KV: DNA-ReplikationMichael Altmann

Herbstsemester 2008/2009

Institut für Biochemie und Molekulare Medizin

Übersicht VL DNA-Replikation

1.) Das Zentraldogma der Molekularbiologie

1.) Semikonservative Replikation

2.) Matrizengesteuerte DNA-Synthese

3.) DNA-abhängige Primase

4.) Kontinuierlich vs. diskontinuierlich

5.) Koordinierte Synthese an der Replikationsgabel

6.) Abschliessende Schritte der DNA-Synthese

7.) Ligation von DNA

8.) Problematik bei der Replikation linearer DNA

8.) Funktion der Telomerase

9.) Replikationsursprünge

10.) Negatives Supercoiling

11.) Topoisomerasen

12.) Transition und Transversion

13.) Prinzip der DNA-Reparatur

14.) Homologe Rekombination bei der Meiose: Crossing-over

DNA-Replikation

DNA

RNA

RNA-Replikation

Protein

revers

eTr

ansk

riptio

n

Protein

cDNADNA

RNA

Das Zentraldogma der Molekularbiologie

Trans

kripti

on

T.A. Brown, Moderne Genetik (2. Auflage 1999), Abb. 4.7

Translation

Semikonservative Replikation

Meselson-Stahl-Experiment (1958):• Beide Tochterzellen erhalten je einen DNA-Strang der Mutterzelle

• Die Replikation ist ein sehr genauer Prozess(Fehlerrate 10-10)

Matrizengesteuerte DNA-Synthese

• Syntheserichtung: immer 5‘->3‘,Ableserichtung: immer 3‘->5‘

• Antiparalleler Verlauf des neu synthetisiertenStranges

• Die DNA-Polymerase braucht zur Syntheseeine abzulesende Matrize undeinen Primer, ein kurzes RNA-Stück mit einemfreien 3‘-OH Ende

DNA-abhängige Primase

• Primase: DNA-abhängige RNA-Polymerase, dieden Primer für die DNA-Synthese polymerisiert

• RNA-Polymerasen brauchen keinen Primer

Kontinuierlich vs. diskontinuierlich

DNA-Synthese an der Replikationsgabel:

• Wegen der 5‘->3‘ Syntheserichtung wird dereine Strang (Leit- oder Vorwärtsstrang)kontinuierlich, der andere Strang (Folge- oderRückwärtsstrang) diskontinuierlich synthetisiert

Koordinierte Synthese an der Replikationsgabel

DNA-Synthese an der Replikationsgabel:

• Die zu replizierende Doppelhelix wird mit Hilfevon DNA-Helicasen geöffnet (nicht gezeigt).

• Enzelstrang-Bindungsproteine verhindern, dassdie Doppelhelix wieder vor dem Ablesenzuschnappt.

• Die DNA-Polymerase ist ein Enzymkomplex, deraus zwei synthetisierenden Untereinheiten undder Primase besteht. Beide Stränge werdensimultan synthetisiert.

• „Trick“: Da sich die Replikationsgabel von derSyntheserichtung am Folgestrang wegbewegt,bildet der Folgestrang eine Schleife, umgleichzeitig abgelesen werden zu können.

Abschliessende Schritte der DNA-Synthese

• DNA-Polymerasen können nicht nursynthetisieren, sie können auch DNA- oder RNA-Stücke entfernen (Korrekturfunktion).

• Es gibt sowohl eine 5‘-3‘-Exonuklease wie eine3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität (nicht jede DNA-Polymerase hat beide Aktivitäten).

• Die 5‘-3‘-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase I entfernt die RNA-Primer und fülltdie Lücken auf.

• Die letzte 3‘-OH / 5‘-Phosphat Lücke zwischenzwei benachbarten Nukleotiden wird mit Hilfe derDNA-Ligase geschlossen.

Ligation von DNA

• Für die Schliessung der Lücke muss die 5‘-Phosphat Bindung erst mit Hilfe von ATPaktiviert werden. Dabei wird zuerst AMP an ein Lysin-Rest am aktiven Zentrum derLigase angehängt.

• Die DNA-Ligase knüpft vorübergehend eine Phosphosäureanhydrid-Bindung am 5‘-Phosphat (durch Anhängen von AMP), die den nukleophilen Angriff der freien 3‘-OHGruppe und die Bildung der 3‘-5‘-Bindung unter Abspaltung von AMP begünstigt.

Problematik bei der Replikation linearer DNA

Funktion der Telomerase (eine reverse Transkriptase)

• Das Ende der Chromosomen besteht ausrepetitiven DNA-Sequenzen (hier: TTAGGG)

• Die Telomerase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, bringt eine zur repetitiven DNA-Sequenz komplementäre RNA mit.

• Die angelagerte RNA dient als Matrize um denoberen DNA-Strang zu verlängern

• Im letzten Schritt wird die ursprüngliche Lückemit Hilfe der DNA-Polymerase und -Ligaseaufgefüllt.

• Nicht alle Zellen enthalten Telomerase, deshalbwerden je nach Zelltypus pro Teilung dieChromosomen kürzer.

