Upload
bioinformaticsinstitute
View
637
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Молекулярная биология для биоинформатиков
• Академический университет
• Ефимова Ольга Алексеевна
В презентации выборочно использованы слайды из курсов «Биохимия» и «Молекулярная биология» и «Молекулярная генетика СПбГУ
• Репликация
• Транскрипция
• Трансляция
Лекция 5,6 – Матричные процессы
Направление матричных процессов всегда соответствует 5’ – 3’, т.е. присоединение новых нуклеотидов происходит на 3’ конце
Перенос генетической информации
ТрансляцияТранскрипция
Репликация
Центральная догма: ДНК-РНК-белок
Жизнь зависит от 3 молекул
• ДНК– Содержит информацию о работе клетки
• РНК (мРНК)– Передает эту информацию в различные части клетки
– Служит матрицей для синтеза
• Белки– Образуют ферменты, катализирующие различные
процессы в клетке
– Образуют основные структурные компоненты живого организма
ДНК: основа жизни• Деоксирибонуклеиновая кислота• Полимерная молекула
– Углеводно-фосфатный скелет
– Основания одной цепи соединяются с другой цепью путем водородных связей
Двойная спираль ДНК
• Модель Уотсона-Крика– Используя рентгеновские снимки структуры ДНК
• В соответствии с этой моделью ДНК:– Спираль из 2 комплементарных анти-параллельных цепей– Правозакрученная– Стабилизованная водородными связями– Основания находятся внутри спирали
• Пуриновые основания образуют водородные связи с пиримидиновыми.
Доказательства генетической роли ДНК
Трансформация бактерий. Ф.Гриффитс, 1928 г. – доказал, что ДНК способна переносить наследственные свойства между штаммами пневмококков
S-форма – патогенна для мышей, имеет полисахаридную оболочку, образует гладкие блестящие колонии на питательной среде. Формы: IS, IIS, IIIS и т.д.
R-форма – непатогенна для мышей, нет полисахаридной оболочки, образует шероховатые колонии на питательной среде. Формы: IR, IIR, IIIR и т.д.
Если ввести мышам убитые нагреванием клетки формы IIIS и добавить живые клетки IIR, то мыши погибают и из их трупов можно выделить клетки IIIS. Следовательно, живые клетки IIRтрансформируются в присутствии убитых нагреванием клеток IIIS, приобретая свойства патогенности.О.Эвери, К.МакЛеод, М.МакКарти, 1944 г. – идентифицировали трансформирующий агент как ДНК.
Доказательства генетической роли ДНК
PLAY
Размножение бактериофагов. А.Херши, М.Чейз, 1952 г.
Репликация ДНК
• Доказательства полуконсервативного способа репликации ДНК (Meselson, Stahl,
1958)
• Ферментативный аппарат репликации ДНК
а) Полуконсервативный
б) Консервативный
в) Дисперсный
Использовали колонии бактерий E.coli, которым давали единственный источник азота – 15NH4Cl
М.Мезельсон, Ф.Сталь предложили спопоб, позволяющий различать исходные молекулы ДНК и молекулы-потомки:Равновесное центрифугирование в градиенте плотности CsCl. Для мечения вновь синтезируемых молекул использовали утяжеляющую метку - 15N
Эксперимент Мезельсона и Сталя
Градиент:
1,66 – 1,76 г/см3
Центрифугирование в течение 50 – 60 часов при 100 000 g приводит к формированию градиента плотности CsCl и образованию полос ДНК
Ув
ели
чен
ие
пл
отн
ост
и
в
: ИсходнаяДНК/тяжелая тяжелая
1- : епоколениевсятяжелая/легкая
2- :епоколение 2 тяжелые/легкие 2 /легкие легкие
3- : епоколение2 тяжелые/легкие 6 /легкие легкие
Центрифугирование в течение 50 – 60 часов при 100 000 g приводит к формированию градиента плотности CsCl и образованию полос ДНК Репликация
Репликация
Репликация
В 1958 г. А. Корнберг открыл ферментативную реакцию синтеза ДНК из мономеров путем конденсации нуклеотидтрифосфатов и впервые выделил из клеток E.coli фермент ДНК-полимеразу I.
Нобелевская премия, 1959 г.
