Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=77660107 Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y PortugalSistema de Informacin Cientficascar Julin Snchez Toro, Mara Cristina Ortiz Buritic, Adriana Lorenza Betancourt GarcsObtencin de cido ctrico a partir de suero de leche porfermentacin con Aspergillus sppRevista Colombiana de Biotecnologa, vol. VI, nm. 1, julio, 2004, pp. 43-54,Universidad Nacional de ColombiaColombia Cmo citar?Fascculo completoMs informacin del artculoPgina de la revistaRevista Colombiana de Biotecnologa,ISSN (Versin impresa): 0123-3475revcbib_bog@unal.edu.coUniversidad Nacional de ColombiaColombiawww.redalyc.orgProyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto43Obtencin de cido ctrico a partir de suero de leche porfermentacin con Aspergillus spp.Citric acid production from whey by fermentation usingAspergillus spp.scar Julin Snchez Toro*, Mara Cristina Ortiz Buritic**,Adriana Lorenza Betancourt Garcs***RESUMEN RESUMEN RESUMEN RESUMEN RESUMENEl suero de leche se ha constituido en el principal desecho de la industria lctea, a pesar de los constantes esfuerzos por aprovecharlo. Elpresente trabajo tuvo por objeto estudiar la obtencin de cido ctrico por fermentacin sumergida con hongos del gnero Aspergillus,utilizando lactosuero en calidad de sustrato con miras a su aprovechamiento y a la reduccin del impacto ambiental que causan losvertimientos de este subproducto en los cursos de agua. Se utilizaron las siguientes cepas: A. carbonarius NRRL 368, A. carbonariusNRRL 67 y A. niger NRRL 3. Fue seleccionado el mejor medio de adaptacin para la propagacin del inculo. El diseo experimentalplanteado para evaluar la biosntesis de cido ctrico a partir de suero de leche modificado mediante diferentes tratamientos, dio comoresultado que las dos cepas de A. carbonarius no presentaran diferencias significativas en la formacin del cido, mientras A. niger NRRL3 alcanz mayores concentraciones cuando se utiliz suero de leche desproteinizado, evaporado y con lactosa hidrolizada con -galactosidasa. A. carbonarius arroj concentraciones promedio de cido ctrico mayores que las encontradas para A. niger, lo que sugierela necesidad de profundizar en su estudio como productor potencial. Se obtuvo la cintica de crecimiento celular, consumo de sustratoy formacin del cido en un biorreactor de tanque agitado con aireacin de 3 L para el caso de A. niger, la cual fue simulada mediantemodelos matemticos no estructurados.Palabras clave:Palabras clave:Palabras clave:Palabras clave:Palabras clave: Aspergillus carbonarius, Aspergillus niger, biorreactor, simulacin, -galactosidasa.ABSTRACT ABSTRACT ABSTRACT ABSTRACT ABSTRACTWhey has become the main dairy-industry waste product, despite continuous efforts aimed at finding a way to use it. The aim of thisresearch was to investigate citric acid production by submerged fermentation using Aspergillus genus fungi, using whey as substrate to takeeconomical advantage of it and to reduce the environmental impact caused by discharging this by-product into nearby streams. Thefollowing three strains were used: A. carbonarius NRRL 368, A. carbonarius NRRL 67 and A. niger NRRL 3. The best adaptation medium forinoculum propagation was selected. Proposed experimental design for evaluating citric acid biosynthesis from whey modified throughdifferent treatments showed that the two A. carbonarius strains did not present significant differences in acid production whereas A. nigerNRRL 3 reached higher concentration when evaporated, deproteinised and -galactosidase lactose-hydrolysed whey was used. However, A.carbonarius gave higher average citric acid titres than those found for A. niger. This suggests the need for carrying out further research on itas a potential producing strain. Cell growth, substrate consumption and acid production kinetics in a 3-L stirred-tank bioreactor withaeration were developed in the case of A. niger; kinetics were simulated through non-structured mathematical models.Key words:Key words:Key words:Key words:Key words: Aspergillus carbonarius, Aspergillus niger, bioreactor, simulation, -galactosidase.INTRODUCCINEl suero de leche es un lquido claro, de color amari-llo verdoso, resultantede la coagulacin de la lechedurante la elaboracin del queso, y contiene en pro-medio 4.9% de lactosa, 0.9% de protena, 0.6% decenizas y 0.3% de grasas, entre otros componentes(Baena et al., 1994; Marwaha y Kennedy, 1988). Estesubproducto se ha constituido en el principal dese-cho de la industria lctea. A pesar de los constantes*Ingeniero Qumico, M.Sc., Departamento de Ingeniera, Universidad de Caldas, calle 65 No. 26-10, Manizales, Colombia.Correo electrnico: osanchez@ucaldas.edu.co**Bacteriloga, Departamento de Ciencias Biolgicas, Universidad de Caldas.