Nucleotidi e Acidi Nucleici

• Nucleosidi

• Nucleotidi

• Funzioni biologiche dei nucleotidi

Struttura di DNA e RNA

• Concatenazione e appaiamento dei nucleotidi

• Lo scheletro degli acidi nucleici

• La forme B, Z, etc.

• Analisi tridimensionale (CHIME)

Componenti degli acidi nucleici• Gli acidi nucleici sono macromolecole lineari, a catena,

isolate per la prima volta dai nuclei delle cellule.• L’idrolisi completa di un acido nucleico fornisce una

miscela di – BASI ETEROCICLICHE (quattro tipi)– ACIDO FOSFORICO – ed uno ZUCCHERO.

Componenti degli acidi nucleici

Basi EterociclicheLe basi eterocicliche presenti negli acidi nucleici appartengono a due

classi:

PURINE

PIRIMIDINE

ADENINA6-AMMINOPURINA

GUANINA2-AMMINO-6-OSSIPURINA

URACILE2,4-DIOSSI-PIRIMIDINA

TIMINA2,4-DIOSSI-5-METILPIRIMIDINA

CITOSINA4-AMMINO-2-OSSIPIRIMIDINA

METILAMMINA (ALCHILICA) CHMETILAMMINA (ALCHILICA) CH33NHNH22 4.5 x 10 4.5 x 10-4-4

ANILINA (AROMATICA) -NHANILINA (AROMATICA) -NH22 4.2 x 10 4.2 x 10-10-10

PIRROLO NHPIRROLO NH22 2,4 x 102,4 x 10-14-14

PIRROLIDINA NHPIRROLIDINA NH22 1 x 10 1 x 10-3-3

PIRIDINA NHPIRIDINA NH22 2.3 x 102.3 x 10-9-9

PIPERIDINA NHPIPERIDINA NH22 2 x 102 x 10-3-3

BASICITA’ DELLE AMMINE (KBASICITA’ DELLE AMMINE (Kbb))

forma lattamicaforma doppio-lattimica

forma lattimica

tautomeria lattamico-lattimica

uracileuracile

N

O

OH

H

N

N

OH

NHO

N

O

H

NO

H

Forme tautomeriche

Forme tautomeriche

Monosaccaridi degli Acidi NucleiciGli zuccheri presenti negli acidi nucleici sono2-deossi-D-ribosio (DNA) e D-ribosio (RNA)

Nucleosidi

• Il legame tra basi eterocicliche e ribosio forma i

diversi Nucleosidi

• Il legame è di tipo -N-glicosidico tra il

Carbonio anomerico del ribosio e l’N 9 delle

purine o N1 delle pirimidine

• Il legame può avere due orientazioni: Syn e

Anti. Anti è predominante

• Hanno numerosi gruppi polari e sono solubili in

acqua. Sono facilmente idrolizzabili da

soluzione acquose di acidi.

syn

anti

Nucleosidi

Base Zucchero NucleosideDNAAdenina 2-deossi-D-R. 2’-deossiadenosinaGuanina 2-deossi-D-R. 2’-deossiguanosinaCitosina 2-deossi-D-R 2’-deossicitidinaTimina 2-deossi-D-R. 2’-deossitimidina

RNAAdenina D-R. AdenosinaGuanina D-R. GuanosinaCitosina D-R. CitidinaUracile D-R. Uridina

Nucleotidi• I nucleotidi sono ESTERI FOSFATO dei nucleosidi.

• Il sito di fosforilazione è spesso l’ossidrile al 5’ del ribosio, ma può essere anche quello in 3’

• Possono essere mono- di- e tri-fosfati (Es.: TMP, TDP, TTP.)

• I di- e tri-fosfati sono legati da legame anidridico, stabile e ad alta energia

TMP

Funzioni dei nucleotidi

• Unità strutturali degli acidi nucleici• Deposito di energia delle reazioni di

trasferimento di fosfato (ATP - GTP)• Mediatore di processi cellulari (cAMP)• Parte di coenzimi (NADH, FAD, CoA )• Intermedi di reazioni sintetiche

(S-Adenosilmetionina)

ATP-ADP-AMP• L'adenosina è presente come fosfato in varie forme.

Il 5'-monofosfato, difosfato e trifosfato, così come il monofosfato 3',5'-ciclico, sono intermedi chiave in numerosi processi biologici.

• L'ATP contiene due legami di anidride fosforica ed ha la caratteristica di liberare quantità notevoli di energia quando si idrolizza ad ADP e, successivamente, ad AMP. Sono queste le reazioni che forniscono l'energia necessaria per altre reazioni biologiche.

