KỸ THUẬT MIỄN DỊCH

SỬ DỤNG TRONG CHẨN SỬ DỤNG TRONG CHẨN

ðOÁN VI SINH VẬT

- sự kết hợp giữa KN và KT ph ụ thuộc vàocấu trúc b ề mặt của KN và KT.

I. BẢN CHẤT CỦA SỰ KẾT HỢP GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG TH Ể

- xảy ra gi ữa một phần rất giới hạn giữa:

• phân t ử KN (nhóm quy ết ñịnh)

• một ph ần rất giới hạn của phân t ử KT(trung tâm ho ạt ñộng).

Theo Pauling:

- KN ña hóa trị

I. BẢN CHẤT CỦA SỰ KẾT HỢP GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG TH Ể

- phân tử KT thường hóa trị hai nghĩa

- KN ña hóa trị

KN + KT � phức hợp hình mạng lưới trong không

gian ba chiều (kích thước rất lớn)

kết tủa ngưng kết

I. BẢN CHẤT CỦA SỰ KẾT HỢP GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG TH Ể

KN và KT có thể kết hợp với nhautheo bất cứ tỷ lệ nào nhưng:

- phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tửKN tương ñương với số phân tử KT.

- phản ứng yếu ñi nếu thừa hoặc thi ếuKN hoặc KT

Sự kết hợp giữa phân t ử KN và KT x ảy ra nh ờ các lực:

• lực liên kết ion (lực tĩnh ñiện Coulomb) giữa các giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hoá học mang ñiện trái dấu, ví dụ giữa NH3+ và COO-,

• lực liên kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang ñiện tích dương với các nguyên tử mang ñiện tích âm

lực Van der Walls (lực hấp dẫn liên phân tử) giữa hai phân tử phụ thuộc phụ thuộc vào tương tác giữa các lớp mây ñiện tử ở mặt ngoài

Van der Walls The antibody's HV region forms anopening to surround the antigen's protruding Gln121 (green). Hydrogen bonds (yellow) stabilizethe antibody-antigen interaction. In addition tohydrogen bonds, other weak interactions suchhydrogen bonds, other weak interactions suchas van der Waals forces, hydrophobicinteractions and electrostatic forces improve thebinding specificity between antibody andantigen. These interactions occur over large andsometimes discontinuous regions of themolecules, improving binding affinity

lực ố thu ỷ nếu ở diện tiếp xúc cả phía KN và KT ñều có các axít amin ố thuỷ thì khi KN, KT kết hợp, nước sẽ bị ñẩy ra tạo nên một lực gắn giữa các axít amin ố thuỷ ñó, sự kết hợp này không phải là axít amin ố thuỷ ñó, sự kết hợp này không phải là một phản ứng hóa học.

Phản ứng k ết hợp giữa kháng

nguyên - kháng th ể rất ñặc hi ệu

- Phản ứng kếttủa là sự kết hợpgiữa kháng

1. Nguyên lý

II. PHẢN ỨNG KẾT TỦA

giữa khángnguyên hòa tanlúc gặp kháng thểtương ứng, tạothành tủa có thểquan sát trực tiếpbằng mắt thườnghoặc nhờ soi kínhlúp.

- Phản ứng có thể thực hiện ở môi trường lỏnghoặc môi trường gel.

2. Phản ứng k ết tủa ở môi tr ường lỏng

Kháng huyết thanh và kháng nguyên ñược trộn với nhau và quan sát kết tủa

- ðịnh tính

và quan sát kết tủa tạo thành.

Một vòng kết tủa ñược quan sát ở mặt phẳng phân cách.

- ðịnh lượngCho phép xác ñịnh lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên ñã biết.

