Celične strukture

• mikroskopija

• površina celic

• celična stena

• citoplazemska membrana

• citoplazma

• spore in sporulacija

Mikroskopija

• mikrobiologija v svetlem polju

• mikroskopija v temnem polju

• stereomikroskopija

• fazno kontrastna mikroskopija

• Nomarski mikroskopija

• polarizacijska mikroskopija

• mikroskopija v bližnjem polju

• mikroskopija na atomsko silo

• fluorescenčna mikroskopija

• konfokalna fluorescenčna mikroskopija

• elektronska transmisijaksa mikroskopija

• vrstična elektronska mikroskopija

Mikroskopija v svetlem polju

Za kvaliteto mikroskopa je najpomembnejša ločljivost, sposobnost

ločevanja dveh točk. S povečevanjem objekta ne dosežemo veliko, če je

ločljivost slaba. Ločljivost, D, je odvisna od:

- aperture objektiva, α

- lomnega količnika, n

- valovne dolžine svetlobe, λ

D = 0.61λ / (n x sin α)

Zaradi tehničnih omejitev glede α, λ in n je

meja ločljivosti pri svetlobni mikroskopiji okoli

0.2 µm.

Video svetlobna mikroskopija

Merjenje dimenzij s svetlobnim mikroskopom

Štetje mikroorganizmov s svetlobnim mikroskopom

Število dobimo tako, da:

• preštejemo število celic

• upoštevamo redčitev vzorca

• upoštevamo volumen števne komore

Kontrastiranje

Barvanje po Gramu

Barvanje po Gramu

G+ temno vijolično

G- rožnato

Barvo vedno primerjamo z

ustrezno kontrolo (poznana

G+ in G- bakterija, ki je bila

enako pripravljena kot

neznani vzorec.

Druga barvanja

• negativno barvanje (nigrozin, indijsko črno, kristal vijolično, metilensko modro)

• acidorezistentno barvanje (za barvanje mikobakterij)

• barvanje endospor

• barvanje cist (npr. ciste pri Azotobacter sp.)

• barvanje kapsule

• barvanje flagel

• barvanje citoplazmatskih vključkov (polifosfat, poli-β-hidroksibutirat, glikogen, kisli polisaharidi)

• barvanje nukleoida

• barvanje spirohet,rikecij, legionel, mikoplazm

Običajne oblike mikrobnih celic

Oblike mikrobnih celic

Oblike kokov

diplokoki

streptokoki

stafilokoki

tetrade

sarcine

Stereo mikroskopija

Guignardia bidwellii, črna grozna gniloba

Mikroskopija v temnem polju

Arachnoidiscus ehrenbergi,

diatomeja

DIC (differential interference contrast) ali Nomarski mikroskopija

Sordaria fimicola, plodno telesce z askusi

Fazno kontrastna mikroskopija

Polarizacijska mikroskopija

a sferulitb polikarbonatc DNA

Epi-fluorescenčni

mikroskop

Olympus BX51

LSCM - laserska vrstična konfokalna mikroskopija

Dekonvolucijska mikroskopija

Fluorofori za G+ in G- bakterije

Pseudomonas aeruginosa zeleno

Bacillus cereus rumeno

Pseudomonas aeruginosa zeleno

Bacilus cereus oranžno

Fluorofori za ločevanje živih in mrtvih celic

Micrococcus luteus

• žive celice zelene

• mrtve celice modre

Micrococcus luteus in Bacilus cereus

• žive celice zelene

• mrtve celice rdeče

Fluorofori za določanje spor

membrane rdeče

DNA modro

zeleno fuzijski zeleni protein

Fluorofori za določanje virusov

Večje rumene pike celice, manjše zelene pike virusi (Syber Green-1)

Fluorofori na osnovi 16S rRNA

16S rRNA specifična barvila za

dve vrsti bakterij na

globokomorskem črvu

Fluorofori za določanje celičnih struktur

aktin rdeče

membrane zeleno

jedro modro

kromosomi

tubulin

Konjugacija ciliate

Spolna delitev ciliate Tetrahymena thermophila

• tubulin rdeče

• makro in mikrojedra zeleno

Fluorofori za vakuole in celične stene

Sacharomyces cerevisae

• vakuola rdeča

• celična stena modra

Sacharomyces cerevisae

lumen vakuole moder

Fluorofori za ER in Golgijev aparat

Endoplazmatski retikulum rdeč

vakuole zelene

Golgijev aparat rumen

jedro zeleno

tubulin rdeč

Fluorofori za mitohondrije

mitohondriji rdeče

aktin zeleno

jedro modro

lizosomi modro

mitohondriji rdeče

Aktivnost alkalne fosfataze v celici

• aktivna mesta v celici, kjer deluje

alkalna fosfataza so zelena

• jedro so modro obarvana

Fluorescenčna vizualizacija lipidnih domen

Domenska struktura velikih

lipidnih veziklov izgrajenih iz

DPPC/DLPC mešanice.

