Nukleinsäuren: Replikation und Transkription

Das Zentrale Dogma (F. Crick, 1956):

Biochemie 06/1

DNA Replikation

Bei der Zellteilung muss die DNA schnell, effizient und korrekt vermehrt werden.

Aus einem Doppelstrang werden zwei identische Tochter-Stränge, wobei das Experiment von Meselson & Stahl gezeigthat, dass die DNA-Replikation semikonservativ verläuft.

Biochemie 06/2

DNA-Replikation

Biochemie 06/3

DNA Polymerisation

DNA-Polymerase(DNA-abhängig)

dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Biochemie 06/4

DNA-Polymerasen

E. coli: DNA-Polymerase I, II, III (Pol I, Pol II, Pol III)

Pol I Pol II Pol IIIMasse (kD) 103 90 130Moleküle/Zelle 400 ? 10-20Wechselzahl* 600 30-60 60.000Strukturgen polA polB polCLetale Mutante + - +Polymerase:

5‘3‘ + + +Exonuclease

3‘ 5‘ + + +5‘ 3‘ + - -

*neue Nucleotide/min und Molekül bei 37°CBiochemie 06/5

Polymerisationsrichtung: 5‘3‘

Die DNA-Polymerisation verläuft immer in 5‘3‘-Richtung!!!!DNA-Polymerase kann nur Oligonucleotide verlängern!

ElternstrangFolgestrang (Okazakifragment)Leitstrang

Bewegung derReplikationsgabel

Biochemie 06/6

DNA-Replikation

• Entwindung der DNA: Einzelstrang• Stabilisierung der Einzelstränge• RNA-Primer durch Primase• Verlängerung durch DNA-Polymerase III• Leit- und Folgestrang• Nick-Translation durch DNA-Polymerase I• DNA-Ligase

Biochemie 06/7

DNA-Replikation bei E. coli

Untersuchung mit Hilfe von AutoradiogrammenReplikationsauge: Θ-Struktur

Biochemie 06/8

Replikations-Typen

Biochemie 06/9

Initiation der Replikation

• oriC-Locus: 245 bp, stark konserviert,„Origin of Replication“

• 30 UE von DnaA-Protein (52 kD) binden an oriC, schmelzen DNA auf

• Helikase: DnaB (Hexamer) entwindet DNA,ATP-abhängig

• Einzelstrang-Bindungsproteine (SSBs) stabilisieren die einzelsträngige DNA

Biochemie 06/10

Initiation der Replikation

Biochemie 06/11

Komplex aus SSB und DNA

ssDNA

SSB

Biochemie 06/12

Primase (DnaG)

• DNA-abhängige RNA-Polymerase• Synthese eines RNA-Primers durch Primase (DnaG)• Teil des Primosom (mit DnaA, DnaB, PriA,B,C, DnaT)

Biochemie 06/13

RNA-Primer

• 10-12 Basen lang• etwa alle 1000 Basen auf der DNA (Folgestrang)

Biochemie 06/14

RNA-Primer

Okazaki-Fragmente:• Prokaryonten: 1.000-2.000 Basen• Eukaryonten: 100-200 Basen

Biochemie 06/15

Replikation

• Entwindung der DNA: Einzelstrang• Stabilisierung der Einzelstränge• RNA-Primer durch Primase• Verlängerung durch DNA-Polymerase III• Leit- und Folgestrang• Nicktranslation durch DNA-Polymerase I• DNA-Ligase

Biochemie 06/16

DNA-Polymerase III

Holoenzym: Multiproteinkomplex

Biochemie 06/17

Komponenten der DNA-Polymerase III (E. coli)

Biochemie 06/18

DNA-Polymerase III

Core-Enzyme:α-Untereinheit: Polymerase 5‘3‘ε-Einheit: Exonuclease 3‘5‘θ-Einheit: Hilfsprotein

Biochemie 06/19

DNA-Polymerase III

β-Untereinheit: sliding clamp

Biochemie 06/20

DNA-Polymerase III

β-Untereinheit: sliding clamp

Biochemie 06/21

DNA-Polymerase III

Core-Enzym: 10-15 BasenHoloenzym: >5.000 Basen!

Prozessivität:

Katalyse-Zyklen, ohne vom Substrat abzufallen

Biochemie 06/22

DNA Rotation

Biochemie 06/23

DNA Rotation

Replikationsgeschwindigkeit (E. coli):

500-800 Nukleotide/sec

50-80 Rotationen/sec wären nötig!(~3.000-5.000 rpm)

großer Energie-Verbrauch!

Biochemie 06/24

DNA Rotation

Topoisomerase

Biochemie 06/25

DNA Rotation

Replikationsgeschwindigkeit (E. coli):

500-800 Nukleotide/sec

50-80 Rotationen/sec wären nötig!(~3.000-5.000 rpm)

großer Energie-Verbrauch!

Biochemie 06/26

RNA Primer

RNA Primer(müssen noch gegen DNA ausgetauscht werden!)