***Universidad Nacional de Colombia, sede Manizales.Recibido: marzo 8 de 2004. Aceptado: abril 12 de 2004.44esfuerzos por aprovechar el suero, la mayora de losvolmenes producidos son vertidos directamente enlos cursos de agua naturales provocando un impac-to ambiental negativo debido a su elevado contenidodemateriaorgnica,quealcanzaunaDBO5de30.000-50.000 mg/L (Baena et al., 1994; Marwaha yKennedy, 1988). En la actualidad, la legislacin prohbeel vertimiento directo del suero a los cursos de aguasin un tratamiento previo, que consiste principalmen-teenlaremocindelalactosaylasprotenas.Sinembargo, son justamente estos componentes los msvaliosos en el momento de aprovechar el lactosuerocomo medio de cultivo para fermentaciones industria-les (Garca et al., 1993; Moulin y Galzy, 1984).Como medio de cultivo, el suero de leche pue-de suministrar las fuentes de carbono y de energanecesarias para el desarrollo de diferentes microor-ganismos y la produccin de metabolitos de alto va-lor. El nmero de microorganismos que tienen la ca-pacidaddeasimilarlalactosaeslimitado,peroalhidrolizar este disacrido y obtener glucosa y galactosamedianteunprocesoenzimticoempleando-galactosidasa (lactasa), se amplan significativamentelasperspectivasdeaprovechamientodelsueroenprocesos de fermentacin (Garca et al., 1993). Adi-cionalmente, se ha iniciado el estudio del suero deleche como medio alternativo para el cultivo de mi-croorganismosrecombinantes(Souzaetal.,2001;Domingues et al., 2001).El suero de leche ha sido utilizado para la pro-pagacin de inculos en queseras (Huggins 1984;Lamboley et al., 1997) y la obtencin de lactasa (Gon-zlez, 1994; Rech et al., 1999), poligalacturonasa (Gar-caetal.,1987),protenaunicelular(El-Hawaryetal., 1991; Hosseini et al., 2003; Ben-Hassan y Ghaly,1994), etanol (Domingues et al., 2001; Grba et al.,2002;GhalyyEl-Taweel,1995)ycidosorgni-cos, entre otros productos. La produccin de ci-dos orgnicos representa gran inters por cuantoestos metabolitos obtenidos a partir del suero pue-denserutilizadosasuvezcomoaditivosdeori-gennaturalenlamismaindustrialctea. Apartirdesuerodelechesehaobtenidocidolctico(Trujillo et al., 1998; Tejayadi y Cheryan, 1995), ac-tico (Huang y Yang, 1998; Talabardon et al., 2000),propinico(Colombanetal.,1993;Yangetal.,1994), glucnico (Vanhuynh et al., 1986), succnico(Lee et al., 2000) y ctrico.El cido ctrico es ampliamente utilizado en laindustriadealimentos,bebidas,qumicayfarma-cutica,entreotras.Esempleadocomoagenteacidificante y resaltador del sabor, como antioxidantepara prevenir la rancidez de grasas y aceites, comoamortiguador en mermeladas, y como estabilizanteen gran variedad de alimentos. La industria farma-cutica emplea alrededor del 16% de la produccinde este cido. Se estima que su produccin anualesde400.000tonparaunmercadodecercade1.400 millones de dlares por ao. Su consumo seest incrementando por lo que se contina investi-gandoenlaimplementacindenuevosprocesostecnolgicosmsrentablesyecolgicamentelim-pios (Demain, 2000).La obtencin industrial de cido ctrico se llevaacaboempleandoelhongoAspergillusnigerenmedios ricos en carbohidratos como las melazas decaa y de remolacha. Tambin seutiliza sacarosa,almidn de papa, hidrolizados de almidn y jarabesdeglucosa(Vorobeva,1989).Sehaexploradolaposibilidad de emplear levaduras para la produccinde cido ctrico en procesos por lotes (Kubicek y Rhr,1986;Moresi,1994;KimyRoberts,1991)yconti-nuos (Klasson et al., 1989).Uno de los microorganismos que tiene la capa-cidaddesintetizarcidoctricoeselAspergilluscarbonarius segn lo reportan diferentes bancos decepas (NRRL, ATCC, CABI, DSMZ, entre otros). Estehongo recientemente ha sido investigado en la ob-tencinde productos de aplicacin industrial comopoligalacturonasas(DeviyRao,1996)yfitasa(Al-Asheh y Duvnjak, 1995), aunque son muy pocos lostrabajos publicados.Igualmente, existen pocos reportes sobre la pro-duccin de cido ctrico a partir de suero. SomkutiyBencivengo (1981) realizaron ensayos en erlenmeyers,mientras Hossain et al. (1983), intentaron optimizar elproceso en biorreactores a nivel de laboratorio utili-zandocepasmutantesymodificandolascondicio-nes del cultivo sumergido. En estos cultivos se em-ple el hongo A. niger, pero no se hidroliz la lactosani se evapor el suero. Abou-Zeid et al. (1983) repor-taronlaobtencindecidoctricoapartirdeunamezcla de semillas de dtiles y suero de leche utili-zandoCandidalypolitica.El-Samragyetal.(1996)investiglaproduccindecidoctricoapartirdeREVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA VOL. VI No.1 Julio 200443 - 5445suero de leche con la adicin de sal y metanol parados cepas de A. niger, pero las concentraciones ob-tenidas fueron muy bajas. El-Holi y Al-Delaimy (2003)adicionaron concentraciones significativas de diferen-tes azcares al suero de leche, as como metanol,fosfatos y riboflavina, con el fin de aumentar la con-centracin de cido ctrico en cultivos superficialesutilizando A. niger, con resultados positivos. Sin em-bargo, la concentracin obtenida sin aditivos fue sus-tancialmentebaja.Enestosestudiostampocoseensay la hidrlisis previa de la lactosa del suero.El presente trabajo tuvo por objeto estudiar laobtencin de cido ctrico por fermentacin sumergi-da con A. niger y A. carbonarius, hongos de la sec-cin Nigri del gnero Aspergillus, utilizando suero delechedulceencalidaddesustrato,conmirasasuaprovechamientoyalareduccindelimpactoam-biental que causan los vertimientos de este subpro-ducto en los cursos de agua naturales.MATERIALES Y MTODOSMicroorganismos y medios de produccinSeutilizarontrescepasdehongos:Aspergilluscarbonarius NRRL 67, A. carbonariusNRRL 368 y A.niger NRRL 3, suministradas por el National Center forAgricultural Utilization Research del Departamento deAgricultura de Estados Unidos.Las cepas liofilizadasse reconstituyeron en Caldo Triptona Soya (Oxoid, In-glaterra) donde permanecieron de 2 a 3 h, para luegotransferirlas a diferentes medios de cultivo.A fin de determinar una conidiognesis ptima,las cepas se sembraron en diferentes medios de cul-tivo slido recomendados para este gnero de hon-gos (Smith y Onions, 1983; Domsch et al., 1980) yse incubaron a dos temperaturas (37 y 25 C) duran-te10das.Losmediosempleadosfueron:AgarCzapek(Difco,EUA),AgarSabouraudDextrosa(Difco,EUA),PDA(Oxoid,Inglaterra),MEA,AgarCzapek Malta y Agar Czapek Malta modificado me-diante la adicin al agar Czapek de 4 g de extractode malta, 0.1 mL de ZnSO4.7H2O al 1% y 0.1 mL deCuSO4.5H2O al 0.5 % c.s.p. 100 mL. Todas las ce-pasfueronconservadasentubosconagarSabouraudinclinadocubiertasconaceitemineralestril bajo refrigeracin y subcultivadas cada dosmeses (Smith y Onions, 1983).Suero de lecheSe utiliz suero dulce de leche que fue suministrado poruna fbrica local de productos lcteos. Segn los reque-rimientos del diseo experimental al lactosuero se le rea-lizaron diferentes procesamientos: desproteinizacin delsuero por termocoagulacin a 90 C a un pH de 6.0seguidodecentrifugacina6000rpm;hidrlisisenzimticadelalactosadelsueroconlactasaco-mercial (Maxilact L 2000 de DSM, Holanda) a 40 Ca un pH de 6.6 durante 1 h con una dosificacin deenzima de 0.4 mL/100 mL de suero para alcanzar un80% de hidrlisis; evaporacin del suero hasta un 50%de su volumen inicial.Diseo experimentalCon el objetivo de llevar a cabo la etapa de adapta-cin,loshongosfuerontransferidosdelmediodecrecimiento donde presentaron desarrollo ptimo, ados medios de cultivo lquido. El medio de adapta-cin 1 tuvo la siguiente composicin (en g/L): gluco-sa, 145; (NH4)NO3, 2.23; K2HPO4, 1.0; MgSO4.7H2O,0.23. El medio de adaptacin 2 consisti en (en g/L):glucosa, 60; (NH4)2SO4, 3.0; MgSO4.7H2O, 0.8; licorde remojo de maz 1.5 mL/L.La fase de adaptacin se realiz en erlenmeyersde 250 mL que contenan 100 mL de los medios men-cionadosajustadosaunpHde5.0. Todoslosme-dios preparados y el material de vidrio fueronesteri-lizados en autoclave a 121 C, a 15 psi durante 20min. Los medios fueron inoculados con una suspen-sin de conidias provenientes del medio de crecimien-to. El cultivo se llev a cabo a 30 C en un termostatode recirculacin digital con agitacin (Julabo SW21/1, Alemania) a 180 rpm durante 8 das.Para evaluar la biosntesis de cido ctrico por partede las cepas estudiadas en medios de produccin ba-sados en suero de leche, se plante un diseo experi-mentaldeunfactoracuatroniveles(tratamientos)ycon tres rplicas por nivel. Los tratamientos realizadosfueron:sueroentero,suerodesproteinizado,suerodesproteinizado e hidrolizado y suero desproteinizado,hidrolizadoyevaporado.Elanlisisdevarianzaylavalidacin de los supuestos (Daz, 1999; Walpole et al.,1998)serealizmedianteelpaqueteestadsticoStatgraphics v. 5.2. El cultivo se realiz en erlenmeyersde 250 mL con unvolumen de medio de 100 mL. A losmedios as preparados no se les agreg ningn com-ponente adicional. El pH inicial de los medios se ajusta un valor de 3.0 (Vorobeva, 1989; Crueger y Crueger,OBTENCIN DE CIDO CTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE461993). El porcentaje del inculo fue de un 5%, el cualse adicion a los medios en condiciones aspticas. Elcultivosellevacaboa30Ceneltermostatoderecirculacin digital con agitacin a 180 rpm durante 10das. Durante la fermentacin no se control el pH.Estudio cintico de la fermentacinDe los resultados obtenidos en el diseo experimentalse seleccionaron la cepa y el medio de produccin quepresentaronlamayorconcentracindecidoctrico.Se prepar un volumen suficiente de medio de produc-cinquefuevertidoenunbiorreactorenchaquetadode 3 L con un impulsor de turbina Rushton (Applikonmod. Z61103CT04, Holanda) empleando un volumende trabajo del 50%. El medio fue esterilizado en auto-clave a 121 C a 15 psi durante 20 min, ajustndose supH a un valor de 3.0 y se le adicion antiespumantenatural.Elequipofueesterilizadoconvaporvivodecalderadurante11/2horas.Elvolumendelinculocorrespondi a un 5% del volumen del medio de pro-duccin; la inoculacin se llev a cabo a partir del culti-voprocedentedelmediodeadaptacinencondicio-nesaspticas.Elprocesodefermentacinseiniciinyectando aire purificado por un filtro de lana de vidrioa razn de 0.33 vvm a 200 rpm, mantenindose la tem-peratura a 30 C mediante la circulacin por la chaque-ta del biorreactor de agua de calentamiento proceden-te de un termostato. Estas condiciones se mantuvierondurante los dos primeros das de cultivo. Durante losnueve das siguientes se aument la aireacin a un ni-vel de 0.62 vvm y la agitacin a 300 rpm. Se acondicio-n un sistema de toma de muestras de tal forma queno se contaminara el contenido del biorreactor.Se tomaron muestras cada 6 horas durante 11das de fermentacin, analizndose la concentracindecidoctrico,azcaresreductores,protenaybiomasa. Con los datos obtenidos se construyeronlas curvas de concentracin de sustrato, biomasa yproducto en funcin del tiempo. Se simul la cinticade la fermentacin utilizando modelos matemticosnoestructuradosconayudadelossiguientespro-gramas: MS Excel, Visual Basic y Statgraphics.Tcnicas analticasLa concentracin de sustrato se midi por el mtodoespectrofotomtricodedeterminacindeazcaresreductoresutilizandocidodinitrosaliclico(Miller,1959). El cido ctrico fue determinado por un mtodoespectrofotomtricocomercialqueutilizalaenzimacitrato-liasa (Boehringer Mannheim/R-Biopharm, Ale-mania) llevndose a cabo la medicin a una longituddeondade340nmenunespectrofotmetroUV(UnicammodeloUV530,Inglaterra).Labiomasasedetermincentrifugandolasmuestrasdecaldodecultivo; el precipitado obtenido se depositsobre pa-pel filtro Whatman no. 1 previamente secado y pesa-do