These photos show one type of interaction — precipitation — between antibodies and antigen. (a) The tube contains antibodies to the Type III pneumococcal polysaccharide isolated from the capsule surrounding the bacteria. (b) A solution of the polysaccharide is added, and (c) the formation of insoluble antigen-antibody complexes is revealed by the almost instantaneous appearance of turbidity. (d) After an hour, the complexes settle out as a precipitate. If the proportion of antigen to antibody in the mixture is selected properly, the fluid above the precipitate will be devoid of both. In the human body, this binding can literally be life-saving

3. Phản ứng kết tủa ở môi tr ường gel

2.1. Ph�n �ng khu �ch tán ñôi Ouchterlony

Kháng nguyên và kháng thể ñược ñặt vào những lỗ ñục ở trong thạch. Chúng khuếch tán và tạo nên khuếch tán và tạo nên những ñường kết tủa ở trên mặt thạch.

Một phẩm vật chứa nhiều kháng nguyên tạo thành nhiều ñường kết tủa.

Những liên hệ miễn dịch giữa hai kháng nguyên có thể khảo sát bằng phản ứng khuếch tán ñôi.

2.2. Ph�n �ng khu �ch tán ñ�n (Mancini)- trộn kháng thể vào thạch �nhạy hơn do- KN : khuếch tán từ một lỗ ñục ở trên môi trường thạch chứa kháng thể.chứa kháng thể.- lúc bắt ñầu khuếch tán, KN còn ở nồng ñộ cao

� phức hợp hòa tan.- khi khuếch tán xa hơn, khi nồng ñộ ñạt một trị số thích nghi � vòng kết tủa ñược tạo thành.

ứng dụng:+ nhận mặt kháng nguyên + ñịnh lượng IgG ở trong huyết thanh.

III. PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT

1. Nguyên lý

• sự kết hợp giữa KN hữu hìnhvới KTtương ứng � các hạtngưng kết có thể quan sát ñượcbằng mắt thường.bằng mắt thường.

• Kháng nguyên có thể là vi khuẩn, hồng cầu,bạch cầu, tinh trùng.v.v...

•chỉ xảy ra nếu có chất ñiện giải,

• rõ nhất, nhanh nhất ở pH từ 7 ñến 7,2 và ở nhiệtñộ 370C.

2. Phản ứng ng ưng k ết trực ti ếp

- Vi sinh vật sống và chết ñều có khả năng ngưng kết với kháng thể.

- Với vi sinh vật sống, thực hiện phản ứng trên - Với vi sinh vật sống, thực hiện phản ứng trên một phiến kính � nhận mặt vi khuẩn

- vi khuẩn, các tếbào như hồng cầu, tinh trùng... ñều có khả năng ngưng kết với kháng thể ñối ứng

NK trực ti ếp

Trường hợp kháng nguyên là vi sinh vật chết,thực hiện phản ứng trong ống nghiệm ñể xác

2. Phản ứng ng ưng kết trực tiếp

ñịnh hiệu giá kháng thể ở trong huyết thanhtrong chẩn ñoán bệnh như phản ứng Widaltrong chẩn ñoán bệnh thương hàn (TO, TH).

chỉ ngưng kết khi có sự hiện diện của một nhân tố thứ 3.

3. Phản ứng ng ưng k ết gián ti ếp

Ví dụ: Phản ứng Coombs

Trực tiếp

Test Coomb

Gián tiếp

4. Phản ứng ng ưng k ết thụ ñộng

Kháng nguyên hòa tan ñược hấp phụ lên bề mặt những nền mượn như hạt bentonit, hạt latex nhưng thông dụng nhất là hồng cầu cừu

ASO (ASLO)

5. Phản ứng ng ăn ngưng k ết hồng c ầu

chẩn ñoán bệnh do virus như cúm, quai b ị, sốt xuất huy ết, ñậu mùa.v.v...

IV. PHẢN ỨNG KẾT HỢP BỔ THỂ

1. Nguyên lý

Kháng thể ñặchiệu với sự thamhiệu với sự thamgia của bổ thể sẽgây ly giải tế bàovi khuẩn hoặc mộtsố tế bào ñộng vậtkhác.

IV. PHẢN ỨNG KẾT HỢP BỔ THỂ

V. CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

Nguyên lý

Kháng thể ñặc hiệu có khả năng trung hoà ñộc tố,

ñộc lực của vi sinh vật, làm mất ñi một tính chấtñộc lực của vi sinh vật, làm mất ñi một tính chất

nào ñó của vi sinh vật hoặc sản phẩm của nó.

V. CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

2. Phản ứng trung hòa ñộc tố

• ngoại ñộc tố

• Nếu một liều ñộc hay lớn hơn ñộc tố ñược cho • Nếu một liều ñộc hay lớn hơn ñộc tố ñược cho vào một lượng thích nghi kháng ñộc tố ñặc hiệu rồi tiêm vào một ñộng vật nhạy cảm thì con vật không bị nguy hiểm.

• Tính ñộc của ñộc tố ñã bị kháng ñộc tố trung hòa

V. CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

3. Phản ứng trung hòa virus (1)

• Nhiều loài virus phát triển ở nuôi cấy tế bào�hiện tượng tế bào bệnh lý)

• Nếu cho kháng thể tương ứng của virus vàoñồng thời với virus thì virus bị trung hòa � hiện tượng tế bào bệnh lý không xảy ra.

• Sử dụng ñể xác ñịnh:- hàm lượng kháng thể trong huyết thanh - ñịnh typ virus

V. CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

3. Phản ứng trung hòa virus (2)

• ðịnh lượng kháng thể kháng virus ở trong huyết thanh bằng cách trộn kháng huyết thanh với virus rồi thanh bằng cách trộn kháng huyết thanh với virus rồi tiêm h ỗn hợp vào ñộng v ật nhạy cảm.

• Nếu ñộng vật thử nghiệm không cho thấy triệu chứng bệnh thì có sự hiện diện của kháng thể trung hòa

V. CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

4. Phản ứng trung hòa enzym

• Nhiều enzym của vi khuẩn có tính KN:

- Streptolysin O (SO/ASO) � Anti streptolysin O (ASO)- Streptolysin O (SO/ASO) � Anti streptolysin O (ASO)

- Streptokinaza (SK) �Anti streptokinaza (ASK)

• Sử dụng trong chẩn ñoán bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp sau nhiễm liên cầu nhóm A.

VI. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

1.Nguyên lý

• Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể kết hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất ñặc kháng thể mà không phá hủy tính chất ñặc hiệu của kháng thể.

• Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp KN-KT có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang.

VI. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

VI. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

KTMDHQ trực ti ếp, gián ti ếp , sandwich

VI. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

KTMDHQ trực ti ếp, gián ti ếp

PHẢN ỨNGMIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

VII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ENZYM (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

Nguyên lý:

•sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố ñịnh vào một tấm polystyren. •nó ñược dùng ñể bắt kháng nguyên hoặc kháng thể •nó ñược dùng ñể bắt kháng nguyên hoặc kháng thể ñối ứng ở dung dịch thử nghiệm•phức hợp ñược phát hiện nhờ enzym gắn với kháng thể hoặc kháng nguyên tác ñộng lên cơ chất ñặc hiệu. •Cơ chất của enzym thủy phân ño ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng ñộ của kháng thể hoặc kháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm.

VII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ENZYM (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

• Kháng nguyên hoặc kháng thể liên hợp với enzym vẫn giữ hoạt tính miễn dịch. • Enzym ñược sử dụng có thể là photphataza kiễm hoặc peroxydaza. hoặc peroxydaza. • Thử nghiệm cho kết quả khách quan và rất nhạy.• Thử nghiệm miễn dịch liên kết enzym ñược áp dựng ñể chẩn ñoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella, vi khuẩn tả..và các virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota...

VII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ENZYM (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

VII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ENZYM (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

Solid Phase

VII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ENZYM (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

VIII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ (Radioimmunoassay: RIA)

Nguyên lý:

Dùng ñồng vị phóng xạ như Thymidin H3 Cacbon Dùng ñồng vị phóng xạ như Thymidin H3 Cacbon 14, I125... ñánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể ñể theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên -kháng thể

VIII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ (Radioimmunoassay: RIA)

Có thể xác ñịnh vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể) ñã ñánh dấu ñồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản tổ chức học, sau ñó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường.

