Vrani, Ema
2021
Degree Grantor / Ustanova koja je dodijelila akademski / struni stupanj: University of Zagreb, Faculty of Food Technology and Biotechnology / Sveuilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet
Permanent link / Trajna poveznica: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:893320
Rights / Prava: Attribution-NoDerivatives 4.0 International
Download date / Datum preuzimanja: 2021-11-08
Repository / Repozitorij:
1285/USH
OPTIMIRANJE
MIKROVALOVIMA
Cystoseira barbata
Diplomski rad je izraen u Laboratoriju za procese sušenja i praenje stabilnosti biološki
aktivnih spojeva na Zavodu za prehrambeno-tehnološko inenjerstvo, Prehrambeno-
biotehnološkog fakulteta Sveuilišta u Zagrebu pod mentorstvom prof.dr.sc. Verice Dragovi-
Uzelac te uz pomo doktorandice Ane Dobrini, mag. ing.
Ovo istraivanje provedeno je u okviru projekta Bioprospecting Jadranskog mora
(KK.01.1.1.01.0002) financiranog od strane Europskog fonda za regionalni razvoj.
ZAHVALA
povjerenju, suradnji i uloenom vremenu. Posebno se zahvaljujem mag.ing. Ani Dobrini na
prenesenom znanju, velikoj podršci i pomoi koju mi je pruila te strpljenju i dostupnosti
tijekom izrade ovog rada.
Zahvaljujem se svojoj obitelji na vjeri u mene te velikom strpljenju i potpori koju su mi pruili.
Hvala Franku te svim prijateljima i kolegama koji su mi bili oslonac tijekom studiranja i pruali
mi podršku.
Laboratorij za procese sušenja i praenje stabilnosti biološki aktivnih spojeva
Znanstveno podruje: Biotehnike znanosti
Znanstveno polje: Prehrambena tehnologija
Ema Vrani, 1285/USH
Saetak: Morske alge bogat su izvor biološki aktivnih spojeva i to posebno sulfatiranih polisaharida,
koji pokazuju antiviralna, antitumorska i antioksidativna svojstva. Cilj rada bio je optimirati
mikrovalovima potpomognutu ekstrakciju polisaharida iz smee alge Cystoseira barbata.
Mikrovalovima potpomognuta ekstrakcija provedena je pri temperaturama 40, 60 i 80 °C te vremenu
ekstrakcije 10, 15 i 20 min, dok je konvencionalna ekstrakcija provedena pri 80 °C kroz 3 h. U obje
metode, kao ekstrakcijsko otapalo su korištene destilirana voda i 0,1 M HCl. Utvren je utjecaj otapala,
temperature i vremena ekstrakcije na prinos polisaharida, koncentraciju ukupnih ugljikohidrata, udio
sulfatnih grupa i udio fukoze. Konvencionalnom ekstrakcijom postignut je vei prinos polisaharida (8,09
%) u odnosu na mikrovalovima potpomognutu ekstrakciju (3,88 %). Najvei prinos polisaharida i
najvea koncentracija ukupnih ugljikohidrata dobiveni su uz 0,1 M HCl, pri 10 min i 80 °C, najvei udio
sulfatnih grupa dobiven je uz 0,1 M HCl, pri 40 °C i 10 min, a najvei udio fukoze dobiven je uz 0,1 M
HCl, pri 80 °C i 20 min.
Kljune rijei: smee alge, Cystoseira barbata, mikrovalovi, ekstrakcija, sulfatirani polisaharidi
Rad sadri: 57 stranica, 5 slika, 5 tablica, 105 literaturnih navoda
Jezik izvornika: hrvatski
Rad je u tiskanom i elektronikom (pdf format) obliku pohranjen u: Knjinica Prehrambeno-
biotehnološkog fakulteta, Kaieva 23, Zagreb
Mentor: prof.dr.sc. Verica Dragovi-Uzelac
1. Doc.dr.sc. Ivona Elez Garofuli
2. Prof.dr.sc. Verica Dragovi-Uzelac
3. Izv.prof.dr.sc. Sandra Balbino
BASIC DOCUMENTATION CARD
Department of Food Engineering
Scientific area: Biotechnical Sciences
Scientific field: Food Technology
FROM BROWN ALGAE Cystoseira barbata
Ema Vrani, 1285/USH
Abstract: Marine algae are rich source of biologically active compounds, especially sulfated
polysaccharides, which show antiviral, antitumor and antioxidant properties. The aim of this study was
to optimize microwave-assisted extraction of polysaccharides from the brown alga Cystoseira barbata.
Microwave-assisted extraction was performed at temperatures of 40, 60 and 80 °C and extraction times
of 10, 15 and 20 min, while conventional extraction was performed at 80 °C for 3 h. In both methods,
distilled water and 0.1 M HCl were used as the extraction solvent. The influence of solvent, temperature
and extraction time on polysaccharide yield, total carbohydrates, sulfate group content and fucose
content was determined. Conventional extraction achieved a higher yield of polysaccharides (8.09 %)
compared to microwave-assisted extraction (3.88 %). Highest yield of polysaccharides and the highest
concentration of total carbohydrates were obtained with 0.1 M HCl, at 10 min and 80 °C, the highest
content of sulfate groups was obtained with 0.1 M HCl, at 40 °C and 10 min, and the highest content of
fucose was obtained with 0.1 M HCl, at 80 °C and 20 min.
Keywords: brown algae, Cystoseira barbata, microwaves, extraction, sulfated polysaccharides
Thesis contains: 57 pages, 5 figures, 5 tables, 105 references
Original in: Croatian
Graduate Thesis in printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the
Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kaieva 23, Zagreb.
Mentor: Verica Dragovi-Uzelac, PhD, Full Professor
Technical support and assistance: Ana Dobrini, MSc
Reviewers:
2. PhD. Verica Dragovi-Uzelac, Full Professor
3. PhD. Sandra Balbino, Associate Professor
4. PhD. Zoran Herceg, Full Professor (substitute)
Thesis defended: January 29th, 2021
Sadraj
2.3. EKSTRAKCIJA POLISAHARIDA IZ ALGI ........................................................................................ 11
2.3.1. Ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima (MAE) .......................................................................... 15
2.4. PRIMJENA FUKOIDANA .................................................................................................................... 18
3. EKSPERIMENTALNI DIO ....................................................................................................................... 19
3.1.2. Kemikalije ...................................................................................................................................... 19
3.1.3. Aparatura ........................................................................................................................................ 20
3.1.4. Pribor .............................................................................................................................................. 20
3.2. METODE .............................................................................................................................................. 21
3.2.1. Predtretman .................................................................................................................................... 21
3.2.3. Ekstrakcija polisaharida potpomognuta mikrovalovima (MAE) ...................................................... 21
3.2.4. Postupci nakon ekstrakcije .............................................................................................................. 22
3.2.5. Odreivanje koncentracije ukupnih ugljikohidrata .......................................................................... 23
3.2.6. Odreivanje koncentracije fukoze ................................................................................................... 24
3.2.7. Odreivanje koncentracije sulfatnih grupa ...................................................................................... 25
3.2.8. Odreivanje koncentracije ukupnih fenola ...................................................................................... 26
3.2.9. Odreivanje klorofila a, klorofila b i karotenoida UV/Vis spektrofotometrijom ............................... 27
3.2.10. Statistika obrada rezultata ............................................................................................................ 28
4. REZULTATI I RASPRAVA ...................................................................................................................... 29
4.1. USPOREDBA KONVENCIONALNE EKSTRAKCIJE I EKSTRAKCIJE POTPOMOGNUTE
MIKROVALOVIMA ................................................................................................................................... 32
4.2.1. Utjecaj otapala na prinos polisaharida ............................................................................................. 34
4.2.2. Utjecaj otapala na koncentraciju ukupnih ugljikohidrata ................................................................. 35
4.2.3. Utjecaj otapala na udio sulfatnih grupa............................................................................................ 36
4.3. UTJECAJ TEMPERATURE NA PRINOS POLISAHARIDA, KONCENTRACIJU UKUPNIH
UGLJIKOHIDRATA, UDIO SULFATNIH GRUPA I UDIO FUKOZE ....................................................... 37
4.3.1. Utjecaj temperature na prinos polisaharida ...................................................................................... 37
4.3.2. Utjecaj temperature na koncentraciju ukupnih ugljikohidrata .......................................................... 38
4.3.3. Utjecaj temperature na udio sulfatnih grupa .................................................................................... 39
4.3.4. Utjecaj temperature na udio fukoze ................................................................................................. 39
4.4. UTJECAJ VREMENA EKSTRAKCIJE NA PRINOS POLISAHARIDA, KONCENTRACIJU
UKUPNIH UGLJIKOHIDRATA, UDIO SULFATNIH GRUPA I UDIO FUKOZE .................................... 39
4.4.1. Utjecaj vremena ekstrakcije na prinos polisaharida ......................................................................... 39
4.4.2. Utjecaj vremena ekstrakcije na koncentraciju ukupnih ugljikohidrata .............................................. 40
4.4.3. Utjecaj vremena ekstrakcije na udio sulfatnih grupa ........................................................................ 40
4.4.4. Utjecaj vremena ekstrakcije na udio fukoze .................................................................................... 41
4.5. UTJECAJ KOMBINACIJE UVJETA EKSTRAKCIJE NA PRINOS POLISAHARIDA,
KONCENTRACIJU UKUPNIH UGLJIKOHIDRATA, UDIO SULFATNIH GRUPA I UDIO FUKOZE .... 41
4.6. ANALIZA EKSTRAKTA IZ PREDTRETMANA ................................................................................. 43
4.6.1. Koncentracija ukupnih fenola.......................................................................................................... 43
4.6.2. Koncentracija klorofila a, klorofila b i ukupnih karotenoida ............................................................ 44
5. ZAKLJUCI ............................................................................................................................................... 46
6. LITERATURA ............................................................................................................................................ 47
1. UVOD
Morske alge su ve godinama neizostavan dio prehrane Azijskih zemalja, a danas se sve
više prouava njihov sastav i mogua primjena u razliitim podrujima. Predstavljaju izvor
razliitih biološki aktivnih spojeva poput polifenola, vitamina, minerala, proteina i polisaharida
razliitih struktura i fizikalno-kemijskih svojstava te zanimljivih funkcionalnih karakteristika
(Hentati i sur., 2020). Posebno su bogate sulfatiranim polisaharidima koji privlae veliku
pozornost u prehrambenoj, kozmetikoj i farmaceutskoj industriji te se pokazalo da posjeduju
veliku biološku aktivnost, ukljuujui antitumorska, imunomodulirajua, antivirusna,
antikoagulativna i antioksidativna svojstva (Barbosa i sur., 2019). Najznaajniji predstavnici
sulfatiranih polisaharida su karagenan iz crvenih algi, ulvan iz zelenih te laminarin, alginat i
fukoidan iz smeih algi (Ngo i Kim, 2013).
Fukoidan i ostali sulfatirani polisaharidi se naješe izoliraju konvencionalnim
metodama ekstrakcije koje ukljuuju korištenje otapala poput vode, razrijeenih kiselina i soli
pri višim temperaturama uz vrijeme trajanja od nekoliko sati (Lim i Wan Aida, 2017). Takve
metode su pokazale slabu uinkovitost, dugotrajnost te potrebu za velikim koliinama otapala
što je dovelo do potrebe za razvojem novih metoda ekstrakcije (Nguyen i sur., 2020). Nove,
nekonvencionalne metode su ekološki prihvatljivije te pokazuju odreene prednosti nad
konvencionalnima, a naješe se koriste enzimima potpomognuta ekstrakcija (EAE),
ultrazvukom potpomognuta ekstrakcija (UAE), ekstrakcija otapalima pri povišenom tlaku
(PLE) te ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima (MAE) (Dobrini i sur., 2020).
Cilj ovog rada bio je odrediti utjecaj otapala, temperature i vremena ekstrakcije na prinos
polisaharida, koncentraciju ukupnih ugljikohidrata, udio sulfatnih grupa i udio fukoze u uzorku
smee alge Cystoseira barbata te utvrditi optimalne parametre ekstrakcije za dobivanje
najveeg prinosa. Ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima provedena je uz predtretman
acetonom i etanolom, a sama ekstrakcija se odvijala pri temperaturama od 40, 60 i 80 °C,
vremenu trajanja od 10, 15 i 20 min te pomou otapala destilirane vode i 0,1 M HCl-a.