А. Корнберг (1918)
Трехмерная структура фрагмента
Кленова ДНК-полимеразы I
Участники реакции:
ОН
1. Матрица
2. Затравка 3’-ОН (праймер)
3. Нуклеозидтрифосфаты
4. ДНК зависимая ДНК-полимераза
Впоследствии было открыто еще 2 полимеразы:ДНК-полимераза IIДНК-полимераза III
Истинной репликазой оказалась ДНК-полимераза III
Но: ни одна из ДНК-полимераз не может начать синтез сама, всем требуется затравка – наличие свободной –ОН группы
СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ E.coli
ДНК-полимеразы IV и V (1999) вовлечены в необычные формы репарации ДНК
CУБЪЕДИНИЧНЫЙ СОСТАВ ХОЛОФЕРМЕНТА ДНК-
ПОЛИМЕРАЗЫ III E.coli
Структура ориджина репликации(ori) E.coli
Инициация репликации (E.coli)
Инициация репликации (E.coli)
Связывание инициаторного белка dnaA c ДНК
OriC:
Присоединение геликазы и праймазы
3
Полимераза III
5’ → 3
’
Лидирующая цепь
Пары оснований
5’
5’
3’
3’
Общая схема репликации ДНК. Элонгация репликации
Геликаза +
Инициаторные белки
ATP
SSB-белки
РНК-праймер
праймаза
2Полимераза III
Отстающая цепь
Фрагменты оказаки
1
РНК-праймеры замещаются ДНК-полимеразой I, разрывысоединяются ДНК-лигазой
Как ДНК-полимераза перемещается к точке
начала синтеза нового фрагмента Оказаки?
БЕЛОК ФУНКЦИЯ МОЛ.ВЕСkDa
Элонгация репликации
Геликаза (Dna B) Расплетание двойной цепи 300
SSB Связывает одноцепочечную ДНК 75,6
ДНК-полимераза III
α
Элонгация вновь образующейся цепи
полимеразная активность 130
ε корректирующая 3’-5’- экзонуклеазная 27
β скользящий зажим 40
δγ
загрузчик зажима (clamp loader) 3252
τ димеризация кора 71
χ Взаимодействие с SSB-белками 16,6
ψ Взаимодействие с γ и χ субъединицами 15,2
θ ? 10
ДНК-полимераза I удаление РНК-праймеров 103
ДНК-лигаза соединение разрывов в отстающей цепи 74
ДНК-топоизомераза II Снятие торсионного стресса при расплетании
400
Коррекция ошибок ДНК-полимеразой III
За корректирующую активность ответственна ε-субъединица ДНК-полимеразы III
Удаление РНК-праймеров
ДНК-полимеразой I
Соединение фрагментов Оказаки
«Вилка репликации»
Терминация репликации
Хромосома E. coli (4,2 млн. нуклеотидов) – один репликон
84 min
C
Организация области терминации репликации у E. coli
tus (tbp) 36 кДа
aattagtatgttgtaactaaagt
Завершение репликации
Топоизомераза 2 (гираза) (gyrA и gyrВ)Топоизомераза 4 (parCи parE)
Две репликационные вилки движутся в противоположном направлении
Окончательное разделение молекул ДНК происходит с участием топоизомераз;
Образуются суперспирализованные молекулы
Репликация с образованием θ-
структуры
PLAY
Репликация кольцевой ДНК у прокариот начинается в локусе OriC,
заканчивается в области TerC.
Инициатором репликации является белок DnaA.
Репликацию ДНК осуществляет реплисома - динамичный мультисубъединичный белковый комплекс.
Взаимодействие субъединиц ДНК-полимеразы III с другими белками реплисомы увеличивает скорость и процессивность фермента.
Репликация происходит в направлении 5’ 3’, одной цепи (лидирующей) неперерывно, другой (отстающей) – прерывисто.
Репликация отстающей цепи включает дополнительные этапы: узнавание сайтов связывания праймазы, синтез праймеров, синтез фрагментов Оказаки, диссоциацию полимеразы, удаление праймеров, лигирование.
Обе цепи реплицируются синхронно, что достигается взаимодействием ДНК-геликазы, ДНК-праймазы и ДНК-полимеразы и торможением синтеза лидирующей цепи во время синтеза праймеров.
Эукариотические ДНК-полимеразы:
1. Polymerase α (alpha): nuclear, DNA replication, no proofreading
2. Polymerase β (beta): nuclear, DNA repair, no proofreading
3. Polymerase γ (gamma): mitochondria, DNA repl., proofreading
4. Polymerase δ (delta): nuclear, DNA replication, proofreading
5. Polymerase ε (epsilon): nuclear, DNA repair (?), proofreading
6. Different polymerases for nucleus and mtDNA
7. Some proofread; others do not.
8. Some used for replication; others for repair.
Множественные ориджины эукариот
В ядрах млекопитающих при репликации обнаруживается до 150 центров репликации - «репликативных единиц», «репликативных фокусов» или «репликативных фабрик»
В центрах репликации аккумулируются все белки, участвующие в этом процессе.
