簡易DNA抽出実験

◆ 種々の材料から簡易な方法でDNAの抽出実験を行ない、結果を比較した

【材料】鶏レバー、ブロッコリー、バナナ、肉エキス培地に生育した大腸菌

【試薬】10%NaCl水溶液、台所用液体洗剤（界面活性剤）、エタノール

【器具】乳鉢・乳棒、ビーカー、ロート、コーヒーフィルター

****身近な材料からのDNA抽出実験比較*****

日本農芸化学会学術活動強化委員会�編�

プロトコール

材料を10 g計り取り、乳鉢等を用いてすりつぶす

10% NaCl水溶液10 mL加えて混和する

コーヒーフィルター（またはガーゼ）を用いてろ過する

＜大腸菌は約0.2 g＞

ろ液に洗剤（P&G社 ジョイ）を1/5量加えてよく混ぜる

エタノールを20 – 30 mL加える

糸状の核酸成分が浮かび上がる

核酸成分を回収し、70%エタノールで洗浄する

0.5 mL TE緩衝液に溶解し、吸光度を測定

RNase処理し、電気泳動により解析

　簡易DNA抽出実験 (高校で簡単に実施できる)

日本農芸化学会学術活動強化委員会�編�

分子生物学的解析 （大学で実施）

材料の前処理

◆ バナナ(左上図)はビニールの袋に入れ、空気を抜いてから手ですりつぶす

◆ 大腸菌(左下図)は、小型スプーンなどを用いて培地からかき取る

◆ ブロッコリー(右上図)と鶏レバー(右下図) は乳鉢を用いてすりつぶす

日本農芸化学会学術活動強化委員会�編�

ろ過

◆ コーヒーフィルターなどの目の粗い紙を用いてろ過する。

○ 一般的なろ紙を用いると、目詰まりしやすい

○ 大腸菌は大部分の細胞がフィルターを通過した。

○ 鶏のレバーは10%NaCl水を加えると粘性が生じてほとんどろ過できない。本実験では、ガーゼを二つ折りにしてろ過を行った。

○ 最後はろ紙を圧迫してろ液を絞り出した

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ろ液と界面活性剤

◆ 界面活性剤として台所用液体洗剤（P&G社ジョイ等）を1/5量加えてよく混ぜる

【ろ液回収量】 ブロッコリー：3.5 mL、バナナ：7.0 mL 　　　　　　　　大腸菌：5.0 mL、鶏レバー：2.0 mL

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バナナの核酸

◆ エタノールをビーカーの縁からそっと注いでゆくと、核酸成分が泡を含んで浮き上がってくる。

○ バナナ、ブロッコリーからは明確な糸状の物質が抽出された。

○ 大腸菌からは全く検出されなかった。大腸菌の細胞壁は洗剤では溶解しないためであろう。

○ 鶏レバーからもほとんど検出されなかった。実験プロトコールを工夫する必要がある

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指導：都立新宿高校　佐藤由紀夫教諭

核酸の回収

◆ ガラス棒、ピンセット等を用いて、糸状の核酸成分を回収した。

○ 70%エタノールで洗浄した後、0.5 mL TE緩衝液を加えて撹拌した。超音波を用いて10分間強制的に撹拌し、70℃の湯煎にかけたが、半分以下しか溶解しなかった。

○ 溶解しなかった成分の大部分は多糖類および変性したタンパク質と考えられる。

○ 溶解した成分について260 nmと280 nmの吸光度を測定したところ、260/280比は1.7程度で、タンパク質の混入は10-20%程度。0.1 – 1.0 mgの核酸が含まれていると推定された。

【左写真】

ブロッコリー

【TE緩衝液】

10 mM Tris–HCl 　　　　(pH8.0) 1 mM EDTA

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核酸成分の電気泳動解析

○ 真核生物の核酸は大部分がRNAであり、特にリボソームRNA(矢印)が多量に含まれている。RNase処理によりRNAを特異的に分解してから電気泳動によりDNAの検出を行った。

◆ 核酸溶液50 µLに対してRNaseを5 µg ( /5 µL)加えて37℃, 1hr保温し、電気泳動を行った。

RNase処理 ( - )� RNase処理 ( + )�

1: マーカー 2: 大腸菌 3: 鶏レバー 4: ブロッコリー 5: バナナ

○ EtBrによりDNAとRNAが蛍光を発している�

＜本実験デモの結果＞

　簡易なDNA分離実験により抽出される糸状の成分の大部分はRNAであるが、DNAも含まれている。本抽出法にはブロッコリー、バナナが材料として適している。

RNA �

日本農芸化学会学術活動強化委員会�編