Nuôi cấy mô sau xoan ta

Đề tài:

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY XOAN TA

(MELIA AZEDARACH L.) THÔNG QUA PHÔI SOMA TỪ

THÂN MẦM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giang, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà

BÁO CÁO MÔN

NUÔI CẤY MÔ VÀ CHỌN GIỐNG THỰC VẬT

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thanh HiềnLớp: 10060302Tp. Hồ Chí Minh, ngày 7 tháng 4 năm 2014

SV thực hiện:1) Nguyễn Triết Lãm - MSSV: 610032122) Nguyễn Hoàng Lưu Phúc - MSSV: 610032323) Bùi Đức Phúc - MSSV: 611032884) Tạ Thị Thùy Dung - MSSV: 61103246

Bảng đánh giá:

TT Thành phần Điểm

1 Nội dung

2 Hình thức trình bày slide

3 Thuyết trình

4 Trả lời câu hỏi

5 Teamwork

Tổng

Nội dung chính

Chương 1: Tổng Quan

Chương 2: QT nhân giống phôi

soma

Chương 3: Kếtquả và thảo

luậnPhụ lục

Chương 1: Tổng quan

- Đặc điểm cây Xoan Ta?

- Vùng phân bố?

- Ứng dụng của cây Xoan ta.

- Vì sao phải nhân giống câyXoan Ta?

Chương I: Tổng quan

1. Giới thiệu

1. Giới thiệu:

• Coy Xoan Ta có nguồn gốc từ nam châu

Á.

• Ngoài việc sử dụng gỗ để trang trí dịch

chiết từ lá thân hoa quả có đặc tính như

thuốc trừ sâu .

• Dịch chiết từ lá có khả năng ức chế sự tái

bản của tế bào vi khuẩn, vius gây bệnh ở

người và động vật (virus Tacaribe gây

bệnh viêm não ở chuột).

Chương I: Tổng quan

2. Phân bố vàđặc điểm

2. Phân bố & đặc điểm:

• Cây xoan ta phân bố chủ yếu ở Việt Nam, Lào, TQ.

• Ở nước ta: được trồng thành rừng hoặc phân tán hầu hết ở các tỉnh và

là một cậy trồng quan trọng trong chiến lược phát triển lâm nghiệp đất

nước. Nó có mặt ở 6 trên 9 vùng sinh thái lâm nghiệp.

2. Phân bố và đăc điểm:

• Đây là loài cây gỗ lớn có thể cao đến 30m

đường kính lớn gần 100cm.

• Gỗ xoan có lõi màu hồng hay màu nâu nhạt,

dác xám trắng gỗ nhẹ, có vân thớ đẹp nếu

được ngâm tẩm thì đây là loại gỗ bền khó bị

mối mọt, cho nên gỗ xoan thường được dùng

làm xây dựng trang trí nội thất và điêu khắc.

• Nhưng khi mới khai thác thì đây là loại gỗ mềm

khó sử dụng.

Chương 1: Tổng quan

3. Vì sao phải nhân giống cây Xoan Ta?

3. Vì sao phải nhân giống cây Xoan Ta?

a. Nhu cầu sử dụng:

• Tuy phạm vi thích nghi rộng, dễ trồng, yêu cầu dinh dưỡng đất thấp, sản lượnggỗ chất lượng cao, nhanh nhưng do nhu cầu SD làmđồ trang trí, chất đốt,… nên sản lượng bị thu hẹp.

b. Điều kiện sinh lý:

• Do hạt giống cây Xoan Ta làhạt hai lá mầm, khó mọc nếunên cần có các kỹ thuật nhân giống phù hợp để cung cấpđủ lượng cây giống cho thịtrường

Chương 2: QT nhân giốngphôi soma

- Quy trình nhân giống như thế nào?

- Thành phần môi trường dinhdưỡng?

- Điều kiện tối ưu cho nuôi cấy.

Chương 2: QT nhân giống phôi soma

1. Nguyên liệuTV

2. Khử trùng hạtvà chuẩn bị

nguyên liệu tạophôi soma

3. Cảm ứng tạomô sẹo

4. Cảm ứng tạophôi soma

5. Phôi soma nảy mầm

6. Tạo rễ và racây

Sơ đồ quy trình nhân giống phôi soma cây Xoan Ta.


1. Nguyên liệu TV

1. Nguyên liệu TV

• Quả Xoan Ta được chọn lọc và thu hái từ

những cây trội (chống chịu hạn, năng suất

cao về khối lượng gỗ,…) sau đó loại bỏ

phần thịt quả và tách lấy hạt làm vật liệu

nuôi cấy.

• Thu hái là khâu quan trọng nhất và có ý

nghĩa quyết định đến lựa chọn được hạt

giống tốt. Thời gian thu hái tốt nhất là vào

giai đoạn quả chín sinh lý từ tháng 12 đến

tháng 2 năm sau.


2. Khử trùng hạt và chuẩn bịnguyên liệu tạo phôi soma

Sát khuẩn bề mặt hạt bằng ethanol 70% trong 3 phút.