TEM - transmisijska elektronska mikroskopija

Osnovni principi so enaki kot pri svetlobni

mikroskopiji. Namesto svetlobe uporabljamo

snop elektronov in elektromagnetne leče. Zaradi

absrpcije elektronov v zraku je potrebno delati v

vakumu.

Vir elektronov je vroča katoda z napetostjo 50 -

100 kV, ki pospeši elektrone proti anodi.

Elektrone detektiramo na fluorescenčnem

zaslonu.

ločljivost je ~ 0.1 nm

potrebna posebna priprava vzorca

Priprava vzorca za TEM

Ultramikroroton: vzorec fiksiramo v glutaraldehidu

ali ozmijevem tetroksidu, ga posušimo v etanolu ali

acetonu in ga nato damo v tekočo plastiko, ki jo s

toploto polimeriziramo. Polimerizirano plastiko in

vzorec razrežemo na ultratanke rezine ~ 0.1 µm, ki

jih naložimo na mikroskopirne mrežice.

Freze-fracture: vzorce hitro zamrznemo v

tekočem dušiku in jih nato z ostrim nožem

lomimo. Odlomljene dele naparimo s

težkimi kovinami.

SEM - vrstična elektronska mikroskopija

• omogoča opazovanje površine vzorca

• vzorec je potrebno predhodno obdelati s

težkimi kovinami (npr. platino), z

elektroni vrstično preizkujemo vzorec in

detektiramo sekundarne elektrone,

• z obdelavo podatkov lahko dobimo

navidezno 3D sliko.

SEM slike

NSOM (Near Field Scanning Optical Microscopy)

AFM - mikroskopija na atomsko silo

AFM bacteriorodopsina iz Holobacterium salinarium

Velikost mikrobnih celic

Zakaj so prokariontske celice manjše od evkariontskih?

Z zmanjšanjem celice se povečuje razmerje med volumnom in površino.

To pomeni, da imajo manjše celice večjo relativno površino.

Npr.pri krogli je razmerje med površino S = 4πr2 in volumnom V = 4/3πr3:

pri r = 1 je S/V = 3

pri r = 2 je S/V = 1.5

pri r = 5 je S/V = 0.6

pri r = 10 je S/V = 0.3

Strukture, ki jih najdemo na površini

• bički

• fimbriji

• fibrile

• pili

• invazosomi

• kodri

• S - plast

• kapsule

Flagele - bički

lopotrihne flagele

polarne flageleperitrihne flagele

lopotrihne flagele

Flagela je izgrajena iz proteina flagelina, ki tvori dolgo votlo cev.

Struktura bakterijskega bička

Delovanje kemotaktičnega motorja

CheACheW

PCheY

P

CheZ

CheY

CheRCH3

CheBPCH3

CheYP

Taksa - gibanje bakterij v gradientu

Poznamo več vrst takse:

- kemotaksa

- aerotaksa

- magnetotaksa

- fototaksa

- ozmotaksa

Fimbriji

• strukturno podobni flagelam, vendar niso pomembne za gibanje

• so manjši (0.5 do 10 µm) tanjši in številčnejši od flagel

•izgrajeni iz fimbrilinov in pilinov, ki tvorijo vijačnico

• pomagajo pri adsorpciji bakterij na površino (adhezini)

• pomembni pri patogenezi in nastanku biofilmov

Fibrile

• krajše (do 0.5 µm), tanše in številčnejše od fimbrijev

• izgrajene iz večjih proteinov

• pomembne pri adsorpciji

Pili

• daljši in debelejši od fimbrij

• običajno jih je le nekaj (1 do 10) na celico

• specifični receptorji za viruse

• pomembni pri konjugaciji

• pomembni pri adheziji na površino

“Curli” - kodri

• zavite kodrasne strukture na površii celic sestavljene iz

polisaharidov in proteinov

• najdemo samo pri E.coli in Salmonelli

• omogočajo vezavo na epitelijske celice gostitelja ali pa na

fibronektin in plazminogen

Ivazosomi

• površinske proteinske strukture pri Salmonelli typhimurium

• podobni so čepkom, 3x debelejše od flagel in 10x krajše od

flagel do 100 na celico

• po internalizaciji bakterije v celice gostitelja se struktura

invazosoma razgradi

S-plast

S-plast najdemo na površini nekaterih

bakterijskih in arhejskih celic in ima

heksagonalno ali tetragonalno simetrijo.

S-plast je sestavljena iz ene vrste proteinov

oziroma glikoproteinov in se samo-sestavi.

Z ostalo celico je povezana preko

nekovalentnih vezi. Integriteta S-plasti je

vezana na prisotnost divalentnih kationov.

