Online-Derivatisierung von Fettsäuren

Dr. Klaus Schrickel Thermo Fisher Scientific Dreieich, Germany

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Anwendungsbeispiele Fettsäureanalytik

• Lebensmittel-Überwachung

• Nahrungsergänzungsmittel

• Medizinische Diagnostik

• Kosmetische Produkte

• Biokraftstoffe Bilderquelle: Google

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SFA, MUFA, PUFA... • Gesättigte Fettsäuren (SFA, Saturated Fatty Acids)

• Kohlenstoffketten ohne Doppelbindung • Gesättigte Fettsäuren kommen meist in tierischen Lebensmitteln vor (wie Fleisch, Butter, Käse). • Sie können vom Körper selbst gebildet werden. Sie müssen daher nicht in großen Mengen mit

der Nahrung aufgenommen werden. • Eine zu hohe Aufnahme an SFA erhöht den LDL-Cholesterinwert ("schlechtes" Cholesterin) und

den Gesamtcholesterinspiegel. • Einfach ungesättigte Fettsäuren (MUFA, Mono Unsaturated Fatty Acids)

• Kohlenstoffketten mit einer Doppelbindung • Einfach ungesättigte Fettsäuren können vom Körper selbst gebildet werden. • Sie sind vor allem in Pflanzenölen (wie Oliven- und Rapsöl) enthalten. • Sie verbessern die Balance der Blutcholesterinwerte: Das "gute" HDL-Cholesterin bleibt gleich

oder steigt. Das "schlechte" LDL-Cholesterin wird gesenkt. • Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA, Poly Unsaturated Fatty Acids) – lebensnotwenig

• Kohlenstoffketten mit mehreren Doppelbindungen • Mehrfach ungesättigte Fettsäuren können vom Körper nicht gebildet werden. Die Zufuhr mit der

Nahrung ist lebensnotwenig (essentiell). • Sie kommen vor allem in Meeresfischen aus kalten Gewässern (Lachs, Makrele, Thunfisch), in

Nüssen und manchen Pflanzenölen vor (Maiskeim-, Sonnenblumen-, Distelöl). • Eine hohe Aufnahme an PUFA senkt den "schlechten" LDL-Cholesterinwert und den

Gesamtcholesterinspiegel.

https://www.wien.gv.at/lebensmittel/lebensmittel/inhaltsstoffe/fett/qualitaet.html

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ISO 5508

https://law.resource.org/pub/et/ibr/et.iso.5508.1990.pdf

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Analyse als Fettsäuremethylester (FAME) mittels GC

• Säule: Thermo Scientific™ TRACE™ TR-FAME GC Säule 60m x 0,25mm x 0,25µm, PN: 260M154P

• Vorsäule: Guard Gold, 2m x 0.25mm + SilTite SS union • Detektor: FID, 280°C • Injektor: SSL, 280°C, 4mm Splitlos-Liner + Glaswolle

• Trägergas: He, 1.5 mL/min constant flow, Split 10 mL/min

• Ofenprogramm: 80°C – 4min – 15°C/min – 170°C – 0min – 3°C/min – 240°C – 1min

• Injektionsvol.:1 µL, Standard in Hexan (Cold Needle)

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Probe: 37 FAME-Mix (Supelco®)

0.3 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 26.0 28.0 30.0 31.7-1.70.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.072.4

1 -

4.0

9C

4:0

C6

:0

C8

:0

C1

0:0

C1

1:0

C1

2:0

C1

3:0

C1

4:0

C1

4:1

C1

5:0

C1

5:1

C1

6:0

C1

6:1

C1

7:0

C1

7:1

C1

8:0

C1

8:1

n9

tC

18

:1n

9c

C1

8:2

n6

tC

18

:2n

6c

C1

8:3

n6

C1

8:3

n3

C2

0:0

C2

0:1

n9

cC

21

:0C

20

:2C

20

:3n

6C

20

:4n

6C

20

:3n

3C

22

:0C

22

:1n

9C

20

:5n

3C

23

:0C

22

:2

C2

4:0

C2

4:1

C2

2:6

n3

min

pAFAME2 #9 FAME Mix 1:50 FID

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Methoden zur Derivatisierung

• Alkalische Umesterung in Na-Methylat

• Alkalische Verseifung mit NaOH und anschließende Methylierung mit BF3/Methanol

• TMSH-Verfahren: Hydrolyse und Methylierung im GC-Injektor oder in GC-Vial

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Reaktionen

Quelle: Wikipedia

1. Verseifung

2: Veresterung

BF3

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Probenvorbereitung nach Bedarf

• Als Instrumentenmethoden stehen zwei Basismethoden bereit, die in den Einzelparametern beliebig einstellbar sind

• Methode 1 mit alkalischer Verseifung von Glyceriden und anschließender Methylierung der freien Fettsäuren

• Methode 2 mit Methylierung freier Fettsäuren ohne vorgeschalteten Verseifungsschritt

• Jeweils mit der Option, die Probe direkt nach der Derivatisierung in den GC zu injizieren. Hierfür kann in der optionalen ATC-Station eine Injektionsspritze vorgehalten werden.