Возможно, ориджины высших эукариот не содержат
консенсусных последовательностей.
Функционирование ориджина может определяться
контекстом, структурой хроматина, локализацией
нуклеосом.
Общая закономерность структуры инициаторных
участков – обогащенность АТ-парами.
Инициация репликации у эукариот
Элонгация репликации ДНК у эукариотических организмов
Replisome
Polα primase holoenzyme
Pol1 Cdc17
Polymerase priming; replication of lagging strands
Polδ holoenzyme Pol3 Cdc2
Bidirectional replication
Polε holoenzyme Pol2 Cdc20
Bidirectional replication
Rfc1-5 complex PCNA clamp loading
PCNA Pol30 Polymerase clamp
RPA1-3 complex SSB SSB coats ssDNA
Свойства ДНК-полимеразы альфа Относится к семейству В ДНК-полимераз.
Высокая точность репликации (1 ошибка на 106)
Обладает активностью праймазы и инициирует синтез ДНК de novo. Продуктом реакции является РНК-ДНК праймер (40 нуклеотидов, 10 из которых РНК)
Низкая процессивность
Активность зависит от фосфорилирования субъединиц. Фосфорилирование в начале S-фазы, дефосфорилирование при выходе клетки из митоза
Нет 3’-5’ экзонуклеазной активности
Взаимодействует с ORC-комплексом и, возможно, с RPA (replicative protein A)
Свойства ДНК-полимеразы дельта
Относится к семейству В ДНК-полимераз
Высокая точность репликации
Дельта-полимераза нужна для репликации обеих цепей
Низкая процессивность (10-20 нуклеотидов), которая увеличивается при взаимодействии N-конца каталитической субъединицы с белком PCNA (proliferating cell nuclear antigen)
Обладает 3’-5’ экзонуклеазной активностью, которая повышается в присутствии белка RPA
Свойства ДНК-полимеразы эпсилон
Относится к семейству В ДНК-полимераз
Высокая точность репликации
Эпсилон-полимераза присутствует в вилке репликации, может заменять полимеразу-дельта на отстающей цепи
Высокая процессивность
Обладает 3’-5’ экзонуклеазной активностью
Фосфорилирование в S-фазе не влияет на активность
Свойства белков, участвующих в элонгации репликациии
RPA – гетеротример, имеет 4 ДНК-связывающих домена, стимулирует активность геликазы (МСМ), необходим для сборки праймосомы, функциональный гомолог ssb E. сoli.
RFC – комплекс 5 белков, катализирует присоединение PCNA к ДНК для начала синтеза фрагмента Оказаки, функциональный гомолог γ-комплекса E. сoli. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) – гомотример, третичная структура одинакова у всех эукариот, функциональный гомолог β-субъединицы ДНК-полимеразы III E. сoli.
Транскрипция
• ДНК-зависимый синтез РНК – транскрипция
• Ферментативный аппарат транскрипции –ДНК-зависимая РНК-полимераза
• Этапы транскрипции: • инициация, • элонгация, • терминация
Транскрипция
ДНК
РНК
A T G C
U A C G
││ ││ │││ │││
1. Матричный процесс
2. Образуются Уотсон-Криковские пары
РНК-продукт не остаетсякомплементарно связанным с матрицей;
по окончании синтеза двойная спиральвосстанавливается;
одноцепочечнаяРНК высвобождается;
синтезированные РНК – копии ограниченныхУчастков ДНК
Матрица
ПРОДУКТЫ ТРАНСКРИПЦИИ ПРОКАРИОТ
• Матричные РНК (мРНК) – короткоживущие посредники в процессе переноса информации от ДНК к белку
• Рибосомные РНК (рРНК) – компонент рибосом и рибонуклеопротеиновых частиц
• Транспортные РНК (тРНК) – доставка аминокислот к рибосомам
ПРОДУКТЫ ТРАНСКРИПЦИИ ЭУКАРИОТ
•Гетероядерные РНК– предшественники мРНК (mRNA)
•Рибосомные РНК (rRNA)
• Транспортные (tRNA)
• Малые ядерные (snRNA) – компоненты сплайсосомы и др.функции
• Малые ядрышковые РНК (snoRNA) – процессинг рРНК и тРНК
• МикроРНК (miRNA) – напр., индукция и супрессия опухолей
•Малые интерферирующие РНК (siRNA), ассоциированные с повторами
РНК полимераза (прокариоты)
Инициация транскрипции у прокариот
Не нужна затравка
Синтез начинается с определенного нуклеотида (+1)
Начало синтеза определяетсяпромотором
За узнавание промотораответственна σ-субъединица
Направление синтеза 5’→3’
Структура прокариотического промотора
Рибонуклеотидтрифосфаты
Полимераза слабо связывается с промотором, формируя закрытый комплекс
Полимераза связывается более плотно, ДНК расплетается в области -10, формируется открытый комплекс.