Kapsula

Veliko mikroorganizmov na svojo površini izloča sluzast material, predvsem

polisaharide in proteine. Kapsula ni trdno vezana na površino celice.

Kapsula ima več funkcij:

• vezava na površino

• vezava na gostitelja

• zaloga za vodo in hranila

• zaščita pred infekcijo

• tvori matrkis pri nastanku biofilma

• močno antigena, pomembna pri virulenci

Centrifugiranje

Diferencialno centrifugiranje:

Centrifugiramo pri različnih pospeških oziroma različno dolgo

npr. 10 min pri 5000 x g sedimentiramo intaktne celice

20 min prii 50000 x g fragmenti stene in večji membranski fragmenti

60 min pri 200000 x g sedimentiramo membranske vezikle in ribosome

Ravnotežno gradientno centrifugiranje:

Strukture s podobno velikostjo vendar različno gostoto lahko ločimo v saharoznem gradientu (lažje strukture) ali CsCl gradientu (težje strukture).

d je premer delca, pp je gostota delca, pl je

gostota tekočine, g je zemeljski pospešek, η je

viskoznost tekočineη=

=

18g)pp(dv lp

2

Frakcioniranje celičnih komponent

Mehansko razbijanje celic:

francoska preša (1000 atm)

ultrasonikacija

zamrzovanje in odtajanje

mikrovalovna pečica

Kemijska liza celic:

detergenti

ozmotska liza

segrevanje

alkalna liza

Celična stena bakterij

Osnovna sladkorja peptidoglikana

N-acetilglukozamin

N-acetil muramična kislina

Osnovna enota peptidoglikana

N-acetilglukozamin N-acetilmuramična kislina

Povezava glikanskih verig pri G+ in G- bakterijah

D-Ala

DAP

D-Glu

D-Ala

M-G-M-G-M-G-M-G

M-G-M-G-M-G-M-G

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala

G- M-G-M-G-M-G-M-G

L-Ala

D-Glu

L-Lys

D-Ala

G+

[Gly]5

D-Ala

L-Lys

D-Glu

D-Ala

M-G-M-G-M-G-M-G

[Gly]5[Gly]5

Razlike med peptidoglikani

• preko 100 kemijsko različnih peptidoglikanov

• G- bakterije imajo DAP (diaminopimelično kislino), G+ bakterije imajo

namesto DAP običajno lizin.

• različne povezave med tetrapeptidi

• različna sestava tetrapeptidov (npr. glicin, treonin, serin in aspartat). V

celični steni ne najdemo razvejanih aminokislin, aromatskih aminokislin,

žveplo vsebujočih aminokislin, histidina, arginina in prolina.

Sinteza peptidoglikana

Dva temeljna problema:

• kako pridejo sestavni deli v periplazmo

• kako poteka sinteza peptidoglikana v periplazmi brez ATP

Sinteza peptidoglikana poteka v več stopnjah:

- sinteza pentapeptida in derivatizacija UDP sladkorjev

- prenos pentapeptida in derivatiziranih sladkorjev preko membrane z

lipidnim prenašalcem baktoprenolom

- polimerizacija osnovne enote peptidoglikana v periplazmi

- transpeptidacija

Nastanek in derivatizacija UDP sladkorjev

fruktoza-6-P glukozamin-6-P N-acetilglukozamin-6-P N-

acetilglukozamin-1-P UDP-N-acetilglukozamin UDP-N-

acetilglukozamin-3-enolpiruvileter UDP-N-acetilmuramična kislina

UDP-muramil-pentapeptid

Nastanek UDP-muramil pentapeptida in UDP-N-acilgkukozamina

je vezana na citoplazmo.

Prenos UDP-sladkorjev preko membrane

citoplazmatska membrana

citoplazma periplazma

UMP

C55-PUDP-M

M - PP - C55

UDP-G

G - M - PP - C55

UDP

C55 - PP - M - G

C55 - PP - M - G - M - G - M - G

Rast peptidoglikana

Komponente celične stene so dodajajo

v obstoječo celično steno v katero

zareže avtolizin zareže, kar omogoča

dodajanje nove osnovne enote

peptidoglikana. Zaradi tega na mestu

dodajanja nastane brazgotina. V

kolikor avtolizin zareže, nov celični

material pa ni dodan, lahko pride do

avtolize.

brazgotina

Transpeptidacija - rast peptidoglikana

Reakcijo katalizirata karboksipeptidaza in transpeptidaza, ki sta pomembni tarči za delovanje antibiotikov.