Ciclo dell’ATP e Accoppiamento reazioni endoergoniche con reazioni esoergoniche

Derivati dell’AMP• Il più comune è 3'-5'- adenosina monofosfato

ciclico, cAMP

• E’ prodotto dall’enzima adenilato ciclasi

• È un secondo messagero per la trasduzione del segnale dalla superficie cellulare all’interno della cellula. E’ usato dalla protein-chinasi cAMP dipendente (PKA) per fosforilare molte proteine.

Derivati di GMP• La forma ciclica di GMP (cGMP)

• E’ un secondo messaggero analogo a cAMP, ma con funzioni distinte

S-adenosilmetioninaS-adenosil metionina è una forma attivata di metionina per la donazione di metili

NAD, FAD, CoA

Coenzimi importanti contengono nucleotidi nella loro struttura:

Coenzima A, nella cui struttura è presente l'ADP, un agente biologico capace di trasferire i gruppi acilici, che ha un ruolo chiave nel metabolismo dei grassi.

Il nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) ed

il flavina adenina dinucleotide (FAD) sono coenzimi che

partecipano a numerose reazioni biologiche di ossido-riduzione.

CoANAD

FAD

Analoghi sintetici dei nucleotidi• Possono inibire alcuni enzimi e interferire con la sintesi

del DNA

• Esempi sono: 6-mercaptopurina, 5-fluorouracile, 5-iodo-2'-deossiuridina and 6-tioguanina usati come anti-tumorali

• AZT (azidotimidina) and ddI (dideossinosina) per HIV

• I polinucleotidi si formano dalla condensazione

di due o più nucleotidi tra il fosfato legato al

5’-OH del ribosio di un nucleotide ed il 3’-OH

del ribosio dell’altro con eliminazione di H2O

• ogni fosfato ha ancora un protone acido che, a pH 7, è ionizzato (carica negativa sull'ossigeno). Se il gruppo fosfato fosse indissociato, la sostanza sarebbe un acido; polinucleotidi biologici = acidi nucleici.

• Il legame fosfodiestereo è direzionale, e la sequenza va da 5’ 3’

• La sequenza delle basi definisce la molecola 5’-pGpApTpC-3’

• I polinucleotidi biologici sono

l’ACIDO DEOSSIRIBONUCLEICO (DNA) e

l’ACIDO RIBONUCLEICO (RNA)

Polinucleotidi

Legame fosfodiesterico• I mono- e di-esteri del fosfato (pKa = 2) sono carichi

negativamente a pH 7, e ciò li rende meno suscettibili all’attacco nucleofilo, e quindi all’idrolisi.

• L’alta densità di carica negativa stabilizza i trifosfati• La carica riduce la diffusione attraverso le membrane dei

nucleotidi

Ester Hydrolysis at 35º C and pH 7

Ester Rate of Hydrolysis Relative Rate

Ethyl AcetateCH3CO2C2H5

1.0*10-2 5*106

Trimethyl Phosphate(CH3O)3PO 3.4*10-4 2*105

Dimethyl Phosphate(CH3O)2PO2

(-) 2.0*10-9 1.

Il DNA

•Acido nucleico costituito da deossinucleotidi concatenati tramite legame fosfodiestereo.

•La sequenza delle basi in direzione 5’ 3’ determina la struttura PRIMARIA dell’acido nucleico

•L’uridina non è mai presente nel DNA, mentre la Timidina è specifica.

•Presenza di basi modificate (metil-citosina)

DNA vs RNA

Perché la timina nel DNA?

Struttura secondaria del DNA modello Watson-Crick

• Elica destrorsa costituita da due catene polinucleotidiche antiparallele

• Le basi sono all’interno dell’elica allineate

ad angolo retto con l’asse dell’elica

(deossiribosio e fosfato all’esterno)

• Le due catene sono unite da ponti idrogeno

tra purine di una catena e pirimidine dell’altra

• G-C formano 3 legami idrogeno

• A-T formano 2 legami idrogeno

accoppiamenti

Forme tautomeriche

Chimica delle basi e mutazioni del DNA

Chimica delle basi e mutazioni del DNA

Chimica delle basi e mutazioni del DNA:

deamminazione

Appaiamenti modificati

• Adenina + HNO2 ipoxantina

• La ipoxantina si appaia con Citosina

Composti (solitamente) elettrofili che accettano elettroni dai centri nucleofili di composti organici (DNA).