Biochemie 06/27

DNA-Polymerase I

928 Aminosäuren

Polymerase5‘3‘

Exonuklease3‘5‘ erlaubt eigene Fehlerkorrektur5‘3‘ repariert Einzelstrangbrüche, entfernt RNA Primer

Biochemie 06/28

DNA-Polymerase I

Exonuklease 5‘3‘Polymerase 5‘3‘

Nick

Nick Translation

Biochemie 06/29

DNA-Polymerase I

Exonuklease 5‘3‘Polymerase 5‘3‘

*

* * * * *

radioaktive Markierung der DNA

Biochemie 06/30

DNA-Polymerase I

Exonuklease 3‘5‘ Korrekturfunktion (Proofreading)

Biochemie 06/31

DNA-Ligase

Biochemie 06/32

DNA-Ligase

NAD+

ATP

Biochemie 06/33

Replikations-Gabel (3D)

Biochemie 06/34

Replikations-Gabel (3D)

Biochemie 06/35

Termination der Replikation

Ter-Sequenz: ~23 bp350 kb Region DNA Polymerase

DNA Polymerase

Biochemie 06/36

Termination der Replikation

Tus-Proteinebinden anTer-DNA

Ter-Sequenz: ~23 bp350 kb Region DNA Polymerase

DNA Polymerase

Biochemie 06/37

Termination der Replikation

Tus-Protein (Terminator utilization substance) mit ter-DNA

Biochemie 06/38

Replikation

E. coli:Replikation des Genoms: 35-40 min.Zellteilung: 20 min!

Biochemie 06/39

Replikation

E. coli:Replikation des Genoms: 35-40 min.Zellteilung: 20 min!

Biochemie 06/40

Replikation bei Eukaryonten

Biochemie 06/41

Zellzyklus

Mitose

Interphase

Biochemie 01/42

Replikation bei Eukaryonten

• DNA-Polymerase fest assoziierte Primase-Aktivität, keine Exonuclease-Aktivitätsynthetisiert ca. 100 nt

• DNA-Polymerase im Komplex mit PCNAExonuclease-Aktivitäthohe Prozessivität

• DNA-Polymerase Exonuclease-Aktivitäthöchste Prozessivität

• DNA-Polymerase β (Reparatur)• DNA-Polymerase γ (Mitochondrien)

Folgestrang-Polymerase

(proliferating cellnuclear antigen)

Leitstrang-Polymerase

Biochemie 06/43

Initiation bei Eukaryonten

Menschliches Genom:3x109 bp

E. coli Genom:4.7x106 bp

Biochemie 06/44

Initiation bei Eukaryonten

Biochemie 06/45

Eukaryontische Sliding Clamp

Prokaryonten:

Eukaryonten:

Biochemie 06/46

DNA-Polymerase β

DNA-Polymerase βKlenow Fragment

Biochemie 06/47

Replikationsauge

E. coliD. melanogaster

Biochemie 06/48

Verteilung der Nukleosomen

Biochemie 06/49

Ligase (Eukaryonten)

Biochemie 06/50

DNA-Ligase (Eukaryonten)

NAD+

ATP

Biochemie 06/51

ATPPPi

ATP

Termination bei Eukaryonten

Prokaryonten: Eukaryonten:

meist zirkulär linear

Biochemie 06/52

Termination bei Eukaryonten

Biochemie 06/53

Telomerase

Telomerase ist ein Ribonucleo-Protein!

Protein- und RNA-UntereinheitBiochemie 06/54

Telomerase

Biochemie 06/55

Telomer-Struktur

Hoogsteen-Wasserstoffbrücken

G-Quartett

Biochemie 06/56

Nukleinsäuren: Replikation und Transkription

Das Zentrale Dogma (F. Crick, 1956):

Biochemie 06/57

Transkription

DNA:

RNA:

Biochemie 06/58

Transkription

DNA:

RNA:

Biochemie 06/59

Transkription

RNA:

Biochemie 06/60

Transkription

RNA:

Biochemie 06/61

(3) (-)

Transkription

Biochemie 06/62

Transkription

DNA: Sense/codierender StrangDNA: Antisense/nicht codierendRNA: Transkript

(codogen)

Biochemie 06/63

Transkription

Biochemie 06/64

RNA-Polymerase in E. coli

Biochemie 06/65

RNA-Polymerase: E. coli

RNA Polymerase Klenow Fragment

Biochemie 06/66

RNA-Polymerase: E. coli

RNA Polymerase

Cα–Kette von analogem Segment der KLENOW-DNA-Pol

Biochemie 06/67

Transkriptionsstart

Replikation:

Transkription:

Primer-abhängig!

Primer-unabhängig!