G+ bakterijska stena

Tehojske in tehuronske kisline

glicerol fosfat tehojska kislina

glicerol fosfat tehojska kislina

ribitol fosfat tehuronska kislina

tehuronska kislina z N-acetilmanuronsko kislino

tehuronska kislina z N-acetilgalaktozaminom

- O - P - O - CH2 - CH - CH2 - O - P - O -

O- O-

OO

R

On

- O - P - O - CH2 - CH - CH2 - O - P - O -

O- O-

OO

OHn

GlcNac

R

O-

O

On

- O - P - O - CH2 - CH - CH - CH - CH2 - O - P - O -

O-

O

R

OH OH

- ManNacUA - D-Glu -

- D-GluUA - GalNac -

R=alanin

R=alanin

R=glukoza

Lipotehojske kisline

• polimeri glicerol fosfata, ki je substituiran z D-alaninom in

sladkorji

• kovalentno vezane na lipide

• vzdržujejo strukturo celične stene

• vezavno mesto za površinske proteine

• vzdržujejo negativen naboj celične površine

• antigeni, povzročajo vnetni odziv

Proteini vezani na površino

• večinoma so kovaletno vezani na stranske verige aminokislin v

peptidoglikanu, ostali interagirajo s tehojsko in lipotehojsko kislino

• pomembni pri adheziji

• pomembni pri razgradnji polimerov

• pomembni pri indukciji citokinov

M - protein streptokokov A

• štrli do 60 nm izven membrane.

• omogoča serotipizacijo streptokokov A

(obstaja preko 80 različnih tipov)

• pomemben virulenčni dejavnik

G- bakterijska stena

Periplazma

Komponente periplazme:

- oligosaharidi (ozmotska regulacija)

- proteini, ki vežejo topljence (npr.

transport sladkorjev, amino kislin, železo)

- citokormi (npr. citokrom c)

- hidrolitični encimi (npr. alkalna fosfataza,

glikozidaze)

- detoksificirajoči agensi (npr. β-laktamaza)

Lipoprotein

Zunanja membrana gram negativnih

bakterij je povezana s peptidoglikanom

preko lipoproteina z nekovalentnimi

vezmi, kar omogoča selektivno

odstranitev zunanje membrane.

Nastanek protoplastov

Peptidoglikan lahko razgradimo z lizocimom, ki cepi 1 - 4 β-glikozidno

vez. Ob dodatku EDTA se zunanja membrana loči.

Celice brez celične stene imenujemo protoplasti. Velikokrat pa celične

stene ne moremo popolnoma odstraniti in dobimo sferoplaste.

Nekatere bakterije (npr. mikoplazme) lahko preživijo brez celične stene,

vendar imajo v svoji plazmatski membrani povečano koncentracijo

sterolov, ki omogočajo vzdrževanje integritete celične membrane.

Zunanja membrana

Notranji monosloj je sestavljen

predvsem iz fosfolipidov, medtem,

ko je zunanji monosloj sestavljen

predvsem iz lipopolisaharidov LPS.

Relativno propustna membrana.

porin

Porin

Porin neselektivno prepušča

molekule, ki so manjše od 600

Da, najdemo ga samo v

zunanji membrani gram

negativnih bakterij.

V celici je več različnih porinov, npr. E.coli ima:

• OmpC porin ima najmanjše pore, difuzijska bariera

• OmpF porin ima večje pore, olajšan transport

• PhoE porin je selektivna pora za transport fosfata

LPS - lipopolisaharid

sredica lipid AO - antigen

GlcN

GlcN

P

P

n

KDO

KDO

KDO

Hep

Hep HepGlu

Gal

GalGlu

Glu-Nac

P

P

P

GlcN glukozaminKDO ketodeoksikonatHep heptozaGlu glukozaGal galaktozaGluNac N-acetilglukozamin

Sinteza LPS

Sinteza lipida A: fruktoza-6-P glukozamin-6-P N-acetilglukozamin-6-P N-acetilglukozamin-1-P UDP-N-acetilglukozamin UDP-3-monomiristiol-GlcNac UDP-2,3-dimiristoilglukozamin 1-6 tetramiristoil disaharid-1-P tetramiristoil-disaharid-1,4-difosfat lipid A

Sinteza sredice: na lipid A se ena za drugo vezejo ketodeoksonat,heptoza, glukoza, galaktoza in N-acetilglukozamin. Ko so na lipid A vezani vsi sladkorji sredice se lipid A skupaj s sredico prenese v periplazmatski prostor, kjer se dodajo sladkorji O antigena.

Sinteza O-antigena: sinteza poteka ločeno od sinteza lipida A in sredice.Sinteza poteka z baktoprenolom podobno kot pri sintezi peptidoglikana. O-antigen raste tako, da baktoprenol s sladkorjem iizpodrine baktoprenol, ki ima vezano veriogo sladkorjev O-antigena.

