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ÖGBT 2011 13.10.11

Stand der Nicht-invasiven Pränataldiagnostik

(NIPD-RhD) von Rhesus-D und anderen

Blutzellalloantigenen

1. Jahrestagung der ÖGBT13.10.2011

Tobias J. LeglerAbteilung Transfusionsmedizin, Universitätsmedizin Göttingen

Zertifiziert nach DIN ISO 9001:2000

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NIPDNIPD RhDRhD in Europa (in Europa (alloimmunisiertealloimmunisierte))

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NIPDNIPD RhDRhD in Europa (Rhin Europa (Rh--Prophylaxe)Prophylaxe)

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SchwartzSchwartz + Legler = 60 min+ Legler = 60 min

Schwartz Wien 55 minLegler Göttingen 5 min==

Schwartz Wien 1 secLegler Welt 60 min==

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ThemenThemen

• Präanalytik

• Cff Nukleinsäureextraktion

• Amplifikation/Detektion

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Zeitpunkt der BlutentnahmeZeitpunkt der BlutentnahmeAkolekarAkolekar et al. Fetalet al. Fetal DiagnDiagn TherTher 2011;29:3012011;29:301--306306

• 591 RhD negative Frauen 11.-14. SSW (Median 12,4)

• Automatische Nukleinsäureextraktion (BioRobot MDx, Qiagen)

• Real-time PCR 3x RHD exon 5 und 7, CCR5 als genomische Kontrolle

•502 Ergebnisse („conclusive“)

•332 D-positive Ergebnisse, 170 D-negative Ergebnisse (davon 6 falsch negativ,Sensitivität 98,2%)

•84 (14,3%) kein Ergebnis („inconclusive“)

Deutlicher Unterschied in der Sensitivität dieser Methodezwischen 12. SSW (98,2%) und 26. SSW (99,8%)

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TransportbedingungenTransportbedingungenMMüüllerller SP et al. TransfusionSP et al. Transfusion 2008;48:22922008;48:2292--301301

• 1,022 RHD-negative Schwangere, 6. – 32. SSW (median 25)Transportzeit 0-8 Tage

• QIAamp DSP Virus Kit (Qiagen, Hilden, Germany)„Säulenmethode“ (Legler et al. Prenat Diagn 2007; 27: 824-839)

• Chemagic Magnetic Separation Module 1 (Chemagen, Baesweiler, Germany)„Magnetspitzenmethode“

• Real-time PCR 2x RHD exon 5 und 7, CCR5 als genomische Kontrolle

• Diskrepanzen wurden mittels Wangeabstrich beim Neugeborenen abgeklärt

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073n falsch positiv

31†2*†n falsch negativ

99.7%99.2%99.5%Genauigkeit(n = 1,022)

> 99.7%98.1%99.2%Spezifität(n = 360)

99.5%99.8%99.7%Sensitivität(n = 662)

SerologieMagnetspitzen(automatisiert)

Säulenmethode(manuell)

TransportbedingungenTransportbedingungen

*22. SSW, fetale DNA Konzentration unterdurchschnittlich, Magnetspitzenmethode†25. SSW, Transportzeit 6 Tage bei Raumtemperatur

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Transportbedingungen (Transportbedingungen (cffcff DNA)DNA)MMüüller SP et al.ller SP et al. PrenatPrenat DiagnDiagn, im Druck, im Druck

Median 25%-75% Non-Outlier Range Outliers Extremes

0 1 2 3 4 5 6 7 8

30

35

40

45

50

Transportzeit (Tage)

Anstieg der Ct-Werte ab Tag 6(p=0,023)

RHD

Exo

n7

real

tim

e PC

R (

ct)

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TransportbedingungenTransportbedingungen ((GesamtGesamt DNA)DNA)MMüüller SP et al.ller SP et al. PrenatPrenat DiagnDiagn, im Druck, im Druck

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MonovettentypMonovettentypFernando MR et al.Fernando MR et al. PrenatPrenat DiagnDiagn 2010;30:4182010;30:418--424424

Cell-Free DNA BCTFa. Streck, La Vista, USA

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MIDIMB

CSTMINI

MINIMINI

MINIMINI

MINIMINI

HPDSP

Mea

npg

/ml

4000

3000

2000

1000

0

Pool

1

2

3

cffcff DNA Extraktion (manuell)DNA Extraktion (manuell)Legler TJ et al.Legler TJ et al. PrenatPrenat DiagnDiagn 2007;27:8242007;27:824--99