После начала синтеза РНК, как только полимераза минует промотор, σ-субъединица диссоциирует
ПромоторРНК-полимераза Инициация
транскрипции
Инициация транскрипции
Элонгациятранскрипции
Двуцепочечная ДНК
Кор РНК-полимеразыРибонуклеозидтрифосфатыЦепь
ДНК-матрицы
Новая цепь РНК
НАПРАВЛЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ
Цепи ДНК
Rho-независимая терминация транскрипции
терминация
Rho-зависимая терминация
транскрипции
ДНК-зависимые РНК-полимеразы эукариот
Транскрипция у эукариот
2006 г. Нобелевская премия по химии присуждена Роджеру Корнбергу
(Roger Kornberg)
за фундаментальное исследование механизма
копирования клетками генетической информации (транскрипции) эукариот на на молекулярном уровне.
Субъединичная структура эукариотической РНК-полимеразы II
И
Инициация транскрипции
Процессинг РНК:
1. Процессинг рРНК и тРНК: выщепление под действием эндонуклеаз из высокомолекулярного предшественника (прокариоты, эукариоты)
2. Процессинг иРНК (только эукариоты):кэпированиеполиаденилирование
сплайсингредактирование
СХЕМА ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ ПРЕ-МРНК
Кэп (модифицированный гуанилат)
ЭКЗОНЫ
ИНТРОНЫ
СТРУКТУРА КЭПА7-метил
гуанозин
5’,5’-трифосфатная связь
Иногда метилирована
Полиаденилирование(до сигнала терминации)
Сплайсинг пре-мРНК
Трансляция (биосинтез белка)
• Особенности генетического кода• Основные этапы трансляции:• Активация аминокислот
(особенности структуры тРНК, синтез аминоацил-тРНК);
• Инициация(структура рибосом, белковые факторы, синтез первой пептидной связи);
• Элонгация;• Терминация;• Процессинг белка. Пост-трансляционная
модификация – добавление липидов, сахаров, фосфатов, сульфатов и.т.д.
Robert W. Holley Har Gobind Khorana Marshall W. Nirenberg
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1968"for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis"
ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА
•триплетность
•неперекрываемость
•вырожденность
Расшифровка генетического кода
Мутационный анализ: точечные мутации приводили к замене одной АК
Бесклеточные системы трансляции PolyA - пролин
PolyС - лизин
Cинтетический полинуклеотид (AAG)n
может быть прочитан с трех рамок считывания
Трансляция на рибосомах в бесклеточной системе
полилизин полиаргинин полиглутамат
Первое основание
Второе основание
Третье основание
5’ – A T G C C T A G G T A C C T A T G A – 3’3’ – T A C G G A T C C A T G G A T A C T – 5’
5’ – A U G C C U A G G U A C C U A U G A – 3’
5’ – A U G C C U A G G U A C C U A U G A – 3’
N-Met - Pro - Arg - Tyr - Leu-C
DNA
Транскрипция
Трансляция
mRNA
Белок
Неперекрывающийся код
Перекрывающийся код
ВЫРОЖДЕННОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО
КОДА
Генетический код
The genetic code
• consists of 64 triplet codons (A, G, C, U) 43 = 64
• all codons are used in protein synthesis• 20 amino acids• 3 termination (stop) codons: UAA, UAG, UGA
• AUG (methionine) is the start codon (also used internally)
• multiple codons for a single amino acid = degeneracy
тРНК
Вторичная структура тРНК
Третичная структура тРНК
Псевдоуридиновая петля
Ди
гид
роур
иди
нова
я пе
тля
Антикодоновая петля
3’-CCA-конец
Wobble-гипотеза Ф.Крика
1-й нуклеотид антикодона
3-й нуклеотид кодона
1. Активация аминокислот. Синтез аминоациладенилата
Аминоацил-тРНК-
синтетаза
Аминокислота
5’-аминоацил аденилат
аатРНК-синтетазы 1 класса
Аминоацил-тРНК-синтетаза
1 класса5’-аминоацил аденилат
3’ конец тРНК
2.Аминоацилирование тРНК
There is a different Aminoacyl-tRNA Synthetase (aaRS) for each amino acid.