Khử trùng bằng javen 100% và chuyển sang javen 50% trong 5 phút (lắc nhẹ).

Loại bỏ javen và rửa sạch bằng nước cất vôtrùng 10 lần.

Sau khi đã khử trùng, cấy hạt trên môi trườngMS bổ sung 3% Saccharose với mật độ 15 hạttrên 1 bình tam giác 250ml.

2. Khử trùng hạt và chuẩn bị nguyênliệu tạo phôi soma


3. Cảm ứng tạo mô sẹo

3. Cảm ứng tạo mô sẹo

Hạt nảymầm sau 2 tuần nuôicấy trên môitrường MS.

Cắt thânmầm thànhđoạn có kíchthước 0,5 cm.

Cấy mẫu cắtlên môitrường CL (Bảng 1).

Nuôi cấytrongkhoảng 4 tuần.


4. Cảm ứng tạo phôisoma

4. Cảm ứng tạo phôi soma

Cụm mô sẹođược tách bỏ

những thân cũ.

Cấy truyền sang môi trường SE

(Bảng 1).

Nuôi cấy trong6 tuần.




Cụm phôi đãnảy mầm.

Cấy truyền sang môi trường RE

(Bảng 1).

Nuôi cấytrong 6 tuần.


6. Tạo rễ và ra cây

Chồi đạt chiều dàitừ

0,7 – 1,5 cm.

Cấy chuyền sang môi trường R

(Bảng 1) trong 4 tuần.

Cây có bộ rễ hoànchỉnh được chuyển

ra nhà lưới.

Trồng trên giá thể: đât cát pha 60% cộng, trấu hun

40%.

Trong 2 tuần đâutránh ánh sángchiếu trực xạ.

Cây đủ điều kiệnxuất bán cây giống.

6. Tạo rễ và ra cây

Chương 3: Kết quả vàthảo luận

- Đặc điểm cây Xoan Ta?

- Vùng phân bố?

- Ứng dụng của cây Xoan ta.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

1. Khả năng cảm ứngmô sẹo từ thân mầm

1. Khả năng cảm ứng mô sẹo từ thânmầm• Trong nghiên cứu này các nồng độ từ 5 - 10 mg/L NAA và 1 mg/L BAP (bảng 2) được

sử dụng tạo mô sẹo từ thân mầm. Kết quả hầu hết các nồng độ có khả năng tạo mô

sẹo tuy nhiên chỉ ở nồng độ 3 mg/L NAA, 1mg/L BAP mô sẹo phát triển tốt nhất (tỷ

lệ tạo mô sẹo 92,2%) (Bảng 2). Ở nồng độ 2,4 mg/L NAA mặc dù mô sẹo vẫn phát

triển, tuy nhiên tỷ lệ tạo mô sẹo và chất lượng mô sẹo thấp hơn.

• Ở nồng độ 2,2 mg/L NAA khi kéo dài thời gian tạo mô sẹo xuất hiên hiên tượng mô

sẹo khô và chết dần thời gian tạo mô sẹo thích hợp nhất là 4 tuần. Ở các mốc thời

gian sớm hơn 4 tuần thì mô sẹo phát triển chưa đầy đủ và khi kéo dài hơn 4 tuần thì

mô sẹo bắt đầu khô và chết.

• Điều này có thể giải thích là do ảnh hưởng của các hợp chất thứ cấp

tiết ra từ mẫu cấy. Một yếu tố ảnh hưởng khá quan trọng đến khả năng

tạo mô sẹo là tuổi cây. Nếu dùng thân quá già thì tỷ lệ tạo mô sẹo thấp.

Tuổi cây sử dụng tạo mô sẹo tốt nhất là khoảng 15 đến 20 ngày sau

khi đặt hạt trên môi trường nảy mầm.

1. Khả năng cảm ứng mô sẹo từ thânmầm


2. Khả năng cảm ứngphôi từ mô sẹo

• Sau khi nuôi trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo 4 tuần, các cụm mô

sẹo được chuyển sang môi trường SE. Sau 3 tuần nuôi cấy đã xuất hiện

các phôi đầu tiên. Tuy nhiên số lượng phôi và chất lượng phôi thay đổi

phụ thuộc vào nồng độ BAP. Ở nồng độ 7 mg/L mặc dù phôi vẫn xuất

hiện, nhưng số lượng ít. Ở nồng độ 9 mg/L thì số lượng phôi xuất hiện

cũng tương đối nhiều (9,3 phôi/cụm mô sẹo), nhưng nếu duy trì trên

môi trường nuôi cấy thì phôi bắt đầu thay đổi từ màu vàng ngà sang

màu trắng. Ở nồng độ 11 mg/L NAA phôi phát triển tốt nhất cả về số

lượng lẫn chất lượng, số phôi soma tạo được cao nhất là 12,7 phôi trên

đoạn thân mầm ban đầu.

2. Khả năng cảm ứng phôi từ mô sẹo


3. Khả năng nảy mầmcủa phôi

• Sau thời gian nuôi cấy trên môi trường SE3 (Bảng 3) ít nhất 4

tuần, các phôi hình thành và chuyển sang giai đoạn phôi chín.

