MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI IONIZZABILIIONIZZABILI

Aminoacidiproteine

Acidi nucleici nucleotidi

ELETTROFORESI

Metodo di separazione basato sulla diversa velocità di Migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di unCampo elettrico

Metodi FRONTALI - in soluzione liberaMetodi FRONTALI - in soluzione libera Metodi ZONALI – attraverso un mezzo porosoMetodi ZONALI – attraverso un mezzo poroso

cartagel Acetato di cellulosa

ELETTROFORESIELETTROFORESI

Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.Tecnica soprattutto ANALITICA ma anche PREPARATIVA.E’ un mezzo di separazione molto potente, fra i piu’ usati in biochimica

UN METODO ANALITICOUN METODO ANALITICO

NUMERO NUMERO di proteine presenti in una misceladi proteine presenti in una miscela

GRADO DI PUREZZAGRADO DI PUREZZA

PUNTO ISOELETTRICOPUNTO ISOELETTRICO

PESO MOLECOLAREPESO MOLECOLARE

FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’ DI FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’ DI MIGRAZIONEMIGRAZIONE

Natura del supportoNatura del supporto

Campo elettrico applicatoCampo elettrico applicato

Caratteristiche della particella:Caratteristiche della particella: MassaMassa CaricaCarica DimensioniDimensioni formaforma

mobilità elettroforetica

= velocità di migrazione

Campo elettrico applicatoVE

NATURA DEL SUPPORTONATURA DEL SUPPORTO

assorbimento – ritenzione di molecole da parte del – ritenzione di molecole da parte del supporto (coda)supporto (coda)

Elettroendosmosi – per la presenza di gruppi carichi sulla superficie del mezzo di supporto

Carta – COOH Agarosio – SO4

-

pareti di vetro – Si-OH

Filtrazione molecolare Filtrazione molecolare – effetto setaccio

CAMPO ELETTRICO APPLICATOVoltaggio – Corrente - Resistenza

La differenza di potenziale tra gli elettrodi La differenza di potenziale tra gli elettrodi genera:genera:

E = V / dE = V / d E = gradiente di potenzialeE = gradiente di potenziale

V = voltaggio applicatoV = voltaggio applicato d = distanza fra gli elettrodid = distanza fra gli elettrodi

Intensità di correnteIntensità di corrente = Voltaggio applicato / = Voltaggio applicato / ResistenzaResistenza

RESISTENZARESISTENZA

+Aumentare della distanza fra

Gli elettrodi

_Aumenta la forza ionica del tamponeAumenta la temperatura

INFLUENZA DEL TAMPONEINFLUENZA DEL TAMPONE

ha la funzione di mantenere le molecole del ha la funzione di mantenere le molecole del campione in uno campione in uno stato di ionizzazionestato di ionizzazione

COMPOSIZIONE:COMPOSIZIONE: non deve legarsi ai composti da separarenon deve legarsi ai composti da separare

CONCENTRAZIONE:CONCENTRAZIONE: da 0.05 a 0.10 M da 0.05 a 0.10 M

pH : pH : determina, influenza, stabilizza la velocità di determina, influenza, stabilizza la velocità di migrazionemigrazione

RISULTATI RIPRODUCIBILIRISULTATI RIPRODUCIBILI VOLTAGGIO O AMPERAGGIO COSTANTIVOLTAGGIO O AMPERAGGIO COSTANTI

CARATTERISTICHE DELLA PARTICELLACARATTERISTICHE DELLA PARTICELLACarica – dimensioni - massaCarica – dimensioni - massa

A PARITA’ DI CONDIZIONI ELETTROFORETICHEA PARITA’ DI CONDIZIONI ELETTROFORETICHE

Le molecole si separano sulla base del rapporto:

CARICA / MASSA

CAMPO ELETTRICO SUPPORTO

Un apparato per elettroforesi è costituito da

ALIMENTATORE CAMERA ELETTROFORETICA

Verticale Orizzontale

SUPPORTO SOLIDO POROSO SU GEL (su carta da filtro o acetato di cellulosa) (poliacrilammide o Agarosio)

Sulla base alla composizione del mezzo in cui avviene l’elettroforesi :

· Elettroforesi in condizioni native – denaturanti - riducenti Isoelettrofocalizzazione (IEF) · Elettroforesi bidimensionale · Elettroforesi su gradiente