y se sec en una mufla hasta peso constante. Ladeterminacindeprotenaenelcaldodecultivoserealiz por el mtodo de Biuret (Weaver, 2003).RESULTADOSA las tres cepas seleccionadas con base en su habi-lidadreportadaparasintetizarcidoctrico(bancode cepas NRRL WDCM97 del Agricultural ResearchServiceCultureCollectiondelNationalCenterofAgricultural Utilization Research, Peoria, Illinois, EUA)se les evalu su conidiognesis ptima en diferentesmedios de cultivo slido. De la experimentacin contodoslosmediosutilizados,seobservqueambascepas de A. carbonarius presentaron conidiognesispobre en Agar Czapek, a pesar de que ste es el me-dioseleccionadoparaelaislamientodehongosdelsuelo que posean la capacidad de usar nitrgeno in-orgnico (Difco Laboratories, 1998), por lo que se de-cidi utilizar Agar Czapek Malta y Agar Czapek Maltamodificado con la adicin de sales de zinc y cobre. Loanterior en razn de que la adicin de cobre favorecela formacin de conidias y el zinc ayuda a mantener lasntesis celular y controla las relaciones entre el me-tabolismo de carbono y nitrgeno (Domsch et al., 1980;Volcy y Pardo, 1994). Los resultados obtenidos confir-man una profusa conidiognesis para el medio modi-ficado,locualgarantizaunadecuadosuministrodematerial de siembra para la preparacin del inculo.Los medios de cultivo que mejor conidiognesispresentaron fueron Agar Czapek Malta modificado yAgarSabouraudparalasdoscepasdeAspergilluscarbonarius, y Agar Czapek, Agar Czapek Malta mo-dificadoy AgarSabouraudparaelAspergillusnigerNRRL3.LoanteriorindicalasmayoresexigenciasnutricionalesdelA.carbonariusencuantoaforma-cin de conidias se refiere. La temperatura ptima decultivo en medios de crecimiento fue de 25 C para lascepas de A. carbonarius. La cepa deA. niger NRRL 3presentaunaprofusaconidiognesistantoa25Ccomoa37Csiseseleccionaelmedioadecuado.Para las siguientes etapas del estudio se seleccionel medio Czapek Malta modificado para las cepas deA. carbonarius y Czapek para la cepa de A. niger.REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA VOL. VI No.1 Julio 200443 - 5447En las figuras 1a y 1b se pueden observar lasestructurasmorfolgicaspresentadasdurantelaconidiognesis del A. carbonarius NRRL 368 al iniciodelamaduracin:conidiforo,cabezuela,mtulas,filidesyconidiashialinas. Amedidaqueelhongomadura, va adquiriendo una pigmentacin oscura (Fi-guras 1c, 1d y 1e) en todas sus estructuras con ex-cepcin del conidiforo. El hongo present conidiforode pared gruesa y conidias equinuladas oscuras. Ca-ractersticas similares se observaron en A. carbonariusNRRL67yA.nigerNRRL3,lascualescoincidencon las descritas en la literatura para los hongos delgneroAspergillusdelaseccinNigri(Domschetal., 1980; Vlez, 1989).Lasuspensindeconidiasprocedentesdelmedio de crecimiento seleccionado para cada cepafue transferida a los dos medios lquidos de adapta-cinconelfindedisponerdematerialdesiembraparalainoculacindelosdiferentesmediosbasa-dos en suero de leche. El medio que mejores resul-tadospresent en cuanto a formacin de biomasafue el medio de adaptacin 2, a causa de la presen-ciaensucomposicindeunafuenteorgnicadenitrgeno:ellicordemaceracindemaz.Noseapreci la presencia de conidias debido a que s-tas germinaron favoreciendo el crecimiento micelial,locualesexplicableporlaintensaagitacinalaque fue sometido el cultivo. En las tres cepas estu-diadas se observaron aglomeraciones de hifas depigmento verde oscuro al finalizar la etapa de adap-tacin (ver figura 2).Enlatabla1seevidencialaefectividaddelprocedimiento empleado para la desproteinizacindel suero. Igualmente se observa el aumento en laconcentracindeazcaresreductoresconlahidrlisis enzimtica de la lactosa y con la evapora-cin del suero.Los resultados del diseo experimental plantea-do para evaluar la biosntesis de cido ctrico en dife-rentes medios basados en suero de leche se compi-lan en la tabla 2 para cada una de las cepas estudiadas.LosresultadosobtenidosparaelhongoA.carbonarius NRRL 368 se muestran en la figura 3. Elanlisis de varianza de los datos obtenidos mostrque no existe diferencia significativa entre los diver-sos tratamientos a un nivel de significancia del 5%(Pvalue =0.876), lo que implica que se acepta la hip-tesis nula, es decir, la media de los tratamientos esigual. Los supuestos fueron validados, en particular laprueba de Barttlet para verificar la homocedasticidadde la varianza, lo que permite comprobar que no haydiferencia entre las varianzas de los tratamientos.Figura 1. Micrografas de las etapas del desarrollo de la estructurafructfera del hongo A. carbonarius NRRL 368: a y b (10X) - iniciode la maduracin; c, d (10X) y e (40X) estructuras maduras.Figura2.Micrografa(10X)delaaglomeracindehifasdeA.carbonarius NRRL 368 al finalizar la etapa de adaptacin.EnteroDesproteinizadoDesproteinizado e hidrolizadoDesproteinizado, hidrolizado yevaporadoTratamiento delsueroTabla 1. Concentracin de azcares reductores totalesy protena de acuerdo con los diferentes tratamientos utilizadosAzcaresreductores (g/L)Protena(g/L)52.2850.3382.57165.139.575.576.009.29OBTENCIN DE CIDO CTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE48Lo anterior indica que desde el punto de vista dela biosntesis de cido ctrico, el hongo metaboliza losdiferentes tipos de suero independientemente de la for-ma como est presente la fuente de carbono (lactosa olactosahidrolizada).Igualmente,ladesproteinizacindel suero no represent una ventaja en la biosntesisde cido ctrico por