d’une activité coagulante plus importante avant cette période d’incubation
(72heures) est possible.
Dans une étude similaire, Silveira et al., (2005) ont trouvé que l’activité coagulante de la
protéase produite par Mucor miehei par SSF à base du son de blé additionné de 2g de
caséine/g du substrat solide, s’améliore après 48h d’incubation au lieu de 72h par
comparaison avec le témoin (milieu sans caséine).
De plus, la valeur négative du coefficient de corrélation du facteur caséine indique que
l’augmentation de sa concentration dans le milieu provoque une diminution de l’activité
coagulante, ce qui reflète la répression catabolique induite par la caséine. La même
observation a été signalée par Silveira et al., (2005), quand la concentration en caséine est
supérieure à 2g/g du son de blé.
87
En conclusion, l’application du plan factoriel fractionnaire 24-1
permet d’avoir une
production plus faible en protéase par rapport à celle obtenue avec la méthode d’un seul
facteur à la fois (166±6,3 US/ml), probablement due au choix des facteurs et de leurs
domaines de variation, d’où la nécessité d’une maîtrise plus rigoureuse des plans
d’expériences ainsi que la disposition d’un ensemble de données établie à partir des
expériences préliminaires. Mais, la méthode permet une réduction importante du nombre
d’expériences (ici de moitié) et la modélisation du phénomène.
3.4.3. Effet des facteurs sur l’activité protéolytique (AP)
L’équation de régression (modèle complet) qui exprime l’effet des 4 facteurs testés sur
l’activité protéolytique de la protéase d’A. niger est la suivante :
Tableau XIII: Analyse de variance des facteurs du plan factoriel fractionnaire 24-1
: le cas
d’activité protéolytique.
Variables Coefficient de
corrélation
ddl T P Significativité
Constante 837,27 - 11,44 0,001 -
Lait écrémé (A) 6,21 1 0,08 0,938 Non
Caséine (B) 21,35 1 0,29 0,790 Non
CaCl2 (C) -244,91 1 -3,35 0,044 Oui
Taux d’humidité (D)
447,90 1 6,12 0,009 Oui
Les résultats illustrés dans le tableau XIII indiquent un effet positif du lait écrémé, de
la caséine et du taux d’humidité sur l’activité protéolytique de la protéase d’A. niger, traduit
par leurs coefficients de corrélation positifs (6,21 ; 21,35 ; 477,9 respectivement). Cela montre
que leur présence à la concentration supérieure entraîne une augmentation de l’activité
protéolytique de la protéase.
L’effet du CaCl2 ajouté au milieu de fermentation est négatif (coefficient de
corrélation=-244,91); dont la concentration élevée entraîne la diminution d’activité
protéolytique. Seuls le taux d’humidité et la concentration en CaCl2 dans le milieu ont des
AP (μg/h/ml) = 837 + 6,2 A + 21,3 B - 245 C + 448 D…..[2]
88
effets significatifs (PC=0,044, PD=0,009). Le modèle complet est hautement significatif
(P=0,034).
Il faut bien comprendre qu'une expérience factorielle n'a pas pour but de montrer que
certains facteurs ont une influence plus grande que d'autres (il y’a toujours des différences
entre les effets), mais le l’objectif réel est d'identifier des facteurs qui permettent d'améliorer
un processus.
De plus, il est important de signaler que le modèle mathématique obtenu ne peut être
utilisé qu'à l'intérieur du domaine d'étude ; toute extrapolation est très risquée, car elle pourrait
apporter des résultats bien différents de ceux attendus.
Conclusion 2
L’application du plan factoriel fractionnaire 24-1
à l’optimisation de la production de la
protéase d’A. niger, nous permet de déterminer les influences significatives de la teneur en
humidité du substrat et de la quantité en CaCl2 dans le milieu et d’exclure l’importance des
autres facteurs du plan d’expériences (la quantité du lait écrémé et celle de la caséine), ainsi
que la modélisation de la production.
Cette étape d’optimisation permet d’avoir une activité coagulante de 116,44 US/ml
et un rapport AC/AP de 4,32 ; obtenus en appliquant les conditions expérimentales
préalablement optimisées par la méthode classique (un facteur à la fois), mais avec un taux
d’humidité de 46,7% et en présence de CaCl2, la caséine et la poudre du lait écrémé
additionnés au milieu de fermentation avec les concentrations suivantes: 0,5g ; 1g et 2g/10g
de son de blé respectivement.
3.5. Purification partielle de la protéase d’A. niger
3.5.1. Précipitation d’extrait enzymatique au sulfate d’ammonium
D’après le tableau XIV, on constate que la précipitation des protéines d’extrait brut
d’A. niger au sulfate d’ammonium avec un taux de saturation à 80%, donne la meilleure
activité coagulante (62,84±1,008 US/ml) au niveau du culot avec l’absence de cette dernière
au niveau de surnageant. À ce taux de saturation, 35,5% de protéines sont précipitées par
rapport à l’extrait brut.
89
Le même résultat a été obtenu par Abdellaoui, (2007); Kumar et al., (2008); Gais,
(2011) et Nouani et al., (2011), lors d’étude des protéases coagulantes produites par A. niger,
Synergistes sp., Rhizopus stolonifer et Mucor pusillus respectivement.
Tableau XIV : Précipitation de l’extrait enzymatique brut d’A. niger au sulfate d’ammonium.
D’autres taux de saturation situés dans l’intervalle 60-70% sont utilisés pour précipiter
les protéases coagulantes des grains d’albizia et de tournesol (Egito et al., 2007), ainsi que
celle produite par Centaurea calcitrapa (Raposo et Domingos, 2009).
Il faut signaler que les autres méthodes de précipitation des protéines (par des alcools,
des solvants organiques ou par le polyéthylène glycol) sont utilisables pour précipiter les
protéases, mais qui nécessitent des conditions rigoureuses afin d’éviter leur dénaturation
(Sine, 2003; Sumantha et al., 2006).
3.5.2. Chromatographie d’exclusion moléculaire
La figure 13 représente le profil d’élution sur gel Sephadex G-100 de l’extrait
enzymatique brut d’A. niger concentré par dialyse après précipitation au sulfate d’ammonium
à 80% de saturation. Il est caractérisé par la présence d’un seul pic qui exprime l’activité
coagulante et de deux pics qui représentent les protéines de l’extrait enzymatique brut
concentré.
Abdellaoui, (2007); Nouani et al., (2011) et Gais, (2011) ont trouvé presque des
profils d’élution similaires après la gel filtration des extraits enzymatiques concentrés produits
par A. niger, Mucor pusillus et Rhizopus stolonifer sur gel Sephadex G-75 et G-100
respectivement.
Des représentations graphiques obtenues après chromatographie sur gel filtration des
extraits enzymatiques bruts ou concentrés et qui exposent la présence d’un seul pic d’activité
coagulante comme dans notre cas, ont été signalées par certains chercheurs: Poza et al.,
Taux de saturation en
(NH4)2SO4 (%)
Activité coagulante
(US/ml)
Dans le surnageant Dans le culot
40 19,58± 0,48 15,3±0,266
60 8,85± 0,124 38,4±1,440
80 Absence 62,84±1,008
90
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60A
ctiv
ité
coagu
lan
te (
US
/ml)
Ab
sorb
an
ce (
280 n
m)
N de fraction
Absorbance (280nm)
Activité coagulante (US/ml)
(2003) lors de purification de l’enzyme coagulante de Myxococcus xanthus 422 sur gel
Sepharyl S-200; Siala et al., (2009) et Vishwanatha et al., (2009), après séparation des
différentes fractions des extraits coagulantes produites par A. niger et A. oryzae sur gel
Sephadex G-75.