Konvencionalna ekstrakcija je provedena uz kontinuirano miješanje s otapalom (voda i 0,1 M
HCl) pri temperaturi od 80 °C i vremenu od 3 h te je usporeena s ekstrakcijom potpomognutom
mikrovalovima. Odreena je i koncentracija ukupnih fenola i pigmenata (klorofila a, klorofila
b i ukupnih karotenoida) u acetonskim i etanolnim ekstraktima iz predtretmana.
2
Termin „alge“ predstavlja skupinu autotrofnih i fotosintetskih organizama koji nemaju
zajednikog pretka i prema tome ne mogu biti svrstane u istu taksonomsku jedinicu, ali dijele
odreene karakteristike koje ih povezuju (Barsanti i Gualtieri, 2014). Veinom su vodenog
podrijetla, no mogu biti i kopnene, a postoji i odreeni broj vrsta koje mogu rasti u ekstremnim
uvjetima (Sahoo i Baweja, 2015). Procijenjeno je da postoji izmeu 350 000 i 1 000 000 vrsta
algi (Lee, 2016), no prema globalnoj bazi podataka o algama, postoji tek 158.822 razliitih vrsta
i podvrsta koje su istraene (Guiry i Guiry, 2020). Prema svojoj grai mogu biti jednostanine
ili višestanine. Jednostanine alge se mogu podijeliti na pokretne i nepokretne, ovisno o
prisutnosti ili odsutnosti izdanaka za pokretljivost, dok se višestanine alge dijele na alge koje
tvore kolonije i alge koje tvore nitaste oblike (Sahoo i Baweja, 2015). Alge svojim izgledom
nalikuju na biljke, ali nemaju pravo korijenje, stabljiku i listove, ve se njihovo tijelo naziva
talus (Barsanti i Gualtieri, 2014).
Alge se strukturno mogu podijeliti na mikroalge i makroalge (Griffiths i sur., 2016).
Mikroalge obuhvaaju raznoliku skupinu prokariotskih i eukariotskih organizama koji mogu
rasti na razliitim prirodnim staništima. Mnoge prouavane vrste su fotoautotrofne, no postoji
i mali broj mikroalgi koje mogu biti miksotrofne i heterotrofne (Lee, 2016). Osim naina na
koji osiguravaju nutrijente za prehranu, neka od obiljeja koja karakteriziraju mikroalge su ta
da sadre razliite fotosintetske pigmente koji im daju obojenje te su preteno jednostanine,
iako mogu tvoriti i kolonije nediferenciranih stanica (Olaizola i Grewe, 2019). Za razliku od
mikroalgi, makroalge su višestanini organizmi koji brzo rastu te mogu tvoriti strukture
dugake i do 60 metara, a naješe se koriste za proizvodnju hrane i ekstrakciju hidrokoloida
(Rajkumar i sur., 2014). Od vodenih algi, morske alge predstavljaju najmnogobrojnije
organizme u morima i oceanima te se na temelju kemijskog sastava i izraenih fotosintetskih
pigmenata mogu svrstati u tri glavne skupine: zelene, smee i crvene alge (Xu i sur. 2017).
Zelene alge (Chlorophyta) su fotosintetski organizmi jednostavne grae, a karakterizira
ih prisutnost kloroplasta s dvostrukom membranom, a pigmenti koje naješe sadre su klorofil
a i b (Arora i Sahoo, 2015). Prema grai talusa mogu biti jednostanine, nitaste, listolike,
cjevaste, sifonokladalne i sifonalne (Antoli i sur., 2011). Smatraju se najraznovrsnijom
skupinom algi s više od 7500 vrsta koje veinom rastu u slatkoj vodi, dok mali broj raste i u
morskoj vodi te na kopnu (Arora i Sahoo, 2015).
3
imaju sitno razgranati nitasti talus te oblici sloenije grae, listolikog talusa dugog više od 10
metara. Neke vrste imaju diferencirani talus kod kojeg se razlikuju dijelovi koji nalikuju na
korijen, stabljiku i listove (rod Sargassum). Veina ovih algi nastanjuje stjenovito, šljunano i
pješano morsko dno, no mogu ivjeti u talusu drugih algi ili na ivotinjama poput morskih
pueva ili spuvi (Antoli i sur., 2011). Karakterizira ih boja koja potjee od karotenoidnog
pigmenta, fukoksantina, koji se nalazi u kloroplastima. Najpoznatiji predstavnici su razliite
vrste iz rodova Dictyota, Laminaria i Sargassum (Verma i sur., 2015).
Crvene alge (Rodophyta) dobile su naziv prema dominantnim pigmentima fikocijanu i
fikoeritrinu koji daju plavkasto i crveno obojenje. Openito se smatraju najvanijim izvorom
mnogih biološki aktivnih metabolita kada se usporede s drugim algama. Naješe rastu u
morskoj vodi i slatkovodnim staništima, ali postoje i kopnene vrste (Mayanglambam i Sahoo,
2015). Karakterizira ih nedostatak bieva koji omoguuju kretanje, a od klorofila sadre samo
klorofil a (Barsanti i Gualtieri, 2014). Vrste iz rodova Gracilaria, Gelidium i Pterocladia
koriste se u proizvodnji agara, medija koji slui kao hranjiva podloga za mikroorganizme te je
u širokoj laboratorijskoj i biotehnološkoj upotrebi (El Gamal, 2010).
Osim tri navedene podjele algi, znaajnije su i cijanobakterije (Cyanobacteria), kremene
alge ili dijatomeje (Chrysophyceae), euglenoidi (Euglenozoa) i dinoflagelati (Dinophyceae)
(Guiry, 2012).
Morske alge bogate su polisaharidima, mineralima i odreenim vitaminima te drugim
bioaktivnim spojevima poput proteina, lipida i polifenola koji pokazuju antibakterijska,
antiviralna i antifungalna svojstva (Holdt i Stefan, 2011). Takoer, sadre spojeve koji se ne
mogu pronai u biljkama, a pokazali su se vrlo djelotvornima u farmaceutskoj, prehrambenoj i
kozmetikoj industriji te kao suplementi prehrani. Smee alge sadre polisaharide kao što su
fukoidan, alginat i laminarin, crvene alge sadre agar i karagenan, a zelene alge karakterizira
ulvan (Khotimchenko i sur., 2020). Spojevi izolirani iz odreenih algi roda Dictyota sp.
pokazali su citotoksinu te antimalarijsku aktivnost, dok su vodeni ekstrakti vrsta Gracilaria
corticata i Sargassum oligocystum pokazali biološku aktivnost protiv ljudskih kancerogenih
stanica leukemije (Gallimore, 2017).
Morske alge su vaan izvor svakodnevne prehrane u Kini i Japanu, a Koreja ima
najraznolikiju industriju uzgoja morskih algi na svijetu. Morske alge se pripremaju i
konzumiraju na razliite naine: sirove, prene, kuhane na pari ili u vodi (Hafting i sur., 2015).
4
Takoer, agar i karagenan iz crvenih algi te alginati iz smeih algi se koriste u prehrambenoj
industriji kao sredstva za eliranje, a pigmenti izolirani iz razliitih algi, koriste se kao bojila i
aditivi u hrani (Griffiths i sur., 2016). Zbog svojih svojstava, smee alge se koriste kao gnojivo
i mogu posluiti u razliitim aspektima medicine te predstavljaju koristan i isplativ izvor za
proizvodnju biogoriva (Verma i sur., 2015). Od zelenih algi, vrsta koja se naješe koristi u
prehrani je Chlorella sp. Osim za prehranu, široko je korištena kao suplement u prehrani, u
kozmetikoj industriji te za proizvodnju antibiotika, a brojne druge vrste mogu posluiti u
procesima za smanjenje emisije ugljikovog dioksida te kao izvor obnovljive energije (Arora i
Sahoo, 2015).
U Jadranskom moru obitava oko 170 vrsta smeih algi koje zauzimaju veinu stjenovite
površine na dubini 20 – 30 metara, a vrste roda Cystoseira su najraširenije. Od zelenih algi
poznato je oko 118 vrsta, od kojih najvei znaaj imaju vrste iz rodova: Ulva, Enteromorpha,
Cladophora i Ulothrix. Crvenih algi u Jadranskom moru ima oko 350 vrsta, a najznaajniji
predstavnici su Phymatolithon lenormandii, Lithophyllum incrustans, Tenarea undulosa i
Lithothamnium fruticulosum (Antoli i sur., 2011).
2.1.1. Cystoseira barbata
Cystoseira je rod smeih algi koji obuhvaa oko 294 vrsta algi i najznaajniji je
predstavnik obitelji Sargassaceae, sastavljene od nekadašnjih dviju porodica Sargassaceae i
Cystoseiraceae (Gouveia i sur., 2013) koja pripada redu Fucales (Sousa i sur., 2019). U
globalnoj bazi podataka o algama trenutno se nalazi 165 opisanih vrsta roda Cystoseira i 129
podvrsta, kultivara i varijeteta (Guiry i Guiry, 2020), a u Jadranskom moru ih se nalazi oko 56
(Roi i sur., 2012). Neke od najraširenijih vrsta Jadranskog mora su C. barbata, C. compressa,
C. corniculata, C. crinita i C. spinosa (Antoli i sur., 2010).
C. barbata (Slika 1.) je višegodišnja alga grmolikog izgleda, graena od razgranatog
talusa koji je cilindrinog oblika i raste iz drvenaste strukture konusnog oblika. Iz centralnog
dijela alge uzdiu se osnovne grane koje se dijele u vlaknaste grane i granice koje se ponekad
ne razviju i ne šire daleko. Na malim granicama se nalaze redovi malih vezikula (Chapman i
Chapman, 1973). Pripada endemskim vrstama Sredozemnog mora, a najbujnije raste tijekom
travnja i svibnja te se morfološki moe razlikovati ovisno o staništu i uvjetima okoline (Falace
i Bressan, 2006).
Slika 1. Cystoseira barbata (Razred: Phaepohyta; Red: Fucales; Rod: Cystoseira)
(ukrbin.com, pristupljeno 29. srpnja 2020.)
Prirodno stanište ove vrste je morsko dno otvorenih i zaklonjenih stjenovitih obala te
obalna podruja laguna. Obino raste u gornjoj sublitoralnoj zoni dubine do 0,2 metra (Guiry i
Guiry, 2020), no moe rasti i na dubinama od 20 – 30 metara, pri emu ovisi o propusnosti
morske vode za svjetlost (Antoli i sur., 2011). C. barbata obitava u Jadranskom moru, pri
emu najviše raste u obalnom podruju sjevernog Jadrana (Antoli i sur., 2010). Njena
rasprostranjenost se takoer moe primijetiti kroz cijelo obalno podruje Sredozemnog mora
(Antoli i sur., 2011), a široko je rasprostranjena i na obalama Crnog mora (Trica i sur., 2019;
Falace i Bressan, 2006).
Istraivanja su pokazala da C. barbata sadri razliite spojeve koji imaju biološku
aktivnost. Neki od njih su laminarin, fukoksantin i konjugati polifenola, proteina i polisaharida.
Laminarin ima antioksidacijska, antibakterijska i zacjeljujua svojstva, fukoksantin se koristi
kao pojaiva boja i oksidacijske stabilnosti mesnih proizvoda, a konjugati polifenola, proteina
i polisaharida se koriste kao konzervansi (Trica i sur., 2019).
2.2. POLISAHARIDI U ALGAMA
Polisaharidi ili glikani su polimeri velike molekulske mase, sastavljeni od jednostavnih
šeera, tj. monosaharida, koji su meusobno povezani glikozidnim vezama (Løvstad Holdt i
Kraan, 2011). U prirodi je više od 90 % ugljikohidrata u obliku polisaharida. Molekule
polisaharida mogu biti linearne i razgranate. Obje strukture sadre jedan reducirajui kraj te
jedan ili više nereducirajuih krajeva, ovisno o tome jesu li linearne ili razgranate. Polisaharidi
6
sastavljeni od istih monosaharida nazivaju se homoglikani, a ako su sastavljeni od dvije ili više
razliitih monomernih jedinica nazivaju se heteroglikani (BeMiller, 2019).
