NGUYỄN THỊ THƠM PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC … (327).pdf · LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NGUYỄN THỊ THƠM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM

PYRETHROID TRONG RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NGUYỄN THỊ THƠM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM PYRETHROID

TRONG RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội - 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri đã

tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện

và viết luận văn.

Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban giám đốc Trung tâm Phân

tích và Chuyển giao Công nghệ Môi trƣờng và các anh chị, các bạn cộng tác tại

phòng Phân tích Môi trƣờng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc học tập và

nghiên cứu trong môi trƣờng hiện đại.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa

Hóa, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hóa Phân tích, đã cho em những kiến

thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hóa

k23, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm hóa phân tích k23 đã giúp đỡ, chia sẻ

những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,

chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.

Hà Nội, tháng 01 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Thơm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật .......................................................... 3

1.1.1. Định nghĩa .............................................................................................. 3

1.1.2. Phân loại ................................................................................................. 3

1.1.3. Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật ....................................................... 4

1.1.4. Tình hình tồn dƣ hóa chất bảo vệ thực vật trong rau ............................... 5

1.1.5. Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật ............................................ 7

1.2. Giới thiệu về hóa chất thực vật nhóm pyrethroid .......................................... 8

1.2.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 8

1.2.2. Cấu tạo và tính chất một số pyrethroid ................................................... 9

1.3. Các phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng thuốc BVTV...................................... 14

1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao................................................ 14

1.3.2 Phƣơng pháp sắc ký khí ......................................................................... 15

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ............................................... 18

2.1.1 Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu ......................................................... 18

2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 18

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 19

2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết mẫu ................................................................. 19

2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký khí ........................................................................ 20

2.2.3. Định lƣợng các hoạt chất pyrethroid bằng GC- ECD ............................ 25

2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .......................................................................... 26

2.3.1. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................... 26

2.3.2. Hóa chất ............................................................................................... 26

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 28

3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ƣu đối với việc phân tích các hoạt chất

thuốc BVTV nhóm pyrethroid ....................................................................... 28

3.1.1. Lựa chọn cột tách ................................................................................. 28

3.1.2. Nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm ........................... 28

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình nhiệt độ cột tách ................................................ 29

3.1.4. Khảo sát tốc độ khí mang...................................................................... 34

3.1.5. Khảo sát thể tích bơm mẫu ................................................................... 36

3.1.6. Tổng kết các điều kiện chạy sắc ký ....................................................... 39

3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ................................................................. 41

3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn ......................... 41

3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ................... 46

3.2.3. Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn ..................................................... 47

3.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ............................................................ 51

3.3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ...................................................................... 52

3.3.1. Khảo sát dung môi chiết và thể tích dung môi chiết .............................. 53

3.3.2. Lựa chọn điều kiện làm sạch ................................................................. 55

3.3.3. Quy trình phân tích dƣ lƣợng pyrethroid trong rau ................................ 59

3.4. Ứng dụng qui trình phân tích các mẫu rau ................................................... 61

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 67

PHỤ LỤC.............................................................................................................. 70

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Mức độ tối đa cho phép sử dụng thuốc trừ sâu pyrethroid ở một số quốc

gia .........................................................................................................................13

Bảng 2.1: Một số detector thông dụng dùng cho sắc ký khí ....................................22

Bảng 3.1: Thời gian lƣu của các hợp chất theo các chƣơng trình nhiệt độ ...............30

Bảng 3.2: Vị trí các chất trên sắc ký đồ ...................................................................32

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của tốc độ khí mang đến quá trình tách chất .........................34

Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình phân tích ......................37

Bảng 3.5: Điều kiện chạy tối ƣu cho phân tích đồng thời 4 hợp chất nhóm

pyrethroid ...............................................................................................................40

Bảng 3.6: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất ....................................41

Bảng 3.7: Phƣơng trình đƣờng chuẩn của các hoạt chất ..........................................46

Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các chất ..........................47

Bảng 3.9: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phƣơng trình đƣờng chuẩn λ-

cyhalothrin với giá trị 0 ..........................................................................................48

Bảng 3.10: Chuẩn F-tính của các chất BVTV .........................................................49

Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa b và b’ trong phƣơng trình hồi quy ......................50

Bảng 3.12: Các giá trị để so sánh chuẩn t 2 phía .....................................................50

Bảng 3.13: Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau ...................52

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát thể tích dung môi diclomethane (DCM) đối với các

hoạt chất pyrethroid ................................................................................................54

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát loại dung môi rửa giải đối với hoạt chất pyrethroid ....56

Bảng 3.16: Khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với các hoạt chất pyrethroid ..........57

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với hoạt chất pyrethroid ....58

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát thể tích dung môi rửa giải đối với các hoạt chất

pyrethroid ...............................................................................................................59

Bảng 3.19: Kết quả phân tích các mẫu rau ..............................................................62

Bảng 3.20: Kết quả phân tích các mẫu rau thêm chuẩn ...........................................63

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình thiết bị sắc ký khí thông thƣờng ................................................22

Hình 2.2: Sắc ký đồ của 2 cấu tử 1 và 2 ..................................................................23

Hình 3.1: Sắc đồ các hoạt chất nhóm pyrethroid theo CT 1.....................................30




Hình 3.5. Sắc đồ của các hoạt chất nhóm pyrethroid khi tốc độ khí mang giảm dần36

Hình 3.7: Sắc đồ các hoạt chất pyrethroid chuẩn nồng độ λ-cyhalothrin 0,5mg/l,

cypermethrin 1,0mg/l, deltamethrin 1,0mg/l và permethrin 1,0mg/l theo điều kiện

sắc ký tối ƣu. ..........................................................................................................40

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của λ-cyhalothrin và đƣờng

chuẩn của λ -cyhalothrin .........................................................................................42

Hình 3.9: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của permethrin ....................43

và đƣờng chuẩn của permethrin ..............................................................................43

Hình 3.10: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ cypermethrin .....................44

và đƣờng chuẩn của cypermethrin ..........................................................................44

Hình 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ deltamethrin ......................45

và đƣờng chuẩn của deltamethrin ...........................................................................45

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết pyrethroid vào thể tích

dung môi chiết DCM ..............................................................................................55

Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các pyrethroid khi rửa giải bằng

toluen, hexan, aceton, DCM ...................................................................................56

Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi khi kết hợp hai loại dung môi khác

nhau .......................................................................................................................57

Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết pyrethroid vào.................58

tỉ lệ dung môi rửa giải.............................................................................................58

Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi pyrethroid vào thể tích

dung môi rửa giải ........................................................................................................... 59

Luận văn Thạc Sĩ Nguyễn Thị Thơm

1

MỞ ĐẦU

Trong thời gian gần đây, hiện tƣợng ô nhiễm môi trƣờng gây ra do các hoá chất

nông nghiệp đang trở thành một vấn đề đƣợc đề cập đến khá nhiều. Các loại thuốc

trừ dịch hại, thuốc bảo vệ thực vật đang là một trong những nguyên nhân làm giảm

số lƣợng nhiều sinh vật có ích, làm giảm đa dạng sinh học, ảnh hƣởng có hại tới sức

khoẻ con ngƣời. Hàng năm, ở nƣớc ta có khoảng hơn 300 ngƣời chết vì nhiễm độc

thuốc trừ sâu, con số ngƣời bị nhiễm độc mãn tính khá cao khoảng trên 2 triệu

ngƣời, tỉ lệ ngƣời bị các bệnh rối loạn thần kinh thực vật, xảy thai, đẻ non… do bị

nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật cũng không nhỏ. Thuốc bảo vệ thực vật xâm nhập

vào cơ thể con ngƣời chủ yếu qua con đƣờng ăn uống thông qua các sản phẩm nông

sản nhƣ rau, củ, quả, ngũ cốc… Ngƣời bị nhiễm độc chủ yếu là do ăn các sản phẩm

nông sản mà dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật còn tồn lƣu trong các sản phẩm đó quá

mức cho phép.

Tuy nhiên, trên thƣc tê vi nhiêu ly do khac nhau ma tinh trang lam dung thuôc

BVTV trong san xuât rau gây ô nhiễm dƣ lƣợng thuốc BVTV đang diên ra khá phô

biên. Cùng với sự phát triển của nền kinh tế và mức sống của nhân dân, yêu cầu về

các sản phẩm nông sản sạch và an toàn nói chung, về rau an toàn nói riêng và vệ

sinh môi trƣờng của toàn xã hội ngày càng cao. Do đó, việc ứng dụng và phát triển

các phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật nhằm đánh giá thực

trạng dƣ lƣợng thuốc trong các sản phẩm rau ở nƣớc ta là rất cần thiết.

Để đóng góp thêm phƣơng pháp phân tích cho đối tƣợng này, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu các điều kiện tách cũng nhƣ xác định các hợp chất thuốc bảo vệ

thực vật nhóm pyrethroid trong rau là λ-cyhalothrin, permethrin, cypermethrin,

deltamethrin bằng phƣơng pháp sắc ký khí (GC) sử dụng detector bắt điện tử

(ECD).


2

Mục tiêu thực hiện đề tài luận văn là:

1. Xây dựng phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật pyrethroid

trong rau, bao gồm:

+ Khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu và phân tích

+ Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng

2. Áp dụng phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật pyrethroid để

khảo sát một số mẫu rau trên địa bàn Hà Nội.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật

1.1.1. Định nghĩa [10]

Hóa chất bảo vệ thực vật là những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng

hợp hóa học đƣợc dùng để phòng và trừ sinh vật gây hại cây trồng và nông sản. Hóa

chất bảo vệ thực vật gồm nhiều nhóm khác nhau, gọi theo tên nhóm sinh vật gây hại

nhƣ: thuốc trừ sâu để trừ sâu hại, thuốc trừ bệnh dùng để trừ bệnh cây…

1.1.2. Phân loại [10]

Các loại hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều loại, chủ yếu 4 nhóm chính:

- Nhóm clo hữu cơ (organnochlorine) là các dẫn xuất clo của một số hợp

chất hữu cơ nhƣ diphenyletan, cyclodien, benzen, hexan. Nhóm này bao gồm những

hợp chất hữu cơ rất bền vững trong môi trƣờng tự nhiên và thời gian bán phân hủy

dài (ví dụ DDT có thời gian bán phân hủy 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích lũy

vào cơ thể sinh vật qua chuỗi thức ăn). Đại diện nhóm này là aldrin, dieldrin, DDT,

heptachlo, lindan, methoxychlor.

- Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn xuất hữu

cơ của acid photphoric. Nhóm này có thời gian bán phân hủy ngắn hơn so với nhóm

clo hữu cơ và đƣợc sử dụng rộng rãi. Nhóm này tác động vào thần kinh của côn

trùng bằng cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt

động kém, làm yếu cơ, gây choáng váng và chết. Nhóm này bao gồm một số hợp

chất nhƣ parathion, malathion, diclovos, chlopyrifos…

- Nhóm carbamat là các dẫn suất hữu cơ của các acid cacbamic, gồm những

hóa chất ít bền vững hơn trong môi trƣờng tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối

với nguời và động vật. Khi sử dụng, chúng tác động trực tiếp vào men Chlinestraza

của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc giống nhƣ nhóm lân hữu cơ. Đại diện cho

nhóm này nhƣ: carbofuran, carbonyl, carbosulfan, isoprocarb…


4

- Nhóm pyrethroid là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp

của các este khác nhau có cấu trúc phức tạp đƣợc tách ra từ hoa của những giống

cúc. Đại diện của nhóm này gồm cypermethrin, permethrin, deltamethrin, λ-

cyhalothrin…

Ngoài ra, còn có một số nhóm khác nhƣ: các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen),

nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm,

trừ vi khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp chất của đồng, thủy ngân…).

1.1.3. Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật [10]

Hầu hết hóa chất bảo vệ thực vật đều độc với con ngƣời và động vật máu

nóng ở các mức độ khác nhau. Theo đặc tính hóa chất bảo vệ thực vật đƣợc chia

làm hai loại: chất độc cấp tính và chất độc mãn tính.

- Chất độc cấp tính: Mức độ gây độc phụ thuộc vào lƣợng thuốc xâm nhập

vào cơ thể. Ở dƣới liều gây chết, chúng không đủ khả năng gây tử vong, dần dần bị

phân giải và bài tiết ra ngoài. Loại này bao gồm các hợp chất pyrethroid, những hợp

chất phốt pho hữu cơ, carbamat, thuốc có nguồn gốc sinh vật.

- Chất độc mãn tính: Có khả năng tích lũy lâu dài trong cơ thể vì chúng rất

bền, khi bị phân giải và bài tiết ra ngoài. Thuốc loại này gồm nhiều hợp chất chứa

clo hữu cơ, chứa thạch tín (Asen), chì, thủy ngân, đây là những loại rất nguy hiểm

cho sức khỏe.

Hóa chất bảo vệ thực vật có thể thâm nhập vào cơ thể con ngƣời và động vật

qua nhiều con đƣờng khác nhau, thông thƣờng qua 03 đƣờng chính: hô hấp, tiêu hóa

và tiếp xúc trực tiếp. Khi tiếp xúc với hóa chất bảo vệ thực vật, con ngƣời có thể bị

nhiễm độc cấp tính hoặc mãn tính, tùy thuộc vào phạm vi ảnh hƣởng của thuốc.

Nhiễm độc cấp tính: là nhiễm độc tức thời khi một lƣợng đủ lớn hóa chất bảo

vệ thực vật thâm nhập vào cơ thể. Những triệu chứng nhiễm độc tăng tỉ lệ với việc

tiếp xúc và trong một số trƣờng hợp nặng có thể dẫn đến tử vong. Biểu hiện bệnh lý

của nhiễm độc cấp tính: mệt mỏi, ngứa da, đau đầu, lợm giọng, buồn nôn, hoa mắt


5

chóng mặt, khô họng, mất ngủ, tăng tiết nƣớc bọt, yếu cơ, chảy nƣớc mắt, sảy thai,

nếu nặng có thể gây tử vong.

Nhiễm độc mãn tính: là nhiễm độc gây ra do tích lũy dần trong cơ thể.

Thông thƣờng, không có triệu chứng nào xuất hiện ngay trong mỗi lần nhiễm. Sau

một thời gian dài, một lƣợng chất độc lớn tích tụ trong cơ thể sẽ gây ra các triệu

chứng lâm sàng. Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc mãn tính: kích thích các tế bào

ung thƣ phát triển, gây đẻ quái thai, suy giảm trí nhớ và khả năng tập trung, suy

nhƣợc nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến hệ thần kinh, gây tổn hại cho gan, thận và não.

1.1.4. Tình hình tồn dƣ hóa chất bảo vệ thực vật trong rau

Theo kết quả kiểm tra của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn năm

2009, trong 25 mẫu rau tại các tỉnh phía Bắc, có tới 44% mẫu rau có dƣ lƣợng thuốc

bảo vệ thực vật, trong đó 4% có hoạt chất độc vƣợt giới hạn cho phép. Kiểm tra 35

mẫu rau tại các tỉnh phía Nam, Cục bảo vệ thực vật phát hiện tới 54% mẫu có dƣ

lƣợng thuốc bảo vệ thực vật, trong đó 8,6% mẫu đƣợc phát hiện có hàm lƣợng

thuốc bảo vệ thực vật đủ khả năng gây độc cho ngƣời sử dụng [5].

Theo thông tin từ Cục trƣởng Cục Bảo vệ thực vật (BVTV) Nguyễn Xuân

Hồng, trong tháng 10/2012, Cục BVTV đã chỉ đạo các đơn vị tiến hành lấy 50 mẫu

rau sống (xà lách, rau diếp, rau húng và rau mùi) tại TP. Hồ Chí Minh và Hà Nội để

kiểm nghiệm các chỉ tiêu về dƣ lƣợng thuốc BVTV và kim loại nặng trong 11 hoạt

chất sử dụng phổ biến có nguy cơ nhiễm chì và asen. Kết quả có 29/50 mẫu (58%)

phát hiện có dƣ lƣợng thuốc BVTV; 20 mẫu (chiếm 40%) phát hiện có kim loại

nặng. Đối với rau tƣơi, hiện có khoảng 6-7% lƣợng rau xanh trên thị trƣờng có dƣ

lƣợng thuốc BVTV vƣợt ngƣỡng cho phép, 40% mẫu rau, giá đỗ có thành phần vi

sinh vật vƣợt ngƣỡng cho phép. Còn theo khảo sát của Cục Quản lý chất lƣợng

nông, lâm, thủy sản, trong hơn 500 mẫu rau quả mà Cục kiểm tra thì có trên 6%

nhiễm thuốc BVTV bị cấm sử dụng [3].

Trong khoản thời gian từ tháng 12/2011 đến 11/2012, Trung tâm Ky thuât

Đo lƣơng Thƣ nghiêm Quang Binh đa tiên hanh điêu tra , khảo sát tình hình sản


6

xuât, tiêu thu va lây 360 mẫu rau các loại tại 08 chợ đầu mối và 09 vùng trồng rau

trên địa bàn tỉnh Quảng Bình đã phát hiện: 169 mẫu còn tồn dƣ thuốc BVTV. Vùng

trồng rau phát hiện 27/58 mẫu (chiếm 47%), các chợ phát hiện 142/302 mẫu (chiếm

47%); có 57 mẫu rau phát hiện có dƣ lƣợng thuốc BVTV thuộc danh mục cấm,

gồm: Gama-BHC: phát hiện 1/360 mẫu; Heptachlor epoxide: phát hiện 5/360 mẫu;

Endosulfan I: phát hiện 1/360 mẫu; Metyl parathion: phát hiện 50/360 mẫu, 21/360

mẫu phat hiên Diclovos , 28/360 mâu phat hiên Prothiofos , Phát hiện 02 mẩu rau có

hàm lƣợng Metyl parathion vƣợt 1,5 - 1,6 lần giới hạn cho phép. Tại hội nghị về

công tác vệ sinh an toàn thực phẩm trong ngành nông nghiệp vừa diễn ra hôm

25/8/2009. Cục Bảo vệ thực vật (BVTV – Bộ NN&PTNT) công bố kết quả kiểm tra

25 mẫu rau tại các tỉnh phía Bắc, có tới 44% mẫu rau có dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực

vật, trong đó 4% có hoạt chất độc hại vƣợt quá giới hạn cho phép [12].

Thông tin từ hội thảo “Quản lý an toàn thực phẩm đối với sản xuất và kinh

doanh rau quả ở quy mô nhỏ” do Viện Chính sách và Chiến lƣợc phát triển nông

nghiệp nông thôn tổ chức ngày 19/12/2012 : trong cuộc khảo sát tại 8 tỉnh cho thấy,

có đến 51,24% mẫu rau phát hiện tồn dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật và kim loại

nặng, 47% mẫu rau tồn dƣ vƣợt ngƣỡng NO3, đây là một trong những nguyên nhân

chính gây ra các vụ ngộ độc tại nƣớc ta thời gian qua [14].

Trên thế giới, tại Ấn độ, cuộc điều tra đƣợc Bộ Nông nghiệp Ấn độ tiến hành

trong một năm từ tháng 11 năm 2007 đến tháng 10 năm 2008 trên toàn đất nƣớc Ấn

Độ. Kết quả là 18% rau và 12% hoa quả nội địa và nhập khẩu của Ấn Độ đều có dƣ

lƣợng thuốc trừ sâu, kể cả những loại thuốc trừ sâu bị cấm, trong đó 4% lƣợng rau

và 2% lƣợng hoa quả có dƣ lƣợng thuốc trừ sâu cao hơn mức cho phép. Khoảng

18% (664 mẫu) trong tổng số 3.648 mẫu rau nhƣ mƣớp, cà chua, bắp cải và súp lơ

đều có dƣ lƣợng thuốc trừ sâu. Các loại rau nhƣ bắp cải, súp lơ và cà chua có dƣ

lƣợng thuốc trừ sâu lớn nhất. Các loại thuốc trừ sâu tìm thấy trong các loại chủ yếu

là chlorpyrifos, monocrotophos, profenophos và cypermethrin [4].