Du même, Fernandez-Lahore et al., (1999) et El-Bendary et al., (2007) trouvent que
l’activité coagulante des protéases élaborées par Mucor sp. et Bacillus sphaericus se présente
sous la forme d’un seul pic après chromatographie sur gel de filtration des fractions obtenues
par élution à travers des échangeurs ioniques.
3.5.3. Chromatographie d’échange d’ions
La chromatographie d’échange d’ions a été réalisée sur un échangeur anionique faible
(DEAE-A50), en utilisant l’extrait brut concentré par dialyse afin de comparer l’efficacité de
purification des deux méthodes chromatographiques.
D’après le profil d’élution illustré dans la figure 14, on observe la présence de
plusieurs pics qui représentent les protéines d’extrait enzymatique et d’un seul pic actif:
Figure 13: Profil d’élution sur Sephadex G-100 de l’extrait enzymatique précipité
(80%) d’A. niger [colonne (1,5x30 cm), tampon citrate de sodium (0,1M; pH 5,2),
débit 0,275ml/min].
91
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0
0,2
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0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Act
ivit
é co
agu
lan
te (
US
/ml)
Ab
sorb
an
ce (
280n
m)
NaC
l (m
ole
/l)
N de fraction
Absorbance (280nm)
NaCl (M)
Activité coagulante (US/ml)
En effet, les premiers pics obtenus (fractions 4-27) représentent les protéines
qui sont éluées au début de la chromatographie en utilisant le tampon citrate
de sodium seul (0,1M ; pH 5,2), indiquant que ces protéines sont soit neutres
soit possèdent une charge du même signe que l’échangeur anionique (charge
positive), ce qui les empêche d’établir des interactions avec ce dernier.
L’utilisation d’un gradient de concentration 0-1M du NaCl préparé dans le
même tampon précédemment décrit, permet d’éluer les autres fractions
protéiques restantes, y comprise la protéase coagulante d’A. niger qui
correspond au cinquième pic du profil, éluée avec le gradient NaCl à une
concentration de 0,36M.
Les trois derniers petits pics apparus après celui de la protéase, représentent
les protéines qui sont les plus fortement retenues sur l’échangeur, car elles
font intervenir plus des liaisons électrostatiques, ce qui demande une
concentration en sel plus importante pour les éluer.
Figure 14 : Profil d’élution sur DEAE- A50 de l’extrait enzymatique précipité
(80%) d’A. niger [colonne (1,5x15 cm), tampon citrate de sodium (0,1M; pH 5,2);
débit 0,245 ml/min].
92
Notre résultat est en accordance avec ceux obtenus par El-Bendary et al., (2007);
Siala et al., (2009) et Nouani et al., (2011), où un seul pic d’élution doué d’activité
coagulante est obtenu après purification sur DEAE-Sephadex A-25, CM-Sephadex C-50
et QEAE-Sephadex A-50 des extraits enzymatiques du Bacillus subtilis, d’A. niger et du
Mucor pusillus respectivement. Poza et al., (2003) rapportent que la protéase de Myxococcus
xanthus 422 présente deux pics d’activité coagulante après purification sur DEAE-Biogel A.
Afin d’estimer de manière quantitative l’efficacité de purification de chaque méthode
appliquée pendant notre démarche expérimentale, les paramètres de purification ont été
déterminés (tableau XV).
Tableau XV : Paramètres de purification de la protéase d’A. niger.
D’après les résultats obtenus, on note une diminution remarquable de la teneur en
protéines totales au cours de la purification, qui passe de 52,65mg pour l’extrait brut à 0,66mg
pour l’extrait purifié par DEAE-A50. La même remarque concerne l’activité coagulante qui
diminue de 5237,5 US à 522 US obtenue avec la protéase purifiée.
Par contre, l’activité spécifique augmente avec chaque étape de purification. Elle passe
de 99,477US/mg pour l’extrait enzymatique brut à 790,9 US/mg dans le cas de l’extrait
purifié obtenu par chromatographie échangeuse d’ions sur DEAE-A50, ce qui reflète une
augmentation d’environ 8 fois avec des pertes en rendements d’activité coagulante jusqu’à
10 % obtenu à la fin de la purification.
Étapes de
purification
Protéines
totales
(mg)
Activité
totale
(US)
Activité
spécifique
(US/mg)
AC/AP Facteur de
purification
Rendement
(%)
Extrait brut 52,65
5237,5 99,477 4,25 1 100
Précipitation
à 80%
10,033 2241,44 223,43 5,22 2,246 42,80
DEAE-A50
(après dialyse)
0,66
522 790,90 14,22 7,95 9,97
Filtration sur
gel
1,33 226,152 170,04 4,757 1,709 4,317
93
Un facteur de purification de 2,246 a été obtenu après précipitation de l’extrait
enzymatique brut au sulfate d’ammonium. Selon la littérature, le fractionnement par
l’augmentation de la teneur en sel conduit généralement à un facteur de purification compris
entre 2 et 5, ce qui constitue une limitation de l’usage du sulfate d’ammonium à une étape de
concentration qui facilite les autres étapes ultérieures de la purification (Sine, 2003).
Le dosage de l’activité protéolytique selon la méthode d’Anson, (1938) modifiée par
Mechakra et al., (1999) nous permet de calculer le rapport AC/AP. D’après le tableau XIV, ce
rapport s’améliore avec les étapes de purification (de 4,25 à 14,22), suite à la diminution de
l’activité protéolytique probablement due à l’élimination des protéases non spécifiques
pendant la purification.
Le facteur de purification obtenu pour la protéase d’A. niger (7,95) est supérieur à
ceux rapportés par Preetha & Boopathy, (1997) et Siala et al., (2009), qui ont obtenu des
facteurs de purification de 5,3 et 3,55 concernant la protéase de Rhizomucor miehei NRRL
3500 et d’A. niger I1 respectivement. Alors qu’il est inférieur par rapport au résultats trouvés
par El-Bendary et al., (2007) et Nouani et al., (2009), travaillant sur la purification des
enzymes coagulantes produites par Bacillus sphaericus et Mucor pusillus respectivement
(le facteur de purification trouvé est 13).
Conclusion 3
La précipitation de l’extrait enzymatique brut par le sulfate d’ammonium à 80% de
saturation a permis d’avoir un facteur de purification de 2,246 et un rendement d’activité de
42,8%, ce qui limite l’utilisation de la précipitation fractionnelle à une étape de concentration.
Un seul pic doué d’activité coagulante a été obtenu après la purification du l’extrait
brut concentré en appliquant séparément deux méthodes chromatographiques : sur gel
filtration et la chromatographie d’échange d’ions.
Une activité spécifique de 790,9 US/mg (une augmentation de 3,54 fois par rapport à
l’extrait précipité), un facteur de purification de 7,95 et un rendement en activité coagulante
de 9,97% ont été obtenus après purification du précipité par chromatographie échangeuse
d’ions sur DEAE-A50.