Sinteza LPS

citoplazmatska membrana

Lipid Asredica

C55 - PP - O

O

O - PP - C55

C55-PP

C55 - PP - O - O - O - O

Lipid A sredica - O - O - O - O - O

C55 - PP - O - O - O - O - O

Pseudopeptidoglikan (arheje)

Bistvena razlika med bakterijskim in arhejskim peptidoglikanom je:

• N-acetiltalosaminuronska kislina namesto N-acetilmuramične kisline

• 1-3 β-glikozidna vez namesto 1-4 β-glikozidne vezi

• nekatere arheje sploh nimajo

pseudopeptidoglikana in imajo le

polisaharide ali proteine (S-plast)

Biološka membrana

Funkcije biološke membrane

• transport snovi v celico in iz celice

• energijske transformacije

• signaliziranje

• gibanje

Gradnja biološke membrane

Lipidi: predstavljajo semipermeabilno pregrado in matriks v katerem so

vgrajeni proteini.

Proteini: skrbijo za encimske reakcije v membrani, omogočajo strukturne

povezave s citoskeletom, mediirajo energijske transformacije, sprejemajo in

prevajajo kemijske signale.

Ogljikovi hidrati: v povezavi z lipidi in proteini skrbijo za sprejem signala,

tvorijo zaščito pred fizikalno-kemijskim stresom in so rezervoar za hranila.

Običajne fosfolipidne glave

- CH2 - C - COO-

H

NH3+

fosfatidil serin, PS

fosfatidil etanolamin, PE- CH2 - CH2 - NH3+

- CH2 - CH - CH2OH

OHfosfatidil glicerol, PG

difosfatidil glicerol (kardiolipin), CL

- CH2 - CH - CH2OH

OH

- CH2 - CH - CH2 - O - P

OH O-

O

Običajne maščobne kisline

nasičene maščobne kisline C atmov: 1, 2, 3, 4, 6, 10, 16, 18(- C - C - C -)

mono nenasičene maščobne kisline C atomov: 4, 12, 14, 16, 18(- C - C = C - C -)

di nenasičene maščobne kisline C atomov: 6, 18(- C = C - C = C -)

tri nenasičene maščobne kisline C atomov: 18(- C = C - C = C - C = C -)

tetra nenasičene maščobne kisline C atomov: 20(- C = C - C = C - C = C - C = C -)

penta nenasičene maščobne kisline C atomov: 20(- C = C - C = C - C = C - C = C - C = C -)

Običajne maščobne kisline

Hidroksialkanojske kisline C atmov: 12, 18(- CH2 - CH - COOH)

OH

Keto in ciklo maščobne kisline C atmov: 5, 19(- C - C - C -) (- C - C - C - C -)

O CH2

Razvejane maščobne kisline C atomov: 5, 10, 16, 19, 20

CH3CH2 CH3

CH - (CH2)n - COOH CH - (CH2)n - COOH

CH3 CH3

Kemijske vezi, ki jih najdemo pri lipidih

estrske vezi pri bakterijah in evkariontih

etrske vezi samo pri arhejah

izoprenska enota samo pri arhejah

Dinamika lipidnih molekul

porazdelitev fosfatne skupine

vzdolž lipidnega dvosloja

verjetnost

Dinamika lipidnih molekul

Polimorfizem lipidov

invezna bikontinuiranakubična faza Pn3m

inverzna heksagonalnafaza HII

Multilamelarni lipidni dvosloj

Struktura in topologija integralnih membranskih proteinov

Dve najbolj običajni strukturi membranskih proteinov

α-heliks β-naguban list

Topologija perifernega peptida v lipidnem dvosloju

Intracitoplazemske membrane

Veliko prokariontov ima v citoplazmi močno nagubane membrane, ki

so povezane s citoplazmatsko membrano in imajo posebno fiziološko

funkcijo. Takšne membrane najdemo pri:

• metanotrofih

• fiksatorjih dušika

• nitrifikatorjih

• fototrofih

Lipidno-proteinske interakcije

Za pravilno funkcioniranje biološke membrane je pomembna:

• sestava lipidov in proteinov ter njihovo razmerje in selektivnost

• konfiguracija lipidnih acilnih verig ter njihova fluidnost

• ukrivljenost lipidnega dvosloja

• interakcija lipidnih polarnih glav s proteini

• struktura proteina

• topologija proteina

• agregacijski status proteinov

• hidrofobno neujemanje proteina in lipidnega dvosloja

Transport snovi skozi membrano

Vsa hranila morajo skozi citoplazmatsko membrano. Za nekatere npr. O2,

CO2, NH3 in H2O velja, da hitro difundirajo skozi membrano.

Nižje maščobne kisline lahko prosto prehajajo membrano (višje maščobne

kisline potrebujejo transporterje).

Za vse ostale spojine velja, da je njihova difuzija skozi membrano močno

omejena in je potreben aktivni transport.

Difuzija snovi skozi membrano

Tok snovi skozi membrano je

J = ∆c P S

kjer je c razlika v koncentraciji, P je

permeabilnost, S je površina membrane.