7

1.1.5. Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật

Theo thống kê của Tổ chức Lao động Quốc tế ILO, trên thế giới, hàng năm

có trên 40.000 ngƣời chết vì ngộ độc rau trên tổng số 2 triệu nguời ngộ độc. Tại

Việt Nam, con số ngƣời bị ngộ độc cũng không nhỏ. Từ năm 1993 – 1998, hàng

chục ngàn ngƣời bị nhiễm độc do ăn phải rau ăn quả còn dƣ lƣợng thuốc trừ sâu.

Nặng nhất ở Đồng bằng song Cửu Long, năm 1995 có 13.000 ngƣời nhiễm độc,

trong đó 354 ngƣời chết [9].

Thống kê của Cục An toàn và vệ sinh thực phẩm thuộc Bộ Y tế, từ năm 2000

- 2007 đã có tới 205 vụ ngộ độc, với 3.637 ngƣời mắc, 23 ngƣời chết do thực phẩm

gây ngộ độc là rau, củ, quả. Tính riêng năm 2007 cũng có 37 vụ ngộ độc, 555 ngƣời

mắc và 7 ngƣời tử vong. Mặc dù đây là số liệu tổng hợp từ báo cáo chƣa đầy đủ của

các tỉnh gửi về nhƣng cũng cảnh báo thực trạng rất đáng lo ngại [15].

Thống kê của Bộ Y tế, trong năm 2012 đã xảy ra 112 vụ ngộ độc thực phẩm

với hơn 3.000 ngƣời mắc phải, trong đó nhiều trƣờng hợp đã tử vong, riêng 6 tháng

đầu năm 2013 cả nƣớc đã xảy ra 67 vụ ngộ độc thực phẩm với 1.856 ngƣời mắc,

1.649 ngƣời nhập viện và 18 trƣờng hợp tử vong. Cũng theo khảo sát của cơ quan

này trong số 200.000 ngƣời/năm bị ung thƣ thì có 35% trong số đó liên quan đến

thực phẩm ô nhiễm chất độc [1].

Năm 1990, một thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho thấy có

khoảng 25 triệu lao động trong ngành nông nghiệp bị nhiễm độc hóa chất bảo vệ

thực vật mỗi năm. Cho đến nay, chúng ta vẫn chƣa có những con số ƣớc tính trên

phạm vi toàn cầu, nhƣng hiện có 1,3 tỷ lao động trong ngành nông nghiệp và có thể

hàng triệu ca nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật vẫn đang xảy ra hàng năm [2].

Năm 2000, Bộ y tế Braxin ƣớc tính trong một năm nƣớc này có 300.000 ca

nhiễm độc và 5.000 ca tử vong do hóa chất bảo vệ thực vật. Trong một nghiên cứu

ở Indonexia, 21% trong số các ca liên quan đến hóa chất bảo vệ thực vật có những

dấu hiệu hay triệu chứng về tâm thần, hô hấp và tiêu hóa. Trong một cuộc khảo sát

của Liên hợp quốc, 88% nông dân Campuchia sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đã

từng có triệu trứng nhiễm độc [2].


8

1.2. Giới thiệu về hóa chất thực vật nhóm pyrethroid

1.2.1. Giới thiệu chung

Pyrethroid là dẫn xuất của este cacboxylat (còn gọi là este pyrethrum hoặc

este của pyrethrin, có nguồn gốc tự nhiên từ cây hoa cúc Chrysanthemum

cinerariaefolium và C.roseum chứa nhiều hoạt chất pyrethrin độc đối với côn trùng.

Các hoạt chất pyrethrin có thể đƣợc chiết xuất từ hoa, lá khô và rễ cây bằng một

dung môi, chúng có tác dụng gây chết tức thời đối với côn trùng. Trong dịch chiết

của pyrethrin có sáu este của hai axit cacboxylic với ba xyclopentenolon với tỷ lệ

khác nhau. Công thức cấu tạo hoá học rất phức tạp nhƣng khi phân giải bị tách nhỏ

thành những hợp chất có cấu tạo đơn giản, có thể chứa các nguyên tố Nitơ, Brôm.

CH3

CH3 C

CH3

CH

CH3CH

O

O

CH3

O

CH CH CH CH2

CÊu t¹o ho¸ häc chÊt Pyrethrin

Các hoạt chất pyrethroid đều tan mạnh trong chất béo, gần nhƣ không tan trong

nƣớc, nên chúng có hiệu lực tiếp xúc mạnh hơn hiệu lực vị độc. Hầu hết thuốc trừ

sâu pyrethroid có điểm sôi khá cao, ở dạng lỏng nhày, áp suất hơi thấp (trừ allethrin,

prothrin và pyrethrin I). Pyrethrin có phổ trừ sâu rộng, hiệu lực diệt cao, độc tính

thấp với động vật máu nóng, nhƣng dễ bị phân hủy quang hóa nên chỉ dùng để diệt

và loại côn trùng trong nhà. Chính nhờ tình chất quý báu đó của pyrethrin, đã thúc

đẩy quá trình nghiên cứu tổng hợp các đồng đẳng của nó với hiệu lực diệt cao hơn

và độ bền quang hóa tốt hơn nhằm đƣa vào sử dụng rộng rãi thay thế cho những hợp

chất diệt côn trùng nhóm clo hữu cơ, phốt pho hữu cơ và carbamat [7].

Pyrethroid không tác động đến các hệ men sống của cơ thể sinh vật, mà tác

động trực tiếp đến hệ thần kinh của công trùng và động vật máu nóng. Ở côn trùng,

pyrethroid tác động đến hệ thần kinh trung ƣơng và ngoại vi ở liều rất thấp. Thuốc

gây rối loạn sự dẫn truyền xung động của kênh natri dọc sợi trục của tế bào thần

kinh côn trùng. Tác động đến sự truyền xung động của tế bào sợi trục thần kinh,


9

ngăn cản và kìm hãm sự truyền xung động trong tế bào thần kinh. Ở động vật máu

nóng, pyrethroid tác động đến các trung tâm hô hấp ở tuỷ sống và hệ thần kinh

kiểm soát chức năng của tim. Triệu chứng ngộ độc của pyrethroid trong côn trùng

và động vật máu nóng rất giống nhau: Trƣớc tiên là kích động, rùng mình, rối

loạn tiếp sau là bại liệt và chết [7].

Các chất chủ yếu của nhóm bao gồm: allethrin, pyrethrin, permethrin,

cypermethrin, cyfluthrin, cyhalothirn , bifenthirn, deltamethrin, fenpropathrin,

ethofenprox…

1.2.2. Cấu tạo và tính chất một số pyrethroid

1.2.2.1. Lambda-cyhalothrin (λ-cyhalothrin)

Tên tƣơng ứng: (1S,3S)-rel-3-[(1Z)-2-Chloro-3,3,3-trifluoro-1-propenyl]-

2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid (R)-cyano(3-phenoxyphenyl) methyl

ester; hoặc (±)-α-cyano-3-pheoxybezyl 3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-

dimethylcyclopropane carboxylate. Tên thƣơng mại là Demand, Karate, Warrior. λ-

cyhalothrin là chất rắn không mùi màu trắng, độ tan trong nƣớc thấp và không bay

hơi [23].

Công thức phân tử: C23H19ClF3NO3.

M = 449,86g/mol.

tnc = 49,2˚C.

ts = 275˚C.

λ-cyhalothrin làm gián đoạn hoạt động của hệ thống thần kinh trong cơ thể

sinh vật. Bằng cách phá vỡ các hệ thống thần kinh của côn trùng. λ -cyhalothrin có

thể làm cho côn trùng tê liệt hoặc chết. Khi tiếp xúc với λ-cyhalothrin có các triệu

chứng: ngứa da, cháy da, chóng mặt, nhức đầu, buồn nôn, chán ăn, mệt mỏi. Những

ca nhiễm độc nặng có thể gây co giật và hôn mê. Nó đƣợc xếp vào nhóm có thể gây

ung thƣ đối với con ngƣời [23].


10

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của λ-cyhalothrin là

0,02mg/kg trọng lƣợng cơ thể. Đối với chuột. liều gây chết trung bình qua đƣờng

miệng LD50 với chuột đực 79mg/kg, chuột cái là 56mg/kg và liều chết trung bình

qua da là 632mg/kg [23].

1.2.2.2. Cypermethrin

Cypermethrin đƣợc tổng hợp thành công vào năm 1974 và đƣợc tung ra thị

trƣờng lần đầu tiên vào năm 1977 (WHO, 1989). Cypermethrin là chất bán rắn (sệt),

không mùi, có màu vàng nâu và ít tan trong nƣớc (khoảng 0,009 mg/L). Tuy nhiên,

cypermethrin hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ nhƣ aceton, cyclohexan, ethanol,

hexan ( 103g/L), xylen ( > 450 g/L). Nó ở dạng bột tinh thể không màu, bền ở điều

kiện thƣờng. Dạng kỹ thuật có màu vàng nâu, nhớt. Tên thƣơng mại là AmmoTM

.

Cyperkill. CybushR….[21].

Tên tƣơng ứng là: [Cyano-(3-phenoxyphenyl)methyl]3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-

dimethylcyclopropane-1-carboxylate

Công thức phân tử: C22H19Cl2NO3

M = 416,30 g/mol.

tnc = 60˚C - 80˚C

ts = 220˚C

Tác động chủ yếu của cypermethrin là tác động lên hệ thống thần kinh. Cơ

chế tác động của cypermethrin là gây ảnh hƣởng đến sự vận chuyển của Na qua

màng tế bào thần kinh. Cypermethrin làm tăng độ thấm của của Na qua màng tế bào

thần kinh, kết quả gây nên sự lặp đi lặp lại và kéo dài xung động thần kinh trong cơ

quan cảm giác và làm đình trệ xung động trong sợi thần kinh. Nó đƣợc xếp vào

nhóm chất độc có thể gây bệnh ung thƣ. Triệu chứng đối với con ngƣời khi tiếp xúc

là ngứa, bỏng rát, chóng mặt [21].