94
y = -1,053x + 5,197
R² = 0,989
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
5
5,1
0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75
Log P
M (
Da)
Rapport frontal (Rf)
3.5.4. SDS-PAGE
Les échantillons et les marqueurs de PM, repris dans le tampon d’échantillon, sont
séparés sur un gel de poly-acrylamide discontinu, constitué d’un gel de séparation à 10%
et d’un gel de concentration à 5%.
L’estimation du poids moléculaire de la protéase d’A. niger est réalisée par
extrapolation de son rapport frontal (0,4925) sur une courbe étalon préétablie avec des
marqueurs protéiques de poids moléculaire connue (figure 15).
A partir du profil électrophorétique obtenu (figure 16) et par référence au courbe
étalon des marqueurs de poids moléculaire, on constate que la protéase purifiée d’A. niger
est une protéine monomérique d'un poids moléculaire de 47,7 kDa. Ce résultat est très proche
de celui rapporté par Abdellaoui, (2007) pour la même protéase dont le poids moléculaire a
été trouvé 48 kDa et par Park et al., (2000), concernant l’enzyme coagulante extraite à partir
des grains de tournesol qui présente un poids moléculaire de 47,6 kDa.
Figure 15 : Courbe étalon des marqueurs de poids moléculaire : Glyceraldéhyde-3-phosphate
déshydrogénase (36 kDa) ; Ovalbumine (45 kDa) ; Glutamique déshydrogénase (55 kDa) ;
Sérum Albumine Bovine (66,2 kDa); Phosphorylase B (97,4 kDa); β-Galactosidase
(116,25 kDa) ; Myosine (200 kDa) établie en conditions dénaturantes (SDS-PAGE).
95
Poza et al., (2003) ; Gais, (2011) ; Vishwanatha et al., (2009) ; Siala et al., (2009)
et Kumar et al., (2008) rapportent que les protéases de Myxococcus xanthus 422, de Rhizopus
stolonifer, d’A. oryzae, d’A. niger I1 et de Synergistes sp. ont des poids moléculaires de 40,
43, 47, 50 et 60 kDa respectivement.
En plus, les travaux de Bosmann, (1973) sur les protéases produites par A. niger permettent
d’isoler une protéinase acide constituée de deux sous unités de 49 et 56 kDa après purification
par chromatographie d’exclusion moléculaire sur Shephadex G-100. Deux protéases acides
produites par A. oryzae sur son de blé possèdent des poids moléculaires de 63 et 32 KDa
ont été purifiées par Tsujita et Endo, (1976).
Figure 16 : Profil électrophorétique des extraits enzymatiques d’A. niger au cours des
étapes de purification sur SDS-PAGE.
Ligne 1: Extrait enzymatique brut.
Ligne 2: Extrait précipité au sulfate d’ammonium à 80 % de saturation.
Ligne 3: Extrait précipité concentré par dialyse.
Ligne 4: Fraction coagulante après gel de filtration.
Ligne 5: Fraction coagulante après DEAE-A50.
Ligne 6: Marqueurs de poids moléculaire Glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (36 kDa) ;
Ovalbumine (45 kDa) ; Glutamique déshydrogénase (55 kDa) ; Sérum Albumine Bovine (66,2 kDa);
Phosphorylase B (97,4 kDa); β-Galactosidase (116,25 kDa) ; Myosine (200 kDa).
96
En comparant les résultats de l’électrophorèse des fractions coagulantes obtenues
séparément par les deux méthodes chromatographiques, il ressort que l’utilisation de la
chromatographie d’échange d’ions comme première étape de purification après la
précipitation au sulfate d’ammonium à 80% ; assure une meilleure purification que celle
obtenue avec la chromatographie sur gel de filtration dans les mêmes conditions
expérimentales (on observe une succession de bandes dans la fraction active issue du
Sephadex G-100 et une seule bande homogène dans la fraction coagulante obtenue sur
DEAE- Sephadex A-50).
La faible efficacité de purification de la première méthode chromatographique
appliquée (la gel filtration) peut être due aux conditions expérimentales (débit d’élution, la
colonne, la qualité du gel). Mais d’une façon générale, la littérature limite l’utilisation de cette
méthode en dernier lieu après d’autres procédés de purification (Singh et al., 2007).
3.5.5. Activité protéolytique sur gel de poly-acrylamide (zymography)
L’activité protéolytique sur gel de poly-acrylamide à base de gélatine (0,1%) de
l’extrait enzymatique purifié est représentée dans la figure 17. L’activité enzymatique est
apparue comme une seule bande translucide sur un fond bleu, ce qui indique que la protéase
d’A. niger est active sous sa forme monomérique, où la possibilité de présence des formes
pro-enzymes (zymogènes) est éliminée. De plus, le poids moléculaire de l’enzyme coagulante
obtenu par la SDS-PAGE est confirmé par cette technique.
Notre résultat est en accordance avec ceux obtenus par Kumar et al., (2008); Siala
et al., (2009); Vishwanatha et al., (2009) et par Raposo & Domingos, (2009), lors de l’étude
des protéases acides purifiées obtenues à partir du Synergistes sp., A. niger I1, A. oryzae
MTCC 5431 et Centaurea calcitrapa respectivement.
97
3.6. Caractérisation physico-chimique de la protéase d’A. niger
3.6.1. pH optimum
L’influence du pH du lait sur l’activité coagulante de la protéase d’A. niger est
illustrée dans la figure 18. Les résultats obtenus montrent une activité coagulante maximale à
pH 5 pour les deux extraits brut et partiellement purifié. Cette activité diminue
progressivement avec l’augmentation du pH du lait jusqu’à l’inactivation totale à pH 7 dans
le cas d’enzyme partiellement purifié et à 7,5 pour l’extrait brut.
Plusieurs travaux indiquent que la diminution du temps de coagulation est plus rapide
au début d’acidification que plus tard, car elle favorise l’agrégation des micelles suite à la
diminution de leur stabilité, due à la neutralisation des charges négatives et à l’augmentation
de la concentration du calcium dissout (Chazarra et al., 2007). De la figure 18, on constate
que nos résultats sont en accord avec ces travaux, du fait que le temps de coagulation diminue
plus rapidement entre le pH 5 et 6 que dans l’intervalle de 6,5-7,5.
Figure 17 : Activité protéolytique de la protéase purifiée d’A. niger
par zymography.
98
Le même résultat a été trouvé par Negi et Banerjee, (2009) lors d’étude de la protéase
acide produite par A. awamori sur milieu solide après purification par deux méthodes
chromatographiques ; gel de filtration et l’échangeuse d’ions. La caractérisation des enzymes
coagulantes produites par Rhizopus oryzae (Kumar et al., 2005), Thermoascus auranticus
(Merheb et al., 2007), Rhizomucor miehei (Preetha et Boopathy, 1997), Thermomucor
indicae-seudaticae N31 (Merheb-Dini et al., 2010) et par A. niger MC4 (Channe et Shewale,
1998), indique des pH optimums d’activité coagulante compris entre 5,5 et 5,8.
Chaque enzyme possède un pH optimal auquel la vitesse de la réaction catalysée est
maximale. Des légères variations du pH autour de cette valeur entraînent une diminution de
l’activité enzymatique, en raison des modifications de l’ionisation des groupements compris
dans le site actif de l’enzyme. Des déviations plus importantes du pH, conduisent à dénaturer
l’enzyme en modifiant l’ionisation des acides aminés et en rompant les interactions non
covalentes maintenant sa structure tridimensionnelle (Hames et al., 2006).