Biochemie 06/68

Promotor

Biochemie 06/69

Promotor

Konsensussequenzen: codierender Strang

-35-Region -10-Region

Biochemie 06/70

Transkriptionsstart

geschlossener Komplex

Bindung der RNA-Polymerase mittels Sigma-Faktor

+

Biochemie 06/71

Transkriptionsstart

Sigma-Faktor: Helix-Turn-Helix-Motiv

große Furche

Erkennung

Fixierung

Biochemie 06/72

Transkriptionsstart

geschlossener Komplex

offener Komplex

Aufschmelzen des Doppelstranges

Biochemie 06/73

Transkriptionsstart

offener Komplex

Transkription ohne Sigma-Faktor

Biochemie 06/74

Transkriptionsstart

Biochemie 06/75

Transkription

Synthese verläuft in 5‘ 3‘-Richtung(analog der DNA-Synthese)

EM-Aufnahme bakterielle Transkription von zwei rRNA Genen

Biochemie 06/76

Termination der Transkription

Terminator

Biochemie 06/77

Termination der Transkription

Rho-unabhängigerTerminator

Biochemie 06/78

Termination der Transkription

Biochemie 06/79

Organisation bakterieller Gene

Operon-Struktur

mRNAZ Y A

Biochemie 06/80

Transkription bei Eukaryonten

RNA-Polymerase II (Hefe)

DNARNA

Roger KornbergStanford

Nobelpreis Chemie 2006:

Biochemie 06/81

Transkription bei Eukaryonten

• RNA-Polymerase I: synthetisiert rRNA• RNA-Polymerase II: synthetisiert mRNA• RNA-Polymerase III: 5S-rRNA, tRNAs,

nukleäre und cytosolische RNAs

• Multimere Proteinkomplexe:2 große, nicht identische UE (>100 kD)< 12 kleine UE (<50 kD)

Biochemie 06/82

Transkription bei Eukaryonten

T. aquaticus S. cerevisiaePol II

Biochemie 06/83

Transkriptionsstart

Konsensus-Sequenz des Transkriptionsstarts der RNA-Polymerase II

-70 bis -90CCAAT-Box

Biochemie 06/84

Transkriptionsstart

Weitere Regulationselemente: Enhancer, …

Biochemie 06/85

Transkriptionsstart

Biochemie 06/86

Präinitiationskomplex

PIC: Präinitiationskomplex Biochemie 06/87

Transkription bei Eukaryonten

Biochemie 06/88

RNA Prozessierung

Biochemie 01/89

RNA Prozessierung

GMP-Addition, Methylierung der ersten Nukleotide

Schnitt der prä-mRNA und Addition von A-Resten

Entfernen von Introns

Biochemie 01/90

Struktur einer eukaryontischen mRNA:

5‘-Kappe

Biochemie 01/91

5‘-Kappe

• 7-Methylguanosin über 5‘, 5‘-Triphosphat an 5‘-Ende

• Guanylyltransferase:an Transkripte über 20 nt

• Export aus dem Zellkern

• verhindert Abbau durch Exonukleasen, erhöht die Stabilität der mRNA

• Ribosomen-Assembly

Biochemie 01/92

5‘-Capping-Mechanismus

S-Adenosyl-Methionin(SAM)

S-Adenosyl-Homocystein

Biochemie 01/93

RNA Prozessierung

Schnitt der prä-mRNA und Addition von A-Resten

Entfernen von Introns

Biochemie 01/94

Struktur einer eukaryontischen mRNA:

3‘-Polyadenylierung

• Poly(A)-Schwanz am 3´-Ende nach der Transkription durch Poly(A)-Polymerase

• erhöht die Stabilität am 3´-Ende gegenüber Exonuklease

Biochemie 01/95

RNA Prozessierung

Entfernen von Introns

Biochemie 01/96

Struktur einer eukaryontischen mRNA:

Exon/Intron-Struktur

Biochemie 01/97

Exon/Intron-Struktur

Biochemie 01/98

Exon/Intron-Struktur

Exons: Expressed Regions; Bereiche in DNA/RNA, die für Teile des Proteins codieren

Introns: Intervening Regions; DNA-/RNA-Bereiche zwischen Exons, die nicht codieren und auf RNA-Ebene entfernt werden müssen

Biochemie 01/99

Konsensus-Sequenz der Exon/Intron-Grenzen

G100=100% G, A60 = 60% A etc.

Biochemie 01/100

Herausschneiden von Introns: Splicing

Biochemie 01/101

Splicing

Splicing.mov

Biochemie 01/102

Posttranskriptionale Modifizierung

GMP-Addition, Methylierung der ersten Nukleotide

Schnitt der prä-mRNA und Addition von A-Resten

Entfernen von Introns

Biochemie 01/103

Struktur einer eukaryontischen mRNA:

Alternatives Splicing

Biochemie 01/104

Alternatives Splicing

- neue, zusätzliche Funktionen- andere Regulation, andere Substratspezifität

Biochemie 01/105

Alternatives Splicing

Humanes Genom:

Caenorhabditis elegans: 19.000Drosophila melanogaster: 14.000Saccharomyces cerevisiae: 6.500Arabidopsis thaliana: 26.000

bis zu 75% aller humanen Gene mit alternativem Splicing!

Biochemie 01/106

Reifung der mRNA

Biochemie 01/107

Zentrales Dogma der Biologie

Das Zentrale Dogma (F. Crick, 1956):

Biochemie 07/108