A. carbonarius NRRL 368.LosresultadosobtenidosparaelhongoA.carbonarius NRRL 67 se muestran en la figura 4. Delanlisis de varianza realizado se concluye que no seencontr diferencia significativa entre los diferentes tra-tamientos a un nivel de significancia del 5% (Pvalue =0.416), lo que implica que se acepta la hiptesis nula,esdecir,lamediadelostratamientosesigual.Lossupuestosfueronvalidados,enparticularlapruebadeBarttletparaverificarlahomocedasticidaddelavarianza, lo que permite comprobar que no hay dife-rencia entre las varianzas de los tratamientos.Loanteriorindicaquedesdeelpunto de vista de la biosntesis de ci-doctricoestacepadelhongo,ase-mejanza de la anterior, metaboliza losdiferentes tipos de suero independien-temente de la forma como est presen-telafuentedecarbono(lactosaolactosahidrolizada).Igualmente,ladesproteinizacindelsueronorepre-sentunaventajaenlabiosntesisdecido ctrico por A. carbonarius NRRL 67.Losresultadosobtenidosparaelhongo A.nigerNRRL3muestranquelas mayores concentraciones de cidoctrico obtenidas corresponden al suerodesproteinizado, hidrolizado y evapora-do (ver figura 5), con un promedio paraeltratamientode5,77g/L.Loanteriorindicaqueconformeaumentalaconcentracindesustrato de tratamiento en tratamiento, aumenta tam-bin la cantidad de cido ctrico producida. Por lo tan-to, A. niger no asimila adecuadamente la lactosa, loque se puede comprobar al observar las bajas con-centraciones obtenidas del cido en el tratamiento desueroconlactosanohidrolizada.Igualmente,ladesproteinizacin del suero no parece tener un efectosignificativosobrelabiosntesisdelcido,alnoob-servarse diferencias relevantes en las concentracio-nes obtenidas con suero entero o desproteinizado.El anlisis de varianza realizado corrobora lasconclusiones anteriores al indicar que existe una di-ferencia significativa entre los tratamientos a un ni-vel de significancia del 5% (Pvalue = 0.000). Al realizarla prueba LSD (mnima diferencia significativa) paradeterminar cules tratamientos presentarondiferen-Figura 3. Produccin de cido ctrico por el hongo A. carbonariusNRRL 368 despus de 10 das de incubacin utilizando diferentestratamientos de suero de leche. SE Suero entero. SD Suerodesproteinizado. SDH Suero desproteinizado, hidrolizado. SDHE Suero desproteinizado, hidrolizado, evaporado.Aspergillus carbonariusNRRL 368Aspergillus carbonariusNRRL 67Aspergillus nigerNRRL 3CepaTabla 2. Resultados del diseo experimental para evaluar la biosntesis de cido ctricoobtenidos para cada cepa de hongos de acuerdo con el tratamiento de suero empleadoTratamiento delsueroPromedio deconcentracionesde cido ctrico(g/L)SESDSDHSDHESESDSDHSDHESESDSDHSDHE6.728.6910.5111.156.517.130.937.580.340.063.075.77Errorestndar3.3432.5536.7732.5403.6424.3210.5701.9630.2090.0500.1880.521Figura 4. Produccin de cido ctrico por el hongo A. carbonariusNRRL 67 despus de 10 das de incubacin utilizando diferentestratamientos de suero de leche. SE Suero entero. SD Suerodesproteinizado. SDH Suero desproteinizado, hidrolizado. SDHE Suero desproteinizado, hidrolizado, evaporado.REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA VOL. VI No.1 Julio 2004 43 - 5405101520SE SD SDH SDHETratamientos del suerocido ctrico (g/L) 0102030SE SD SDH SDHETratamientos del suero cido ctrico (g/L) 49Figura 6. Consumo de sustrato, crecimiento de biomasa y biosntesisdecidoctricoduranteelcultivosumergidodesuerodelechedesproteinizado, hidrolizado y evaporado con A. niger NRRL 3.ciassignificativas,seobservaquenoexistendife-renciasentrelossuerosenteroydesproteinizado,mientras que s existe entre stos y los medios basa-dos en suero con lactosa hidrolizada. As mismo, sedeterminquesexistandiferenciassignificativasentre el suero desproteinizado e hidrolizado y el sue-ro desproteinizado, hidrolizado y evaporado.Despus de 8 das de cultivo del hongo A. nigerNRRL 3 en erlenmeyers de 250 mL, se pudo apre-ciar la profusa formacin de pellets con un dimetropromedio de 5 mm. La forma esfrica adquirida porel hongo se debi a la prolongada agitacin a la quefue sometido durante la fermentacin.Considerando los resultados obtenidos se de-cidi utilizar el hongo A. niger NRRL 3 y el tratamien-to con suero de leche desproteinizado, hidrolizado yevaporado, en razn de que dicho hongo es el quese utiliza industrialmente y que s present diferen-cias significativas entre tratamientos, lo que permiteevaluar la influencia de la hidrlisis de lactosa sobrelos rendimientos de cido ctrico.En la figura 6 se observan los resultados obte-nidos durante 11 das de fermentacin empleando elmedio lquido seleccionado en un biorreactor agita-do de 3 L con aireacin. Para efectos de claridad enla presentacin de los resultados, slo se muestrandos datos por da. A lo largo de la fermentacin sepudieron apreciar los agregados miceliales del hon-go. Durante los cultivos preliminares se form abun-dante cantidad de espuma, por lo que se hizo nece-sario la adicin de antiespumantes naturales. De losdatos cinticos obtenidos se puede observar el cre-cimiento celular hasta el cuarto da, a partir del cualelcultivoentrenfaseestacionaria.Laconcentra-cin de sustrato disminuy ostensiblemente hasta elsptimo da; sin embargo, al final de la fermentacinnosealcanzaronaconsumirtodoslosazcaresreductores disponibles en el medio, lo que indica quees necesario aumentar la conversin del sustrato. Elporcentaje de utilizacin del sustrato fue de 75.5%.Laconcentracindecidoctricoobtenidaesmenor que