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của cypermethrin là

0,05mg/kg trọng lƣợng cơ thể. Liều gây chết trung bình qua đƣờng miệng LD50 là

187- 326mg/kg đối với chuột đực và 150- 500mg/kg đối với chuột cái [21].


11

1.2.2.3. Deltamethrin

Deltamethrin đƣợc coi là hoạt chất mạnh nhất và độc nhất trong nhóm

pyrethroid. Nó có dạng tinh thể rắn màu trắng, bền ở điều kiện thƣờng. Permethrin

không tan trong nƣớc, tan nhiều trong dung môi hữu cơ: Dioxan: 900g/l;

cyclohexanone: 750 g/l; dicloromethane: 700g/l; Acetone: 500g/l; Benzen: 450g/l.

Bền trong môi trƣờng acid hơn môi trƣờng kiềm, tƣơng đối bền dƣới tác động của

không khí, nhƣng dƣới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại bị phân

huỷ; không ăn mòn kim loại; thuộc nhóm độc II. Tên thƣơng mại các sản phẩm

chứa hoạt chất deltamethrin gồm Butoflin, Butoss, Butox, Cislin, Crackdown,

Cresus, Decis, Decis-Prime, K-Othrin and K-Otek [22].

Tên tƣơng ứng: [(S)-Cyano-(3-phenoxyphenyl)-methyl](1R,3R)-3-(2,2-

dibromoethenyl) -2,2-dimethyl-cyclopropane-1-carboxylate.

Công thức phân tử: C22H19Br2NO3

M = 505,24g/mol.

tnc = 98- 101˚C

ts = 300˚C

Deltamethrin có tác dụng chọn lọc cao, ít độc hại với sinh vật có ích, diệt

đƣợc các côn trùng và sâu kháng thuốc clo hữu cơ, phosphat hữu cơ và cacbamat.

Deltamethrin hòa tan nhanh trong lipit và lipoprotein nên có tác dụng tiếp xúc

mạnh, thuốc gây hiện tƣợng choáng độc nhanh và có tác dụng xua đuỗi một số loài

côn trùng. Độ độc cấp tính đối với ngƣời và động vật máu nóng thấp hơn nhiều so

với hóa chất phosphat hữu cơ, nhanh chóng phân hủy trong cơ thể sống và môi

trƣờng, nhƣng rất độc với cá và động vật thủy sinh [22].

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của deltamethrin là

0,01mg/kg/ngày trọng lƣợng cơ thể. Liều gây chết trung bình LD50 đối với chuột

đực qua đƣờng miệng là 128mg/kg, chuột cái là 52mg/kg [22].


12

1.2.2.4. Permethrin

Các tên tƣơng ứng: 3-Phenoxybenzyl (1RS)-cis,trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-

2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate. Permethrin có dạng bột tinh thể màu trắng,

bền ở điều kiện bình thƣờng, phân hủy ở nhiệt độ > 1900C. Nó hầu nhƣ không tan

trong nƣớc (5,5.10-3

ppm), tan tốt trong dung môi hữu cơ nhƣ hexan, xylene. Bền

trong môi trƣờng acid, thủy phân trong môi trƣờng kiềm, thuộc nhóm độc III [27].

Công thức phân tử: C21H20Cl2O3

M = 391,29g/mol.

tnc = 63- 65˚C

ts = 220˚C

Permethrin là một hóa chất diệt côn trùng thông dụng, sinh vật ký sinh. Hóa

chất này thuộc gia đình các hóa chất tổng hợp pyrethroid và có chức năng nhƣ là

một chất gây độc tố cho thần kinh, làm tăng độ thấm của của Na qua màng tế bào

thần kinh, kết quả gây nên sự lặp đi lặp lại và kéo dài xung động thần kinh trong cơ

quan cảm giác và làm đình trệ xung động trong sợi thần kinh. Hóa chất này không

gây hại nhanh động vật có vú và chim, nhƣng là hóa chất rất độc đối với mèo và cá.

Nói chung, permethrin có độ độc thấp với động vật có vú và hầu nhƣ không bị hấp

thụ bởi da. Permethrin diệt hầu nhƣ tất cả các loài côn trùng, nó có thể gây hại đối

với các loài côn trùng có lợi nhƣ ong mật và sinh vật sống dƣới nƣớc. Triệu chứng

gây độc khi tiếp xúc nhiều với permethrin là nôn, đau đầu, yếu cơ, tiết ra nhiều

nƣớc bọt, đau tim cấp và co giật. Theo cơ quan bảo vệ môi trƣờng Mỹ (EPA), nó có

khả năng gây ung thƣ [27].

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của permethrin là 0-

0,05mg/kg/ngày trọng lƣợng cơ thể. Liều gây chết trung bình LD50 đối với chuột

tiếp xúc qua đƣờng miệng là 430- 470 mg/kg [27].

1.2.2.5. Giới hạn cho phép

Dƣ lƣợng thuốc BVTV là những chất đặc thù tồn lƣu trong lƣơng thực và

thực phẩm, trong sản phẩm nông nghiệp và trong thức ăn vật nuôi do sử dụng thuốc


13

BVTV gây nên. Những chất đặc thù này bao gồm hoạt chất và các phụ gia ở dạng

hợp chất ban đầu, các sản phẩm chuyển hoá trung gian và sản phẩm phân giải ở

dạng tự do hoặc liên kết với các chất trong thực vật có hại tới sức khoẻ con ngƣời

và động vật máu nóng (gọi chung là chất độc).

Dƣ lƣợng này đƣợc tính bằng mg (miligam) hoặc g (microgam) trong 1kg

nông sản. Từng loại thuốc đối với từng loại nông sản đều đƣợc qui định mức dƣ

lƣợng tối đa cho phép mà không gây hại đến cơ thể ngƣời và vật nuôi khi ăn nông

sản đó (maximum residue limited, viết tắt là MRL). Mức dƣ lƣợng tối đa cho phép

có thể qui định khác nhau ở mỗi nƣớc, tuỳ theo đặc điểm sinh lý, sinh thái và đặc

điểm dinh dƣỡng của ngƣời dân nƣớc đó.

Bảng 1.1: Mức độ tối đa cho phép sử dụng thuốc trừ sâu pyrethroid ở một số

quốc gia

Quốc gia Đối tƣợng

λ-

cyhalothrin Permethrin Cypermethrin Deltamethrin

mg/kg

Việt Nam

(Quyết định

46/2007/QĐ-

BYT) [8]

- Cà chua,

đậu đỗ.

- Cải xoăn,

rau họ bắp

cải, bông

cải xanh

-

0,2

1,0

2,0

0,5

1,0

0,3

0,5

Mỹ - Cà chua

- Đậu đỗ

- Bắp cải

0,2

3

3

0,04

-

0,2

EU - Cà chua

- Đậu đỗ

- Bắp cải

-

0,5

0,2

0,3

-

0,2


14

1.3. Các phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV

1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xác định dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật flumethrin, deltamethrin,

cypermethrin và cyhalothrin trong sữa và máu của bò sữa bằng phƣơng pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bƣớc sóng 266nm. Mẫu đƣợc chiết với tỷ

lệ hỗn hợp acetonitril và hexan. Sau đó làm sạch bằng cột slilicagel với dung môi n-

hexan và dietyl ether. Dịch chiết đƣợc đem đi đo bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng

cao. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,001mg/kg. Hiệu suất thu hồi trung

bình của 4 hoạt chất pyrethroid từ 78 đến 91% [20].

Tác giả Loper và cộng sự đã xác định thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethrin

và pyrethroid trong nƣớc mẫu nƣớc đầu vào và nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp sắc ký

lỏng sử dụng detector Diode array (LC-DAD). Pha động gồm: nuớc và acetonitril,

chế độ chạy gradient. Tốc độ dòng 0,5ml/phút. Các mẫu đƣợc chiết đơn giản, không

độc và nhanh, chỉ sử dụng natri clorua và acetonitril. Dịch chiết đƣợc lọc và phân

tích trên hệ thống sắc ký lỏng. Hiệu suất thu hồi mẫu nuớc đầu vào trong khoảng từ

77 đến 103% với độ lệch chuẩn tƣơng đối đạt 3-12%. Hiệu suất thu hồi mẫu nƣớc

tiểu đạt 80 – 117% với độ lệch chuẩn tƣơng đối từ 2-27%. Tất cả các hoạt chất thu

đuợc ở bƣớc sóng 235nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp trong 5mL mẫu

nƣớc tiểu là 0,005µg/mL đối với tetramethrin, allethrin, resmethrin, permethrin;

0,004µg/mL đối với pyrethrum I; 0,04µg/mL đối với pyrethrum II; 0,002µg/mL đối

với fenvalerate [26].

Phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC) đƣợc phát triển để tách và

định lƣợng các đồng phân của cypermethrin, resmethrin và permethrin. Quá trình

tách đƣợc thực hiện trên cột Phenomenex Luna C18 (4,6 x 150mm x 5µm). Các

hoạt chất pyrethroid đƣợc phát hiện bằng detector UV-DAD ở bƣớc sóng 220nm.

Pha động tối ƣu là hỗn hợp của acetonitril: methanol: nƣớc theo tỷ lệ thể tích 1 : 3

:1 tƣơng ứng. Hệ số tƣơng quan (R2) lần lƣợt là 0,9991; 0,9951; 0,9964 và độ lệch

chuẩn tƣơng đối (RSD%) là 1,95; 2,89; 1,87 tƣơng ứng với hoạt chất cypermethrin,


15

resmethrin, permethrin. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

nằm trong khoảng 17-23,4µg/L và 56-78µg/L [17].