-monofunzionali o bifunzionali

-Sede di attacco: azoto delle basi (N7 guanina) o ossigeno;

ossigeno dei legami fosfodiestere

Agenti Alchilanti

Esempi:

Monofunzionali:

-EMS (etilmetansulfonato).

-Nitrosammine.

-Nitrosourea.

Bifunzionali:

- mostarde azotate.

-mitomicina.

-Cis-platino.

Alchilazione da Etilmetansulfonato

1) Alogeno-derivati dell’uracile

Esempio: 5-bromo-uracile.

Bromo al C-5 aumenta la proporzione del raro tautomero enolico

Analoghi Delle Basi

Appaiamento alternativo di 5-bromouridina

IL modello della doppia elica di Watson-Crick è in realtà una semplificazione. Le conformazioni ad elica del DNA vengono attualmente classificate in tre famiglie generali:

forme A, B e Z.

Conformazioni del DNA

Proprietà di DNA-A, -B e -Z

B-DNA• Forma predominante = regolare elica destrorsa di Watson e

Crick, con basi perpendicolari all’asse dell’elica• Si ottiene quando il DNA è completamente idratato (in vivo)• 10 basi per giro completo dell’elica• 3,4 Ǻ = distanza tra due basi 36° = angolo rotazione tra due

basi• La superficie esterna mostra due solchi separati dalla catena

fosfato-ribosio: solco maggiore (major groove) e solco minore (minor groove). Il “pavimento” di questi solchi è costitutito dai fianchi delle basi azotate interazioni sequenza specifiche DNA-Proteine.

Major e Minor Groove

Nel B-DNA: • asse dell’elica attraversa il centro di ciascuna base, posta perpendicolarmente ad esso. • attacco delle basi alla catena ribosio-fosfato è asimmetrico

Solco maggiore e minore hanno profondità simile,ma diversa ampiezza.

A-DNA• Ottenuto in condizioni di disidratazione non fisiologica

(sembra non esistere in vivo)

• Elica destrorsa con catene antiparallele

• 10.9 basi per giro completo dell’elica

• 33,1° rotazione angolare tra due basi adiacenti

• 2,9 Ǻ = distanza tra due basi adiacenti

• Struttura trovata in sequenze caratterizzate da alternanza di G e C. Probabile anche in vivo

• Elica è sinistrorsa e la dorsale zucchero-fosfato segue un andamento a zig-zag.

• Guanidina in posizione syn.

• Major groove molto superficiale e minor molto stretto.

Z-DNA

Proprietà termiche

• Se il DNA è portato ad alte temperature i legami H diventano instabili e le due catene si separano: DENATURAZIONE TERMICA.

• Le sequenze ricche di A e T si denaturano più facilmente di quelle ricche in G e C

• La temperatura alla quale il 50% del DNA è denaturato è detta Tm (Melting Temperature) dipende dalla sequenza (solvente e ioni)

• Dopo raffreddamento le basi si riappaiano: rinaturazione, ibridizzazione o annealing

Principi di interazione DNA-Proteine

Nel B-DNA le zone di possibile interazione specifica con proteine sono i “pavimenti” dei solchi maggiori. Gli atomi di N e O ed i gruppi metile delle basi possono interagire con le catene laterali delle proteine in modo specifico.

Analisi del DNA

• Cromatografia

• Elettroforesi

• CHIME

RNA

• Gli acidi ribonucleici (RNA) differiscono per tre aspetti importanti dal DNA:(1) lo zucchero è il D-ribosio, (2) una delle quattro basi eterocicliche è l'uracile (al posto della timina) (3) molecole di RNA sono costituite da un unico filamento, sebbene possano essere presenti zone a elica, dovute al ripiegamento della catena su se stessa.

• Il D-ribosio, lo zucchero dell'RNA, è diverso dal 2-deossi-D-ribosio, lo zucchero del DNA, in quanto ha un ossidrile sul C-2. Per il resto i nucleosidi e i nucleotidi dell'RNA hanno strutture simili a quelli del DNA.