VIII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ (Radioimmunoassay: RIA)

• ðể phát hiện và ño lường ñồng vị phóng xạ trong môi trường lỏng, ví dụ các ñồng vị phát xạ beta (như thymidin H3, Cacbon C14 ), cần dùng một dung dịch nhấp nháy và ño trong máy ñếm tự ñộng.

• Phương pháp ñồng vị phóng xạ không những có thể khu trú vị trí kết hợp một cách chính xác mà còn làm tăng ñộ nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần.

VIII. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ (Radioimmunoassay: RIA)

IX. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH

Nguyên lý:

•KKTgắn chất màu ñược phân b ố ñều trên b ản gi ấy sắc ký

•KN của vi sinh v ật ñược gắn cố ñịnh t ại “v ạch ph ản ứng”

•Khi nh ỏ huyết thanh lên b ản sắc ký, KT ñặc hi ệu (nếu có) sẽ kết hợp với KKT g ắn màu, sẽ kết hợp với KKT g ắn màu,

•Phức hợp KT-KKT g ắn màu di chuy ển trên gi ấy sắc ký s ẽ bị giữ lại tại “v ạch ph ản ứng” do KT k ết hợp với KN ����“v ạch ph ản ứng” hi ện màu.

•Nếu trong huy ết thanh không có KT ñặc hi ệu, ở “v ạch ph ản ứng” KN không th ể giữ ñược KKT g ắn màu, vì v ậy không hiện màu.

IX. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH

Âm tính Dương tính Không giá tr ị

X. NHẬN ðỊNH KẾT QUẢ CÁC PHẢN ỨNG KẾT HỢP KHÁNG NGUYÊN KHÁNG TH Ể

1. Kết quả ñịnh tínhKết quả ñịnh tính cho biết trong mẫu xét nghiệm cóhay không cókháng thể hoặc kháng nguyên

2. Kết quả ñịnh lượngKết quả ñịnh lượng trong chẩn ñoán huyết thanh choKết quả ñịnh lượng trong chẩn ñoán huyết thanh chobiết hiệugiá kháng thể. Nồng ñộ kháng thể trong huyết thanhcao haythấp ñược ñánh giá qua hiệu giá kháng thể.

3. Ranh gi ới hi ệu giágiữa hiệu giá kháng thể bình thường và hiệu giá bệnh lý

4. Kết quả dương tính gi ả5. Kết quả âm tính gi ả

• 2. Immunoelectrophoresis In immunoelectrophoresis, a complex mixture of antigens is placed in a well punched out of an agar gel and the antigens are electrophoresed so that the antigen are separated according to their charge. After electrophoresis, a trough is cut in the gel and antibodies are added. As the antibodies diffuse into the agar, precipitin lines are produced in the equivalence zone when an precipitin lines are produced in the equivalence zone when an antigen/antibody reaction occurs as illustrated in Figure 14.

• This tests is used for the qualitative analysis of complex mixtures of antigens, although a crude measure of quantity (thickness of the line) can be obtained. This test is commonly used for the analysis of components in a patient' serum. Serum is placed in the well and antibody to whole serum in the trough. By comparisons to normal serum, one can determine whether there are deficiencies on one or more serum components or whether there is an overabundance of some serum component (thickness of the line). This test can also be used to evaluate purity of isolated serum proteins.

3. Countercurrent electrophoresis In this test the antigen and antibody are placed in wells punched out of an agar gel and the antigen and antibody are electrophoresed into each other where they form a precipitation where they form a precipitation line as illustrated in Figure 15. This test only works if conditions can be found where the antigen and antibody have opposite charges. This test is primarily qualitative, although from the thickness of the band you can get some measure of quantity. Its major advantage is its speed.