Za razliku od biljaka, veina algi sadri sulfatirane, acetilirane ili metilirane polisaharide
(Wang i sur., 2014) koji imaju jedinstvena fizikalna i kemijska svojstva ovisna o vrsti,
geografskom podruju rasta i godišnjem dobu (Dobrini i sur., 2020). Koncentracije
polisaharida u razliitim vrstama algi ine 4 % do 76 % suhe tvari alge, a vee koncentracije se
mogu pronai u vrstama iz rodova Ascophyllum, Porphyra, Palmaria i Ulva (Løvstad Holdt i
Kraan, 2011). Mnoga istraivanja su pokazala da sulfatirani polisaharidi imaju poseban
fiziološki utjecaj na ovjekov organizam svojom razliitom biološkom aktivnošu. Venugopal
(2019), Wang i sur. (2014) i Jesus Raposo i sur. (2013) navode kako sulfatirani polisaharidi iz
morskih algi pokazuju antikoagulativna, antiviralna, antikancerogena, antioksidativna i
imunomodulirajua svojstva te da njihove strukturne karakteristike pogoduju primjeni u
biomedicini. Takoer, vanost u medicini predstavlja i njihovo svojstvo prepoznavanja stanica
te mogunost stanine adhezije i regulacije funkcije receptora (Wang i sur., 2014), a široko su
implementirani i u farmaceutskoj, kozmetikoj i prehrambenoj industriji (Jesus Raposo i sur.,
2013). Najvaniji predstavnici sulfatiranih polisaharida su karagenan iz crvenih algi, ulvan iz
zelenih (Muhamad i sur., 2019) te alginat, laminarin i fukoidan iz smeih algi (Dobrini i sur.,
2020).
Karagenani su skupina sulfatiranih polisaharida koji formiraju gelove i imaju svojstva
zgušnjivaa, a dobivaju se ekstrakcijom iz odreenih vrsta crvenih morskih algi rodova
Chondrus, Gigartina i Eucheuma (Necas i Bartosikova, 2013). Predstavljaju glavne
komponente staninih stijenki osiguravajui strukturu te meustaninu adheziju i signalizaciju
(Khotimchenko i sur., 2020). Karagenan se sastoji od naizmjeninih jedinica D-galaktoze i 3,6-
anhidro-galaktoze koje su meusobno povezane α-(1→3) i β-(1→4) glikozidnim vezama
(Necas i Bartosikova, 2013). Postoje tri glavne strukture karagenana: Kappa, Iota i Lambda, od
kojih svaka posjeduje razliita gelirajua svojstva (Løvstad Holdt i Kraan, 2011). Sve tri
strukture sadre 22 – 35 % sulfatnih skupina (Necas i Bartosikova, 2013) ugraenih tako da
molekule šeera imaju jednu ili dvije sulfatne skupine esterificirane na hidroksilnu skupinu na
ugljikovim atomima C2 ili C6.
Struktura karagenana omoguuje im topljivost u vodi te sposobnost tvorbe vrlo
viskoznih pseudoplastinih otopina. Viskoznost tako nastale otopine je stabilna u širokom
7
rasponu pH vrijednosti zbog ioniziranih sulfatnih skupina koje molekulama daju negativan
naboj. Tvorba gela najvanije je svojstvo Kappa i Iota karagenana. Gelovi se mogu formirati u
vodi ili mlijeku te u prisutnosti kationa poput K+, Ca2+ ili proteina, tvore gelove koji mogu biti
bistri, zamueni, kruti, elastini, ilavi, mekani, toplinski stabilni i termiki reverzibilni
(BeMiller, 2019). Zbog svojih fizikalno-kemijskih svojstava, karagenani se koriste kao
emulgatori i sredstva za eliranje te kao zgušnjivai i stabilizatori u prehrambenoj industriji pri
proizvodnji sladoleda, jogurta i drugih proizvoda (Venugopal, 2019).
Kao biološki aktivni spojevi, karagenani su pokazali izrazito povoljan uinak na ljudsko
zdravlje. Posjeduju antiviralna i antitumorska (Løvstad Holdt i Kraan, 2011) te antikoagulativna
i imunomodulacijska svojstva in vitro i in vivo te se sve više koriste u medicini kao terapijska
sredstva (Muhamad i sur., 2019).
2.2.2. Ulvan – zelene alge
Ulvan je najzastupljeniji sulfatirani polisaharid zelenih morskih algi (Jiao i sur., 2011)
koji se nalazi u meustaninom prostoru i vlaknastim stijenkama talusa te se sastoji od
raminoze, ksiloze, glukuronske i iduronske kiseline (Surendhiran i Sirajunnisa, 2019). Topljiv
je u vodi i naješe se dobiva ekstrakcijom iz algi rodova Ulva i Enteromorpha (Wang i sur.,
2014). Moe initi 18 – 29 % suhe tvari alge, ovisno o vrsti, taksonomskom podrijetlu, sezoni,
uvjetima rasta i ekstrakcijskim postupcima (Pangestuti i Kurnianto, 2017). Strukturno je vrlo
sloene grae te pokazuje veliku varijabilnost ponavljajuih disaharidnih i oligosaharidnih
graevnih jedinica koje se javljaju u nativnoj i kemijski modificiranoj strukturi ulvana, a
povezane su α- ili β-(1→4) glikozidnim vezama. Glavne dvije vrste disaharida koje ine
strukturu ulvana su 3-sulfat ulvanobiuronska kiselina koja sadri glukuronsku kiselinu (tip A)
i ulvanobiuronska kiselina koja sadri iduronsku kiselinu (tip B) (Jiao i sur., 2011).
Zbog svoje kemijske strukture, ulvan tvori viskozne vodene otopine, a u prisutnosti
viševalentnih kationa i borata, termoreverzibilne gelove. Pokazalo se da moe tvoriti i
komplekse s glinama koji mogu biti osnova za nove nanomaterijale (Robic i sur., 2008).
Takoer, pokazuje afinitet prema vezanju iona što moe dovesti do vezanja teških metala na
ulvan u staninim stijenkama algi (Lahaye i Robic, 2007).
Kao biološki aktivan spoj, ulvan se uinkovito primjenjuje u farmaceutskoj i
prehrambenoj industriji te kao nutraceutik. Osim antikoagulativnih i imunomodulirajuih
svojstava, pokazao je znaajnu citotoksinu aktivnost protiv raka jetre, dojke te grlia
8
maternice. Novija istraivanja usmjerena su prema tome da ga potpuno implementiraju u
postupcima previjanja rana te kao sastojak antimikrobnih premaza (Muhamad i sur., 2019).
2.2.3. Alginat – smee alge
Alginat je polisaharid izoliran iz stanine stijenke brojnih vrsta smeih algi, a proizvode
ga i neke vrste bakterija u obliku izvanstaninog matriksa (Brownlee i sur., 2005). Moe biti u
obliku kiseline kao linearna poliuronska kiselina koja se naziva alginska kiselina te u obliku
soli kao komponenta staninih stijenki smeih algi (Løvstad Holdt i Kraan, 2011). Glavna
funkcija alginata je strukturna, jer prua vrstou i fleksibilnost tkivu alge (Skjik-Braek, 1992).
Komercijalno dostupan alginat je naješe ekstrahiran iz algi: Laminaria hyperborea,
Laminaria digitata, Laminaria japonica, Ascophyllum nodosum i Macrocystis pyrifera, a udio
alginata u njima varira od 22 – 44 % suhe tvari alge (Lee i Mooney, 2012). Alginat se sastoji
od (1→4) linearnih kopolimera α-L guluronske kiseline (G) i β-D manuronske kiseline (M) koji
su kovalentno povezani u razliitim nizovima ili blokovima. Kopolimeri se kombiniraju tako
da strukturno daju podruja bogata G, MG i M jedinicama (G blokovi, MG blokovi i M blokovi)
(Brownlee i sur., 2005).
Alginati izolirani iz razliitih vrsta algi imaju razliite udjele G, MG i M blokova, te
posljedino i razliita biokemijska i biofizika svojstva te molekulske mase (BeMiller, 2019).
Otopine alginata bogate G blokovima imaju veu viskoznost, pokazuju pseudoplastino
ponašanje i viskoelastina svojstva, a dodatkom Ca2+ iona tvore gelove (Hentati i sur., 2020).
Alginatni gelovi nisu termoreverzibilni i koriste se u prehrambenoj industriji, ali nemaju
svojstvo topljenja u ustima (BeMiller, 2019). Zbog biokompatibilnosti i lakoe geliranja
alginati su našli brojne primjene u biomedicini i inenjerstvu. Alginatni hidrogelovi posebno su
korisni u zacjeljivanju rana, a koriste se i pri aplikaciji lijekova te u tkivnom inenjerstvu
(Muhamad i sur., 2019).
Biološka aktivnost alginata ukljuuje antibakterijska, prebiotika i antihipertenzivna
svojstva te pozitivan uinak na smanjenje pretilosti i pojavu ireva. Alginati s visokim
sadrajem M blokova su imunogeni te induciranju proizvodnju citokina, a pokazuju i efekte
zgrušavanja krvi te aktiviraju trombocite (Venugopal, 2019). U literaturi se takoer navodi da
alginska kiselina dovodi do smanjenja vrijednosti koncentracije kolesterola, sprjeava
apsorpciju toksinih kemijskih tvari i ima veliku ulogu kao prehrambeno vlakno za odravanje
zdravlja ivotinja i ljudi (Løvstad Holdt i Kraan, 2011).
9
2.2.4. Laminarin – smee alge
Laminarin je glavni skladišni polisaharid smeih algi roda Laminaria i ini do 36 %
suhe tvari alge ovisno o sezoni (Deville i sur., 2004). Neke od vrsta bogatih laminarinom su
Laminaria japonica i Laminaria hyperborea te u manjoj mjeri alge rodova Ascophyllum, Fucus
i Undaria (Venugopal, 2019). Laminarin je linearni homopolisaharid molekulske mase oko 5
kD ovisno o stupnju polimerizacije, koji se sastoji od β-(1→3) i β-(1→6) glukana u omjeru 3:1
(Dobrini i sur., 2020). Sadri izmeu 50 i 69 % D-glukoze i prosjeno oko 1,3 % manitola
(Venugopal, 2019). Opisane su dvije vrste laminarina, jedan s M-lancima, gdje lanci laminarina
sadre D-manitol na reducirajuem terminalnom kraju te laminarin s G-lancima gdje se na
reducirajuem terminalnom kraju nalazi D-glukozna jedinica. Ovisno o udjelu M-lanaca u
strukturi, mogu se razlikovati topljivi laminarin koji ima oko 75 % M-lanaca i netopljivi
laminarin koji sadri manje od 45 % M-lanaca (Hentati i sur., 2020).
Za razliku od do sada opisanih polisaharida, laminarin ne formira viskozne otopine i
gelove, ali ima primjenu u razvoju prehrambenih proizvoda jer se koristi kao izvor vlakana i
kao prebiotik te pokazuje svojstva povoljna za imunološki sustav ovjeka (Venugopal, 2019).
Pokazalo se i da laminarin ima veliki potencijal u medicini i farmaceutici kao prah za kirurške
potrebe, sredstvo sa svojstvima inhibicije tumora te ako je u obliku sulfatnog estera kao
antikoagulans. Takoer, prua zaštitu protiv infekcija uzrokovanih bakterijskim patogenima,
pojaava imunološki sustav, smanjuje razinu kolesterola u serumu i sistoliki krvni tlak te
razinu ukupnog kolesterola, slobodnog kolesterola, triglicerida i fosfolipida u jetri (Løvstad
Holdt i Kraan, 2011). Pokazano je i da laminarin moe sprijeiti aktivnost virusa HIV, tako što
sprjeava adsorpciju virusa na limfocite te inaktivira HIV reverznu transkriptazu (Ahmadi i
sur., 2015).
Fukoidan je termin koji predstavlja sulfatirane polisaharide izolirane iz smeih algi i
nekih morskih beskralješnjaka i prvi put je izoliran 1913. godine (Barbosa i sur., 2019). Odnosi
se na polisaharide graene od uglavnom sulfatirane L-fukoze i drugih monosaharida (Ahmadi
i sur., 2015) poput manoze, galaktoze, glukoze i ksiloze kojih je manje od 10 %, a mogu
sadravati i uronsku kiselinu, acetilne skupine i proteine (Løvstad Holdt i Kraan, 2011).
Struktura fukoidana (Slika 2.) je raznolika te fukoidani dobiveni iz rodova Fucus, Sargassum,
Pelvetia, Ascophyllum i Cystoseira imaju glavnu okosnicu od α-L-fukoze povezane (1→2),
(1→3) i (1→4) glikozidnim vezama, dok fukoidani iz rodova Laminaria, Ecklonia i Eisenia
10
imaju linearni lanac α-L-fukopiranonozilnih ostataka povezanih (1→3) glikozidnim vezama.