Các cụm phôi chín này được chuyển sang môi trường có nồng độ

BAP thấp (1 mg/L BAP) để nảy mầm tạo thành cây hoàn chỉnh.

Giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng với thí nghiệm, vì nếu số

lượng phôi tạo ra nhiều nhưng không nảy mầm được thì cùng

không thể có ý nghĩa. Tỷ lệ phôi nảy mầm càng cao thì xác suất

chọn được cây biến nạp càng lớn. Kết quả có khoảng 70% số

phôi có khả năng nảy mầm, tỷ lệ này rất có ý nghĩa cho các thí

nghiệm chuyển gen vào cây xoan ta.

3. Khả năng nảy mầm của phôi


4. Khả năng tạo rễ

• Theo Thakur và đồng tác giả năm (2004), môi trường MS bổ

sung thêm IBA ở nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng ra

rễ sẽ tăng cường khả năng tạo rễ cây. Các chồi đạt chiều dài

từ 0,7 đến 1,5 cm, giai đoạn đầu được cấy lên môi trường

tiền cảm ứng tạo rễ MS bổ sung 3 mg/L IBA + 3%

saccharose, nuôi trong thời gian 3 ngày và sau đó cấy chuyền

sang môi trường MS có chứa 1% saccharose không chứa

chất điều hòa sinh trưởng nuôi tiếp trong thời gian 4 tuần.

Kết quả thu được cho thấy tỷ chồi ra rễ đạt 100%.

4. Khả năng tạo rễ


5. Khả năng sống sót khiđưa cây ra vườn ươm

• Cây con có bộ rễ phát triển được chuyển ra trồng trên giá thể

trấu hun pha cát với tỷ lệ 4:6. Trong 2 tuần đầu cây được

nuôi trrong phòng nuôi cấy với nhiệt độ 27oC, cường độ

chiếu sang 1000 – 1500 lux, thời gian chiếu sang 12h/ngày.

Sau 2 tuần đầu cây mô được đưa ra trồng trong nhà lưới,

tuần đầu tránh ánh sang chiếu trực xạ và chăm sóc cây mô

như cây hom. Tỷ lệ cây mô sống sót trên giá thể trấu hun cát

pha đạt 100%.

5. Khả năng sống sót khi đưa cây ravườn ươm

Phụ lục- Phụ lục 1.- Phụ lục 2.- Phụ lục 3.- Phụ lục 4.

Bảng 1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy.

Môi trường Ký hiệu Thành phần

Nảy mầm G MS + 30g Saccharose + 7g Agar

Cảm ứng mô sẹo CL MS + BAP(1 mg/L) + NAA (từ 1 đến 5 mg)

Cảm ứng tạo phôi SE MS + BAP(từ 7 đến 15mg/L) + 60g Saccharose + 7g agar

Phôi soma nảy mầm RE MS + 1mg/L BAP + 30g Saccharose + 7g Agar

Ra rễ R MS + 1mg/L BAP + 30g Saccharose

MS + 10g Saccharose

Phụ lục 1

Bảng 2: Kết quả tạo mô sẹo.

Môi trường NAA(mg/L) BAP(mg/L) Thân mầm Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo

CL1 1 1 95 72,6

CL2 2 1 110 75,5

CL3 3 1 90 92,2

CL4 4 1 115 77,4

CL5 5 1 123 74,0

Phụ lục 2

Bảng 3: Tỷ lệ % cụm mô sẹo cảm ứng phôisoma và số phôi soma trung bình/cụm mô sẹo.

Môi trường BAP(mg/L) Cụm mô sẹoTỷ lệ cảm ứng

phôi soma (%)

Số phôi soma

TB/cụm mô sẹo

nuôi cấy

SE1 7 56 78,6 4,7

SE2 9 56 87,5 9,3

SE3 11 60 95,0 12,7

SE4 13 52 82,7 7,3

SE5 15 65 78,5 5,7

Phụ lục 3

Phục lục 4

• Các môi trường được sử dụng được điều chỉnh pH = 5,8 và

bổ sung thêm 7 g/L agar.

• Khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1,5 atm trong 15 phút.

Nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ ánh sang 3000 lux

với thời gian chiếu sáng 16h/ngày.

Tài liệu tham khảo

[1]. Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giang, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà, Nghiên cứu hệ thông táisinh cây Xoan Ta ( Melia azedarach L.) thông qua phôisoma từ thân mầm phục vụ chuyển gen, Tạp chí côngnghệ sinh học, số 6, 2008.

[2]. Đoàn Thị Hoa, Đỗ Phương Chi, Đặng Thị Thu Huyền, Nghiên cứu hạt giống và nhân giống cây XoanTa Ta ( Melia azedarach L.) bằng hạt tại tỉnh Hòa Bình, Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam, số 8, 2008.

Thanks!Cảm ơn Cô và các bạn

đã chú ý theo dõi!

Documents

Nuôi cấy mô sau xoan ta