Figure 18 : Effet du pH du lait sur l’activité coagulante de l’extrait
enzymatique brut et partiellement purifié d’A. niger (température du lait
35°C, concentration en CaCl2 0,01M).
0
20
40
60
80
100
120
4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
Acti
vit
é c
oa
gu
lan
te r
ela
tiv
e (%
)
pH du lait
Extrait Brut
Extrait partiellement purifié
99
0
20
40
60
80
100
120
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Acti
vit
é c
oa
gu
lan
te r
ela
tiv
e (%
)
Température ( C)
Extrait Brut
Extrait partiellement purifié
3.6.2. Température optimale d’activité
La figure 19 montre que le maximum d’activité est obtenu à 45°C, comme dans le cas
d’enzyme coagulante produite par A. versicolor (Abdel-Fattah et Saleh, 1988) et par A. niger
(Abdellaoui, 2007 ; Fazouane, 2010). Cette valeur optimale est très proche de celle indiquée
pour la présure animale (42-45°C à pH 6,5) (Kumar et al., 2006 ; Nouani et al., 2009). Une
activité coagulante plus faible a été obtenue avec les autres températures testées et qui
s’annule à 60°C. Du même la présure animale du veau devient inactive à des températures
supérieures à 56°C (Moschopoulou et al., 2006).
Les températures optimales d’activité des enzymes coagulantes varient selon les
espèces fongiques : 37°C pour la coagulase produite par Myxococcus xanthus 422 (Poza et al.,
2003), 40°C pour la protéase d’A. clavatus (Tremacoldi et al., 2004), 50°C pour celle
d’A. awamori (Negi et Banergee, 2009), 55°C dans le cas des enzymes coagulantes extraites
à partir d’A. niger MC4 (Channe et Shewale, 1998) et d’A. oryzae MTCC 5431 (Vishwanatha
et al., 2010). Certaines enzymes coagulantes sont plus actives à des températures plus élevées
(60°C) telles que celles produites par Rhizopus oryzae, Cryptococcus albidus et Penicillium
oxalicum (Kumar et al., 2004).
Figure 19 : Influence de la température du lait sur l’activité coagulante
de l’extrait enzymatique brut et partiellement purifié d’A. niger
(pH du lait 6,4 ; concentration en CaCl2 0,01M).
100
L’élévation de la température de la réaction, augmente l’énergie calorique des
molécules de substrat. Ceci accroît la proportion des molécules avec une énergie suffisante
pour surmonter la barrière d’activation qui fait augmenter la vitesse de la réaction.
D’un autre côté, à de plus haute température, une augmentation de la rupture des
multiples faibles interactions non covalentes qui habituellement stabilisent la structure
tridimensionnelle, est considérable. Ce qui conduit à la dénaturation d’enzyme. En plus,
même des petites modifications dans la conformation spatiale, peuvent altérer la structure du
site actif d’enzyme et conduire à une diminution de son activité catalytique (Hames et al.,
2006).
3.6.3. La concentration optimale en CaCl2
La figure 20 montre que l’activité coagulante de l’enzyme est optimale à une
concentration en CaCl2 de 0,04 M. Une diminution de l’activité à des concentrations plus
élevées à cette valeur peut être expliquée par l'augmentation de la force ionique dans le lait
oupar l’augmentation de la charge positive des micelles de caséine (Kumar et al., 2005;
El-Bendary et al., 2007; Merheb-Dini et al., 2010).
Un comportement similaire a été rapporté par Sardinas, (1968) et par Merheb-Dini
et al., (2010) qui montrent que les protéases coagulantes produites par Endothia parasitica
et Thermomucor indicae-seudaticae N31 respectivement, présentent la même réponse à la
concentration en calcium avec une activité maximale à 0,04 M de CaCl2. Vairo-Cavalli et al.,
(2005), étudiant l'effet de la concentration de CaCl2 dans le lait sur l'activité de la protéase
coagulante produite par les fleurs du Silybum marianum, ont également constaté un pic de
coagulation maximal à 0,03M de CaCl2 proche de 0,04M.
Il est très connu que le calcium joue un rôle important dans l’agrégation des caséines
au cours de la phase non-enzymatique de la coagulation du lait. Il se combine avec la
para-caséine par des ponts calciques et provoque la neutralisation des résidus négatifs des
micelles pour former un caillé (Merheb-Dini et al., 2010).
101
3.6.4. La concentration en extrait enzymatique
Les résultats obtenus dans la figure 21, indiquent la présence d’une relation entre
l’activité coagulante et la concentration en enzyme qui s’améliore de manière proportionnelle
avec l’augmentation de la concentration. On note également l’absence de palier correspondant
à la concentration saturante en enzyme. Chazarra et al., (2007) ; Nouani et al., (2009) ont
observé le même comportement avec les protéases extraites à partir des fleurs de Cynara
scolymus et du latex de Ficus carica respectivement.
Figure 20 : Influence de la concentration en CaCl2 sur l’activité coagulante
de l’extrait enzymatique brut et partiellement purifié d’A. niger
(température 35°C, pH du lait 6,4).
0
20
40
60
80
100
120
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Acti
vit
é c
oa
gu
lan
te r
ela
tiv
e (%
)
CaCl2 (mole/l)
Extrait Brut
Extrait partiellement purifié
102
0
20
40
60
80
100
120
0 0,058 0,116 0,174 0,232 0,29 0,348 0,406 0,464
Acti
vit
é c
oa
gu
lan
te r
ela
tiv
e (%
)
Extrait brut (mg/ml)
(a)
0
20
40
60
80
100
120
0 0,013 0,026 0,039 0,052 0,065 0,078
Acti
vit
é c
oa
gu
lan
te rela
tiv
e (%
)
Extrait partiellement purifié (mg/ml)
(b)
3.6.5. Etude de la stabilité de la protéase d’A. niger
3.6.5.1. Stabilité thermique
Les résultants de la figure 22, montrent que l’activité coagulante de la protéase acide
d’A. niger est thermiquement stable jusqu’à une température de 45°C. Au-delà de cette
température, une diminution de l’activité est notée jusqu’à l’inhibition totale à 60°C pour
l’extrait purifié et à 65°C pour l’extrait brut, due probablement à la dénaturation de la
structure moléculaire de la protéine.
Figure 21 : Influence de la concentration en extrait enzymatique brut (a)
et partiellement purifié (b) d’A. niger sur l’activité coagulante (température
35°C, pH du lait 6,4 ; concentration en CaCl2 0,01M).
103
La même gamme du stabilité (30-45°C) est indiquée par Kumar et al., (2005);
Abdellaoui, (2007) et par Merheb-Dini et al., (2010) concernant les enzymes coagulantes
d’A. oryzae, d’A. niger et de Thermomucor indicae-seudaticae N31. La protéase d’A. niger
F2078 et celle du Thermoascus auranticus présentent une stabilité thermique dans l’intervalle
compris entre 30 et 60°C (Sigh et al., 1994; Merheb et al., 2007).
La majorité de l'activité coagulante de l’enzyme ajoutée au lait pendant la fabrication
du fromage est perdue dans le lactosérum et seulement 0-15% de l’activité reste dans le caillé.
De plus, cette quantité retenue dans le caillé exerce également une action protéolytique
responsable de la dégradation des caséines pendant la maturation du fromage (la protéolyse
primaire), en particulier durant les premières 24h après l’addition d’enzyme.