ELETTROFORESI SU SUPPORTOELETTROFORESI SU SUPPORTO

su cartasu cartasu gelsu gel

GEL DI AGAROSIOGEL DI AGAROSIO: : usato per separare frammenti di DNA grandi usato per separare frammenti di DNA grandi

(da 500 bp a 20 Kb)(da 500 bp a 20 Kb)

GEL DI ACRILAMMIDEGEL DI ACRILAMMIDE: : usato per separare frammenti di DNA piccoli usato per separare frammenti di DNA piccoli

(da 1 nucleotide a 2 Kb) (da 1 nucleotide a 2 Kb)

I FRAMMENTI DI DNA SI MUOVONO I FRAMMENTI DI DNA SI MUOVONO VERSO IL VERSO IL POLO POSITIVOPOLO POSITIVO

AD UNA VELOCITA’ INVERSAMENTE AD UNA VELOCITA’ INVERSAMENTE PROPORZIONALE AL LOGARITMO DELLA LORO PROPORZIONALE AL LOGARITMO DELLA LORO LUNGHEZZALUNGHEZZA((rapporto CARICA / MASSA è COSTANTErapporto CARICA / MASSA è COSTANTE))

ELETTROFORESI SU GEL DI ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDEPOLIACRILAMMIDE

Utilizzata per la separazione di PROTEINE e Utilizzata per la separazione di PROTEINE e di ACIDI NUCLEICI di ACIDI NUCLEICI

Il gel si ottiene dalla polimerizzazzione di Il gel si ottiene dalla polimerizzazzione di molecole di molecole di ACRILAMMIDEACRILAMMIDE e con la e con la formazione di legami crociati in presenza di formazione di legami crociati in presenza di METILEN-BIS-ACRILAMMIDE METILEN-BIS-ACRILAMMIDE

Il processo di polimerizzazione è innescato Il processo di polimerizzazione è innescato dall’aggiunta di dall’aggiunta di TEMED TEMED (tetrametilendiammina) e persolfato(tetrametilendiammina) e persolfato

GEL DI ACRILAMMIDEGEL DI ACRILAMMIDE: usato per separare : usato per separare frammenti di DNA piccoli ( da 1 nucleotide a frammenti di DNA piccoli ( da 1 nucleotide a 2 Kb) 2 Kb)

Formazione di un gel di poliacrilammideFormazione di un gel di poliacrilammide

RivelazioneRivelazione, , stima quantitativastima quantitativa e e recupero recupero da gelda gel

Comparison of the sensitivity achieved with SYPRO, silver and Coomassie brilliant blue stains. Identical SDS-polyacrylamide gels were stained with A) SYPRO Orange protein gel stain, B) SYPRO Red protein gel stain; C) silver stain and D) Coomassie brilliant blue stain, according to standard protocols.

densitometria

a scansione

elettro-eluizione

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI (gel di poliacrilammide DENATURANTI (gel di poliacrilammide

in UREA)in UREA)

Separazione di frammenti di DNASeparazione di frammenti di DNA

UREA 7 M aggiunta al gel mantiene denaturatiUREA 7 M aggiunta al gel mantiene denaturati

(a singolo filamento) i frammenti di DNA(a singolo filamento) i frammenti di DNA Gel lungo (fino a 50-60 cm) e sottileGel lungo (fino a 50-60 cm) e sottile Ad alto voltaggio (circa 2000V)Ad alto voltaggio (circa 2000V) I frammenti migrano solo in base alla loro I frammenti migrano solo in base alla loro

lunghezzalunghezza

DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICANUCLEOTIDICA

ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIOELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO

Separazione ed analisi di campioni contenenti Separazione ed analisi di campioni contenenti DNA o RNADNA o RNA

Si scioglie l’agarosio in polvere nel tampone in Si scioglie l’agarosio in polvere nel tampone in seguito ad EBOLLIZIONE della sospensioneseguito ad EBOLLIZIONE della sospensione

Dopo raffreddamento fino alla temperatura di Dopo raffreddamento fino alla temperatura di 45°C la soluzione si versa in uno stampo dove 45°C la soluzione si versa in uno stampo dove gelificheràgelificherà

Un pettine genera gli spazi per depositare i Un pettine genera gli spazi per depositare i campionicampioni

Il gel viene immerso completamente nel tamponeIl gel viene immerso completamente nel tampone Migrazione orizzontale Migrazione orizzontale verso il polo positivo verso il polo positivo