DSP: QIAamp DSP Virus Kit, HP: High Pure PCR Template Preparation Kit, MINI:QIAamp DNA Blood Mini Kit, CST: CST genomic DNA purification Kit, MB: in-housemagnetic bead separation method, MIDI: QIAamp DNA Blood Midi Kit

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DNADNA AusbeuteAusbeute:: RHDRHD ExonExon 7 PCR7 PCR

Säulenmethode: Median, 99 pg/ml mütterliches Plasma (6-6.973 pg/ml)Magnetspitzen: Median, 692 pg/ml mütterliches Plasma (35-34.418 pg/ml)

n = 660 Proben, die richtig RHD+ mit beiden Extraktionsverfahren bestimmt wurden

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NukleinsNukleinsääureextraktionureextraktionQIAampQIAamp CirculatingCirculating NucleicNucleic AcidAcid KitKit, QIAGEN, Hilden, Deutschland, QIAGEN, Hilden, Deutschland

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

RH

D E

xon

7 cf

f DN

A p

g/m

l

Magnetspitzen Säulenmethode

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Automatisierte DNAAutomatisierte DNA--ExtraktionsverfahrenExtraktionsverfahrenLegler TJ et al.Legler TJ et al. TransfusTransfus MedMed HemotherHemother 2009;36:1892009;36:189––198198

ChemagenSeparation Module 1

QIAGENBiorobot MDx

bioMérieuxNucli-Sens easyMAG

RocheAmpliprep

RocheMagna Pure

QIAGENQIAsymphony

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DiagnostischeDiagnostische LeistungsfLeistungsfäähigkeithigkeit

99.5>99.7Ampliprep (Minon 2008)

98.999.5MagnaPure(van der Schoot 2006)

94.099.7MDx (Finning 2008)

98.199.8Chemagen (Müller 2008)

>99.799.5Serologie (Müller 2008)

Spezifität [%]Sensitivität [%]

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Kontrollen bei der Analyse fetaler MarkerKontrollen bei der Analyse fetaler Marker

• Y-Chromosom: nur 50% werden erfasst

• Ins/Del Polymorphismen: ca. 300 $ / Test

• Plazentare m-RNA: Bisher keine Studiendaten

• Methylierungsspezifische PCR/RFLP

• Plasmid-DNA als Sensitivitätsmarker: CE-Markierung

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Free DNA FetalFree DNA Fetal KitKit®® RhDRhDInstitut deInstitut de BiotechnologiesBiotechnologies, Jacques Boy, Reims, France, Jacques Boy, Reims, France

http://www.biotechjboy.com/http://www.biotechjboy.com/ Vertrieb: BioVertrieb: Bio--RadRad LaboratoriesLaboratories

DNA Extraktion• QIAamp® MinElute® Virus Vacuum Kit (QIAGEN)• QIAamp DSP Virus Kit (IVD CE) (QIAGEN)RHD Exons• RHD Exons 5, 7 und 10Kontrollen• Positives Kontrollplasma• Negatives Kontrollplasma• Extraktions-/Amplifikationskontrolle DNA (Mais)

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Free DNA FetalFree DNA Fetal KitKit®® RhDRhDC.C. RouillacRouillac--LeLe Sciellour et al.Sciellour et al. TransfusTransfus ClinClin BiolBiol 2007;14:5722007;14:572--577577

• 300 D-negative Frauen (CTS 2009/108/EC: 3000)

• 10. – 34. SSW

• 229 richtig positiv (Ct 35-40, Sensitivität 100%)

• 79 richtig negativ (Spezifität >99%)

• 2 falsch positiv (Ct>39 Exon 7 und 10)

• Bestätigung durch 2. Blutprobe bei RHD-negativem

Ergebnis

310

Spezifität 97.5%

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Matrix Assisted LaserMatrix Assisted Laser DesorptionDesorptionIonizationIonization -- Time Of Flight MassTime Of Flight Mass

(MALDI(MALDI--TOF)TOF)

SequenomCMM (Center for Molecular Medicine)http://www.scmmlab.com/

SensiGene™ Fetal RhD Genotyping (launched Feb 04, 2010)

SEQureDx™ technology

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SensiGeneSensiGene FetalFetal RHDRHD GenotypingGenotypinghttp://www.scmmlab.com/

95% Konfidenz Intervall

89.5% - 99.2%96.9%Spezifität

92.9% - 98.9%97.2%Sensitivität

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RASSF1A-GenHyland CA et al.Hyland CA et al. Med JMed J AustAust.. 2009;191:212009;191:21--55

• 139 D-negative Schwangere• 94 richtig D-positv• 2 Exon 4/5 neg. Exon 10 pos.