Sulfati i acetatne skupine veu se na α-L-fukozne ostatke i smješteni su na poloajima C2 i C4,
a povremeno i na C3 (Hentati i sur., 2020).
Slika 2. Strukturni prikaz molekule fukoidana s naizmjeninim α-(1→3) i α-(1→4)
glikozidnim vezama (Ahmadi i sur., 2015)
Prosjena relativna molekulska masa fukoidana varira od 7 kDa do 2300 kDa, a udio fukoidana
iznosi otprilike 5 do 10 % suhe tvari alge, dok udio sulfatnih skupina varira izmeu 5 i 38 %,
ovisno o vrsti alge (Dobrini i sur., 2020). Za vrstu smee alge Fucus vesiculosus, pokazano
je da sadri najveu koncentraciju fukoidana i to do 20 % suhe tvari alge (Løvstad Holdt i
Kraan, 2011).
Topljivost fukoidana povezana je sa stupnjem razgranatosti ovisno o sadraju sulfatnih
skupina. Moe tvoriti viskozne otopine u vrlo niskim koncentracijama i podloan je raspadanju
kada se tretira razrijeenim kiselinama i bazama. Moe tvoriti gelove tako da se u vodenu
otopinu fukoidana visoke koncentracije doda glicerol (Venugopal, 2019).
Fukoidan se opseno istrauje zbog svoje biološke aktivnosti, koja je povezana s
molekulskom masom, vrstom i udjelom šeera, stupnjem sulfatacije i molekularnom
strukturom koji uvelike ovise o staništu, prinosu i uvjetima ekstrakcije alge (Barbosa i sur.,
2019). Dokazane su raznolike biološke funkcije i mogua terapeutska svojstva koja ukljuuju
antitumorsko, antivirusno, imunomodulacijsko, protuupalno i antikoagulativno djelovanje
(Besednova i sur., 2020; Venugopal, 2019; Ale i Meyer, 2013). Pokazan je izravan
11
antiproliferativni uinak fukoidana protiv odreenih stanica raka, gdje je uoeno znatno
smanjenje broja stanica raka plua i melanoma in vitro te je zabiljeeno da primjena fukoidana
izaziva apoptozu stanica melanoma, raka dojke i raka debelog crijeva (Ale i Meyer, 2013).
Takoer, pokazana je i antiviralna aktivnost protiv mnogih RNA i DNA virusa in vivo i in vitro,
ukljuujui vane ljudske patogene kao što su HIV, HSV1-2 i virus denge (Ahmadi i sur.,
2015). Istraivanje provedeno na smeoj algi Turbinaria conoides pokazalo je da fukoidan ima
najveu antioksidacijsku aktivnost, nakon kojeg slijede alginat i laminarin, a takoer je istraen
i antialergijski uinak fukoidana na induciranoj preosjetljivosti mišjih dišnih puteva, gdje je
pokazano da fukoidan smanjuje koncentraciju interleukina 4 (IL-4) i 13 (IL-13) u
bronhoalveolarnoj tekuini za ispiranje i inhibira porast antigen specifinog imunoglobulina E
(IgE) (Ngo i Kim, 2013).
2.3. EKSTRAKCIJA POLISAHARIDA IZ ALGI
Švedski botaniar Kylin je 1913. prvi ekstrahirao i okarakterizirao fukoidan iz raznih
vrsta algi rodova Laminaria i Fucus te je od tada do danas razvijen niz razliitih tehnika
ekstrakcije fukoidana (Lim i Wan Aida, 2017). Postoji nekoliko glavnih koraka koje je potrebno
provesti kako bi proces ekstrakcije fukoidana bio uspješan (Slika 3.). Prvi korak je priprema
uzorka alge, gdje se alge prikupljene iz mora prvo ispiru vodom kako bi se uklonile neistoe,
zatim se suše na umjerenim temperaturama te na kraju melju kako bi se dobio vei omjer
površine i volumena te kako bi se osigurala homogena smjesa. Daljnji koraci su predtretman,
ekstrakcija te proišavanje i frakcioniranje (García-Vaquero i sur., 2016; Hahn i sur., 2012).
Predtretman je korak prije same ekstrakcije i posljednjih je godina postao uobiajen zbog
poboljšanja uinkovitosti i olakšanja postupka ekstrakcije te poveanja prinosa eljenog
ekstrakta (Zayed i Ulber, 2020). Ekstrakcija je nestacionaran, heterogeni postupak za odvajanje
spojeva i/ili frakcija iz vrste tvari, gdje dolazi do prijenosa mase iz vrste tvari pomou
selektivnog otapala. Najvanije faze ekstrakcije su: difuzija otapala unutar vrste matrice,
hidroliza i/ili otapanje ciljanih komponenata u otapalu, difuzija otopljenih tvari kroz vrstu
matricu te prijenos mase u završnu otopinu s otapalom (Flórez-Fernández i sur., 2018). Nakon
ekstrakcije, provode se postupci frakcioniranja i proišavanja kako bi se osigurala izolacija
fukoidana maksimalne istoe, a nakon izolacije, potrebno je osušiti fukoidan kako bi se mogle
provoditi daljnje analize. Sušenje se provodi razliitim metodama, a neke od njih su sušenje u
razliitim izvedbama sušionika ili pomou vakuuma te liofilizacija (Lim i Wan Aida, 2017).
Nakon sušenja, za utvrivanje sastava monosaharida, molekulske mase te odnosa strukture i
12
magnetske rezonance te razliitih kromatografskih metoda (Xu i sur., 2017).
Slika 3. Glavni koraci ekstrakcije fukoidana (Torres i sur., 2020)
Predtretman se koristi za uklanjanje spojeva koji predstavljaju neistoe te kako bi se
sprijeila ekstrakcija drugih komponenata alge tijekom izolacije fukoidana. Prilikom
provoenja predtretmana koriste se organska otapala poput acetona, toluena, heksana,
izopropanola i etanola, jer se fukoidan zbog svoje strukture i negativnog naboja nee otapati u
njima (Zayed i Ulber, 2020). Predtretman koji se naješe primjenjuje je ispiranje osušenog i
samljevenog uzorka alge smjesom metanola, kloroforma i vode u omjeru (4:2:1) ime se
uklanjaju fenoli, lipidi i terpeni te razne druge molekule (García-Vaquero i sur., 2016; Ale i
Meyer, 2013; Hahn i sur., 2012; Ale i sur., 2011), a postupak se provodi pri niim
temperaturama da se ne zapone prerana ekstrakcija fukoidana zbog njegove topljivosti u vodi
(Lim i Wan Aida, 2017). Fenoli imaju visok afinitet za fukoidane i vrsto se adsorbiraju na njih
tijekom ekstrakcije pa ih je u postupku predtretmana potrebno ukloniti, zbog mogunosti
narušavanja antioksidativnih i antitumorskih aktivnosti fukoidana (Zayed i Ulber, 2020). Druge
vrste predtretmana koje se mogu koristiti su: upotreba acetona ili etanola pri razliitim
temperaturama za uklanjanje lipida, proteina, fenola, manitola i klorofila (García-Vaquero i
sur., 2016), ispiranje formaldehidom za uklanjanje polifenola i flavina (Hahn i sur., 2012),
taloenje i uklanjanje drugih polisaharida poput alginata dodatkom CaCl2 pri emu se dobije
13
netopljivi kompleks kalcija s alginatom (Zayed i Ulber, 2020) te dodatak proteolitikih enzima
za uklanjanje proteina (Ale i Meyer, 2013).
Ekstrakcija sirovog fukoidana treba biti optimirana kako bi se osigurao najvei prinos
bez utjecaja na strukturu i biološku aktivnost fukoidana. Parametri koji utjeu na prinos i sastav
ekstrahiranog fukoidana su temperatura, pH, vrijeme i broj stupnjeva ekstrakcije, a najvaniji
parametar predstavlja omjer vrste tvari i tekuine, odnosno alge i otapala (Flórez-Fernández i
sur., 2018). Konvencionalne metode ekstrakcije ukljuuju korištenje otapala poput vode,
razrijeenih kiselina i soli pri razliitim temperaturama (od sobne do 120 °C) uz vrijeme trajanja
od nekoliko sati. Od kiselina se naješe koriste klorovodina i sumporna kiselina, a od soli
kalcijev klorid (January i sur., 2019; Flórez-Fernández i sur., 2018; Lim i Wan Aida, 2017;
García-Vaquero i sur., 2016). Ekstrakcija vruom vodom je metoda koja se esto koristi za
ekstrakciju sulfatiranih polisaharida topljivih u vodi, a za prednost ima to što je za njeno
provoenje potrebno vrlo malo kemikalija (Flórez-Fernández i sur., 2018). Ekstrakcija se
provodi pri višim temperaturama (70 – 100 °C) uz mehaniko miješanje, ali nije dovoljno
selektivna za ekstrakciju odreenog polisaharida ve dolazi do ekstrakcije i drugih polisaharida
prisutnih u staninoj stijenki alge te je potrebno provesti više koraka kako bi se poveala istoa
i dobila frakcija s ciljanim polisaharidom (Lim i Wan Aida, 2017). Za razliku od ekstrakcije
vodom, pokazano je da ekstrakcija kiselinama i solima ima bolji utjecaj na prinos i istou
ekstrahiranog polisaharida. Upotreba 0,1 M otopine klorovodine kiseline pokazala se
uinkovitom jer omoguuje hidrolizu staninih stijenki i olakšava ekstrakciju fukoidana i
laminarina iz matrice (Dobrini i sur., 2020). Daljnja prednost upotrebe kiselina prilikom
ekstrakcije je u sposobnosti vodikovih iona da ometaju vodikove veze izmeu razliitih
polisaharida, uzrokujui njihovo taloenje te poveanje prinosa. Takoer, ponavljanjem
ekstrakcije kiselinom te neutralizacijom dobivenih frakcija moe se sprijeiti razgradnja
ciljanog polisaharida, u ovom sluaju fukoidana (Hahn i sur., 2012). Za uinkovito uklanjanje
alginata prisutnog u staninim stijenkama u obliku kalcijevih, magnezijevih i natrijevih soli
alginske kiseline, koristi se 2 % otopina kalcijevog klorida. Kalcijevi ioni u kontaktu s
natrijevim alginatom zamjenjuju natrijeve ione te nastaje vrsti kalcijev alginat koji nije topiv
u vodi i lako se odvaja (Dobrini i sur., 2020). U usporedbi s ekstrakcijom vruom vodom,
upotrebom vodene otopine kalcijevog klorida dobije se sirovi fukoidan s niim sadrajem
laminarina, uronskih kiselina i polifenola (Flórez-Fernández i sur., 2018).
Parametri konvencionalne ekstrakcije mogu se podesiti kako bi se optimirao prinos, sastav i
svojstva ekstrakata (Torres i sur., 2020), ali nedostaci poput dugotrajnosti, toksinosti, slabe
14
uinkovitosti te mogunosti utjecaja na strukturu fukoidana što potencijalno moe imati štetan
uinak na njegovu bioaktivnost, doveli su do potrebe za razvojem novih metoda ekstrakcije
(Nguyen i sur., 2020).
fukoidana i drugih sulfatiranih polisaharida razvijene su kako bi se unaprijedili nedostaci
konvencionalnih metoda. Takve metode su pokazale nekoliko prednosti u odnosu na
konvencionalne metode, ukljuujui smanjenu koliinu upotrijebljenog otapala, krae vrijeme
ekstrakcije i rad pri niim temperaturama. Takoer, imaju bolju selektivnost za izolaciju
eljenih spojeva te se njihovom upotrebnom moe izbjei stvaranje nusproizvoda i neeljenih
reakcija tijekom ekstrakcije (Cikoš i sur., 2018). Metode koje se naješe koriste su: enzimima
potpomognuta ekstrakcija (EAE), ultrazvukom potpomognuta ekstrakcija (UAE), ekstrakcija
tekuinama pri povišenom tlaku (PLE) te ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima (MAE)
(Dobrini i sur., 2020)
Enzimima potpomognuta ekstrakcija (EAE) je metoda visoke specifinosti i katalitike
uinkovitosti te je pogodna za rad u blagim uvjetima reakcije. Uz to, enzimi su ekološki,
netoksini te prikladni za rad s prehrambenim proizvodima (García-Vaquero i sur., 2016).
Prema definiciji, enzimi predstavljaju katalizatore koji u blagim uvjetima poveavaju brzinu
pretvorbe supstrata u produkt. Prilikom izolacije fukoidana iz algi, posreduju u degradaciji
stanine stijenke i time omoguavaju lakše izdvajanje fukoidana u blagim uvjetima reakcije uz
ouvanje njegove biološke aktivnosti (Hahn i sur., 2012).