(anodo)(anodo) separazione in BASE ALLA LORO separazione in BASE ALLA LORO MASSAMASSA poiché il poiché il

loro loro rapporto CARICA / MASSA è costanterapporto CARICA / MASSA è costante

1) dalle dimensioni dei frammenti 2) dalla percentuale dell’agarosio nel

gel 3) dal voltaggio applicato. Frammenti lineari piu’ piccoli migrano

piu’ velocemente rispetto a quelli piu’ grandi, mentre, a parita’ di peso molecolare, il DNA circolare migra piu’ velocemente di un DNA lineare, in quanto assume una conformazione detta super avvolta (super coiled DNA)

La velocita’ di migrazione dipende:

Come si rivelano gli acidi nucleici?Come si rivelano gli acidi nucleici?

Colorazione con Colorazione con ETIDIO BROMUROETIDIO BROMURO (colorante (colorante fluorescente) fluorescente)

Questo composto contiene un gruppo planare che si intercala tra le coppie di basi del DNA.

il colorante viene quindi visualizzato irradiando con raggi U.V. (ad esempio con un transilluminatore) e fotografandolo su un film polaroid.

la sensibilità del rilevamento è solitamente migliore di 0.1 g di DNA.

Dal momento che l'etidio è un agente intercalante, è un potenziale mutageno.

SOUTHERN BLOT

IMPRONTA DEL DNA basata sui polimorfismi di sequenza cioè piccole differenze di sequenza presenti in media ogni 500 – 1000 coppie di basi eDiverse da individuo ad individuo ( polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione o RFLP)

ELETTROFORESI DI PROTEINEELETTROFORESI DI PROTEINEsu gel di poliacrilammidesu gel di poliacrilammide

La porosità del gel dipende dal rapporto La porosità del gel dipende dal rapporto ACRILAMIDE/BIS-ACRILAMIDEACRILAMIDE/BIS-ACRILAMIDE

LA VELOCITA’ DI MIGRAZIONE DIPENDELA VELOCITA’ DI MIGRAZIONE DIPENDE

Carica nettaCarica netta DimensioneDimensione Corrente applicataCorrente applicata Dal valore di pH del tamponeDal valore di pH del tampone

A pH fisiologici la maggior parte delle proteine è sotto A pH fisiologici la maggior parte delle proteine è sotto forma di ANIONI (-)forma di ANIONI (-)

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVEELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVE

Permette di individuare un enzima o Permette di individuare un enzima o proteina per la sua proteina per la sua ATTIVITA’ BIOLOGICAATTIVITA’ BIOLOGICA

Le proteine conservano la loro carica nativaLe proteine conservano la loro carica nativa Separazione: rapporto Separazione: rapporto CARICA / MASSACARICA / MASSA nel gel è possibile incubare un substrato: nel gel è possibile incubare un substrato:

l’enzima si lega e sviluppa un prodotto l’enzima si lega e sviluppa un prodotto coloratocolorato

PAGE al 7,5 %PAGE al 7,5 % in sistema refrigerato per in sistema refrigerato per evitare denaturazioneevitare denaturazione

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI SDS-PAGE

Le proteine si denaturano con molecole di SDS ogni due Le proteine si denaturano con molecole di SDS ogni due residui di Aminoacidiresidui di Aminoacidi

La carica nativa della proteina viene eliminata dalle La carica nativa della proteina viene eliminata dalle molecole di SDS cariche negativamentemolecole di SDS cariche negativamente

SI ALLESTISCE:SI ALLESTISCE: Running gelRunning gel matrice al 10% di PAGE in cui avviene la matrice al 10% di PAGE in cui avviene la

separazioneseparazione Staking gelStaking gel al 4% al 4%

TUTTE LE PROTEINE SONO CARICHE TUTTE LE PROTEINE SONO CARICHE NEGATIVAMENTE (NEGATIVAMENTE (migrano verso l’anodo)migrano verso l’anodo)

SEPARAZIONE BASATA SULLE DIMENSIONISEPARAZIONE BASATA SULLE DIMENSIONI (gel come setaccio molecolare)(gel come setaccio molecolare)

SDS-PAGESDS-PAGE

(Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)(Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)

Effetto “setaccio” in un gel uniforme

•Fissaggio del gel in metanolo e acido acetico

•Colorazione con Blu di Coomassie

•Valutazione della PUREZZA DEI CAMPIONI

•DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE rispetto a STANDARD DI RIFERIMENTO