Effetto del 2’OH

• Il gruppo è ingombrate ed interferisce con la struttura della doppia elica

• RNA va incontro ad idrolisi spontanea 100 volte più velocemente di DNA

Struttura del RNA• Il ripiegamento della

catena può esser descritto da 7 angoli di torsione (

Una struttura comune è quella a forcina (hairpin)

RNA

Le cellule contengono tre tipi principali di RNA:- l'RNA messaggero (mRNA), che presiede

alla trascrizione del codice genetico e funge da matrice ella sintesi proteica;

- l'RNA transfer (tRNA), che trasporta al ribosoma gli amminoacidi in forma attivata, pronti per la formazione dei legami peptidici;

- l'RNA ribosomiale (rRNA), che assomma a circa l'80% dell'RNA cellulare totale (tRNA=15%; mRNA=5%) e che è il principale componente dei ribosomi

FINE

tRNA 1

tRNA 2

ATP-ADP-AMP-cAMP

ATP (1)

ATP (2)

Produzione di ATP:

• Fosforilazione ossidativa

• Glicolisi

• Ciclo di Krebs

ATP (3)

+

=

FAD

Sede della RIDUZIONE

N

NN

O

O

H3C

H3C

H

H C

C

C

C

CH O

H

H OH

H OH

H OH

H

P O

O

O-

P O CH2

H

N

N

NH2

N

N

O

OHOH

N

NN

N

O

O

H3C

H3C

H

H

H

R H

H

N

Forme ossidata e ridotta del FAD

Flavin adenin dinucleotide

H

FADFAD

N

N

NH2

N

N

O

OHOH

CH2OP

O

O

O

P

O

O O CH2 O

OH OH

N

CONH

+

2

N

CONH2+ 2H+ 2H++ + 2e + 2e--

- 2H- 2H++ - 2e - 2e--

Forme ossidata e ridotta del NAD

( dinucleotide)nicotinammide adenin

NADNAD

Coenzima A

Produzione di cAMP

cAMP come secondo messaggero

cAMP

ORMONI: primi messaggeri (tra una cellula e l’altra)

cAMP: secondo messaggero(all’interno delle cellule)

DNA

Polinucleotidi

Doppia elica (1)

Negli acidi nucleicidue filamentipolinucleotidicisono associatiin una strutturaa doppia elica

Le basi purinicheLe basi purinichee pirimidinichee pirimidinichesono invece sono invece all’internoall’internodella doppia elicadella doppia elica

Il ribosio ed i gruppiIl ribosio ed i gruppifosfodiesterei sonofosfodiesterei sonodisposti all’esternodisposti all’esternodella doppia elicadella doppia elica

Doppia elica (2)

Appaiamento basi

Appaiamento basi (2)

Conformazioni

B-DNA (1)

B-DNA (2)

Major e Minor Groove (1)

Major e Minor Groove (2)

Major e Minor Groove (3)

Z-DNA (1)

Z-DNA (2)

Denaturazione termica

DNA-Proteine (1)

DNA-Proteine (2)

DNA-Proteine (3)

RNA

mRNA

tRNA (1)

tRNA (2)

rRNA

RNA messaggero• Hanno strutture tridimensionali (3D)

complesse

Adenosina-5’-trifosfatoAdenosina-5’-trifosfato

ATP ATP ATP ATP

5’5’

4’4’

3’3’ 2’2’

1’1’

11

22

33 44

5566 77

88

99

N

N N

N

NH2

O

OH OH

CH2OP

O

O

OH

P

O

O

OH

P

O

HO

OH

N

N N

N

NH2

O

OH OH

CH2OP

O

O

OH

P

O

O

OH

P

O

HO

OH

Legami Legami fosfoanidridicifosfoanidridici

Legame Legame fosfoestereofosfoestereo

Legame Legame -N-glicosidico-N-glicosidico

Legame Legame -N-glicosidico-N-glicosidico

Meccanismo di azione: interagiscono direttamente con il DNA formando un legame covalente grazie ad una reazione di alchilazione tra la forma attivata del farmaco (un carbocatione , elettrofilo) e le basi azotate del DNA (strutture nucleofile). Il principale bersaglio di questa reazione è l’N in posizione 7 della guanina. La base , riconosciuta anomala , viene escissa dalle endonucleasi , mentre l’integrità del filamento è ricostituita dall’enzima ligasi.Tuttavia, gli alchilanti bifunzionali, possono formare dei legami a ponte(cross-link) tra due filamenti del DNA o anche all’interno dello stesso filamento provocando la rottura completa della molecola di DNA oppure un blocco della trascrizione e della duplicazione. In generale gli alchilanti appartengono al gruppo dei farmaci ciclo aspecifici , quindi danneggiano ogni cellula in qualsiasi fase essa si trovi ma la fase più suscettibile rimane comunque la fase S del ciclo cellulare, quando alcuni il DNA è parzialmente svolto e più accessibile. Quindi il bersaglio degli alchilanti sono le cellule in replicazione che muoiono in fase G2.