4. Phản ứng trung hòa enzym Nhiều enzym của vi khuẩn có tính chất sinh kháng tốt Nhiều enzym của vi khuẩn có tính chất sinh kháng tốt và khích ñộng sự tạo thành kháng thể như streptolysin O, streptokinaza của liên cầu khích ñộng sự tạo thành kháng streptolysin O (antistreptolysin O - ASO), kháng streptokinaza (anti streptokinaza - ASK). Dựa trên nguyên tắc phản ứng trung hòa có thể ñịnh lượng kháng streptolysin O (ASO), kháng streptokinaza (ASK) có trong huyết thanh của bệnh nhân ñể chẩn ñoán nhiễm liên cầu. ðặc biệt phản ứng ASO phát hiện kháng thể kháng streptolysin O ñược sử dụng trong chẩn ñoán bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp sau nhiễm liên cầu nhóm A.

b. Quantitative agglutination test Agglutination tests can also be used to measure the level of antibodies to particulate antigens. In this test, serial dilutions are made of a sample to be tested dilutions are made of a sample to be tested for antibody and then a fixed number of red blood cells or bacteria or other such particulate antigen is added. Then the maximum dilution that gives agglutination is determined. The maximum dilution that gives visible agglutination is called the titer. The results are reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination. Figure 8 illustrates a quantitative hemagglutination test.

Phản ứng ngưng kết thụ ñộng

D. Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Radioimmunoassays (RIA) are assays that are based on the measurement of radioactivity associated with immune complexes. In any particular test, the label may be on either the antigen or the antibody. Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) are those that are based on the measurement of an enzymatic reaction associated with immune complexes. In any particular assay, the enzyme may be linked to either the antigen or the antibody.1. Competitive RIA/ELISA for Ag Detection 1. Competitive RIA/ELISA for Ag Detection The method and principle of RIA and ELISA for the measurement of antigen is shown in Figure 16. By using known amounts of a standard unlabeled antigen, one can generate a standard curve relating radioactivity (cpm) (Enzyme) bound versus amount of antigen. From this standard curve, one can determine the amount of an antigen in an unknown sample.

RIA

. Immobilization of the Antibody The antibody can be immobilized onto the surface of a plastic bead or coated onto the surface of a plastic plate and thus the immune complexes can easily be separated from the other components by simply washing the beads or plate (Figure 17). This is the most common method used today and is referred to as Solid phase RIA or ELISA. In the clinical laboratory, competitive RIA and ELISA are commonly used to quantitate serum proteins, hormones, drugs metabolites hormones, drugs metabolites

2. Noncompetitive RIA/ELISA for Ag or Ab Noncompetitive RIA and ELISAs are also used for the measurement of antigens and antibodies. In Figure 18, the bead is coated with the antigen and is used for the detection of antibody in the unknown sample. The amount of labeled second antibody bound is related to the amount of antibody in the unknown sample. This assay is commonly employed for the measurement of antibodies of the IgE class directed against particular allergens by using a known allergen as antigen and allergens by using a known allergen as antigen and anti-IgE antibodies as the labeled reagent. It is called the RAST test (radioallergosorbent test). In Figure 19, the bead is coated with antibody and is used to measure an unknown antigen. The amount of labeled second antibody that binds is proportional to the amount of antigen that bound to the first antibody.

. Immunofluorescence Immunofluorescence is a technique whereby an Immunofluorescence is a technique whereby an antibody labeled with a fluorescent molecule (fluorescein or rhodamine or one of many other fluorescent dyes) is used to detect the presence of an antigen in or on a cell or tissue by the fluorescence emitted by the bound antibody.a. Direct Immunofluorescence In direct immunofluorescence, the antibody specific to the antigen is directly tagged with the fluorochrome (Figure 20).

b. Indirect ImmunofluorescenceIn indirect immunofluorescence, the In indirect immunofluorescence, the antibody specific for the antigen is unlabeled and a second anti-immunoglobulin antibody directed toward the first antibody is tagged with the fluorochrome (Figure 21). Indirect fluorescence is more sensitive than direct immunofluorescence since there is amplification of the signal.

http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/rx-24.jpg

F. Complement FixationAntigen/antibody complexes can also be Antigen/antibody complexes can also be measured by their ability to fix complement because an antigen/antibody complex will "consume" complement if it is present, whereas free antigens or antibodies do not. Tests for antigen/antibody complexes that rely on the consumption of complement are termed complement fixation tests and are used to quantitate antigen/antibody reactions. This test will only work with complement fixing antibodies (IgG and IgM are best).