la alcanzada durante el diseo experimen-tal, debido entre otras razones al cambio de escala.Sin embargo, la cepa empleada demostr su capaci-dad de biosintetizar el cido. Se diferencia claramentela trofofase (etapa de formacin de biomasa) de laidiofase (etapa de biosntesis de producto). El segui-miento a la concentracin de protena en el medio decultivo durante la fermentacin no tuvo cambios sig-nificativos indicando que el mayor consumo de nitr-geno orgnico se llev a cabo durante el primer dade fermentacin, mantenindose constante el conte-nido de protena en un nivel cercano a 8 g/L.Con base en los datos experimentales se cal-cularon los rendimientos aparentes de biomasa y ci-do ctrico, expresados como gramos de biomasa for-madaporgramodesustratoconsumido,ygramosdecidoctricoproducidosporgramodesustratoconsumido.Losvaloresobtenidosfueron0.177gbiomasa/g sustrato y 0.034 g cido ctrico/g sustrato.Figura 5. Produccin de cido ctrico por el hongo A. niger NRRL3despusde10dasdeincubacinutilizandodiferentestratamientos de suero de leche. SE Suero entero. SD Suerodesproteinizado. SDH Suero desproteinizado, hidrolizado. SDHE Suero desproteinizado, hidrolizado, evaporado.OBTENCIN DE CIDO CTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE0204060801001201401601800 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11t[das]S, X [g/L]00.511.522.533.54P [g/L]Sustrato (S) Biomasa (X) cido Ctrico (P)02468SE SD SDH SDHETratamientos del suerocido ctrico (g/L) ctrico50Lamximavelocidadobservadadeproduccindecido ctrico fue de 71 mg/(L.h).A partir de los datos biocinticos se llev a caboel modelamiento matemtico del proceso de fermen-tacin. Para ello se plante el siguiente modelo noestructurado:steestbasadoenunmodelodefinidoenuntrabajo anterior (Vinarov et al., 1996), para la formula-cin, del cual se tuvieron en cuenta las siguientes su-posiciones: (1) La fuente de carbono principal se gastadurante la biosntesis, mayoritariamente en la produc-cindebiomasa;(2)lavelocidaddeformacindebiomasa durante la biosntesis se limita por la interac-cin entre las clulas cuando se consume el sustrato;(3) la velocidad de produccin de cido ctrico dependede la concentracin de los microorganismos producto-res en el medio lquido; (4) el proceso ocurre en condi-cionesaerbicasnolimitadaspordficitdeoxgeno;(5) el modelo describe el proceso cintico cuando unacierta cantidad de inculo es transferida al biorreactor ocuando se alcanza la concentracin celular inicial (X0)en el caso de siembra con suspensin de conidias.La primera ecuacin del Sistema (1) correspon-de a un modelo logstico, el cual describe la fase decrecimiento y la fase estacionaria de una fermenta-cin por lotes. La segunda ecuacin muestra que lavelocidad de consumo de sustrato (dS/dt) es directa-mente proporcional a la velocidad de formacin debiomasa (dX/dt). Finalmente, la tercera ecuacin re-vela que la velocidad de formacin de producto (dP/dt) es directamente proporcional a la concentracinde biomasa y no a su velocidad de formacin, lo cuales vlido para la biosntesis de metabolitos relacio-nados indirectamente con el crecimiento celular.Los parmetros cinticos del modelo planteadose determinaron con base en los datos experimenta-les que se muestran en la figura 7. Los datos fueronajustadosmedianteregresionespolinomialesparaobtener as curvas suavizadas que reflejaran los re-sultadosobtenidos.Medianteunanlisisderegre-sin se estimaron los parmetros cinticos.Los valores dey se hallaron con base en laregresinlinealdelospuntosobtenidosalgraficar(1/X).(dX/dt) vs. X. La pendiente de la recta obtenidacorrespondea-,mientraselinterceptoconelejede las ordenadas corresponde a(ver figura 7). Losvalores de dX/dt se obtuvieron diferenciando num-ricamente los datos experimentales de concentracinde biomasa en funcin del tiempo. De la misma ma-nera se procedi para determinar YX/S y qP, constru-yendo las grficas de dS/dt vs. dX/dt y dP/dt vs. X yrealizando las regresiones lineales correspondientes.Las pendientes de las ecuaciones lineales obtenidascorrespondieron a los valores de YX/S y qP.En la figura 8 se observan los resultados de lasimulacin de la fermentacin con base en el mode-lo matemtico propuesto de acuerdo con el Sistema(1), el cual se resolvi por el mtodo de Runge-Kuttade cuarto orden con paso fijo. Los valores de los pa-rmetros cinticos empleados son los siguientes: =0.8069, = 0.0286, YX/S = 0.2038 y qP = 0.0163. Esde anotar que el valor obtenido del rendimiento apa-rente de biomasa a partir de sustrato corresponde al86.9% del valor del rendimiento de biomasa a partirde sustrato obtenido de la simulacin, lo cual indicaque la mayor parte del sustrato consumido se desti-n a la formacin de biomasa celular.) 