Za glukozo velja, da bi bil pri razliki v koncentracije

glukoze znotraj in zunaj celice 10-4 mol/cm3 in

permeabilnostjo = 10-7 cm/s pretok skozi 1 cm2

membrane ~10-11 mol/sek oziroma 6 x 104 molekul

na sekundo skozi 1µm2.

Membrana je različno

permeabilna za snovi.

Permeabilnost (P) za:

vodo ~ 10-3 cm/s

glicerol ~ 10-5 cm/s

glukozo ~ 10-7 cm/s

Cl- ~ 10-10 cm/s

Na+ ~ 10-12 cm/s

Difuzija vode skozi akvaporine

Kinetika transporta topljencev skozi membrano

Z difuzijo poteka transport počasi.

Z aktivnim transportom poteka

prenos hitro vendar prihaja pri

višjih koncentracijah substrata do

saturiranosti transporterja.

Koncentracijo substrata pri kateri

je hitrost transporta enaka 1/2

max hitrosti imenujemo Km ali

afinitetna konstanta za substrat.

Aktivni transport snovi skozi membrano

Različno velike spojine potujejo skozi membrano na različne načine:

• majhni topljenci (npr. ioni, monomeri) s permeazami in transporterji

• veliki topljenci (npr. proteini) s transporterji

• delci s fagocitozo

Struktura transporterjev

Nastanek gradientov preko membrane

Snov vedno potuje vzdolž gradienta. Kontinuiran nastanek gradientov H+,

K+, Na+ ali H2PO4- ionov preko membrane omogočajo metabolne reakcije s

pomočjo:

• svetlobe

• redoks reakcij

• kotransporta

• hidrolize ATP

Zmanjševanje gradienta ionov preko membrane spremlja sproščanje

energije.

Energetika prenosa naboja preko membrane

Sprememba proste energije zaradi transporta spojine preko membrane je

∆G = -RT ln cin/cout

Sprememba proste energije zaradi prenosa naboja preko membrane je

∆G = nFV

pri ravnotežnih pogojih velja nFV -RT ln cin/cout = 0 oziroma, električni potencial preko membrane, ko ni toka elektronov je

V = RT/nF ln cin/cout

V primeru, da je koncentracija K+ v celici 140 mM, zunaj pa 5 mM se pri sobne temperaturi

razvije 89 mV potenciala.

Sekundarni transportni sistemi

Sekundarne transportne sisteme poganjajo sklopitve s primarnimi

transportnimi sistemi, ki generirajo gradient ionov preko

membrane.

- simporterji

- antiporterji

Energetika sekundarnega transporta

H+

simport elektronevtralnega topljenca s protonom

[H+]/[S] ∆p = -60 log [Sin]/[Sout] S

H+

simport monovalentnega aniona s protonom

([H+]/[S-] - 1) ∆ - [H+]/[S-] 60 ∆pH = -60 log [S-in]/[S-

out] S-

H+antiport kationa s protonom

([H+]/[S+] - 1) ∆ - [H+]/[S+] 60 ∆pH = -60 log [S+

in]/[S+out]

S-

Transport s simportom in antiportom

simport antiport

H+/glicin H+/galaktoza H+/Ca2+

H+/histidin H+/laktoza H+/CaHPO4

H+/lizin H+/fosfat H+/K+

H+/fenilalanin Na+, H+/ glutamat H+/Na+

H+/laktat Na+/prolin K+/CH3NH4

H+/piruvat Na+/melobioza H2PO4-/organski anioni

H+/sukcinat Mg2+,H+/citrat H2PO4-/ heksoza-6-P

H+/glukonat H2PO4-/ glicerol-3-P

H+/arabinoza H2PO4-/ fosfoenolpiruvat

Transportni sistemi Haemophilus influenzae

Fosforilacija sladkorja po prehodu skozi membrano

Sisetem za prenos sladkorjev je izgrajen iz 24 proteinov. Fosfatna

skupina prihaja iz fosfoenolpiruvata. Glukoza-6P vstopa direktno v

glikolizo.

ABC transportni sistemi pri G- bakterijah

ABC je akronim za “ATP-

binding cassette” in je

sestavljen iz 3 delov. Pri

prokariontih poznamo več

kot 200 različnih ABC

transporterjev. Za vse ABC

transporterje je značilna

visoka konstanta za

vezavo substrata v

periplazmi.