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp thông dụng để

xác định các hợp chất hữu cơ. Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng để xác định

đồng thời các hoạt chất pyrethroid. Tuy nhiên, phƣơng pháp có độ nhạy kém khi sử

dụng detector UV, DAD. Đối với các nền mẫu phức tạp, các chất phân tích dễ bị

ảnh hƣởng bởi nền mẫu, nếu chỉ dựa vào thời gian lƣu sẽ rất khó để có thể khẳng

định chất cần phân tích.

1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký khí

Tác giả Phan Nguyễn Tâm Minh đã xác định đƣợc đồng thời dƣ lƣợng thuốc

trừ sâu họ Pyrethroid và Lân hữu cơ trong nƣớc bằng phƣơng pháp sắc ký khí kết

hợp với chiết pha rắn. Các hoạt chất đƣợc xác định đồng thời trong mẫu: lambda-

cyhalothrin, permethrin, deltamethrin, fenvalerate, cyfluthrin, tetramethrin,

cypermethrin, allethrin, cyphenothrin, diazinon, chlorpyrifos, dimethoate,

phenthoate, phenitrothion. Tác giả xây dựng đƣợc điều kiện tối ƣu trên thiết bị sắc

ký khí kết hợp detector bắt điện tử và điều kiện tối ƣu để chiết 14 hoạt chất trên

bằng chiết pha rắn C18: hoạt hóa cột bằng 5ml hexan, 5ml methanol, 20ml nƣớc,

rửa giải các hoạt chất bằng hỗn hợp etyl acetate và hexan (75: 25, v/v) [6].

Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ đƣợc tác giả Nguyễn Thị Bích Thu và cộng

sự dùng để phân tích dƣ lƣợng một số hóa chất bảo vệ thƣờng dùng trong mẫu dƣợc

liệu và một số nông sản. Tác giả đã ứng dụng thành công phƣơng pháp phân tích

trên các nhóm thuốc clo hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid đồng thời đề xuất đƣợc

quy trình phân tích 3 nhóm thuốc bảo vệ thực vật trên đối tƣợng là mẫu dƣợc liệu.

Dung môi chiết đƣợc nghiên cứu là hỗn hợp aceton: n-hexan (1:1, v/v) và dung môi

rửa giải là hỗn hợp diclomethan: hexan (1:4, v/v). Đề tài sử dụng cột silicagel kết

hợp với than hoạt tính để làm sạch chất phân tích đã thu đƣợc hiệu suất thu hồi cao

khoảng từ 80-110% [13].

Dƣ lƣợng các thuốc trừ sâu họ clo hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid trong các

loại nông sản gồm bột ngũ cốc, trái đào và rau diếp đƣợc xác định bằng phƣơng

pháp sắc ký khí với detector bắt điện tử (GC-ECD) và sắc ký khí khối khổ (GC-MS)


16

theo qui trình sau: mẫu đƣợc chiết với dung môi acetone: nƣớc (8:2) sau đó đƣợc

lọc lấy dịch chiết. Dịch chiết đƣợc pha loãng theo tỉ lệ 5g mẫu/200ml nƣớc rồi cho

qua cột GCB (400mg ENVI- Carb), rửa với ethyl acetate: methanol (8:2). Tiếp tục

cho qua cột SAX/PSA (250mg + 250mg), rửa giải bằng ethyl acetate: methanol

(8:2). Sau đó cho bay hơi dịch chiết còn 5ml và lấy dịch này tiêm vào máy sắc ký.

Giới hạn phát hiện LOD của phƣơng pháp từ 0,0005- 0,004mg/kg và giới hạn định

lƣợng LOQ từ 0,005- 0,01mg/kg [19].

Tác giả Kuang Hua và cộng sự đã xác định đuợc 16 dƣ lƣợng thuốc

pyrethroid trong mẫu chè bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS). Thuốc

trừ sâu nhóm Pyrethroid đựợc chiết bằng acetone và chiết lỏng lỏng bằng hexan.

Dịch chiết đƣợc cô khô và làm sạch qua cột florisil, dung dịch rửa giải là ete dầu

hỏa- dietyl ete. Phân tích thuốc bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ. Hiệu suất

thu hồi của 16 thuốc nhóm pyrethroid trong khoảng từ 71,3 đến 106,3% và hệ số

biến thiên nhỏ hơn 17%. Giới hạn phát hiện từ 0,001µg/g đến 0,05µg/g. Phƣơng

pháp ứng dụng thành công để xác định dƣ lƣợng pyrethroid trong 25 mẫu chè. Dƣ

lƣợng của cyfluthrin, λ-cyhalothrin, cypermethrin, dicofol, fenpropathrin,

femvalerate, fluvalinate and tetramethrin trong các mẫu ở khoảng 1,18 –

3071,29µg/g [25].

Phƣơng pháp sắc ký với detector bắt điện tử và sắc ký khí khối phổ đƣợc ứng

dụng xác định đồng thời 12 hợp chất pyrethroid (tefluthrin, bifenthrin,

fenpropathrin, cyhalothrin, permethrin, cyfluthrin, cypermethrin, α-cypermethrin,

flucythrinate, fenvalerate,. fluvalinate và deltamethrin) trong mẫu cà chua xay, rƣợu

đào tiên, nƣớc cam, đậu đóng gói. Mẫu đƣợc chiết với acetone, hỗn hợp ethyl

acetate – cyclohexane (50 + 50, v/v). Dịch chiết đem cô và tiến hành bƣớc làm sạch

trên cột florisil với hỗn hợp dung môi rửa giải là etyl acetate và hexan. Thu toàn bộ

dịch rửa giải có chứa chất phân tích đem cô khô và định mức bằng 1ml hexan, đem

đo trên thiết bị sắc ký khí với detector bắt điện tử và detector khối phổ. Hiệu suất

thu hồi đạt 70,2- 96,0%. Hệ số biến thiên nằm trong khoảng 4,0 đến 13,9% cho tất


17

cả các hợp chất. Giới hạn phát hiện < 0,01mg/kg khi phân tích trên detector ECD

[28].

Tác giả Alicja Niewiadowska và cộng sự đã xác định đƣợc đồng thời dƣ

lƣợng 7 hoạt chất thuốc nhóm pyrethroid (bifenthrin, cyfluthrin, λ-cyhalothrin,

cypermethrin, deltamethrin, fenvalerate và permethrin) trong mẫu thịt động vật.

Phƣơng pháp này dựa trên việc chiết dƣ lƣợng pyrethroid bằng hỗn hợp acetone-

ether dầu hỏa, làm sạch mẫu trên cột florisil sử dụng dung môi rửa giải là hexan-

dietyl ete và cuối cùng xác định bằng hệ thống GC- ECD. Hiệu suất thu hồi của

phƣơng pháp cho tất cả các thuốc nhóm pyrethroid (trừ deltamethrin) đều > 80%,

độ lặp lại < 6%, độ tái lặp < 16%, LOQ là 10µg/kg, độ không đảm bảo đo < 21%

[18].

Tác giả Hans- Peter Their và Jochen Kirchhoff đã xác định dƣ luợng thuốc

bảo vệ thực vật nhóm pyrethroid trong một số mẫu rau quả, đất, nƣớc bằng phƣơng

pháp sắc ký khí. Mẫu thực vật sau khi đƣợc nghiền nhỏ đem đồng nhất với hỗn hợp

hexan và acetone. Dịch chiết thu đƣợc đem cô trên thiết bị cô quay chân không và

làm sạch trên cột Florisil sử dụng dung môi rửa giải hỗn hợp hexan- dietyl ete. Với

mẫu thực vật chứa dầu cần chiết với hỗn hợp acetonitril – hexan. Dƣ lƣợng thuốc

bảo vệ thực vật pyrethroid đƣợc chiết ra khỏi nƣớc dùng hexan và chiết ra khỏi đất

dùng dung dịch NH4Cl và acetone sau đó làm sạch trên cột florisil nhƣ đối với mẫu

thực vật. Hoạt chất pyrethroid đƣợc xác định bằng sắc ký khí kết hợp với detector

bắt điện tử (GC-ECD) [24].

Phƣơng pháp sắc ký khí đã đƣợc ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất

bảo vệ thực vật nhƣ clo hữu cơ, lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat. Phƣơng pháp

có ƣu điểm là có thể phân tích hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác

nhau với độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh. Với

những ƣu điểm trên, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp sắc ký khí kết hợp với

detector bắt điện tử (GC-ECD) để nghiên cứu xác định đồng thời các chất

pyrethroid.


18

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu

Rau là thành phần không thể thiếu trong bữa ăn của ngƣời Việt Nam. Sản

xuất rau ở nƣớc ta trong thời gian qua đã có những bƣớc tiến đáng kể về năng suất

và chất lƣợng. Nhiều vùng sản xuất rau chuyên canh, tập trung đã đƣợc hình thành,

góp phần vào việc giải quyết nhu cầu trong nƣớc cũng nhƣ xuất khẩu. Tuy nhiên,

diện tích sản xuất rau thực hiện theo tiêu chí rau an toàn ở vẫn còn khá khiêm tốn

(chỉ chiếm khoảng 10%). Đa phần các vùng sản xuất rau chuyên canh hiện nay đều

quản lý sản xuất theo kinh nghiệm. Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) là một biện pháp

đƣợc tăng cƣờng cho việc thâm canh rau. Hiện nay, nhiều ngƣời dân đã lạm dụng

thuốc BVTV làm cho dƣ lƣợng thuốc trong nhiều mẫu rau vƣợt giới hạn cho phép

hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá nhƣ cải ngọt, cải bẹ xanh, cải bắp, cải thảo,

mồng tơi, rau muống, dƣa leo…

Ngoài mặt tích cực là tiêu diệt các sinh vật gây hại trên rau, dƣ lƣợng thuốc

BVTV còn gây hậu quả nghiêm trọng: phá vỡ hệ cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm

nguồn nƣớc, ô nhiễm môi trƣờng sống và ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời tiêu

dùng và cả cho ngƣời sản xuất; là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực

phẩm. Do đó, đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi là một số rau đại diện cho các rau

đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam, bao gồm: cải bắp, cải xanh, cải ngọt, rau mồng

tơi, rau muống, đậu đỗ, cà chua.