Ultrazvukom potpomognuta ekstrakcija (UAE) je zbog svoje jednostavnosti, kratkog vremena
ekstrakcije te mogunosti ostvarenja velikih prinosa eljene komponente, najpraktinija
alternativna tehnika za primjenu na industrijskoj razini (Dobrini i sur., 2020). Metoda se
bazira na upotrebi ultrazvunih valova pri frekvencijama od 20 do 100 kHz koji uzrokuju
stvaranje mjehuria te zona visokog i niskog tlaka. Takva pojava se naziva kavitacija te dovodi
do kolapsa i implozije mjehuria koji uzrokuju razgradnju stanine stijenke te poveanje
prijenosa mase i oslobaanje bioaktivnih spojeva iz matrice (Cikoš i sur., 2018). Prednosti
ultrazvukom potpomognute ekstrakcije ukljuuju nisku potrošnju otapala, visoku razinu
automatizacije, manje troškove te mogunost kombiniranja s drugim konvencionalnim i
nekonvencionalnim tehnikama (García-Vaquero i sur., 2016).
Ekstrakcija tekuinama pri povišenom tlaku (PLE) temelji se na primjeni visokog tlaka za
odravanje tekueg otapala iznad njegove temperature vrelišta te ima utjecaj na bolju topljivost
15
i bolji prijenos mase eljene komponente. Takoer je pokazano da utjee na brzinu ekstrakcije
i poveanje prinosa (Flórez-Fernández i sur., 2018). Ovisno o otapalu koje se koristi za
ekstrakciju i parametrima vanim za proces, postoje: ekstrakcija fluidima pri povišenom tlaku
(PFE), ekstrakcija otapalima pri povišenom tlaku (PSE), ubrzana ekstrakcija otapalima pri
povišenom tlaku (ASE), ekstrakcija subkritinom vodom (SWE) i ekstrakcija vruom vodom
(HWE) (Dobrini i sur., 2020).
Nakon ekstrakcije, dobije se smjesa polisaharida razliite molekulske mase, sastava
monosaharida i sadraja sulfatnih skupina uz proteine i druge spojeve male molekulske mase
koji predstavljaju neistoe. Kako bi se uklonili drugi polisaharidi i dobio fukoidan maksimalne
istoe koriste se procesi proišavanja i frakcioniranja (Xu i sur., 2017). Frakcioniranje je
postupak klasifikacije analita ili skupine analita iz odreenog uzorka prema fizikalnim ili
kemijskim svojstvima i provodi se tako da se sirova smjesa spojeva kontinuirano razdvaja u
manje frakcije razliitih sastava (Templeton i sur., 2000). Membranska filtracija koja ukljuuje
dijafiltraciju, ultrafiltraciju, reverznu osmozu i nanofiltraciju te razliite kromatografske
metode dobre su tehnike za provoenje frakcioniranja. Iako ne postoji univerzalna metoda za
proišavanje fukoidana, postoje metode koje su se pokazale uinkovite te se naješe koriste.
Tehnike proišavanja ukljuuju taloenje spojeva dodatkom etanola, membransku filtraciju te
kolonsku kromatografiju putem ionske izmjene ili iskljuivanjem prema veliini ili afinitetu
(Xu i sur., 2017). Dodatak etanola je jedan od postupaka koji se naješe koristi za
proišavanja ekstrahiranog fukoidana. Dodatkom CaCl2 taloe se alginati koji se potom
uklanjaju centrifugiranjem, a fukoidan u supernatantu se dalje moe podvrgnuti postupku
dijalize ili membranske filtracije kako bi se uklonile zaostale neistoe male molekulske mase
(Lim i Wan Aida, 2017).
2.3.1. Ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima (MAE)
Ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima je nova, nekonvencionalna metoda koja se
uspješno primjenjuje za ekstrakciju mnogih biološko aktivnih spojeva iz razliitih prirodnih
resursa (Rodriguez-Jasso i sur., 2011). Pogodna je za ekstrakciju funkcionalnih sastojaka hrane
i aktivnih farmaceutskih spojeva iz biomaterijala (Sosa-Hernández i sur., 2018) te je jedna od
naješe korištenih metoda ekstrakcije fenolnih spojeva i sulfatiranih polisaharida iz morskih
algi (Xu i sur., 2017). Princip ove metode bazira se na zagrijavanju mikrovalovima.
Mikrovalovi nastaju rotacijom dipola, odnosno separacijom pozitivnog i negativnog naboja iste
magnitude. Ova pojava uzrokuje obrnuto polje koje stvara inverziju na silu koja djeluje na
njega. Daljnjom separacijom naboja dolazi do oscilacija, a oscilacije generiraju elektrino i
16
magnetsko polje. Oscilacijom tih dvaju polja nastaje elektromagnetsko zraenje koje se mjeri
u frekvencijama. Mikrovalovi se nalaze u rasponu frekvencija od 300 MHz do 300 GHz i
pripadaju neionizirajuem zraenju jer ne utjeu direktno na molekulsku strukturu (Aguilar-
Reynosa i sur., 2017). Uspješno mikrovalno zagrijavanje postie se pretvorbom
elektromagnetske energije u toplinu. Isto tako, uinkovitost mikrovalnog zagrijavanja ovisi o
dielektrinim svojstvima materijala i njegovoj sposobnosti da apsorbira mikrovalnu energiju i
pretvori ju u toplinu (Flórez-Fernández i sur., 2018).
Prilikom ekstrakcije mikrovalovima, mikrovalni reaktor (Slika 4.) inducira mikrovalove
koji simultano zagrijavaju cijeli volumen uzorka te ošteuju vodikove veze potiui rotaciju
dipola (Bleki i sur., 2011), ime dolazi do vibracije molekula vode koje se nalaze u uzorku
alge. Zbog vibracija se poveava temperatura unutarstanine tekuine, voda poinje isparavati
te stvara tlak na staninu stijenku uzorka alge, a zatim dolazi do pucanja stanine stijenke i
izlijeva unutarstaninog sadraja u okolni medij (Hahn i sur., 2012).
Postoje dvije vrste sustava za mikrovalnu ekstrakciju, a to su ekstrakcija u zatvorenim
posudama pri kontroliranoj temperaturi i tlaku veem od atmosferskog te ekstrakcija u
otvorenim posudama pri atmosferskom tlaku. Zbog rada pod atmosferskim tlakom, ekstrakcija
u otvorenim posudama je uinkovitija i sigurnija te je mogue obraditi vee uzorke. Takoer,
procesni uvjeti su pogodni za termolabilne spojeve (Cikoš i sur., 2018). Mikrovalna ekstrakcija
u zatvorenim posudama se openito koristi za ekstrakciju pri uvjetima niske ili visoke
temperature ekstrakcije, a tlak u posudi ovisi o koliini i vrelištu otapala (Bleki i sur., 2011).
17
Slika 4. Mikrovalni reaktor, Ethos Easy (Milestone, Italija) (fotografija: Vrani, 2020)
Za postizanje veih prinosa ekstrakcije i bolje izolacije eljenog spoja bitno je optimirati
uvjete ekstrakcije poput snage i frekvencije mikrovalova, omjera otapala i vrste tvari,
temperature i vremena odvijanja ekstrakcije (Cikoš i sur, 2018). Rodriguez-Jasso i sur. (2011)
pokazali su da je MAE u reakcijskim uvjetima najvišeg tlaka (8,28 bar) i najkraeg vremena
odvijanja reakcije (1 min) te omjera alge i vode 1g/25 ml, bila uinkovita metoda za ekstrakciju
fukoidana iz smee alge F. vesiculosus s najveim prinosom fukoidana od 18,22 %. Yuan i
Macquarrie (2015a) navode da fukoidan dobiven pomou MAE ima slian sastav i molekulsku
masu kao i fukoidan ekstrahiran konvencionalnim metodama, a antioksidativnim testovima su
pokazali da ima vei redukcijski potencijal, dok Okolie i sur. (2019) navode da visoki prinos
fukoidana dobivenog pomou MAE moe biti zbog neistoa prisutnih u tretiranom uzorku.
Ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima je uinkovita metoda prihvatljiva za okoliš,
a bitno je istaknuti i druge prednosti poput visoke uinkovitosti ekstrakcije, male potrošnje
otapala i smanjene potrošnje energije što ju ini isplativom za korištenje (Cao i sur., 2018).
Takoer, ovom metodom je mogue dobiti vee prinose u kraem vremenu odvijanja
ekstrakcije te metoda ima potencijal za industrijsku primjenu. Najvei nedostaci MAE su
potencijalna degradacija odreenih spojeva uzrokovana temperaturom koja se generira tijekom
procesa ekstrakcije (Flórez-Fernández i sur., 2018) te raspodjela mikrovalova kada dou u
kontakt s nehomogenom smjesom gdje moe doi do lokalnog pregrijavanja. Takoer,
mikrovalovi nee imati dobar uinak na materijale koji zbog svojih dielektrinih svojstava slabo
apsorbiraju energiju (Aguilar-Reynosa i sur., 2017).
18
te se pokazalo da posjeduje veliku biološku aktivnost, ukljuujui antitumorska,
imunomodulirajua, antivirusna, antikoagulativna, protuupalna i antioksidativna svojstva te da
pokazuje pozitivan uinak na razliite bubrene i jetrene poremeaje (Leandro i sur., 2020;
Oliveira i sur., 2020; Alboofetileh i sur., 2019; Barbosa i sur., 2019; Cikoš i sur., 2018; García-
Vaquero i sur., 2016; Wu i sur., 2016; Wijesinghe i Jeon, 2012; Ale i sur., 2011), što ga ini
pogodnim za upotrebu u farmaceutske i biomedicinske svrhe. Isto tako, fukoidan se koristi i u
kozmetikoj industriji zbog svojstva dobrog upijanja i zadravanja vlage (Leandro i sur., 2020),
a novija istraivanja navode kako fukoidan takoer pokazuje potencijal za implementaciju u
medicini za prijenos i kontrolirano otpuštanje lijekova. Zbog svoje biološke aktivnosti, sve više
se koristi u prehrambenoj industriji kao dodatak prehrani i kao funkcionalni sastojak hrane
(Fitton i sur., 2019).
Amerika agencija za hranu i lijekove (FDA) dodijelila je ekstraktima fukoidana iz
smeih algi Undaria pinnatifida i Fucus vesiculosus status „Openito prepoznati kao sigurni“,
odnosno (GRAS) status, a Europska unija je 2017. godine iste ekstrakte odobrila Uredbom (EU)
2017/2470 o utvrivanju Unijina popisa nove hrane u skladu s Uredbom (EU) 2015/2283
Europskog parlamenta i Vijea o novoj hrani, pri emu je propisana najvea dopuštena koliina
za dnevnu konzumaciju od 250 mg (Fitton i sur., 2019). U SAD-u i Velikoj Britaniji, fukoidan
je dostupan u prodaji kao suplement prehrani u obliku napitaka i tableta. U Japanu je
proizvodnja fukoidana visoko zastupljena, a najvaniji izvori su smee morske alge
Cladosiphon okamuranus (Mozuku), Undaria pinnatifida (Mekabu) i Laminaria japonica
(Kombu). Mnoge Japanske tvrtke proizvode fukoidan kao dodatak prehrani u obliku praha,
kapsula i napitaka za poboljšanje imunološkog sustava ili kao protuupalni sastojak koji se
dodaje napitcima i funkcionalnoj hrani (Ale i Meyer, 2013).
Na globalnoj razini, Azija je najvei potroša fukoidana, s Kinom i Japanom na prvom
i drugom mjestu. U 2017. godini u Aziji je potrošeno 6751 kg fukoidana, od kojih se 38,54 %
odnosi samo na Kinu. Nakon Azije slijede Sjedinjene Amerike Drave kao drugi najvei
potroša fukoidana na svijetu, s potrošenih 5248 kg fukoidana u 2017. godini. Profit na
svjetskom trištu fukoidana u 2019. godini iznosio je 30 milijuna amerikih dolara, a u sljedeih
5 godina, oekuje se da e porasti za 3,8 % i dosei 37 milijuna amerikih dolara (Fior Market
Research, 2020).