– 1x paternales Pseudogen– 1x paternale RHD Variante

• 3 „inconclusive“ (4 Replikate, 3 Exons)• 40 richtig D-negativ

– 24 männlich– 16 SRY negativ (11.5 % D-neg. weibliche Feten)

• 16 hypermethyliertes RASSF1A nachgewiesen

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WHO Reference Reagent RHD/SRY Plasma DNA

sensitivity standard NIBSC code: 07/222

1414131111 178 15 17

13 7 9 1912 7 8 18

16 12 4 6 1816 9 2 6 1510 4 1 3 5

10 3 1 2 5 19

No +ve neat 1 in 2 1 in 4 1 in 8 1in 16 1in 32

Anforderung: 1:2

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44thth ISBT WorkshopISBT WorkshopDaniels G et al.Daniels G et al. VoxVox Sang 2011 (Sang 2011 (EpubEpub aheadahead ofof printprint))

• 24 von 25 Laboratorien richtig D-positiv• 20 von 21 Laboratorien richtig D-negativ• Kontrollen

– 18 von 24 Y-Chromosom– 5 RASSF1A– 3 Ins/Del Polymorphismen– 2 Multiples SNPs– 19 von 24 Referenz DNA

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44thth ISBT WorkshopISBT WorkshopDaniels G et al.Daniels G et al. VoxVox Sang 2011 (Sang 2011 (EpubEpub aheadahead ofof printprint))

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153

147

n

100%

100%

Genauigkeit

RhE

RhCc

NIPDNIPD ffüürr fetalesfetales RhCRhC,, RhcRhc, und, und RhERhE(Geifman(Geifman--Holtzman O, et al. BJOG 2009;116:144Holtzman O, et al. BJOG 2009;116:144--151)151)

Metaanalyse: Legler 2002, Hromadnikova 2005, Finning 2007

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100

87

46

n

>99%

>99%

>98%

Genauigkeit

>99%>95%RhE

>97%>98%Rhc

>97%>93%RhC

SpezifitätSensitivität

NIPDNIPD ffüürr fetalesfetales RhCRhC,, RhcRhc, und, und RhERhEGutensohn K et al. BJOG. 2010 117:722Gutensohn K et al. BJOG. 2010 117:722--99

• Chemagic MSM1• Primer/Sonde nach Finning et al. Transfusion 2007; 47:2126-2133• 12.-28.Schwangerschaftswoche, Median 16. SSW

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>97%>93%>94%30Scheffer et. al 2011real-time PCR PNA

32

70

n

94%

98%

Genauigkeit

>95%85%Li et al. 2008MALDI-TOF

>98%96%Finning et. al. 2007real-time PCR, LNA

SpezifitätSensitivität

NIPDNIPD ffüürr KellKell

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HPAHPA--11Scheffer et al. BJOG 2011;118:1392Scheffer et al. BJOG 2011;118:1392--55

12.-39. SSW (Median 32), n=34, Msp1-Verdau

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ZusammenfassungZusammenfassung• Vorläufig ab 9. SSW, endgültig ab 12. SSW

• NIPD Monovetten

• NIPD Extraktionsverfahren

• NIPD Amplifikation/Detektion

• NIPD fetale Kontrollen

• Kein NIPD CE-IVD Verfahren

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DanksagungenDanksagungen

Sina MüllerSibylle DammeBritta SeverittMichael Köhler†Kirsten ThomannIris BartelsWolfgang EngelGünther EmonsWerner Stein

Kai Gutensohn

SAFE Partner: Ellen van der Schoot, SinuheHahn, Kirsten Finning, Geoff Daniels, NeilAvent ....

Susan Gammon, Dirk van den Boom: Sequenom

Abteilung Transfusionsmedizin

Institut für Humangenetik

Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe

Endokrinologikum Hamburg

Europäische Kommission SAFE-NoE (LSHB-CT-2004 503243)für die finanzielle Unterstützung

ÖGBT 2011 13.10.11Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!