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời các hoạt

chất pyrethroid trong rau bằng phƣơng pháp sắc ký khí kết hợp với detector bắt điện

tử (GC- ECD).

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách hệ thống các vấn đề

sau:


19

2.1.2.1. Xây dựng phương pháp

Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:

- Điều kiện tách chiết mẫu

- Điều kiện chạy máy

Thẩm định phƣơng pháp:

- Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ

- Khoảng tuyến tính

- Độ chụm (độ lặp lại)

2.1.2.2. Ứng dụng phương pháp

Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định tồn dƣ thuốc bảo vệ thực

vật họ pyrethroid trong một số loại rau trên địa bàn Hà Nội.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết mẫu

Đối tƣợng mẫu phân tích trong luận văn là các loại rau có nền mẫu phức tạp.

Do đó, cần có phƣơng pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hƣởng của nền

mẫu, tránh làm bẩn detector và tăng khả năng phát hiện.

Trong bản luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu lựa chọn dung môi

và điều kiện tách chiết, làm sạch mẫu phân tích.

Tách chiết:

Tách chiết là bƣớc quan trọng trong quá trình phân tích, trong bƣớc này cần

phải lựa chọn dung môi để chuyển chất cần xác định từ mẫu phân tích ra dung môi

chiết. Có nhiều loại dung môi khác nhau đƣợc lựa chọn để chiết mẫu. Dung môi

đƣợc lựa chọn cần phải hòa tan tốt các chất cần chiết nhằm đạt đƣợc hiệu suất thu

hồi cao nhất.

Làm sạch:

Yêu cầu của bƣớc chiết mẫu trong phƣơng pháp phân tích đa dƣ lƣợng các


20

thuốc BVTV phải tách chiết đƣợc nhiều loại thuốc BVTV cùng một lúc. Tuy nhiên,

trong quá trình chiết suất có rất nhiều tạp chất đi kèm theo vào dịch chiết, bƣớc làm

sạch đƣợc thực hiện với mục đích loại bỏ các tạp chất đi kèm mà vẫn giữ

đƣợc chất cần phân tích. Có hai phƣơng pháp làm sạch thƣờng đƣợc sử dụng:

- Chiết lỏng - lỏng: Quá trình chiết lỏng - lỏng cũng đƣợc xem nhƣ một bƣớc

làm sạch để loại bỏ cơ chất thực vật dựa trên khả năng phân bố khác nhau của thuốc

BVTV và các nội chất thực vật trong hai dung môi không hòa tan vào nhau. Trong

luận văn này, chúng tôi đã sử dụng diclomethan để làm sạch dịch chiết.

- Sắc ký cột: cột hấp phụ có thể là cột silicagel, florisil, oxit nhôm trung tính.

Một số phƣơng pháp, ngƣời ta làm sạch mẫu nhờ các chất nhồi cột SPE-C18, SPE-

Florisil. Trong khuôn khổ luận văn và dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến

hành làm sạch mẫu qua cột florisil với các dung môi rửa giải đƣợc khảo sát trong

các thí nghiệm bên dƣới.

2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký khí

2.2.2.1. Khái niệm

Sắc ký khí là một phƣơng pháp tách chất trong đó pha động là chất khí (đƣợc

gọi là khí mang) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên

bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong cột. Tùy thuộc vào

bản chất pha tĩnh, ngƣời ta chia thành 2 loại sắc ký khí:

+ Nếu pha tĩnh là một chất hấp phụ rắn thì kĩ thuật phân tích đƣợc gọi là sắc

ký khí – rắn.

+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng đƣợc gắn lên bề mặt của chất mang trơ hoặc

đƣợc phủ dƣới dạng một lớp phim mỏng lên thành trong của cột mao quản thì kĩ

thuật này gọi là sắc ký khí – lỏng.

Phƣơng pháp có hiệu quả tách rất cao và thời gian phân tích nhanh, với

detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phƣơng pháp có thể đạt 0,1ppb [16].


21

2.2.2.2. Nguyên tắc hoạt động

Nhờ có khí mang từ bom khí (hoặc máy sinh khí), mẫu từ buồng bay hơi

đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây.

Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào

detector, tại đây nồng độ chất đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc

khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hay máy vi tính. Các tín hiệu đƣợc

xử lí tại đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả. Kết quả của quá trình phân

tích sắc ký khí đƣợc biểu diễn bằng sắc đồ. Trên sắc đồ nhận đƣợc, sẽ có các tín

hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là pic. Mỗi pic của sắc đồ ứng với một hay

một nhóm cấu tử của mẫu phân tích [16].

2.2.2.3. Cấu tạo và mô hình sắc ký khí

a) Cấu tạo:

Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và

detector.

* Cột tách: có 2 loại cột tách là cột nhồi và cột mao quản.

Ở cột nhồi, cột đƣợc nhồi đầy pha tĩnh xốp hay bằng các viên chất mang có

phủ trên bề mặt một lớp mỏng pha lỏng tƣơng ứng có khối lƣợng từ 0,1% - 0,25%

khối lƣợng so với chất mang. Khi dòng khí mang len lỏi qua các khe hở trong cột

tách, các cấu tử cần phân tích trong dòng khí mang sẽ đƣợc lƣu giữ ở pha tĩnh với

mức độ khác nhau. Nhƣng với cột nhồi, chiều dài cột không thể kéo dài một cách

tùy ý vì độ chênh lệch áp suất giữa đầu và cuối cột tăng tỉ lệ với chiều dài cột. Do

đó để khắc phục điều này, ngƣời ta đã chế tạo ra cột mao quản.

Cột mao quản là loại cột tách với đƣờng kính nhỏ hơn 1mm, thành trong của

cột đƣợc tẩm pha tĩnh. Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ

đƣa mẫu đi qua cột tách rất dài (làm cho năng suất tách cao) mà không gặp trở

kháng lớn (về độ chênh lệch áp suất). Các cấu tử sẽ tƣơng tác với pha tĩnh bám trên

thành cột và đƣợc lƣu giữ lại mức độ khác nhau. Hiện nay, ngƣời ta hay sử dụng 2

loại cột mao quản là cột mao quản phim mỏng và cột mao quản lớp mỏng [16].


22

* Detector:

Detector là bộ phận có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lƣợng không điện

(nồng độ khối lƣợng các chất đƣợc tách ra khỏi cột sắc ký) thành đại lƣợng điện.

Hiện nay, tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ngƣời ta có nhiều loại detector khác

nhau. Một số detector thông dụng của sắc ký khí đƣợc liệt kê trong bảng 2.1 [16].

Bảng 2.1: Một số detector thông dụng dùng cho sắc ký khí

Detector Giới hạn phát

hiện (g.s-1

) Khả năng áp dụng

Dẫn nhiệt (TCD) 2,5.10

-6 Tất cả các chất không làm hỏng dây

nung

Ion hóa ngọn lửa (FID) 5.10

-12 Detector vạn năng cho hầu nhƣ tất cả

các chất hữu cơ

Bắt điện tử (ECD)

2.10-14

Áp dụng cho các chất có ái lực điện tử

cao nhƣ các thuốc trừ sâu, diệt cỏ (loại

clo hữu cơ), chất dị tố.

Quang hóa ngọn lửa

(FPD)

10-8

đối với

parathion

Phát xạ tối ƣu cho lƣu huỳnh ở 394 nm

và photpho ở 526 nm

b) Sơ đồ thiết bị sắc ký khí:

Hình 2.1: Mô hình thiết bị sắc ký khí thông thƣờng


23

2.2.2.4. Một số đại lượng dùng trong sắc ký khí

Hình 2.2: Sắc ký đồ của 2 cấu tử 1 và 2

Một số thông số được mô tả trên hình 2:

tM (thời gian chết): là thời gian cần thiết để khí mang đi qua cột tách của hệ

sắc ký khí.

tR (thời gian lƣu) = tR’ + tM: là thời gian đƣợc tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu

vào đầu cột đến khi pic đạt giá trị cực đại. Trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn

tR của mỗi chất là không đổi. Đây là thông tin về mặt định tính của một chất.

tR’ (thời gian lƣu hiệu chỉnh): là thời gian lƣu không tính đến thời gian chết

(thời gian lƣu thực của chất).

Wb (độ rộng của đáy pic).

k’ (hệ số dung lƣợng): cho biết khả năng phân bố của cấu tử cần phân tích

trong hai pha với sức chứa của cột. Nó cũng là tỷ số giữa lƣợng chất trong pha tĩnh

và lƣợng chất bị kéo đi bởi khí mang tại thời điểm cân bằng.

(2.1)

α (hệ số tách hay độ chọn lọc): là tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất, cho biết

hiệu quả tách của hệ thống sắc ký khí, hai chất chỉ đƣợc tách ra khi giá trị k’ khác

nhau, hay α >1.


24

(2.2)

Để tách riêng 2 chất, ta thƣờng chọn α trong khoảng từ 1,05 đến 2. α càng lớn thì 2

chất càng tách nhau tốt, nhƣng khi α quá lớn thì thời gian phân tích sẽ kéo dài, gây

doãng píc và tốn kém không cần thiết.

N (số đĩa lý thuyết): là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực của cột tách. Số đĩa

lý thuyết càng cao, khả năng tách càng tốt. N đƣợc tính theo công thức sau:

(2.3)

R (độ phân giải): là đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ tách của 2 chất cạnh

nhau trên cùng một điều kiện sắc ký. R đƣợc tính theo công thức sau:

(2.4)

Khi R = 0,75 thì 2 píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.

Khi R = 1,0 hai pic có độ lớn tƣơng tự nhau đƣợc tách ra khỏi nhau khoảng 95%.