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Ablauf

1. Aufheizen der Probe im Agitator 2. Zugabe von KOH/MeOH in Tray 1 3. Intensivschütteln im Vortexer 4. Inkubation und Verseifung im Agitator 5. Entnahme eines Aliquots von Tray 1 und Dosierung in Tray2 6. Zugabe von BF3/MeOH zur Methylierung 7. Intensivschütteln im Vortexer 8. Inkubation und Methylierung im Agitator 9. Zugabe von Heptan in Tray 2 für Extraktion FAME aus Wasser in Heptan 10.Zugabe von NaCl-Lösung in Tray 2, Hilfsreagenz zur besseren Extraktion 11. Intensivschütteln im Vortexer 12.Abwarten in Tray 2 bis Phasentrennung erreicht ist 13.Entnahme der überstehenden Heptanphase von Tray 2 und Dosierung in Tray 3

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Samplerkonfiguration Übersicht

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Traykonfiguration am Probenhalter, Park Station, Inkubationsofen (Agitator) und Vortexer

Traykonfiguration am Probenhalter

13

Konfiguration der Lösungsmittel- und Waschstationen

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Custom Methode am TriPlus RSH

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Stand – alone Derivatisierungs-Roboter

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Vollautomatische Analysenstation

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Biodiesel

0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50 8.75 10.0011.2512.5013.7515.0016.2517.5018.7520.0021.2522.5023.7525.0026.2527.5028.7530.00-200-1000

100200300400500600700800900

1,0001,1001,2001,3001,4001,5001,600

C4:0 C6:0 C8:0C10

:0C12

:0C14

:0C14

:1C15

:0

C1 6 : 0

C1 6 : 1

C1 7 : 0

C1 7 : 1

C1 8 : 0

C1 8 : 1

c + t

C1 8 : 2

c + t

C1 8 : 3

n 3

C2 0 : 0

C2 0 : 1

C2 0 : 2

C2 2 : 0

C2 2 : 1

C2 2 : 2

C2 3 : 0

C2 4 : 0

C2 4 : 1

min

mV 11 - C1 6 : 012 - C1 6 : 1 13 - C1 7 : 0 14 - C1 7 : 1 15 - C1 8 : 0 16 - C1 8 : 1 c + t 17 - C1 8 : 2 c + t 18 - C1 8 : 3 n 319 - C2 0 : 0 20 - C2 0 : 1 21 - C2 0 : 2 22 - C2 2 : 0 23 - C2 2 : 1 24 - C2 2 : 225 - C2 3 : 0 26 - C2 4 : 0 27 - C2 4 : 1 1 - C4:02 - C6:03 - C8:04 - C10:05 - C12:06 - C13:07 - C14:08 - C14:19 - C15:010 - C15:1FAME Profile #14 Biodiesel ohne IS (Channel 1) techCHROM

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Chromatogaphy Data System (CDS) - Sequenz

Thermo Scientific™ Dionex™ Chromeleon CDS

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Chromatogramm + Interaktive Charts

20

Chromatogramm + Interaktive Charts - Ausschnitt

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Beispiel-Report

Probeninfo

Gruppen-Auswertung

Chromatogramm

Auswertung Einzelpeaks

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Zusammenfassung

• Vollautomatische Analyse von Fettsäuren in einem System umfasst: • Online-Probenvorbereitung • GC-Analyse • Berechnung aller relevanten Ergebnisse • Grafische Darstellung der Ergebnisse im Report

• Verschiedene Optionen zur Verschachtelung zur optimalen Abbildung

der Labor-Abläufe • Automatische Abläufe minimieren Fehlerquellen • Automatische Probenvorbereitung schafft Kapazitäten für andere,

wichtige Tätigkeiten – z.B. QS

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Kontakt

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

Dr. Klaus Schrickel

Produktspezialist GC, GC/MS Thermo Fisher Scientific Chromatography and Mass Spectrometry Division Im Steingrund 4 – 6 63303 Dreieich Germany Phone: +49 6103 / 408 - 1269 Mobil: +49 172/7214580 klaus.schrickel@thermofisher.com