La mobilità di una proteina è direttamente proporzionale al logaritmo decimaledella MASSA MOLECOLARE

IEF ISOELETTROFOCALIZZAZIONEIEF ISOELETTROFOCALIZZAZIONE

separazione di sostanze anfotere Separazione sulla base del pi GEL con GRADIENTE DI pH Si usano GLI ANFOLITI (elettroliti anfoteri) Sono miscele di acidi alifatici sintetici

poliammino-policarbossilici che formano un gradiente di pH nella matrice prima della sua polimerizzazione

Gli analiti migrano verso la zona di pH corrispondente al proprio punto isoelettrico (FOCALIZZAZIONE)

E’ utile una CALIBRAZIONE con proteine a pi noto

Il gradiente di pH e’ formato dall’ introduzione nel gel di composti conosciuti come “anfoliti”, che sono miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici.

Gli anfoliti possono essere acquistati per diversi range di pH, sia a banda larga (ad es. da pH 3 a pH 10) che a banda stretta (ad es. da pH 7 a pH 8)

USO: per separare forme isoenzimatiche e per determinare il punto isoelettrico di una proteina

MAPPA DI PROTEINE: confronto tra normale e malatoSEQUENZIAMENTO di proteina da singola macchiaAnalisi con SPETTROMETRIA DI MASSA

FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICAFOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA

Miscela di anfoliti

Un’altra tecnica, oltre alla cromatografia a scambio ionico, che permette la separazione di macromolecole sulla base della loro carica. Estremamente potente

Focalizzazione isoelettrica di alcune varianti della stessa

proteina, l’emoglobina :

Catodo (-) Anodo (+)

Trasferimento su un foglio dinitrocellulosa

Nel punto in cui è localizzata la proteina che interessa si forma una bandaColorata- L’immunoblot consente di identificare proteine anche in quantitàMolto piccole e di definire il loro peso molecolare

Una applicazione clinica del Western Blot

Viral Proteins

HIV, like any other virus, is composed of a number of different proteins. The Western Blot positive control lane contains proteins from patient sera as well as HIV proteins. HIV positivity can therefore only be confirmed by the presence of the following types of proteins:

gp160 viral envelope precursor (env) gp120 viral envelope protein (env) binds to CD4 p24 viral core protein (gag) p31 Reverse Transcriptase (pol)

Band pattern interpretation

In 1987 the Centers for Disease Control along with several other organizations established criteria for serologic interpretation of HIV Western blot tests. The criteria are listed below.

No bands present Negative Bands at either p31 OR p24 AND bands present at either gp160 OR gp120 Positive

Bands present, but pattern does not meet criteria for positivity Indeterminate

Lane 1, HIV+ serum (positive control) Lane 2, HIV- serum (negative control) Lane A, Patient A Lane B, Patient B Lane C, Patient C

Capillary Electrophoresis (CE)

Advantages of Capillary Electrophoresis

High separation efficiency (105 to 106 theoretical plates)

Small sample size required (1-10 ul)

Fast separation (1 to 45 min)

Easy and predictable selectivity

Automation

Quantitation (linear)

Reproducibility

Couple to mass spectrometer

Types of Molecules that can be separated by Capillary Electrophoresis

Proteins, Peptides, Amino acids Nucleic acids Inorganic ions, Organic bases, Organic acids Whole cells

•Fissaggio del gel in metanolo e acido acetico•Colorazione con Blu di Coomassie•Valutazione della PUREZZA DEI CAMPIONI•DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE delle proteine rispetto a STANDARD DI RIFERIMENTO•Nell’esempio la purificazione dell’enzima RNA Polimerasi da E.Coli

Elettroforesi di proteine in condizioni native

(A) Analysis of binding of the b subunit cytoplasmic domain (bsol) to ECF1 and ECF1 (-). Mixtures of polypeptides were first analyzed by native agarose gel electrophoresis (A) through a 1% agarose gel.Lanes from left to right: I, ECF1 (-) II, bsol ; III, IV, bsol + ; V, bsol + ( 1-134); VI, bsol + ECF1 (-); VII, + ECF1 (-); VIII, bsol + + ECF1 (-); IX, ECF1 (-) + ( 1-134); X, bsol + ECF1 (-) + ( 1-134).

(B) Bands were excised from the agarose gel and separated on a 10-18% gradient of polyacrylamide in SDS.

Rodgers et al (1997) J. Biol. Chem. 272: 31058