Transport železa, železo-kelirajoč agensi (hidroksamat)

Fe3+hidrokamat

Fe3+- hidrokamat

Fe3+- hidrokamat

redukcijahidrokamat

citoplazemska membrana

Fe3+- hidrokamat

Fe2+

porfirin

hem

Transporterji za ostale ione

ion transporter

Ca2+ fosfoprotein

Fe3+ siderogfori/citrat/transferin

Cu2+ caeruloplazmin

Ni2+ albumin/histidin

Zn2+ albumin

Co2+ vitamin B12

Transport proteinov skozi membrano

Obstaja več sistemov za transport proteinov skozi membrano:

• Sec sistem

• tip I

• tip II

• tip III

• tip IV

• tip V

• šaperoni

šaperoni tip II tip IV tip V

Sec Tattip I tip III

zunanja membrana

notranja membrana

Tip I sistem

Hyl D

ATP

Tol C

Hyl B

ADP + Pi Pul E

Tip III sistem

zunanja membrana

Lcr D / Ysc

notranja membrana

Yop B, Dgostiteljska membrana

TARČNA CELICA

ATP

ADP + Pi

Sec sistem

SecD, F SecY, E, G

SecB

ribosom

SRP

FtsY

Tat sistem

Tat A, B, E citoplazemska membrana

Tip II sistem

Pul D

Pul C, F - O

SecD, F SecY, E, G

Pul E

Citoplazma

inkluzijska telesca in granule

ribosomi

plinski vezikli

nukleoid

citosol

znotrajcelične membrane

metanotrofi

nitrifikatorji

fototrofi

fiksatorji dušika

poli hidroksi butirati

polifosfati

polisilfudi

elementarno žveplo

glikogen

karboksisom, klorosom

magnetosom

Granule elementarnega žvepla

Veliko mikroorganizmov lahko oksidira

H2S in tiosulfat. Pri tem lahko pride do

akumulacije elementarnega žvepla v

obliki granul. Granule se večajo dokler je

na voljo reducirana oblika žvepla. Ko

reducirane oblike zmanjka pride do

porabe granul in oksidacije žvepla do

sulfata.

Polifosfat

Veliko mikroorganizmov akumulira rezerve anorganskega fosfata v obliki

granul polifosfata.

Anorganski fosfat je pomemben pri celični energetiki in signaliziranju.

Polifosfat v celici lahko pobarvamo z bazičnimi barvili.

Poli-β-hidroksialkaonati

Inkluzijska telesca iz poli-β-hidroksibutirata so izgrajena iz več podenot

poli-β-hidroksibutirata povezanih z esterskimi vezmi.

Dolžina monomerov je različna od C4 (butirat) do C18.

Poli-β-hidroksialkaonate producirajo bakterije in arheje.

Poli-β−hidroksialkaonate uporabljamo za izdelavo biorazgradljive plastike.

CH2 CH2

CH3 CH3

CH CH

CH2

CCC

O

O

O

O

O

O

CH

CH3

Glikogen

V glikogenu so glukozni ostanki povezani z α-1,4 in α-1,6 glikozidno

vezjo.

Granule glikogena so običajno majhne.

Glikogen se podobno kot poli-β-hidroksalkanoati uporablja kot

energijska rezerva in kot vir ogljika.

Karboksisom

Avtotrofne bakterije, ki uporabljajo CO2 kot edini ali glavni vir ogljika

imajo velika (do 100 nm) poliedrska inkluzijska telesca, v katerih se

nahaja ribuloza-bifosfat (glavni encim Calvinovega cikla). Take vključke

najdemo pri:

• nitrifikatorjih

• žveplo oksidirajočih bakterijah

• cijanobakterijah

Klorosom

Zelene žveplove in nežveplove bakterije imajo elipsoidno inkluzijsko

telesce, ki ga obdaja membrana. Klorosom je pomemben pri fotosintezi.

Magnetotaktične bakterije in magnetosomi

Magnetosomi so intracelularni kristali

magnetita Fe3O4.

Magnetosom daje celici permanenten

magnetni dipol, kar omogoča bakteriji, da se

orientira v magnetnem polju.

Magnetosomi so obdani s fosfolipidno

membrano in glikoproteini.

Plinski vezikli

Omogočajo celici lebdenje v vodnem

stoplu, izgrajeni iz proteinov ~ 2 nm

debeli, kar omogoča rigidnost.

V veziklih je sestava atmosfere enaka

kot v citoplazmi, napolnjeni vezikli so od

5 do 20 krat lažji od ostalega celičnega

materiala.

GvpC

GvpA

Ribosomi

Ribosomi so ribonukleoproteinski delci, kjer

poteka sinteza proteinov. So ~ 30 nm veliki,

sestavljeni iz velike in male podenote. Njihovo

število se spreminja glede na metabolni status

celice.

Nukleoid

Nukleoid je mesto sinteze DNA

in RNA. Nahaja se v središču

bakterij. Hitro rastoče bakterije

imajo lahko več nukleoidov.