3.1.1. Smea alga Cystoseira barbata
Za istraivanje su korišteni uzorci smee alge Cystoseira barbata izronjene u prosincu
2018. godine s obalnog podruja Zadra (44°12'42“ N; 15°09'23“ E). Vrstu alge identificirao je
biolog Donat Petricioli. Svjei uzorci alge isprani su u slatkoj i destiliranoj vodi te odmah
zamrznuti na -60 °C u zamrzivau ScanCool SCL210P (Labogene ApS, Danska) te je proveden
proces liofilizacije 24 sata na liofilizatoru CoolSafe, Model: 55-9 PRO, (Labogene, Danska).
Masa od oko 500 g smrznute alge u jednom je sloju rasporeena na 6 plitica nakon ega je
proveden postupak liofilizacije koji je trajao ukupno 24 sata. Primarno sušenje (sublimacija)
provedeno je pri vakuumu 0,130 – 0,155 hPa i temperaturi od -30 do 0 °C/18 sati, a izotermna
desorpcija pri 20 °C/6 sati. Osušena alga samljevena je elektrinim mlincem (CM 3260,
Grundig, Njemaka), a prah je skladišten na -20 °C do provoenja ekstrakcije.
3.1.2. Kemikalije
96 %-tni etalnol (CARLO ERBA Reagents, Italija)
destilirana voda
apsolutni etanol (CARLO ERBA Reagents, Italija)
natrijev karbonat 20 %-tni
PRIPREMA: 200 g anhidrida natrijeva karbonata (Gram-mol doo, Zagreb, Hrvatska)
otopi se u 800 mL vrue destilirane vode u odmjernu tikvicu volumena 1000 mL, a
zatim ohladi na sobnu temperaturu. Doda se nekoliko kristalia natrijeva karbonata i
tikvica se nadopuni destiliranom vodom do oznake. Nakon 24 sata pripremljena otopina
se filtrira.
sumporna kiselina, 95 % (Scharlab S.L., Španjolska)
D (+)-glukoza (Gram-mol doo, Zagreb, Hrvatska)
fenol, 5 %-tna otopina
Aldrich, SAD) otopi se u 100 mL destilirane vode
20
elatina, 3 %-tna otopina
PRIPREMA: 0,3 g elatine (Acros Organics, Belgija) otopi se u 100 mL vode
temperature 70 °C i pohrani preko noi u hladnjak na 4°C.
otopina elatine (3 %)-barijev klorid
PRIPREMA: 2 g barijeva klorida (GmbH, Njemaka) otopi se u prethodno
pripremljenoj otopini elatine i ostavi mirovati 2 – 3 h na 25 °C.
trikloroctena kiselina (TCA)
PRIPREMA: 3 g TCA (Fisher Scientific, UK) otopi se u 100 mL destilirane vode
L-cistein, 3 %-tni
PRIPREMA: 3 g L-cisteina (Sigma-Aldrich, SAD) otopi se u 100 mL destilirane vode
3.1.3. Aparatura
centrifuga, Rotofix 32 (HETTICH, Njemaka)
elektrini mlinac, CM3260 (Grundig, Njemaka)
liofilizator, CoolSafe, Model: 55-9 PRO (Labogene, Danska)
magnetna miješalica, RT 5 (IKA, Njemaka)
mikrovalni reaktor, Ethos Easy (Milestone, Italija)
spektrofotometar, UV-1600PC (VWR International, SAD)
sterilizator, ST-01/02 (Instrumentaria, Hrvatska)
3.1.4. Pribor
filter papir
laboratorijske aše (25 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL)
mikropipete (100 µL, 1000 µL i 5000 µL)
magnetni štapi
21
odmjerne tikvice (50 mL, 100 mL, 250 mL, 1000 mL)
petrijeve zdjelice
plastine lice
staklene epruvete
stakleni lijevak
3.2. METODE
3.2.1. Predtretman
Postupak koji prethodi ekstrakciji polisaharida provodi se na nain da se u
Erlenmeyerovu tikvicu od 500 mL izvae 10 g uzorka alge C. barbata, potom se dodaje 250
mL acetona te magnetni štapi. Tikvica se zatim prekriva parafilmom te stavlja na magnetnu
miješalicu (brzina miješanja – 5). Nakon 18 sati, sadraj tikvice se filtrira te se filtrat prenosi u
odmjernu tikvicu od 250 mL, nadopuni se do oznake acetonom i uva pri 4 °C do provoenja
analiza (odreivanje koncentracije ukupnih fenola i pigmenata). Na talog se ponovo stavlja
magnetni štapi te se dodaje 250 mL etanola koji je prethodno zagrijan na 70 °C. Tikvica se
zatvori vatom te stavi na magnetnu miješalicu uz grijanje na 70 °C. Nakon 4 sata sadraj tikvice
se filtrira, filtrat se prenosi u odmjernu tikvicu od 250 mL, nadopuni do oznake etanolom i uva
u hladnjaku do provoenja analiza. Talog se prebaci u Petrijevu zdjelicu te se suši na zraku 3
dana. Osušeni talog uva se u plastinoj posudi do provoenja postupka ekstrakcije
polisaharida.
3.2.2. Konvencionalna ekstrakcija polisaharida
Za provoenje postupka ekstrakcije polisaharida na analitikoj vagi izvae se 1 g
predtretiranog i osušenog uzorka alge C. barbata u Erlenmeyerovu tikvicu od 100 mL. Zatim
se u tikvicu dodaje 30 mL odgovarajueg ekstrakcijskog otapala (voda ili 0,1 M HCl)
zagrijanog na 80 °C i magnetni štapi. Tikvica se zatvori vatom i postavlja 3 sata na magnetnu
miješalicu uz zagrijavanje na 80 °C (brzina miješanja – 5).
3.2.3. Ekstrakcija polisaharida potpomognuta mikrovalovima (MAE)
Ekstrakcija polisaharida potpomognuta mikrovalovima (MAE) odvija se u
mikrovalnom reaktoru Ethos Easy (Milestone, Italija). Uzorak se priprema tako da se u
ekstrakcijsku eliju odvae 1 g predtretiranog i osušenog uzorka te se dodaju magnetni štapi i
22
30 mL odgovarajueg otapala. elija se zatvara i postavlja na postolje mikrovalnog reaktora na
kojem se zatim postavljaju temperatura i vrijeme ekstrakcije prema planu eksperimenta
prikazanom u tablici 1. Maksimalna snaga ureaja je 1900 W, a primijenjena snaga ovisi o
postavljenoj temperaturi. Vrijeme potrebno za zagrijavanje na eljenu temperaturu postavi se
na 5 min, a vrijeme hlaenja nakon ekstrakcije takoer na 5 min.
Tablica 1. Uvjeti provoenja ekstrakcije polisaharida potpomognute mikrovalovima iz alge
Cystoseira barbata
V1 H2O 10 40
V2 H2O 10 60
V3 H2O 10 80
V4 H2O 15 40
V5 H2O 15 60
V6 H2O 15 80
V7 H2O 20 40
V8 H2O 20 60
V9 H2O 20 80
3.2.4. Postupci nakon ekstrakcije
potpomognuta mikrovalovima, ekstrakt se profiltrira kroz filter papir u Erlenmeyerovu tikvicu
od 100 mL u koju se zatim dodaje 60 mL apsolutnog etanola. Sadraj tikvice se promiješa,
zatvori parafilmom te stavlja u hladnjak na 4 °C preko noi kako bi se istaloili polisaharidi.
Idueg dana, sadraj tikvice se prebacuje u plastine kivete i centrifugira 20 minuta na 5000
okretaja/min. Nakon filtracije, filtrat se prebacuje u odmjernu tikvice od 100 mL, nadopuni do
oznake ekstrakcijskim otapalom i uva u hladnjaku na 4 °C do provoenja analize (odreivanje
koncentracije ukupnih ugljikohidrata). Talog se metalnom špatulom prenosi na prethodno
23
izvagane i oznaene Petrijeve zdjelice te se suši do konstantne mase nakon ega se tukom
dodatno usitnjava. Prenosi se u plastine kivete od 15 mL i uva u hladnjaku do provoenja
analiza (odreivanje koncentracije fukoze i sulfatnih grupa). Iz dobivenih masa rauna se prinos
polisaharida (% PS) prema formuli [1] (Rodriguez-Jasso i sur., 2011):
% PS =
M0 – masa alge (g) korištena za eksperiment
3.2.5. Odreivanje koncentracije ukupnih ugljikohidrata
Princip metode:
Za odreivanje koncentracije ukupnih ugljikohidrata korištena je fenol-sumporna
metoda (Dubois i sur., 1956). Metoda se temelji na reakciji ugljikohidrata poput jednostavnih
šeera, oligosaharida, polisaharida i njihovih derivata u prisutnosti jake kiseline i topline, pri
emu se stvaraju derivati furana koji se kondenziraju s fenolom te nastaju stabilni uto-zlatni
spojevi. Takvi spojevi se mjere spektrofotometrijski na valnoj duljini od 490 nm (Nielsen,
2010).
Postupak rada:
U staklenu epruvetu otpipetira se 400 μL uzorka i 400 μL 5 %-tne otopine fenola. Zatim
se dodaje 2 mL koncentrirane H2SO4 pri emu je potrebno paziti da se kiselina dodaje u jednom
mlazu direktno u epruvetu, bez diranja stjenki. Na isti nain se priprema i slijepa proba, ali se
umjesto uzorka uzima voda ili 0,1 M HCl, ovisno o tome koje otapalo je korišteno pri
ekstrakciji. Svako mjerenje provodi se u paraleli. Sadraj epruveta se promiješa na vortexu te
se epruveta stavlja 20 minuta u vodenu kupelj na 25 °C. Nakon termostatiranja u vodenoj
kupelji, mjeri se apsorbancija pri 490 nm na spektrofotometru (UV-1600PC, VWR
International, SAD) (Li i sur., 2012).
Izrada badarnog pravca i izraun rezultata:
Za pripremu badarnog pravca odvae se 10 mg glukoze koja se otopi u 100 mL vode u
odmjernoj tikvici od 100 mL Iz tako pripremljene otopine glukoze (100 mg L-1) rade se
24
razrjeenja koncentracija 20, 40, 60 i 80 mg L-1. Od svakog razrjeenja otpipetira se 400 μL i
postupa po propisu za odreivanje ukupnih ugljikohidrata. Iz izmjerenih vrijednost
apsorbancija nacrta se badarni pravac ija jednadba [2] glasi:
y = 0,0092x + 0,0149 [2]
x – koncentracija otopine glukoze (mg L-1)
3.2.6. Odreivanje koncentracije fukoze
razvili Dische i Shettles (1948). Ekstraktu polisaharida dodaje se razrijeena sumporna kiselina,
a nakon zagrijavanja na 100 °C nastaje obojeni produkt te se potom dodaje L-cistein koji se
vee s kromoforom. Nastali obojeni produkt ima maksimum apsorpcije na 396 nm te gotovo ne
apsorbira na 427 nm. Drugi šeeri takoer stvaraju obojeni produkt s L-cisteinom i imaju
maksimum apsorpcije na 396 nm, ali i na 427 nm. Zbog toga je razlika u apsorpciji na te dvije
valne duljine apsorpcija same fukoze.
Postupak rada:
U staklenu epruvetu se odvae 5 mg uzorka polisaharida, doda 5 mL destilirane vode te
se uzorak dobro promiješa na vortex miješalici. Nakon toga se u novu staklenu epruvetu
otpipetira 1 mL tako pripremljenog uzorka te se u epruvetu, koja je uronjena u ledenu kupelj,
zatim dodaje 4,5 mL razrijeene sumporne kiseline (1:6, H2O:H2SO4). Uzorak se potom stavlja
u vodenu kupelj (Rotavapor R-205, Büchi, Švicarska) 10 minuta na 100 °C, a zatim se u ledenoj
kupelji hladi na sobnu temperaturu. Nakon hlaenja dodaje se 0,1 mL otopine 3 %-tnog L-
cisteina, ostavlja se 30 minuta na sobnoj temperaturi te se mjeri apsorbancija pri 396 i 427 nm
(Baba i sur., 2018) na spektrofotometru (UV-1600PC, VWR International, SAD). Slijepa proba
priprema se na isti nain, ali se ne dodaje L-cistein. Sva mjerenja se provode u paraleli.