Each aaRS recognizes its particular amino acid and the tRNAs coding for that amino acid.
Accurate translation of the genetic code depends on attachment of each amino acid to an appropriate tRNA.
Domains of tRNA recognized by an aaRS are called identity elements.
Aminoacyl-tRNA Synthetases arose early in evolution. The earliest aaRSs probably recognized tRNAs only by their acceptor stems.
трансэтерефикация
Аминоацил-тРНК
СТРУКТУРА РИБОСОМ
Субъединицы состоят из рРНК и белков, соединяются только для трансляции
Компоненты рибосомы
– Малая субъединица
– 16 S рРНК у прокариот и 18S рРНК у эукариот
– Ее последовательность используется для установления эволюционного родства между организмами
– + белки
Компоненты рибосомы II
• Большая субъединица (на примере прокариот)– 23 S rRNA
– 5 S rRNA
– 26 белков
Бороздка между субъединицами
– Место связи анти-кодон-кодон– Пептидная цепь выходит оттуда
тоже
Эукариотические рибосомы• 40S + 60S
– 18S, 28S + 5.8S rRNA +5S
Участки связывания тРНК на рибосоме
• А-сайт: узнавание аминоацил-тРНК; позиционирование аминоацила.
• Р-сайт: связывание инициаторной fMet-тРНК; связывание пептидил-тРНК при транслокации.
• Е-сайт: выход деацилированной тРНК с 50S субчастицы.
Пептидная связь– Костяк белка– Функция белка
определяется боковыми цепями аминокислот его составляющих
Инициация
• Сборка рибосомы– 70 S из 30S и 50S
субъединиц у прокариот
– 40S + 60S = 80S у эукариот
• Требует факторов инициации
• Требует (ф)метионил-тРНК
Комплекс инициации у прокариот
• Требуются факторы инициации
• Последовательность Шайна-Дальгарно (Shine-Dalgarno sequence,) — была описана австралийскими учеными Джоном Шайном и Линн Дальгарно и является сайтом связывания рибосом на молекуле мРНК прокариот, обычно на расстоянии около 10 нуклеотидов до стартового кодона AUG
Эукариотическая инициация
• Эукариотичеккая мРНК имеет специальные белки на 5 ’ и 3 ’ конце (связываются с 5’ CAP и 3’ poly A)
• Первый AUG после CAP – начало трансляции
Элонгация и терминация • Элонгация
• Аминоацилированная тРНК устанавливается на рибосоме в месте кодона
• Пептид переносится на эту тРНК
• Цикл повторяется
• Терминация– Стоп кодон
соединяется со специальным белком вместо тРНК
Процессинг
• Начинается с момента синтеза белка
• Требует специальных ферментов
• Может происходить разрезание пептидной цепи с образованием конечного продукта (например, инсулин)
Посттрансляционные модификации белков
• Формирование третичной структуры – фолдинг белка
• Удаление сигнальной последовательности
• Модификации N- и С-концов (удаление fMet, N-ацетилирование)
• Ковалентные модификации аминокислотных остатков
Ковалентные модификации аминокислотных остатков
О-гликозилирование N-гликозилирование
Ограниченный протеолиз;добавление дисульфидных связей
Основные этапы трансляции
АКТИВАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ → ИНИЦИАЦИЯ → ЭЛОНГАЦИЯ → ТЕРМИНАЦИЯ
тРНК
Аминокислоты
АТР, Mg2+
Амиоацил-тРНК-синтетазы
мРНК; инициирую-щий кодон30S субъединица;50S субъединица
Белковые факторыинициации (IF-1, 2, 3)
fMet-тРНК
GTP, Mg2+
мРНК
Рибосома 70S
Белковые факторыэлонгации (Tu,Ts, G)
Аминоацил-тРНК
GTP
Терминальный кодон в мРНК
Белковые факторы терминации (RF)
АТР
ПРОЦЕССИНГ БЕЛКА (фолдинг, ограниченный протеолиз, ковалентные модификации)
gaattctaacggtcccgaaactctgtgcggtgctgaactggt