Ainsi, les facteurs affectant la rétention de l’activité d’agent coagulant dans le caillé
sont importants et donc, l'utilisation des enzymes coagulantes qui sont plus thermiquement
stables que la présure est contre-indiquée, afin d’éviter un excès d'activité protéolytique dans
le caillé, ce qui engendre la modification de la qualité organoleptique du fromage (Preetha
et Boopathy, 1997 ; Merheb-Dini et al., 2010). Vue le comportement thermique de l’extrait
enzymatique d’A. niger, un essai de fabrication du fromage pourrait être intéressant.
Figure 22: Stabilité thermique des extraits enzymatiques brut
et partiellement purifié d’A. niger après 60min d’incubation à pH 5,2.
0
20
40
60
80
100
120
30 35 40 45 50 55 60 65
Acti
vit
é c
oa
gu
lan
te r
ési
du
ell
e (
%)
Température ( C)
Extrait brut
Extrait partiellement purifié
104
3.6.5.2. Stabilité vis-à-vis du pH
D’après la figure 23, la protéase acide d’A. niger garde son activité coagulante
maximale dans l’intervalle du pH compris entre 3 et 5, après incubation des extraits
enzymatiques pendant 24h à 4°C dans du tampon citrate de sodium (0,1M). L’augmentation
du pH provoque la diminution de l’activité qui disparait à pH 8.
La même réponse vis-à-vis la variation du pH, est obtenue par Singh et al., (1994);
Fernandez-Lahore et al.,(1999) ; Abdellaoui, (2007) et par Merheb-Dini et al.,(2010) lors
d’étude des enzymes coagulantes élaborées par A. niger F2078, Mucor sp., A. niger
et Thermomucor indicae-seudaticae N31 respectivement, présentant une bonne stabilité dans
l’intervalle du pH 3-6.
Figure 23: Stabilité vis-à-vis du pH des extraits enzymatiques brut
et partiellement purifié d’A. niger après 24h d’incubation à 4°C.
0
20
40
60
80
100
120
3 4 5 6 7 8 9
Acti
vit
é c
oa
gu
lan
te r
ési
du
ell
e (
%)
pH
Extrait brut
Extrait partiellement purifié
105
Conclusion 4
Pour que la coagulation du lait par une telle enzyme coagulante soit reproductible, il
est nécessaire de considérer simultanément la température, le pH, la teneur en CaCl2 et la
force de l'enzyme et ce, en relation avec d'autres facteurs tels que la nature du substrat, la
concentration du NaCl,... Puisque ces facteurs sont difficilement dissociables, leur étude
séparée ne peut avoir qu'une importance relative.
Les conditions optimales de l’activité coagulante de l’extrait enzymatique brut
et partiellement purifié ont été déterminées sur le lait écrémé à 10%; elles correspondent
aux paramètres suivants : température de 45°C, pH 5 (protéase acide) et une concentration en
CaCl2 de 0,04M. Ces extraits enzymatiques présentent une stabilité dans la gamme du pH
compris entre 3,0 et 5,0 à 4°C pendant 24 heures dans le tampon citrate de sodium (0,1M)
et une stabilité thermique jusqu’à 45°C pendant 1heure.
106
Références
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107
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123
Annexes
124
Annexe A
1. La composition du lait
La composition chimique du lait et ses caractéristiques technologiques varient sous
l’effet d’un grand nombre de facteurs, les plus importants étant l’individualité, la race
et l’espèce d’animal, son état sanitaire, la période de lactation, l’alimentation, la saison
et l’âge. Cette variation influe la qualité des produits fromagers suite au déséquilibre du
rapport caséine/matière grasse. Lorsque se rapport est en d’hors des valeurs standards, le
fromage obtenu est soit très dur soit très souple (Vignola, 2002; Vilain, 2010). Le tableau A.I
décrit la composition moyenne du lait de vache.
Tableau A.I : Composition moyenne du lait de vache (Vignola, 2002).
Constituants majeurs Variations limites (%) Valeur moyenne (%)
Eau 85,5-89,5 87,5
Matière grasse
2,4-2,5 3,7
Matière protéique
Caséines
Protéines solubles
Azote non protéique
2,9-5,0 3,2
Glucides 3,6-5,5 4,6
Minéraux 0,7-0,9 0,8
Constituants mineurs : enzymes, vitamines, pigments, cellules diverses, gaz
1.1. L’eau
Il représente le constituant majeur du lait (85,4 à 87,7%) et qui se trouve sous deux
forme :
l’eau libre (90%) dont la quasi-totalité contient le lactose, les sels minéraux,
l’azote soluble, etc. Le reste est lié aux éléments hydrosolubles (protéines
solubles).
l’eau liée (10%) où l’une des fractions est liée aux caséines tandis que l’autre
conserve des propriétés solvantes (Mahaut et al., 2000; Chandan, 2006).
1.2. Les glucides
Ils sont représentés à 97% par le lactose, un disaccharide composé d’α ou β-glucose
et de β-galactose, se trouve à l’état libre dans le lait et présente en quantités importantes de
40 à 50 g/l (4,8-5,2%). Sa faible contribution à l’apport énergétique du lait (30%), ne fait pas
de ce dernier un aliment équilibré en terme de répartition calorique (Chandan, 2006 ; Vilain,
2010).
125
En effet, en plus de son rôle nutritionnel, le lactose joue un rôle technologique dans les
produits laitiers en tant que substrat de fermentation pour les bactéries lactiques qui
l’hydrolysent (via l’enzyme lactase), puis transforment les hexoses résultants en acide
lactique. Le lait contient également une cinquantaine d’oligosaccharides bien répertoriés
présents à l’état libre, mais en quantités souvent négligeables (0,1g/l) (Fox et al., 2000;
Chandan, 2006 ; Belitz et al., 2009).
1.3. La matière grasse
De tous les composants du lait de vache, les lipides constituent la partie la plus
variable du point de vue qualitative et quantitative (10 à 500g/l suivant les espèces)
(Fox et al., 2000; Vilain, 2010).
La matière grasse du lait se compose de triglycérides (constituants les plus dominants:
95-98%), de di-glycérides et mono-glycérides, d’acides gras, de stérols (principalement le
cholestérol), de pigments (les caroténoïdes donnent la couleur jaune à la matière grasse), de
tocophérols (vitamine E : rôle d’antioxydant), de vitamines liposolubles (A, D et K) et autres
constituants mineurs.
Hormis quelques rares phospholipides, stérols et acides gras présents dans le
lactosérum, cette fraction lipidique existe sous la forme d’une émulsion composée de petites
gouttelettes microscopiques dispersées dans le lactosérum (3,4 à 5,1%). Leur diamètre est
compris entre 0,1 à 22 µm avec une taille moyenne entre 3,4 et 4,5 µm.
Les globules gras sont entourés par une très fine membrane de 5 à 10 nm d’épaisseur
ressemblant la membrane plasmique cellulaire (2% du poids de la gouttelette). Ayant une
composition complexe [phospholipides, lipoprotéines, cérébrosides, protéines, acides
nucléiques, enzymes, oligo-éléments (métaux) et l’eau]. Cette membrane confère au globule
gras sa stabilité. Il convient de signaler que la composition et l’épaisseur de la membrane ne
sont pas constantes, car les composants sont échangés constamment avec le lactosérum
environnant (Fox et al., 2000; Chandan et al., 2006; Belitz et al., 2009).