Izrada badarnog pravca i izraun rezultata:
25
Za pripremu badarnog pravca odvae se 5 mg standarda fukoidana koji se otopi u 5 mL
destilirane vode. Iz tako pripremljene otopine fukoidana rade se razrjeenja u rasponu od 0,05
do 0,2 mg mL-1. Od svakog razrjeenja otpipetira se po 1 mL i postupa po propisu za
odreivanje koncentracije fukoze. Iz izmjerenih vrijednost apsorbancija nacrta se badarni
pravac ija jednadba [3] glasi:
y = 3,5584x – 0,0769 [3]
x – koncentracija otopine fukoidana (mg L-1)
3.2.7. Odreivanje koncentracije sulfatnih grupa
Princip metode:
koja se temelji na taloenju sulfatnih grupa dodatkom BaCl2-elatine, standardne otopine
K2SO4 te trikloroctene kiseline u otopinu polisaharida. Osloboeni BaSO4 mjeri se
spektrofotometrijski pri valnoj duljini od 360 nm (Dodgson, 1961).
Postupak rada:
U staklenu epruvetu s navojem odvae se 8 mg uzorka polisaharida te se dodaje 3 mL 1
M HCl. Epruveta se zatvori epom, promiješa na vortexu i stavlja u ultrazvunu kupelj na 3
minute. Nakon toga, uzorak se stavlja u penicu ST-01/02 (Instrumentaria, Hrvatska) na 5 sati
pri 105 C. Nakon hidrolize, 0,2 mL uzorka se pomiješa s 3,8 mL trikloroctene kiseline i 1 mL
otopine BaCl2-elatine. Nakon 15 minuta termostatiranja na sobnoj temperaturi, na
spektrofotometru (UV-1600PC, VWR International, SAD) se mjeri apsorbancija pri 360 nm
(Song i sur., 2018). Na isti nain se priprema i slijepa proba, samo što se umjesto standardne
otopine K2SO4 dodaje destilirana voda. Sva mjerenja su napravljena u paraleli.
Izrada badarnog pravca i izraun rezultata:
Za izradu badarnog pravca potrebno je pripremiti otopinu standarda K2SO4 na nain da
se prah K2SO4 osuši pri 105 °C i zatim se izvae tono 181,4 mg te se otopi u 100 mL 1 mol L-
1 HCl. Iz tako pripremljene otopine K2SO4, koja sadri 1 g L-1 sulfatnih grupa, radi se niz od 5
26
razrjeenja. Od svakog razrjeenja otpipetira se 200 μL i postupa po propisu za odreivanje
koncentracije sulfatnih grupa. Dobivene vrijednosti apsorbancije slue za izradu badarnog
pravca s jednadbom [4]:
y = 0,265x – 0,0161 [4]
Princip metode:
koja se temelji na oksidaciji fenolnih skupina dodatkom Folin-Ciocalteu reagensa i nastajanjem
obojenog produkta. Folin-Ciocalteau reagens, odnosno smjesa fosfovolframove i
fosfomolibden kiseline, reagira s fenoksid ionom iz uzorka pri emu se fenoksid-ion oksidira,
a Folin-Ciocalteau reagens reducira do plavo obojenih volframovih i molibdenovih oksida.
Izmjereni intenzitet nastalog obojenja pri valnoj duljini 765 nm je direktno proporcionalan
koncentraciji fenola (Shortle i sur., 2014).
Postupak rada:
U staklenu epruvetu se otpipetira 100 μL razrijeenog ekstrakta, 200 μL Folin Ciocalteu
reagensa i 2 mL destilirane vode. Nakon 3 minute doda se 1 mL 20 %-tne zasiene otopine
natrijeva karbonata i promiješa pomou vortexa. Uzorak se termostatira u vodenoj kupelji 25
min na 50 C, a zatim se na spektofotometru (UV-1600PC, VWR International, SAD) mjeri
apsorbancija pri 765 nm. Slijepa proba se priprema na isti nain, ali se umjesto uzorka dodaje
destilirana voda. Sva mjerenja su provedena u paraleli.
Izrada badarnog pravca i izraun rezultata:
Za pripremu badarnog pravca odvae se 0,5 g galne kiseline koja se otopi u 10 mL 96
%-tnog etanola u odmjernoj tikvici od 100 mL i nadopuni destiliranom vodom do oznake. Iz
tako pripremljene otopine galne kiseline rade se razrjeenja koncentracija 50, 100, 150, 250 i
27
500 mg L-1. Od svakog razrjeenja otpipetira se 100 μL i postupa po propisu za odreivanje
ukupnih fenola. Iz izmjerenih vrijednost apsorbancija nacrta se badarni pravac ija jednadba
[5] glasi:
x – koncentracija galne kiseline (mg L-1)
Dobivene masene koncentracije (mg L-1) preraunate su i izraene kao mg ekvivalenta
galne kiseline na gram suhe tvari praha (mg GAE/g s.tv.).
3.2.9. Odreivanje klorofila a, klorofila b i karotenoida UV/Vis spektrofotometrijom
Princip metode:
na jakim apsorpcijskim spektrima tih pigmenata. Apsorpcijski maksimumi ekstrahiranih
pigmenata uvelike ovise o vrsti otapala te u odreenoj mjeri o tipu spektrofotometra koji se
koristi (Lichtenthaler i Buschmann, 2005).
Postupak odreivanja:
Kvantitativno odreivanje provodi se spektrofotometrom UV-1600PC (VWR
International, SAD) pri valnim duljinama od: 644,8 nm, 661,6 nm, 664 nm i 649 nm za klorofil
a i klorofil b te 470 nm za karotenoide. Svako mjerenje provodi se u paraleli, a kao slijepa proba
koriste se otapala korištena za ekstrakciju, tj. aceton i etanol. Udjeli klorofila a i b te karotenoida
raunaju se prema sljedeim jednadbama (Lichtenthaler i Buschmann, 2005):
Aceton:
Etanol:
28
C(x+c) (µg mL-1) = (1000 A470 – 2.13Ca – 97.63 Cb)/209 [11]
gdje je:
A = apsorbancija
3.2.10. Statistika obrada rezultata
Statistika obrada podataka provedena je pomou programa Statistica 8 (StatSoft Inc.,
Tulsa, OK, SAD). Zavisne varijable bile su: % PS, koncentracija ukupnih ugljikohidrata (mg g-
1), koncentracija sulfatnih grupa (%) i koncentracija fukoze (%) dok su neovisne varijable bile:
(a) otapalo (voda i 0,1 M HCl), (b) vrijeme (10, 15 i 20 min), (c) temperatura (40, 60 i 80 °C).
Kontinuirane varijable analizirane su uz pomo multivarijantne analize varijance
(multifaktorska ANOVA), a višestruko usporeivanje provedeno je Tukey LSD testom
višestrukog usporeivanja. Razina znaajnosti za sve testove je bila α ≤ 0,01.
29
U ovom istraivanju provedena je konvencionalna ekstrakcija polisaharida iz smee
alge Cystoseira barbata gdje je kao otapalo korišteno 30 mL destilirane vode i 0,1 M HCl, pri
temperaturi od 80 °C i vremenu trajanja od 3 sata te mikrovalovima potpomognuta ekstrakcija
(MAE) gdje je kao otapalo korišteno 30 mL destilirane vode i 0,1 M HCl pri razliitim
temperaturama (40, 60 i 80°C) i vremenu ekstrakcije (10, 15 i 20 min). Napravljena je
usporedba konvencionalne ekstrakcije i MAE te je istraen utjecaj uvjeta ekstrakcije i njihovih
kombinacija na prinos polisaharida, koncentraciju ukupnih ugljikohidrata, udio sulfatnih grupa
i udio fukoze. Dobiveni rezultati prikazani su u tablici 2.
Tablica 2. Rezultati mjerenja prinosa polisaharida (%), koncentracije ukupnih ugljikohidrata
(mg g-1), udjela sulfatnih grupa (%) i udjela fukoze (%) iz ekstrakata polisaharida dobivenih
ekstrakcijom potpomognutom mikrovalovima (V1 – V9 i C1 – C9) te konvencionalnom
ekstrakcijom (KV i KC)
grupe (%) Fukoza (%)
V1 H2O 40 10 3,53 ± 0,00 1,46 ± 0,06 70,31 ± 1,58 5,90 ± 0,04
V2 H2O 60 10 4,37 ± 0,00 1,83 ± 0,02 55,20 ± 1,60 5,63 ± 0,02
V3 H2O 80 10 5,39 ± 0,00 1,94 ± 0,02 52,84 ± 1,58 6,95 ± 0,06
V4 H2O 40 15 3,81 ± 0,00 1,27 ± 0,01 65,89 ± 6,10 5,60 ± 0,06
V5 H2O 60 15 4,78 ± 0,00 1,74 ± 0,02 60,11 ± 0,79 5,18 ± 0,12
V6 H2O 80 15 2,85 ± 0,00 1,64 ± 0,04 26,26 ± 2,10 9,10 ± 0,08
V7 H2O 40 20 0,75 ± 0,00 2,28 ± 0,01 25,20 ± 0,21 7,71 ± 0,22
V8 H2O 60 20 2,12 ± 0,00 1,67 ± 0,01 37,13 ± 1,62 12,11 ± 0,52
V9 H2O 80 20 2,80 ± 0,00 1,18 ± 0,03 25,59 ± 0,30 10,48 ± 0,64
C1 0,1 M HCl 40 10 4,22 ± 0,00 1,40 ± 0,07 92,00 ± 2,20 7,46 ± 0,06
C2 0,1 M HCl 60 10 5,13 ± 0,00 2,50 ± 0,06 75,79 ± 0,70 22,40 ± 1,05
C3 0,1 M HCl 80 10 7,54 ± 0,00 5,87 ± 0,03 35,77 ± 0,20 42,01 ± 0,74
C4 0,1 M HCl 40 15 4,43 ± 0,00 1,70 ± 0,06 74,94 ± 2,90 7,98 ± 0,12
C5 0,1 M HCl 60 15 5,35 ± 0,00 2,42 ± 0,12 62,56 ± 3,06 20,32 ± 0,79
C6 0,1 M HCl 80 15 3,40 ± 0,00 2,14 ± 0,04 36,45 ± 0,70 30,85 ± 2,34
C7 0,1 M HCl 40 20 2,36 ± 0,00 1,64 ± 0,08 68,86 ± 5,10 15,59 ± 1,56
C8 0,1 M HCl 60 20 2,81 ± 0,00 1,39 ± 0,01 54,78 ± 0,20 17,69 ± 1,29
C9 0,1 M HCl 80 20 4,28 ± 0,00 4,64 ± 0,10 39,29 ± 2,17 61,74 ± 3,62
KV H2O 80 180 6,65 ± 0,00 1,58 ± 0,01 45,30 ± 0,98 8,79 ± 0,68
KC 0,1 M HCl 80 180 9,53 ± 0,00 4,88 ± 0,21 37,72 ± 1,26 20,04 ± 0,14
30
kombinacije navedenih parametara na prinos polisaharida (%), koncentraciju ukupnih
ugljikohidrata (mg g-1), udio sulfatnih grupa (%) i udio fukoze (%)
N %
Polisaharida
Ukupni
ugljikohidrati
H2O 18 3,38 0,01a 1,67 0,01a 46,51 0,57a 7,63 0,28a
0,1 M HCl 18 4,39 0,01b 2,63 0,01b 60,05 0,57b 25,11 0,28b
Temperatura (°C) p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01†
40 12 3,18 0,01a 1,63 0,02a 66,20 0,70c 15,06 0,35b
60 12 4,09 0,01b 1,92 0,02b 57,60 0,70b 13,17 0,35a
80 12 4,38 0,01c 2,90 0,02c 36,04 0,70a 20,89 0,35c
Vrijeme (min) p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01†
10 12 5,03 0,01c 2,50 0,02c 63,65 0,70c 8,37 0,35a
15 12 4,10 0,01b 1,82 0,02a 54,37 0,70b 13,89 0,35b
20 12 2,52 0,01a 2,13 0,02b 41,81 0,70a 26,86 0,35c
Otapalo; temperatura (°C) p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01†
H2O; 40 6 2,70 0,01a 1,67 0,02a,b 53,80 1,00b 6,40 0,49a
H2O; 60 6 3,76 0,01c 1,74 0,02b 50,81 1,00b 7,64 0,49a,b
H2O; 80 6 3,68 0,01b 1,59 0,02a 34,90 1,00a 8,84 0,49b,c
0,1 M HCl; 40 6 3,67 0,01b 1,58 0,02a 78,60 1,00d 10,34 0,49c
0,1 M HCl; 60 6 4,43 0,01d 2,10 0,02c 64,38 1,00c 20,13 0,49d
0,1 M HCl; 80 6 5,07 0,01e 4,22 0,02d 37,17 1,00a 44,87 0,49e
Otapalo; vrijeme (min) p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01†
H2O; 10 6 4,43 0,01d 1,74 0,02b 59,45 1,00d 6,16 0,49a
H2O; 15 6 3,81 0,01c 1,55 0,02a 50,75 1,00c 6,63 0,49a
H2O; 20 6 1,89 0,01a 1,71 0,02b 29,31 1,00a 10,10 0,49b
0,1 M HCl; 10 6 5,63 0,01e 3,25 0,02e 67,85 1,00e 23,96 0,49d
0,1 M HCl; 15 6 4,39 0,01d 2,09 0,02c 57,98 1,00c,d 19,72 0,49c
0,1 M HCl; 20 6 3,15 0,01b 2,56 0,02d 54,31 1,00b,c 31,67 0,49e
Vrijeme (min); temperatura (°C) p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01† p ≤ 0.01†
10; 40 4 3,87 0,01e 1,43 0,03a 81,15 1,22e 6,68 0,60a
10; 60 4 4,75 0,01g 2,16 0,03d 65,50 1,22c,d 14,01 0,60b,c
10; 80 4 6,47 0,01i 3,91 0,03f 44,31 1,22b 24,48 0,60e
15; 40 4 4,12 0,01f 1,49 0,03a 70,42 1,22d 6,79 0,60a
15; 60 4 5,07 0,01h 2,08 0,03c,d 61,33 1,22c 12,75 0,60b,c
15; 80 4 3,13 0,01c 1,90 0,03b 31,36 1,22a 19,98 0,60d
20; 40 4 1,56 0,01a 1,96 0,03b,c 47,03 1,22b 11,65 0,60b
20; 60 4 2,47 0,01b 1,53 0,03a 45,95 1,22b 14,90 0,60c
20; 80 4 3,54 0,01d 2,91 0,03e 32,44 1,22a 36,11 0,60f
Prosjena vrijednost 36 3,88 2,15 53,28 16,37
Bilješka. Vrijednosti s razliitim slovom su statistiki znaajne kod p ≤ 0,01.