Replikationsursprünge

• Für den Beginn der Replikation wird mindestensein Startpunkt gebraucht, vor allem wenn -wie beivielen Prokaryoten- die DNA ringförmig ist.

• Trotz der hohen Polymerisationsgeschwindigkeitder DNA-Polymerase (mehrere Hundert Nukleotidepro Sekunde), braucht es bei Eukaryoten mehrereReplikationsursprünge, an denen die DNA-Synthese gleichzeitig stattfindet.

• Die DNA-Synthese ist an jedemReplikationsursprung bidirektional, d.h. dass beideDNA-Stränge abschnittsweise kontinuierlich unddiskontinuierlich abgelesen werden.

Negatives Supercoiling• Die Torsion während der Öffnung derDoppelhelix bei der Replikation erzeugtÜberdrehungen/Superwindungen der DNA, dadiese nicht frei um sich selber rotieren kann.Diesem Phänomen sagt man Supercoiling.

• Die rechtsdrehende B-DNA wird gegen denUhrzeiger-Sinn entwunden, d.h. die Zahl derHelixwindungen hinter der Replikationsgabelreduziert sich = negatives Supercoiling.

• Demgegenüber stauen sich vor derReplikationsgabel die DNA-Überdrehungen =positives Supercoiling.

Topoisomerasen

• Topoisomerasen sind Enzymkomplexe, die den Torsionsstress beseitigen. Dazuschneiden sie mittels ihrer DNA-Endonuklease-Aktivität einen (Toposiomerase I) oderbeide (Topoisomerase II) parentale DNA-Stränge in der Nähe der Replikationsgabel.

• Die gelösten DNA-Stränge können nun gegeneinander rotieren und die Spannung gelöstwerden. In einem Folgeschritt verschliesst die Topoisomerase die Bruchstellen.

Transition und Transversion

• Mit einer geringen Frequenz (10-4) kommt eswegen Keto-Enol-Gleichgewichten zuungewöhnlichen Basenpaarungen (G-T in derAbb.).

• Wenn nicht von der DNA-Polymerase erkannt,führen diese ungewöhnlichen Basenpaarungen inder nächsten Generation zu einer Punktmutation(G-C gegen A-T ausgetauscht).

• Ein Austausch eines Purins oder einesPyrimidins gegen das andere (G->A; C->T) wirdals Transition bezeichnet, der Austausch einesPyrimidins gegen ein Purin (oder umgekehrt; zB.A->C) als Transversion.

• Dank 3‘-5‘-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase passieren solche Punktmutationenwährend der Replikation „nur“ mit einer Frequenzvon 10-7.

Prinzip der postreplikativen DNA-Reparatur

• Durch Einwirkung äusserer Faktoren(Chemikalien, UV-Licht, Hitze) kommt es nachder Replikation zu chemischen Veränderungenvon Basen der DNA.

• Neben der Korrekturfunktion der DNA-Polymerase gibt es sog. postreplikativeKorrekturmechanismen, die sowohl die Fehlerratewährend der Replikation erniedrigen (10-10!) wieauch postreplikative Schäden korrigieren.

• Dazu dienen spezialisierte Enzymkomplexe, diedie DNA abtasten und nach Fehlern/Mutationenabsuchen.

• Ein häufig verwendetes Prinzip ist das derNukleotid-Excisionsreparatur. NachIdentifizierung des Defektes wird ein StückEinzelstrang herausgeschnitten, mit Hilfe derDNA-Polymerase und -Ligase eingefüllt undligiert.

Homologe Rekombination bei der Meiose: Crossing-over

Rekombination• Trotz der hohen Replikationsgenauigkeit gibt es definierte Situationen, wo DNA-Veränderungengewünscht werden, so zB. während der Meiose von Geschlechtszellen (zwecks Erhöhung der Varianzder Nachkommenschaft).

• Allerdings handelt es sich beim sog. Crossing-over um den exakten Austausch von gleichen DNA-Regionen zwischen homologen Chromosomen von Vater und Mutter, für die wiederum einspezialisierter Enzymkomplex gebraucht wird.

Ortsgerichtete (somatische) Rekombination

• In manchen somatischen Zellen kommt es zurUmordnung (Deletionen, Rearrangement vonDNA) gewisser Gene oder sogar vonGengruppen.

• Das bekannteste Beispiel ist die programmierteUmordnung der Antikörpergene desImmunsystems. Dieser Vorgang, der in B- und T-Lymphozyten passiert, erlaubt es, mit einemminimalen Repertoir an Genen, eine enormeAuswahl von mehr als 1011 verschiedenenAntikörperproteinen anzubieten.

• Die variablen Regionen der Antikörper-Ketten,welche die Spezifität ausmachen, werdenwährend der Reifung der B-Lymphozyten durchein Rearrangement gewisser DNA-Segmente (inder Abb. L, V, J) aus einem vorgegebenenRepertoir zusammengelegt.

• Ein ähnliches Verfahren der DNA-Rekombination wie bei den B-Zellen kommt beiden T-Zellen zur Maximierung der möglichen T-Zell-Rezeptoren vor.