1.4. La matière azotée
Les protéines représentent 95% de la matière azotée du lait, composées soit d’acides
aminés seulement (β-lactoglobuline, α-lactalbumine), soit d’acides aminés et d’acide
phosphorique (caséines α et β) avec parfois en plus une partie glucidique (caséine-κ).
C’est sur la base de la précipitation à pH 4,6 (20°C) qu’on sépare deux constituants
protéiques : les caséines (αs, β, κ, et γ) et les protéines du lactosérum (tableau A.II). En outre,
il existe dans le lait une fraction dite protéose-peptone issue de la protéolyse de la caséine-β
par la plasmine : protéase alcaline du lait (voire figure A.1). Cette fraction présente des
caractéristiques intermédiaires (mais qui fait partie des protéines sériques) : elle est riche en
126
glucides (11% de sa composition) et ne précipite pas comme les autres protéines solubles
lors du chauffage à 100°C suivi d’une acidification à pH 4,6.
Le lait contient également une fraction azotée non protéique d’environ 5%, mais en
valeur absolue elle est plus faible (0,15g N/l) (Fox et al., 2000-2004; Chandan, 2006).
Tableau A.II : Composition moyenne et distribution des protéines du lait de vache (Roe,
2001; Chandan, 2006).
Moyennes absolues (g/l) Moyenne relative (%)
Matières azotées totales 34 100
1. Protéines 32 94
Caséines entières :
Caséine-αs1
Caséine-αs2
Caséine-β
Caséine-κ
Caséine-γ
24-28
12-15
3-4
9-11
3-4
1-2
82
46
35
13
6
Protéines solubles :
β-lactoglobuline
α-lactalbumine
Sérum-albumine
Immunoglobulines
Protéoses- peptones
5-7
2-4
1-1,7
0,2-0,3
0,5-1,8
0,6-1,7
18
45
25
5
12
13
2. Fraction azotée non protéique 0,15-2 5-6
3. Autres : enzymes (libres ou liées), protéines et lipoprotéines de la membrane de globule gras
Figure A.1: Produits d’action de la plasmine sur la caséine-β-CN
(Fox et al., 2000).
127
Tableau A.III : Caractéristiques des micelles de caséine (Fox et al., 2000-2004; Chandan,
2006).
Caractéristique
Valeur
Diamètre
Surface
Volume
Densité (forme hydratée)
Masse
Teneur en eau
Hydratation
Poids moléculaire (forme hydratée)
Poids moléculaire (forme déshydratée)
Nombre des chaînes peptidiques
Nombre de particules/ml du lait
Surface des micelles/ml du lait
180 nm (entre 50-500 nm)
8 x 10-10
cm2
2,1 x 10-15
cm3
1,0632 g/ cm3
2,2 x 10-15
g
63%
3,7g H2O/g de protéine
1,3 x 109 Da
1,3 x 108 Da
104
1014
– 1016
5 x 104 cm
2
1.4.1. Protéines sériques
Elles représentent 20% des protéines totales du lait. À la différence des caséines, ces
protéines solubles possèdent une forme d’une chaîne enroulée, très serrée en pelote,
naturellement non dénaturées et exclusivement de nature organique.
Ce sont majoritairement des protéines globulaires présentant une grande sensibilité
aux traitements thermiques (à l’exception des protéoses-peptones) et qui sont entrainées dans
le lactosérum lors de la coagulation des caséines sous l’action de la présure.
Elles sont globalement riches en acides aminés soufrés et possèdent des résidus
tryptophane qui assurent une excellente valeur nutritionnelle en particulier l’α-lactalbumine
(tableau A.IV) (Vignola, 2002 ; Fox et al., 2000-2004 ; Vilain, 2010).
Tableau A.IV : Composition et certaines caractéristiques des protéines solubles du lait
(Chandan et al., 2006 ; Belitz et al., 2009).
Protéines sériques
Proportion du total
en protéines du
lactosérum (%)
Résidus
d’acides
aminés
Poids
moléculaire
(KDa)
pH
isoélectrique
β-lactoglobuline 7-12 162 18,277 5,2
α- lactalbumine 2-5 123 14,175 5,1
Sérumalbumine 0,7-1,3 582 69,000 4,8
Immunoglobulines 1,9-3,3 - 150-103 4,6-6,0
Protéoses-peptones 2-6 - 4,0-40,0 3,7
128
Tableau A.V: Les applications industrielles de la fermentation sur milieu solide (Pandey
et al., 2000; Manpreet et al., 2005; Wang et Yang, 2007; Singh et Pandey, 2009).
Domaine d’application Microorganismes
utilisés
Substrats
Industrie pharmaceutique
Insecticides
Antibiotiques:
Pénicilline
Céphalosporine
Céphamycine C
Tétracycline
Oxytétracycline
Surfactine
Cyclosporine A
Hormones de croissance
acide gibbérellique
Mycotoxine
Aflatoxines
Ochratoxines
Anti-fongiques
Bacillus thuringensis
Penicillium chrysogenum
Cephalosporium armonium
Streptomyces clamuligerus
S. viridifaciers
S. rimosus
Bacillus subtilis
Tolypocladium inflautum
Fusarium moniliforme
Gibberella fujikuroi
A. oryzae, A. panasitus
A. ochraceus, Penicillium
viridicatum, A. carbonarius
Bacillus subtilis
Collectotrichum truncatum
Les déchets de noix de coco.
Canne à sucre de la bagasse.
Orge.
Blé avec graines de coton.
Résidus de pomme de terre sucrée.
Epi de maïs.
Résidus de soja.
Son de blé.
Canne à sucre de la bagasse, son
de blé.
Son de blé, maïs, riz, arachides.
Farine de maïs.
Production des enzymes :
Glucoamylase
Lipase
Cellulases
Pectinases
Xylanases
Protéases acides
Phytases
Amylases
Aspergillus sp.
A. niger, Candida rugosa,
Penicillium restrictum
Bacillus subtilis, Aspergillus
sp.,
A. niger, Talaromyces flavus,
A. tamari, A. niger, Bacillus
sp., Trichoderma
longibrachiatum, Trichoderma
reesei,
A. niger, Mucor miehei,
Rhizopus oligosporus,
A. niger, A. ficuum, Mucor
racemosus, Rhizopus
oligosporus
Lentinula edodus, Bacillus
licheniformis
Les déchets de thé, riz, son de blé.
Tourteau de sésame, le gâteau de
noix de coco.
Déchets des fruits, tourteau de
soja.
Déchets d'agrumes, le son de soja
et de blé, la pectine de pomme.
Épi de maïs, son de blé, canne à
sucre, farine de soja.
Son de blé.
Le son de blé, farine de soja, maïs
concassé.
Son de blé.
129
Bio-pesticides :
Bio-insecticide
Bio-remediation
Coniothyrium minitans,
Beauveria bassiana
Phanerochaete chrysosporium,
Lentinula edodes
Imprégné de chanvre, granules
d'argile + milieu liquide.
Canne à sucre colonial de la
bagasse.
Industrie alimentaire:
Aliments Fermentés
Délignification
Amélioration de la nutrition
L’enrichissement en protéines
Composés aromatiques
A. orzyae, A. sojae
Champignons de la
pourriture blanche
Penicilium sp.