*Rezultati su izraeni kao srednje vrijednosti ± standardna pogreška.
† Statistiki znaajni parametar kod p ≤ 0,01.
31
Statistikom obradom podataka istraen je utjecaj otapala, temperature i vremena te
njihov kombinirani utjecaj na prinos polisaharida (%), koncentraciju ukupnih ugljikohidrata
(mg g-1), udio sulfatnih grupa (%) i udio fukoze (%), a rezultati su prikazani u tablici 3.
Dobiveni rezultati ukazuju na to da su svi parametri pojedinano i kombinirano statistiki
znaajni (p ≤ 0,01).
Ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima je metoda koja se uspješno koristi u
ekstrakciji razliitih biološki aktivnih spojeva, ali je do sad rijetko korištena za ekstrakciju
polisaharida iz smeih algi, ime je ogranien broj dostupnih istraivanja. Prema tablici 3,
dobivena prosjena vrijednost prinosa polisaharida iznosi 3,88 % što odgovara istraivanju koje
su proveli Okolie i sur. (2019) usporeujui MAE s drugim nekonvencionalnim tehnikama
ekstrakcije polisaharida iz smee alge Ascophyllum nodosum gdje su dobili prosjenu
vrijednost prinosa od 5,71 %. Prouavajui utjecaj nekonvencionalnih metoda ekstrakcije
polisaharida na antibakterijsku i antivirusnu aktivnost polisaharida izoliranog iz smee alge
Nizamuddinia zanardinii, Alboofetileh i sur. (2019) su primjenom MAE dobili malo veu
prosjenu vrijednost prinosa polisaharida koja iznosi 6,17 %. U usporedbi s navedenim
istraivanjima, gdje prosjene vrijednosti prinosa polisaharida odgovaraju vrijednosti ovog
istraivanja, Rodriguez-Jasso i sur. (2011) koristei MAE za izolaciju fukoidana iz smee alge
Fucus vesiculosus dobili su znaajno veu prosjenu vrijednost prinosa koja iznosi 10,30 %, a
Yuan i Macquarrie (2015a), izolirajui polisaharide iz smee alge A. nodosum dobili su
vrijednost od 11,97 %. Prinos polisaharida dobiven konvencionalnom ekstrakcijom prikazan u
tablici 2 (6,65 % i 9,53 %) vei je od prinosa koji su za algu C. barbata dobili Sellimi i sur.
(2014) koji iznosi 5,45 % te je vei od prinosa koji su za vrste roda Cystoseira dobili Hadj
Ammar i sur. (2015) koji iznosi oko 3 %. Razlog razliitih vrijednosti prinosa polisaharida
moe biti zbog toga što alge mogu imati razliit sastav ovisno o vrsti alge, godišnjem dobu i
geografskom podruju rasta (Hentati i sur., 2020). Takoer bitni parametri koji utjeu na prinos
polisaharida i razliiti kemijski sastav alge su vrijeme izrona i metoda kojom se provodi
ekstrakcija (Hadj Ammar i sur., 2015).
Prema tablici 3, prosjena vrijednost koncentracije ukupnih ugljikohidrata iznosi 2,15
mg g-1 što je znaajno manje nego što je dobiveno u drugim istraivanjima gdje je za ekstrakciju
polisaharida korištena MAE. Yuan i Macquarrie (2015b) su za smeu algu A. nodosum dobili
prosjenu vrijednost ukupnih ugljikohidrata od 10,87 %, a Alboofetileh i sur. (2019) su u svom
istraivanju za smeu algu N. zanardinii dobili prosjenu vrijednost ukupnih ugljikohidrata od
51,27 %. Osim vrste i geografskog podruja rasta, veliki uinak na udio ugljikohidrata u algi
32
ima starost alge i godišnje doba u kojem se odvija izron. Odabir neodgovarajueg godišnjeg
doba za izron alge moe biti razlog velikom odstupanju rezultata prosjene vrijednosti
ugljikohidrata dobivenih u navedenim istraivanjima. Alge u proljee kreu stvarati rezerve
ugljikohidrata kako bi preivjele zimu u kojoj skoro pa i nemaju mogunost fotosinteze. Zbog
toga je poeljno obaviti izron algi poetkom zime jer e tada one sadravati veu koliinu
polisaharida (Rodriguez-Jasso i sur., 2011). Prosjena vrijednost udjela sulfatnih grupa u ovom
istraivanju iznosi 53,28 % što je znatno viša vrijednost u usporedbi s rezultatima Rodriguez-
Jasso i sur. (2011) koji su dobili 24,34 %, Alboofetileh i sur. (2019) koji su dobili 24,09 % te
Okolie i sur. (2019) s prosjenom vrijednosti udjela sulfatnih grupa od 18,8 %. Prema tablici 3,
dobivena prosjena vrijednost udjela fukoze od 16,37 % je manja od prosjene vrijednosti koju
su dobili Yuan i Macquarrie (2015b) (41,25 %), Okolie i sur. (2019) (37,0 %) te Alboofetileh i
sur. (2019) (36,29 %).
POTPOMOGNUTE MIKROVALOVIMA
Fukoidan i drugi sulfatirani polisaharidi koji se nalaze u staninim stijenkama algi
naješe se ekstrahiraju konvencionalnim metodama koje ukljuuju korištenje vrue vode,
razrijeenih kiselina ili luina uz dugo vrijeme ekstrakcije i upotrebu velikih volumena otapala
(Rodriguez-Jasso i sur., 2011). Openito, konvencionalna ekstrakcija polisaharida pokazuje
nedostatke poput visoke temperature ekstrakcije, dugog vremena ekstrakcije i velike potrošnje
otapala i energije (Ren i sur., 2017). Konvencionalne metode ekstrakcije su se pri odreenim
uvjetima pokazale uspješne u izolaciji polisaharida s izraenom biološkom aktivnosti kao što
je citotoksino djelovanje na P388 stanice mišje leukemije (Liu i sur., 2016), inhibitorna
aktivnost za herpes virus HSV-2 (Alboofetileh i sur., 2019), antitumorsko djelovanje na ljudske
stanice raka debelog crijeva HCT 116 (Foley i sur., 2011) te znaajno poboljšanje stope rasta
probiotike bakterije L. delbruecki ssp bulgaricus (Okolie i sur., 2019).
Ekstrakcija potpomognuta mikrovalovima (MAE) je nova, nekonvencionalna tehnika
ekstrakcije koja je razvijena tijekom proteklog desetljea te je privukla znaajnu pozornost zbog
svog mehanizma zagrijavanja, umjerenih troškova i dobrih performansi gdje se postiu slini
ili bolji prinosi u usporedbi s konvencionalnim metodama ekstrakcije, koristei manje energije
i volumena otapala uz krae vrijeme ekstrakcije (Mussatto, 2015). Takoer se pokazala kao
jedna od najuinkovitijih i ekološki najprihvatljivijih metoda ekstrakcije razliitih prirodnih i
biološki aktivnih spojeva te bi mogla prevladati nedostatke tradicionalnih metoda ekstrakcije.
33
Potrebno je provesti još istraivanja i dodatno optimirati metodu zbog moguih nedostataka
poput narušavanja kemijske strukture i bioaktivnosti fukoidana ili drugih ciljanih spojeva (Ren
i sur., 2017) te mogue degradacije spojeva osjetljivih na toplinu (Garcia-Vaquero i sur., 2016).
Za sada se MAE pokazala kao obeavajua metoda za izolaciju biološki aktivnih spojeva iz
morskih algi, što su pokazali i Alboofetileh i sur. (2019) ekstrakcijom polisaharida iz alge N.
zanardiinii, pri emu ekstrakt polisaharida izoliran pomou MAE pokazuje snanu antivirusnu
aktivnost protiv virusa herpesa HSV-2 te inhibitorno djelovanje na E. coli. Okolie i sur. (2019)
su usporedbom razliitih metoda ekstrakcije uz pomo MAE izolirali polisaharide (fukoidan)
iz alge A. nodosum koji je pri koncentraciji od 0,5 % poboljšao stopu rasta probiotike bakterije
L. delbruecki ssp. bulgaricus za 24,5 %, što je znatno više od ekstrakata fukoidana dobivenih
drugim metodama ekstrakcije. Takoer, Yuan i Macquarrie (2015a) su utvrdili da polisaharidi
iz alge A. nodosum izolirani pomou MAE, pokazuju antioksidacijska svojstva te da bi mogli
sluiti kao prirodni izvor antioksidansa.
U ovom istraivanju, dobivena prosjena vrijednost prinosa polisaharida
konvencionalnom ekstrakcijom iznosi 8,09 %, a MAE 3,88 %. Iz navedenih rezultata je vidljivo
da je dvostruko vei prinos polisaharida dobiven upotrebom konvencionalne ekstrakcije u
odnosu na MAE, što je i u skladu s istraivanjem Okolie i sur. (2019) gdje je prinos polisaharida
iz alge A. nososum izoliranog konvencionalnom ekstrakcijom iznosio 11,9 %, a prinos
polisaharida upotrebom MAE iznosio je 5,71 %. Yuan i Macquarrie (2015a) su za istu algu
takoer dobili vei prinos polisaharida konvencionalnom ekstrakcijom (20,08 %), nego
primjenom MAE (11,97 %). Razlog smanjenog prinosa djelovanjem MAE bi mogla biti velika
razlika izmeu vremena trajanja konvencionalne ekstrakcije (3 h) i MAE (10 – 20 min) te je
potrebno provesti daljnja istraivanja u kojima bi vrijeme trajanja MAE bilo due od vremena
postavljenih u ovom istraivanju.
Prosjena vrijednost koncentracije ukupnih ugljikohidrata u ovom istraivanju je nešto
vea pri korištenju konvencionalne ekstrakcije (3,21 mg g-1) nego MAE (2,15 mg g-1), što
odgovara istraivanju Alboofetileh i sur. (2019) gdje je za algu N. zanardiinii konvencionalnom
ekstrakcijom dobiveno 58,13 %, dok je korištenjem MAE dobiveno 51,27 % ukupnih
ugljikohidrata. Takoer, u istom istraivanju, dobivena prosjena vrijednost udjela sulfatnih
grupa vea je kod ekstrakata dobivenih MAE (24,09 %) u odnosu na konvencionalnu
ekstrakciju (18,44 %), što odgovara ovom istraivanju gdje je konvencionalnom ekstrakcijom
dobiveno 41,51 % sulfatnih grupa, a djelovanjem MAE 53,28 %. S druge strane, Okolie i sur.
(2019) te Yuan i Macquarrie (2015a) dobili su vei udio sulfatnih grupa upotrebom
34