Khi R = 1,5 thì sự phân giải đƣợc coi nhƣ là hoàn toàn, khoảng 99,7%.

Giữa độ phân giải, hệ số dung lƣợng của cấu tử ra sau, độ chọn lọc α và số đĩa lý

thuyết N của cột có mối liên hệ thông qua phƣơng trình:

(2.5)

Nhƣ vậy muốn tăng R ta có thể dùng các biện pháp sau:

+ Tăng số đĩa lý thuyết bằng cách dùng cột dài hơn, hay giảm tốc độ pha động

+ Tăng k’2 bằng cách thay đổi thành phần pha động.

+ Tăng α bằng cách thay đổi thành phần pha động hoặc chọn cột khác phù hợp hơn

với quá trình tách.


25

2.2.3. Định lƣợng các hoạt chất pyrethroid bằng GC- ECD

2.2.3.1. Chương trình GC- ECD

Khí mang Khí N2

Tốc độ khí mang 1,4ml/phút

Chƣơng trình nhiệt độ 80˚C giữ 1 phút, tăng 40˚C/phút lên 180˚C

giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ

2 phút, tăng 3˚C/phút đến 265˚C giữ 2

phút, tăng 4˚C/phút lên 280˚C giữ 15 phút.

Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 250˚C

Nhiệt độ ECD 280˚C

Thể tích bơm mẫu 1µl

Kiểu bơm Không chia dòng

2.2.3.2. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

Theo lý thuyết sắc ký khí, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn thì

thời gian lƣu của chất là đại lƣơng đặc trƣng để định tính (phát hiện) các chất. Còn

chiều cao và diện tích pic sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong

một khoảng nồng độ xác định và không lớn, chúng có mối quan hệ tuyến tính nhƣ

sau:

Hi = k1.Ci = f(C) (2.6)

Si = k2.Ci = f(C) (2.7)

Trong đó:

Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của cấu tử i.

Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lƣu tRi.

k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký. của pha

tĩnh cũng nhƣ khí mang.

Dựa vào công thức (2.6) hoặc (2.7) có thể xác định nồng độ các chất phân

tích theo phƣơng pháp đƣờng chuẩn hay thêm chuẩn.


26

Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp toán thống kê với các

thông số đặc trƣng sau [6]:

+ Giá trị trung bình: 1

1 n

i

i

x xn

(2.8)

+ Độ lệch chuẩn:

2

1

( )

1

n

i

i

x x

sn

(2.9)

+ Độ lệch chuẩn tƣơng đối: (%) .100s

RSDx

(2.10)

2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.3.1. Thiết bị và dụng cụ

- Các thiết bị thông thƣờng của phòng thí nghiệm.

- Máy lắc cơ, chuyển động ngang, tần số 200 vòng/phút.

- Máy đồng nhất mẫu tốc độ cao

- Máy thổi khí nito

- Màng lọc PTFE 0,45 μm.

- Thiết bị cô quay chân không.

- Máy sắc ký khí GC-2010 của hãng Shimadzu.

- Cột: DB-5MS, pha tĩnh metylpolisiloxan với 5% phenyl, bề dầy lớp phim

0,25um, I.D 0,25mm, chiều dài cột 30m, nhiệt độ tối đa 325 0C.

- Cân phân tích.

- Khí mang: nitơ.

- Các dụng cụ khác nhƣ các loại bình định mức, pipet, micropipette…

2.3.2. Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất có độ tinh khiết cấp GC hoặc cao hơn:

- Nƣớc không chứa các chất gây ảnh hƣởng tới phƣơng pháp này và phù hợp

với tiêu chuẩn ISO 3696: 1987, cấp 1.


27

- Natri sunfat, Na2SO4

- Florisil, 100-200 mesh

- Metanol, CH3OH.

- Hexan, C6H14.

- Dung môi hữu cơ: acetone, n-hexan, etylacetate, methanol, diclomethan,

toluene (Fisher, Merk).

- Chất chuẩn nhóm pyrethroid:

+ Lambda cyhalothrin (Sigma Alldrich, Mỹ): độ tinh khiết 99,1%.

+ Cypermethrin (Sigma Alldrich, Mỹ): độ tinh khiết 94,3%.

+ Deltamethrin (Sigma Alldrich, Mỹ): độ tinh khiết 99,7%.

+ Permethrin (Sigma Alldrich, Mỹ): độ tinh khiết 98,3%.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/l: Cân chính xác 0,01g chất chuẩn lần lƣợt của

từng pyrethroid, hòa tan vào từng bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng

n-hexan. Chuẩn gốc đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 0 - 5°C.

Dung dich chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l: lấy chính xác 0,1ml dung dịch

chuẩn gốc của mỗi pyrethroid 1000mg/l cho vào bình định mức 10 và định mức đến

vạch bằng n-hexan.


28

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu đối với việc phân tích các hoạt chất

thuốc BVTV nhóm pyrethroid

3.1.1. Lựa chọn cột tách

Cột tách (pha tĩnh) là yếu tố quan trọng trong phân tích sắc ký. Tùy bản chất của

hỗn hợp chất phân tích mà lựa chọn cột tách với pha tĩnh thích hợp. Theo các tài

liệu tham khảo để phân tích hỗn hợp các hợp chất nhóm pyrethroid ngƣời ta sử

dụng loại cột mao quản trên thiết bị GC/ECD. Trong điều kiện phòng thí nghiệm,

chúng tôi chọn cột tách mao quản DB-5MS với các thông số nhƣ sau:

- Bản chất pha tĩnh: Metylpolisiloxan với 5% phenyl.

- Chiều dài cột: 30m.

- Đƣờng kính trong: 0,25mm.

- Bề dày lớp phim: 0,25µm.

- Nhiệt độ tối đa: 3250C.

3.1.2. Nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm

Các thông số nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm những

thông số cần đƣợc lựa chọn thích hợp để máy vận hành ổn định và thu đƣợc kết quả

tốt.

Nhiệt độ cổng bơm mẫu thông thƣờng có thể chọn từ 230-250˚C. Do hỗn

hợp thuốc trừ sâu phân tích có nhiều chất ở nhiệt độ cao trên 250˚C nên nhiệt độ

cổng bơm mẫu đƣợc đặt ở 250˚C nhằm đảm bảo điều kiện hóa hơi toàn bộ mẫu.

Đầu dò ECD chịu đƣợc nhiệt độ cao từ 250˚C- 400˚C và để cho đầu dò hoạt

động ổn định thì nhiệt độ áp đặt thƣờng cao hơn nhiệt độ cao nhất của chƣơng trình

nhiệt lò cột từ 20˚C-25˚C. Do cột DB-5MS có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ tối đa là

325˚C nên để đảm bảo tuổi thọ cột đồng thời cũng phù hợp với đối tƣợng các thuốc

bảo vệ thực vật chƣơng trình nhiệt lò cột thƣờng ở mức tối đa từ 270˚C-280˚C. Vì


29

vậy, nhiệt độ đầu dò đƣợc chọn là 280˚C. Ở nhiệt độ này các chất phân tích sẽ hóa

hơi hoàn toàn, không đọng lại trên đầu dò làm giảm độ nhạy của đầu dò.

Ngoài ra, đối tƣợng mẫu là hỗn hợp có hàm lƣợng thuốc BVTV thấp nên

kiểu bơm không chia dòng đƣợc lựa chọn.

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình nhiệt độ cột tách

Chuẩn hỗn hợp của: lambda-cyhalothrin 0,5mg/l, cypermethrin1,0mg/l,

permethrin 1,0mg/l, deltamethrin 1,0mg/l đƣợc bơm vào hệ thống GC với các

chƣơng trình nhiệt độ sau:

- Chƣơng trình 1 (CT1): 80˚C giữ 1 phút, tăng 40˚C/phút lên 180˚C giữ 1

phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ 2 phút, tăng 3˚C/phút đến 265˚C giữ 2 phút,

tăng 4˚C/phút lên 280˚C giữ 15 phút.

Tổng thời gian phân tích là 36,52 phút.

- Chƣơng trình 2 (CT2): 80˚C giữ 1 phút, tăng 30˚C/phút lên 180˚C giữ 1

phút, tăng 20˚C/phút đến 245˚C giữ 2 phút, tăng 2˚C/phút đến 265˚C giữ 5 phút,

tăng 5˚C/phút lên 280˚C giữ 10 phút.


- Chƣơng trình 3 (CT3): 80˚C giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ 2

phút, tăng 4˚C/phút đến 265˚C giữ 25 phút.


- Chƣơng trình 4 (CT4): 80˚C giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ 2

phút, tăng 4˚C/phút đến 265˚C giữ 20 phút, tăng 5˚C/phút lên 280˚C giữ 3 phút.


Các thông số còn lại:

- Cột tách: DB-5MS

- Khí mang: N2 với vận tốc 1,4ml/phút

- Nhiệt độ ECD: 280˚C

- Thể tích bơm: 1µl

Kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.1.