1 (12SistemaX qdtdPdtdXY dtdSX XdtdXP SX = = = Figura 7. Determinacin de los parmetros cinticos de la ecuacinlogstica que modela la formacin de biomasaREVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA VOL. VI No.1 Julio 200443 - 54y = -0,0286x + 0,8069R2 = 0,99600.10.20.30.40.50.60.70.80 10 20 30X [g/L]1/X * dX/dt51El anlisis de varianza realizado para verificar siel modelo describe adecuadamente los datos experi-mentales muestra que el comportamiento de la biomasay del cido ctrico se ajusta al modelo propuesto. Sinembargo, la curva de sustrato generada por el modelono simula adecuadamente los datos experimentales.DISCUSINLos procesos comerciales para la produccin de ci-do ctrico se llevan a cabo por fermentacin de melazasempleando A. niger. Las melazas tienen como fuentede carbono principal la sacarosa. La utilizacin de sue-ro de leche para la produccin de cido ctrico implicala seleccin de microorganismos que tengan la capa-cidad de asimilar la lactosa del suero.Este estudio demuestra la viabilidad de utilizarlas cepas NRRL 368 y NRRL 67 de A. carbonariusparabiosintetizarcidoctricoapartirdesuerodeleche. Los resultados alcanzados son perspectivosconsiderandolasconcentracionesobtenidas(tabla2), en comparacin con A. niger que es el microorga-nismo utilizado en todo el mundo como productor decido ctrico en fermentaciones industriales. En par-ticular, la cepa de A. carbonarius NRRL 368 presen-t un promedio de concentraciones de cido ctricopara todos los tratamientos de 9.27 g/L, que es ma-yor a la concentracin alcanzada para A. niger tantoen el presente trabajo (0.34 g/L) como en otros estu-dios reportados. Por ejemplo, en el estudio de El-Holiy Al-Delaimy (2003) se obtuvo una concentracin de2.28g/Lalos10dasdefermentacinempleandosuerosinsuplementarencultivosuperficial.Enelcaso del trabajo de Hossain et al. (1983) se reportauna concentracin de 5.0 g/L a los 10 das de cultivosumergido para la mejor cepa productora de A. nigerde las 10 cepas estudiadas, siendo las restantes muyinferiores en produccin; slo llevando a cabo un pro-gramademutacinparaestacepaselogrincre-mentar la concentracin de cido ctrico hasta un ni-velde8.3g/Lparaelpermeadodesuerosinsuplementos adicionales (ver tabla 3).Sin embargo, se hace necesario profundizar enlas condiciones de cultivo del A. carbonarius, en vistade que no se presentaron diferencias significativas alvariar los tratamientos a los que fue sometido el suerode leche en las fermentaciones realizadas. La variabi-lidad observada para todas las muestras tomadas ylostratamientosempleadosenlasconcentracionesdecidoctricoobtenidasporA.carbonarius,hacenecesario ahondar en su estudio, tanto ms si se tie-ne en cuenta que en la literatura disponible no existenreportes detallados sobre las regularidades que rigenla biosntesis de este cido en el caso de este hongo.En especial, sera necesario establecer las tem-peraturas y valores de pH ptimos de cultivo para lascepas estudiadas. De otro lado, es necesario estu-diar las condiciones de preadaptacin de este hongoal medio basado en lactosuero para identificar cmolas condiciones de precultivo pueden afectar los ren-dimientos de cido durante la etapa de produccin.Los procesos industriales operan con una con-centracin inicial de sacarosa de aproximadamente140g/L,porloqueesparticularmenteimportanteexplorarlaposibilidaddelasdiferentescepasdeasimilarlosazcaresreductoresobtenidosdelahidrlisis enzimtica de la lactosa del suero de lechey que alcanzan concentraciones de aproximadamente83 g/L. Evaporando el lactosuero hidrolizado se pue-den obtener concentraciones de hasta 165 g/L, lo queimplica una disponibilidadsuficiente de sustrato parael cultivo de diferentes tipos de microorganismos, en-tre ellos de los hongos productores de cido ctrico.Precisamente, la cepa de A. niger NRRL 3 demostrmayores rendimientos con el suero desproteinizado,hidrolizado y evaporado. El efecto de la hidrlisis y laevaporacinindiscutiblementeaumentalaconcen-Figura8.Simulacindelafermentacinparalaproduccindecido ctrico a partir de suero de leche con A. niger NRRL 3.Datosexperimentales: ( ) Sustrato, S; ( ) Biomasa, X; ( ) Producto, P.Curvas calculadas a partir del modelo: 1 Sustrato;2 Biomasa;3Producto.Laslneascontinuascorrespondenalosdatoscalculadosporelmodelo,lascurvasconpuntosdiscretoscorresponden a los datos experimentales.OBTENCIN DE CIDO CTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE0204060801001201401601800 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11t[d]S, X [g/L]012345P [g/L]13252tracindeazcaresfermentables.Sinembargo,ladesproteinizacin del suero no influy sobre la pro-duccin de cido ctrico por A. niger; lo anterior indi-ca que los estudios subsiguientes pueden realizarsecon suero sin desproteinizar. Se propone la realiza-cindeensayosconmediosbasadosensuerodeleche suplementados con fuentes adicionales de car-bono y nitrgeno como metanol y extracto de leva-dura. Esta suplementacin eventualmente puede in-crementarlosrendimientosdelcidoalaportarnutrientes clave en su biosntesis, aunque eleva loscostosdeunapotencialfermentacinindustrial,lomismo que la evaporacin del medio.Otra opcin a considerar para aumentar la pro-duccin de cido ctrico tanto en el caso de A. niger,como en el de A. carbonarius, consiste en explorarla mutacin inducida de los microorganismos estu-diados con el fin de obtener cepas productoras decido ctrico de mayor rendimiento. De esta mane-ra, la combinacin de esta tcnica con los diferen-tes tratamientos de suero aqu estudiados permiti-ra aumentar las concentraciones de cido obtenidasen el presente trabajo.Losresultadosdelafermentacinenelbiorreactor de 3 L con A. niger revelan que los az-caresreductoresnosoncompletamenteutilizados(porcentajedeutilizacindel75.5%)porloquesepuedeexplorarlaposibilidaddeaumentarsutasade utilizacin en futuros trabajos. En este aspecto esfundamentalprofundizarenladeterminacindelosvalores ptimos de las condiciones de cultivo (pH, tem-peratura, aireacin) que contribuyan a una mayor asi-milacindelsustratoyproduccindecidoctrico.Igualmente, es necesario hacer un seguimiento a laconcentracin de nitrgeno inorgnico en el medio paracorrelacionarlo con la