Neurospora sitophila
Bjerkandera adusta , Bacillus
subtilis, Rhizopus oryzae,
Ceratocystis fimbriata,
Écorce des fruits divers.
La paille de blé.
Fruits de bergamote épluchés.
Pulpe de betterave à sucre ou des
déchets d'agrumes.
Son de blé, soja haché.
Composés organiques
Acide citrique
Acide kojique
Acide lactique
Acide oxalique
Acide fumarique
Acide gluconique
Ethanol
Acide gallique
A. niger
A. oryzae
R. oryzae , Lactobacillus casei
L. helveticus, L. paracasei
Streptococcus thermophilus
A. niger
Rhizopus arrhizus
Rhizopus sp.
Aspergillus niger
Saccharomyces cerevisiae
Schwanniomyces castellii,
Zymomonas mobilis, Candida
utilis, Torula utilis
Aspergillus foetidus
Rhizopus oryzae
Poudre des écales de café, pomme
de terre sucrée, caroubiers
écorcés, déchets d'ananas, épis de
maïs.
Le manioc, carotte-traitement des
déchets, canne à sucre de presse de
boue, sorgho à sucre.
Pomme de terre sucrée.
Écorces d'orange
amidon de manioc brut.
Extrait de figues, le glucose,
fruits des figues.
Pomme de terre sucrée ou le
sorgho sucré.
Mixture des produits agricoles
riches en tannins.
Autres composés:
Vitamine B12 et B6, riboflavine,
thiamine, acide nicotinique,
nicotinamide.
Bio-surfactants
Pigments rouges
Caroténoïdes
Citrobacter freundii, Klebsiella
pneumoniae, Rhizopus
oligosporus, R. arrhizus,
R. stolonifer
Bacillus subtilis
Monascus purfureus
Penicillium sp.
Tempeh de soja.
Résidus agro-industriels
et mélasses.
Canne à sucre de la bagasse, orge.
Farine de maïs.
130
2. Préparation du substrat
Le son de blé est utilisé comme substrat de base en cas de fermentation sur milieu
solide, vue sa richesse en fibres alimentaires insolubles (75% du contenu du germe du grain
de blé et plus de 90% dans le cas du son), en protéines et en sels minéraux (Marlett
et al., 2002). En plus, il a été prouvé que certaines protéases fongiques ont une très grande
spécificité d’action vis-à-vis les protéines des céréales et plus particulièrement celles du blé
(gliadines et gluténines), ce qui le rend un excellent substrat pour la production des protéases
par SSF (Kaur et al., 2001; Kumar et al., 2005; Sumantha et al., 2005; Chutmanop et al.,
2008; Vishwanatha et al., 2009-2010).
Le son de blé caractérisé (tableau A.VI) a été broyé afin de réduire la taille des
particules (0,425- 0,850 mm), puis conservé dans des sachets en plastique ou dans des boites
stériles avant l'utilisation.
Tableau A.VI: Composition chimique du son de blé dur utilisé (zone de récolte: Alger)
(Gais, 2011).
Paramètres mesurés Valeurs
expérimentales (%)
Valeurs de la littérature (%)
(Boudouma, 2009)
Matière sèche
93,6 88
Taux d’humidité
6,4 12
Cendre
4,75 5,5
Matière azotée totale
16,6 14,5
Glucides
62,5 59,8
Lipides
6 4,48
Fibres
26,86 41,7
131
Annexe B : Matériels
1. Microscope photonique (UKA-Technic Nahita)
2. Etuve (Incubator Model 636/13 Nahita)
3. Autoclave (ADOLV WOLF SANoclav)
4. Incubateur-agitateur (INFORS-AG CH-41300 Bottmingen, Navatro)
5. Centrifugeuses réfrigérées (Sigma 1-15K)
(HERMLE, Z300K)
6. Bain Marie (Memmert)
7. Spectrophotomètre UV/VIS 9200 (Zuzi Model 4201/50)
8. Four à moufle
9. Agitateurs magnétiques (Stirrer 6806, Nahita)
(ARE, Velp Scientifica)
10. Balance (SALTEC)
11. Balance de précision (analytique) (Explorer-Pro OHaus)
12. Cuve d’électrophorèse (Consort N.V., Maxwell)
13. Chromatographie sur gel de filtration :
Pompe à vide (NEUBERGER-Knf)
Pompe péristaltique (Desaga Heidelberg-STA)
Collecteur de fraction (2112 Redirec Fraction Collector, LKB-BROMMA)
Spectrophotomètre (SP.6-550 UV-VIS, UNICAM)
14. Chromatographie d’échange d’ions
Pompe péristaltique (ecoline, ISMATEC)
Collecteur de fraction (Retriever 500, TELEDYNE ISCO)
Mélangeur (Pharmacia Fine Chemicals)
Spectrophotomètre (eppendorf: bio-spectrophotometer)
132
Annexe C : Composition des milieux de culture et des solutions
1. Milieu PDA (Potato Dextrose Agar)
Pomme de terre ……………... 200 g
Agar ………………....………. 15 g
Glucose ………………....….... 20 g
Eau distillée ……………......... 1000 ml
pH final………………………..5,6 ± 0,2
2. Milieu Czapek-Dox Agar (modifié) (g/l) (Agrawal et al., 2005)
Saccharose................................ 10
NaNO3……………………….. 1
K2HPO4……………….…........1
MgSO4.7H2O………………….0,5
KCl…………………………….0,5
FeSO4.7H2O…………………...0,01
Caséine……………………….. 1
Agar…………………………... 20
pH……………………………..7,3
3. Solution du Czapek-Dox (g/l) (Tunga et al., 1998; Tunga et al., 2003; Negi
et Banerjee, 2009-2010)
NaNO3……………………….. 2,5
KH2PO4…………………......... 1
MgSO4.7H2O………………….0,5
KCl…………………………….0,5
4. Solution minérale (SM) (%, p/v) (Sumantha et al., 2005; Sumantha et al., 2006;
Paranthman et al., 2009)
NH4NO3……………………….0,5
KH2PO4 ………………….........0,2
MgSO4.7H2O ……………........0,1
NaCl…………………………...0,1
133
5. Solution M-9 (g/l) (Tunga et al., 1998)
NaH2PO4……………...............12,8
KH2PO4…………………........3
NaCl…………………...............0,5
NH4Cl……………………........1
MgSO4.7H2O………………….0,5
CaCl2.2H2O……………………0,01
6. Tampon Citrate de Sodium (0,1M; pH 5,2)
Solution A: acide citrique 21,01 g/l (0,1M), (C6H8O7.H2O)
Solution B: le dissodique 35,6 g/l (0,2M), (Na2HPO4.2H2O)
Pour avoir une solution tampon à pH 5,2 mélanger: 46,9 ml de la solution A
et (100 - 46,9) ml de la solution B.
134
Annexe D : Mesure de l’activité protéolytique
(Anson, 1938 modifiée par Mechakra et al., 1999)
1. Courbe d’étalonnage de la tyrosine
1.1. Mode opératoire
2. Dosage de l’activité protéolytique
La manipulation est réalisée en deux étapes :
Réaction enzymatique : il s’agit de faire agir l’extrait enzymatique sur le substrat (la
caséine).