Bazični proteini ovijajo DNA in

skrbijo za njeno supernavitje.

odprta struktura

supernavita struktura

Citosol

Citosol je tekoči del citoplazme. V citosolu so raztopljeni minerali,

monomeri, intermediati metabolizma, nukleinske kisline, oligosaharidi in

vodotopni proteini. Med proteini v citosolu ločimo:

• samostojne proteine

• encimske komplekse: npr. piruvat dehidrogenaza (sestavljen iz 3 različnih

encimov in 50 proteinov), α-ketoglutarat (3 različni

encimi in 48 različnih proteinov, maščobno kislinska

sintetaza (7 različnih encimov)

Neugodni pogoji za rast

Mikrobne celice imajo izjemno sposobnost, da ostanejo žive v pogojih, ki

ne dovoljujejo rasti in začno zelo hitro rasti, ko ponovno nastopijo ugodni

pogoji. Mikrobne celice se na neugodne pogoje v okolju prilagodijo tako

da:

• zmanjšajo metabolno aktivnost

• agregirajo s sosednjimi celicami

• spremenijo morfologijo

• sporulirajo

Morfološke spremembe stradajočih celic

Zaradi stradanja se spremeni morfologija celic glede na rastoče

celice. Celice postanejo:

• manjše

• okrogle

• spremenijo se razmerja med subcelularni kompartmenti

(kondenzirana citoplazma, povečana periplazma)

• poveča se hidrofobnost površine celic (agregacija)

• spremeni se sestave membrane (povečanje nasičenosti lipidov)

• spremeni se struktura celične stene

• prihaja do kondenzacije kromosomov in plazmidov

Spore in sporulacija

Nastanek spore I

Nastanek spore II

Nastanek spore III

Struktura evkariontske celice

Evkariontska celica

Obnovi znanje o strukturi evkariotske celice, ki si ga pridobil pri

predmetu Biologija celice:

• sestava evkariontske membrane

• organeli in njihova funkcija

• struktura citoskeleta

• struktura znotrajceličnega vezikularnega transporta

• struktura signalnih poti pri evkariontskih celicah

• struktura evkariontskega genetskega aparata

Primerjava prokarionti : evkarionti

struktura/funkcija prokarionti evkarionti

skupine bakterije, arheje alge, glive, protozoji, rastline, živali

velikostni rang < 2 µm > 2 µm

celična organizacija enocelični enocelični, večcelični

jedrna membrana nima ima

diferenciacija nediferencirani diferencirani

število kromosomov 1 > 1

gibanje kromosomov citoplazmatska m. delitveno vreteno

jedrce nima ima

DNA nima histonov histoni

Primerjava prokarionti : evkarionti

struktura/funkcija prokarionti evkarionti

introni redki običajni

plazmidi prisotni odsotni

telomeraza nima ima

spolni ciklus redek, nepopolen običajen, popolen

celični cikel nima ima

transkr./translacija v istem kompartmentu ločeno

operon kontrola več encimov kontrola enega encima

- regulacija transkripcije običajna neobičajna

+ regulacija transkripcije neobičajna običajna

mRNA policistrinska monocistronska

Primerjava prokarionti : evkarionti

struktura/funkcija prokarionti evkarionti

modifikacija mRNA redka poli A in metilacija

rRNA 5S, 16S, 23S 5S, 5.8S, 18S, 28S

mala p. ribosoma 21 proteinov 30 proteinov

velika p. ribosoma 34 proteinov 50 proteinov

poliproteini niso prisotni lahko prisotni

posttranslacijske mod. neobičajne običajne

glikokaliks prisoten, debel tanjši

flagele rotirajoče nerotirajoče

flagele-sestava flagelin mikrotubuli

neflagelarno gibanje drsenje ameboidno

Primerjava prokarionti : evkarionti

struktura/funkcija prokarionti evkarionti

fimbrije pili prisotni odsotni

plazmatska m. nima sterolov ima sterole

plazmatska m. nima ogljikohidratov ima

notranje membrane samo nekateri običajne

fagocitoza odsotna prisotna

mesto respiracije citoplazmatska m. mitohondriji

mesto fotosinteze citoplazmatska m. kloroplasti

organeli nima ima

vakuole redke običajne

mikrotubuli nima prisotni

Primerjava prokarionti : evkarionti

struktura/funkcija prokarionti evkarionti

zračni vezikli lahko ima nima

metabolizem aeroben/anaeroben aeroben

eksosopre pri nekaterih običajne pri glivah

endospore lahko prisotne nima

rezervne snovi žveplo, polifosfati škrob glikogenpolibutirati

Pomembna gesla

ABC transporter periplazma kristalografija

kemotaksa glikokaliks fluorofor

endospora peritrihen koki

flagela lopotrihe bacili

plinski vezikli fototaksa pili

G- in G+ bakterije PHB fimbrije

transport skupin protoplast

LPS sferoplast

magnetosom TEM

nukleoid SEM

organeli LSCM

peptidoglikan AFM