biosntesis del cido.Laformacindecidoctricoeneltiempode-muestra que este metabolito est indirectamente rela-cionadoconelcrecimientocelular,yaquesepuedeobservar un desfase entre las curvas correspondien-tes. Lo anterior fundamenta la eleccin del modelo uti-lizado para la simulacin de la formacin del producto.Las curvas generadas por el modelo matemti-coseajustaronalosdatosexperimentalesdebiomasa y cido ctrico, no as a los de sustrato. Parasimular el comportamiento de los azcares reductoresse deben emplear otros modelos que tengan en cuen-ta tanto el consumo de sustrato para la formacin debiomasa como para la biosntesis del cido.La comparacin realizada con los resultadosdela simulacin obtenidos anteriormente para un culti-vosumergidodeA.nigerenunmediobasadoenglucosa (Vinarov et al., 1996), muestra que las prin-cipales regularidades cinticas se conservan cuan-do el medio de cultivo es reemplazado por suero deleche desproteinizado, con lactosa hidrolizada y eva-porado.Enparticular,laformacindebiomasasepudo describir de la misma forma que para el casodel medio basado en glucosa. De otro lado, aunqueel modelo utilizado para la formacin de cido ctricoeneltrabajodeVinarovycol.tuvoencuentaunainhibicin al final de la fermentacin, durante la ma-yor parte del tiempo de cultivo se verific la propor-cionalidad entre la formacin de producto y la con-centracindebiomasa;finalmente,elconsumodesustrato no pudo ser descrito con las mismas expre-siones cinticas.A. niger IMI 41874A. niger IMI 51433A. niger ATCC 26550A. niger MH 15-15*A. niger CAIM 111A. niger ATCC 9642A. niger NRRL3 (ATCC 9029)A. carbonarius NRRL 368CepaTabla 3. Concentracin de cido ctrico obtenida por fermentacin de suero de leche en varios estudiosTipo de cultivo Tratamiento delsueroTiempo decultivo (d)SumergidoSumergidoSumergidoSumergidoSumergidoSuperficialSumergidoSumergidoPermeadoPermeadoPermeadoPermeadoEnteroEnteroDesproteinizado,hidrolizado,evaporadoVarios10101089101010cido ctrico(g/L)Referencia5.02.62.58.31.12.35.79.3Hossain et al.El-Samragy et al.El-Holi y Al-DelaimyEste trabajoEste trabajo* Mutante de la cepa IMI 41874REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA VOL. VI No.1 Julio 200443 - 5453CONCLUSIONESCon el presente trabajo se demuestra que el suerode leche es un medio de cultivo que proporciona losnutrientes necesarios para el desarrollo de las cepasdeAspergillusspp.empleadas,ascomoparalabiosntesis de cido ctrico.El hongo A. carbonarius ha sido poco estudia-do en cuanto a formacin de productos de valor agre-gado se refiere, por lo que se requiere la realizacindeestudiosposterioresconelobjetivodeutilizarlocomo un microorganismo adicional de potencial apli-cacin industrial.Se demuestra que el hongo A. niger no asimilaadecuadamentelalactosadelsuerodeleche.Suhidrlisis y la concentracin del suero por evapora-cin representan una estrategia vlida para aumen-tar la disponibilidad de sustratos fermentables e in-crementar los rendimientos del cido. Sin embargo,la evaporacin de grandes cantidades de lactosueroimplica grandes costos energticos al momento deescalar el proceso a nivel industrial.Se hace necesario emplear otras tcnicas y es-trategias para maximizar la obtencin de cido ctricoapartirdesuerodeleche,debidoaquelosrendi-mientos obtenidos son muy inferiores en comparacincon los procesos industriales a partir de melazas. Noobstante, el suero de leche contina siendo una alter-nativa potencial considerando su gran disponibilidad,su contenido de nutrientes y la necesidad de ser apro-vechado para minimizar el impacto ambiental que cau-sa su vertimiento a los cursos de agua naturales.El modelamiento matemtico de la biocinticademostr ser una potente herramienta para la simu-lacin del proceso de fermentacin al describir ade-cuadamente el crecimiento de la biomasa y la forma-cindelcidoctrico.Estosmodelossondegranutilidad durante el diseo del proceso y constituyenel primer paso para la simulacin de la transferenciade masa, de calor y las condiciones hidrulicas delcultivo en biorreactores comerciales.AGRADECIMIENTOSLosautoresexpresansusagradecimientosaldoctorStephenW.Peterson,curadordelacoleccindeAspergillusyPenicilliumdelNationalCenterforAgricultural Utilization Research en Peoria, Illinois (EUA),por el suministro de las cepas objeto de este estudio,as como a la doctora Carmen Dussn, directora delDepartamentodeMatemticasdelaUniversidaddeCaldas, por su valiosa asesora estadstica. Este traba-jo fue financiado por la vicerrectora de Investigacionesy Posgrados de la Universidad de Caldas.NomenclaturaP = Concentracin de producto, g/LqP= Velocidad especfica de formacin de producto,g producto/(g biomasa.d)S = Concentracin de sustrato, g/Lt= Tiempo, dX = Concentracin de biomasa, g/LYX/S= Rendimiento de biomasa a partir de sustrato, gbiomasa/g sustrato = Coeficiente de interaccin celular, L/(g.d) = Coeficiente de velocidad de formacin debiomasa, d-1BIBLIOGRAFAAbou-Zeid, A. Z.; Baghlaf, A. O.; Khan J. A.; Makhasin S. S.1983. Utilization of date seeds and cheese whey in theproduction of citric acid by Candida lipolytica. Arab GulfJ. scient. Res. 1 (1): 267-283.Al-Asheh,S.;Duvnjak,Z.1995.Theeffectofphosphateconcentration on phytase production and the reductionofphyticacidcontentincanolamealbyAspergilluscarbonariusduringasolid-statefermentationprocess.Appl. Microbiol. and Biotechnol. 43 (1): 25-30.Baena, S.; Campos, C.;Rojas, G. 1994. 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