Dosage de l’activité : la quantité de produit formé (la tyrosine) est dosée selon la
méthode d’Anson, (1938). L’absorbance de l’échantillon mesurée est transformée en
concentration par référence à la courbe d’étalonnage précédemment obtenue.
2.1. Réactifs
Extrait enzymatique déjà préparé
Caséine à 2,5% dans le tampon citrate de sodium ;
Réactif de Folin-Ciocalteu dilué au 1/10ème
;
Solution de TCA à 4% ;
Eau distillée.
N° du tube
Réactif
et solutions
Blanc 1 2 3 4 5
Concentration de tyrosine (µg/ml) 0 20 40 60 80 100
Volume de tyrosine prélevé (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Eau distillée (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Na2CO3 à 2% dans du NaOH 0,1N
(ml)
2,5
Agiter correctement puis laisser stabiliser le mélange pendant 10 min
Réactif de Folin dilué (1/10ème
) 0,5
Mélanger de nouveau rapidement et énergiquement après chaque addition du réactif de Folin et laisser reposer à l’ombre pendant 30 min au minimum
DO (750 nm) 0 0,140 0,335 0,465 0,603 0,713
135
2.2. Mode opératoire
Préparation du mélange réactionnel
Dosage de l’activité enzymatique
N° du tube
Réactif
et solutions
Blanc 1 Blanc 2 1 2
Extrait enzymatique (ml) - - 0,5 0,5
Solution de caséine (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5
Vol de tampon (ml) 1 1 0,5 0,5
Bien mélanger et placer au bain Marie à 40°C pendant 30 min
TCA à 4% (ml) : arrêt de
la réaction
5
Filtrer les solutions sur papier filtre courant
Le filtrat constitue la solution contenant le produit de la réaction (la tyrosine)
Produit de la réaction Blanc F1 Blanc F2 Filtrat 1 Filtrat 2
N° du tube
Réactif
et solutions
Blanc F1 Blanc F2 Filtrat 1 Filtrat 2
Vol prélevé (ml) 1 1 1 1
Eau distillée ou tampon
(ml)
1 1 1 1
Na2CO3 à 2% dans du
NaOH 0,1N (ml)
2,5
Agiter correctement puis laisser stabiliser le mélange pendant 10 min
Réactif de Folin dilué
1/10ème
(ml)
0,5
Mélanger de nouveau rapidement et énergiquement après chaque addition du réactif de
Folin et laisser reposer à l’ombre pendant 30min au minimum pour effectuer la
lecture
136
y = 0,0073x + 0,0129
R² = 0,993
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
an
ce
(750n
m)
Tyrosine (μg/ml)
3. Résultats
Une unité de protéolyse correspond à la libération de 1µg de tyrosine résultante de
l’hydrolyse enzymatique par heure et dans un ml d’échantillon (1µg/h/ml). La concentration
déduite de la courbe d’étalonnage correspond à 0,5 ml d’échantillon dilué par les réactifs
ajoutés au cours de la première étape.
Activité protéolytique (µg/h/ml) = concentration déduite de la courbe d’étalonnage x
dilution x 2 (pour ramener le volume de l’échantillon à 1ml) x 2 (pour ramener le temps à 1h).
Figure D.1: Courbe d’étalonnage de la tyrosine.
137
Annexe E : Dosage des protéines (Bradford, 1976)
1. Composition du réactif de Bradford
BBC G-250……………………..………….…………………………..100 mg.
Ethanol absolu ………………………………………………………….50 ml.
Acide phosphorique à 85%..........………………………………………100 ml.
Compléter à 1000 ml avec l’eau distillée.
Conservation pendant 3 semaines à 4 °C et à l’abri de la lumière.
2. Elaboration de la courbe d’étalonnage
Une gamme étalon est préparée à partir d’une solution mère de sérum albumine
bovine (BSA) (1mg/1ml) selon les quantités suivantes : 0, 20, 40, 60, 80 et 100 µg. Toutes
les dilutions des solutions protéiques sont effectuées en présence de l’eau distillée.
Les échantillons et le blanc sont ajustés à un volume final de 100µl. Après addition de
3ml du réactif de Bradford et agitation, l’absorbance est mesurée à 595 nm contre le blanc.
Les concentrations protéiques des extraits enzymatiques seront déduites à partir de cette
courbe d’étalonnage.
Tableau E.I : Préparation de la gamme d’étalonnage de la BSA (1mg/ml).
N° du tube
Solutions
et réactifs
Blanc 1 2 3 4 5 échantillon
Solution de BSA (µl) 0 20 40
60 80 100 Fraction
aliquote
Eau distillée (µl) 100 80 60
40 20 0 ?
Réactif de Bradford (ml) 3
Absorbance à 595 nm 0 0,201 0,444 0,625 0,825 1,020 ?
138
y = 0,010x + 0,008
R² = 0,998
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
an
ce (
595n
m)
BSA (µg/µl)
Figure E.1: Courbe d’étalonnage de la solution de BSA
(1mg/ml).
139
Annexe F : Electrophorèse des protéines en conditions dénaturantes
(SDS-PAGE) (Lammeli, 1970)
1) Solution d’acrylamide 30 %
Acrylamide .................................................................................... 30g.
Bis-acrylamide .............................................................................. 0,8g.
Compléter à 100ml avec l’eau distillée.
2) Tampon de séparation (pH 8,8)
Tris-HCl ........................................................................................ 0,15M.
SDS ................................................................................................ 0,4g.
Compléter à 100ml avec l’eau distillée.
3) Tampon de concentration (pH 6,8)
Tris-HCl ........................................................................................ 0,05M.
SDS ................................................................................................ 0,4g.
Compléter à 100ml avec l’eau distillée.
4) Persulfate d’Ammonium (APS à 10%)
Persulfate d’Ammonium ............................................................... 1g.
Eau distillée ................................................................................... 10ml.
5) Préparation des gels
5.1. Gel de séparation (Running gel) à 10%
Acrylamide 30% ........................................................................... 3,50 ml.
Tampon de séparation (pH 8,8) .................................................... 2,50 ml.
Eau distillée ................................................................................... 4,00 ml.
Persulfate d’Ammonium (APS) 10 % ........................................... 50µl.
TEMED ......................................................................................... 5µl.
5.2. Gel de concentration (Stacking gel) à 5%
Acrylamide 30% ........................................................................... 0,65 ml.
Tampon de concentration (pH 6,8)............................................... 1,25 ml.
Eau distillée ................................................................................... 3,10 ml.
Persulfate d’Ammonium (APS) 10 % ........................................... 30µl.
TEMED ......................................................................................... 3µl.
6) Tampon d’échantillon (2X)
Tris-HCl pH 6,8 ............................................................................. 0,5 M.
SDS ................................................................................................ 4%
Glycérol ......................................................................................... 20%.
Bleu de bromophénol .................................................................... 0,004%.
β- mercaptoéthanol ........................................................................ 10%.
140
7) Tampon de migration (10X)
Tris (base) ...................................................................................... 30g.
Glycine .......................................................................................... 144g.
SDS ................................................................................................ 10g.
8) La solution de coloration
Méthanol ........................................................................................ 40ml.
Acide acétique 10% .................................................................... 10ml.
BBC R-250 ................................................................................... 0,15g.
Eau distillée ................................................................................... 50ml.
9) La solution de décoloration
Méthanol ........................................................................................ 400ml.
Acide acétique 10% .................................................................... 100ml.
Eau distillée ................................................................................... 500ml.