30

Bảng 3.1: Thời gian lƣu của các hợp chất theo các chƣơng trình nhiệt độ

Chƣơng

trình

tR λ-cyhalothrin

(phút)

tR permethrin

(phút)

tR cypermethrin

(phút)

tR deltamethrin

(phút)

CT1 15,331 ; 15,693 17,642 ; 17,988 19,982 ; 20,280

20,414 ; 20,546 24,332 ; 25,012

CT2 17,123 ; 17,545 19,726 ; 20,110 22,465 ; 22,887

23,051 ; 23,248 28,410 ; 29,137

CT3 15,538 ; 15,887 17,809 ; 18,151 20,395 ; 20,770

20,942 ; 21,127 26,865 ; 27,971

CT4 15,537 ; 15,886 17,806 ; 18,154 20,388 ; 20,787

20,951 ; 21,135 26,871 ; 27,983

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-c

yh

alo

thri

n

lam

bd

a-c

yh

alo

thri

n

perm

eth

rin

perm

eth

rin

cy

perm

eth

rin c

yp

erm

eth

rin

cy

perm

eth

rin

cy

perm

eth

rin

delt

am

eth

rin

delt

am

eth

rin

Hình 3.1: Sắc đồ các hoạt chất nhóm pyrethroid theo CT 1


31

15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-c

yh

alo

thri

n

lam

bd

a-c

yh

alo

thri

n

perm

eth

rin

perm

eth

rin

cy

perm

eth

rin

cy

perm

eth

rin c

yp

erm

eth

rin

cy

perm

eth

rin

delt

am

eth

rin

delt

am

eth

rin


12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-c

yh

alo

thri

n

lam

bd

a-c

yh

alo

thri

n

perm

eth

rin

perm

eth

rin

cy

perm

eth

rin

cy

perm

eth

rin c

yp

erm

eth

rin

cy

perm

eth

rin

delt

am

eth

rin

delt

am

eth

rin



32

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

del

tam

eth

rin del

tam

eth

rin


Trong 3 chƣơng trình nhiệt độ đã khảo sát, từ sắc đồ và kết quả thu đƣợc

nhận thấy chƣơng trình 2 tách các hoạt chất pyrethroid rõ ràng hơn, các pic đồng

phân của λ-cyhalothrin, permethrin, cypermethrin, deltamethrin đƣợc tách tốt hơn

và rút ngắn đƣợc thời gian phân tích. Do đó, chƣơng trình nhiệt độ 2 đƣợc lựa chọn

cho các nghiên cứu tiếp theo.

Định danh các chất trên sắc ký đồ

Dung dịch chuẩn chứa lần lƣợt các thuốc λ-cyahothrin, cypermethrin,

permethrin, deltamethrin ở nồng độ 1,0mg/l đƣợc tiêm vào máy sắc ký để xác định

vị trí các chất trên sắc ký đồ.

Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2: Vị trí các chất trên sắc ký đồ

Thứ tự

peak Thời gian lƣu (phút) Đặc điểm peak Tên hoạt chất

1 15,348 ; 15,711 Mũi đôi λ-cyahothrin

2 17,657 ; 18,008 Mũi đôi Permethrin

3 19,997 ; 20,292 ; 20,410 ; 20,559 Mũi đa Cypermethrin

4 24,343 ; 25,040 Mũi đôi Deltamethrin


33

Lambda- cyhalothrin Permethrin

14.75 15.00 15.25 15.50 15.75 16.00 16.25 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0uV(x10,000) Chromatogram

17.00 17.25 17.50 17.75 18.00 18.25 18.50 18.75 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0uV(x10,000) Chromatogram

Cypermethrin Deltamethrin

19.50 19.75 20.00 20.25 20.50 20.75 21.00 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

uV(x10,000) Chromatogram

23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

uV(x10,000) Chromatogram


34

3.1.4. Khảo sát tốc độ khí mang

Tốc độ khí mang có ảnh hƣởng lớn đến hiệu quả tách và số đĩa lý thuyết của

quá trình tách. Việc khảo sát tốc độ khí mang đƣợc thực hiện: hỗn hợp nghiên cứu

gồm 4 hợp chất thuốc: lambda cyhalothrin 0,5mg/l, cypermethrin 1,0mg/l,

permethrin 1,0mg/l và deltamethrin 1,0mg/l đƣợc bơm vào hệ thống GC với các

điều kiện sắc ký nhƣ sau:

- Cột tách: DB-5MS

- Chƣơng trình nhiệt độ 2 (tối ƣu ở trên)

- Nhiệt độ ECD: 280˚C

- Thể tích bơm: 1 µl

- Khí mang: N2 với vận tốc 1,0ml/phút; 1,2ml/phút; 1,4ml/phút; 1,6ml/phút.

Kết quả thu đƣợc chỉ ra ở bảng 3.3 và hình 3.5.

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của tốc độ khí mang đến quá trình tách chất

Vkhí mang

(ml/phút)

λ – cyhalothrin

tR (phút)

Permethrin

tR (phút)

Cypermethrin

tR (phút)

Deltamethrin

tR (phút)

1,6 14,721 ; 15,068 16,878 ;

17,199

19,184 ; 19,486 ;

19,612 ; 19,750

23,355 ;

23,998

1,4 15,348 ; 15,711 17,657 ;

18,008

19,997 ; 20,292

20,410 ; 20,559

24,343 ;

25,040

1,2 16,123 ; 16,521 18,627 ;

18,965

20,970 ; 21,258 ;

21,387 ; 21,533

25,653 ;

26,409

1,0 17,194 ; 17,634 19,839 ;

20,179

22,214 ; 22,521 ;

22,667 ; 22,826

27,450 ;

28,300


35

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

del

tam

eth

rin

del

tam

eth

rin

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

del

tam

eth

rin d

elta

met

hri

n

15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

del

tam

eth

rin del

tam

eth

rin

VF = 1,2 ml/phút

VF = 1,6 ml/phút

VF = 1,4 ml/phút


36

15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

del

tam

eth

rin

del

tam

eth

rin

Hình 3.5. Sắc đồ của các hoạt chất nhóm pyrethroid khi tốc độ khí mang giảm

dần

Nhận xét: Khi giảm vận tốc khí mang, sự chênh lệch về thời gian lƣu tăng

lên không nhiều. Điều này có thể đƣợc giải thích là do trong sắc ký khí, pha động

(khí mang) chỉ đóng vai trò cơ học nên không làm thay đổi đáng kể khả năng tách

chất, sự tách chất đƣợc quyết định chủ yếu do pha tĩnh. Do yêu cầu phân tích và vận

hành máy, chúng tôi chọn tốc độ khí mang 1,4ml/phút để đảm bảo sự tách chất tốt

mà không làm doãng pic sắc ký cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.5. Khảo sát thể tích bơm mẫu

Trong sắc ký khí, thể tích bơm mẫu ảnh hƣởng đến nhiều yếu tố nhƣ sự cân

đối của pic sắc ký, sai số, độ nhạy của phép phân tích, tuổi thọ cột…Nếu thể tích

bơm mẫu quá nhỏ, có thể gây sai số lớn khi bơm bằng tay và giảm độ nhạy, nếu thể

tích bơm mẫu quá lớn sẽ gây doãng pic, giảm tuổi thọ của cột.

Để khảo sát thể tích bơm mẫu, chúng tôi sử dụng hỗn hợp chuẩn gồm: λ-

cyhalothrin 0,5mg/l, cypermethrin 1,0mg/l, permethrin 1,0mg/l và deltamethrin

1,0mg/l đƣợc bơm vào máy GC với các điều kiện tối ƣu nhƣ trên và chỉ thay đổi thể

tích bơm lần lƣợt là 0,6µl; 0,8µl; 1,0µl; 1,2µl.

Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.4 và hình 3.6.

VF = 1,0 ml/phút


37

Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình phân tích

V

(µl)

λ–cyhalothrin Permethrin Cypermethrin Deltamethrin

tR

(phút)

Spic

(mAu)

tR

(phút)

Spic

(mAu)

tR

(phút) Spic (mAu)

tR

(phút)

Spic

(mAu)

0,6 15,370

15,732

61369

302938

17,689

18,039

38326

117836

20,033

20,329

20,418

20,600

64126

41088

53569

55796

24,410

25,100

61368

139653

0,8 15,367

15,730

86650

412826

17,681

18,031

54843

167653

20,029

20,321

20,421

20,588

93339

56834

79769

82557

24,386

25,088

93221

217968

1,0 15,348

15,711

111225

552078

17,657

18,008

64506

193440

19,997

20,292

20,410

20,559

129264

79935

85879

95017

24,343

25,040

137767

383370

1,2 15,362

15,724

137596

659104

17,678

18,022

82986

235422

20,015

20,306

20,429

20,575

145906

92941

121371

124799

24,373

25,053

145283

436896

1,4 15,354

15,713

147929

713986

17,665

18,019

91235

262487

20,006

20,311

20,431

20,578

182950

122453

154509

175468

24,371

24,050

158733

455395


38

15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

del

tam

eth

rin

del

tam

eth

rin

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

del

tam

eth

rin

del

tam

eth

rin

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

del

tam

eth

rin d

elta

met

hri

n

Vs= 0,6 µl

Vs= 0,8 µl

Vs= 1,0 µl


39

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

uV(x10,000)

lam

bda-

cyha

loth

rin

lam

bda-

cyha

loth

rin

perm

ethr

in

perm

ethr

in

cype

rmet

hrin

cype

rmet

hrin

cype

rmet

hrin

cype

rmet

hrin

delta

met

hrin

delta

met

hrin

13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

uV(x10,000)

lam

bda

-cyh

alot

hrin

lam

bda

-cyh

alot

hrin

perm

ethr

in

perm

ethr

in

cype

rmet

hrin

cype

rmet

hrin

cype

rmet

hrin

cype

rmet

hrin

delta

met

hri

n

delta

met

hri

n

Hình 3.6: Sắc đồ của các hoạt chất nhóm pyrethroid theo thể tích bơm mẫu

tăng dần

Nhận xét: Qua quan sát sắc đồ thu đƣợc và diện tích píc của các hoạt chất

nhóm pyrethroid, có thể thấy rằng trong phạm vi khảo sát, thể tích bơm mẫu không

ảnh hƣởng nhiều đến hiệu quả tách các hoạt chất nhóm pyrethroid mà chỉ ảnh

hƣởng đến độ nhạy của các chất. Vì vậy, để đảm bảo độ nhạy cho quá trình phân

tích cũng nhƣ đảm bảo an toàn cho cột tách, đề tài lựa chọn thể tích bơm mẫu là

1,0µl cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.6. Tổng kết các điều kiện chạy sắc ký

Sau khi khảo sát các điều kiện có thể ảnh hƣởng đến quá trình phân tích,

chúng tôi lựa chọn các điều kiện tối ƣu:

Vs= 1,2 µl

Vs= 1,4 µl


40

Bảng 3.5: Điều kiện chạy tối ƣu cho phân tích đồng thời 4 hợp chất nhóm

pyrethroid

Cột tách DB-5MS (Metylpolisiloxan với 5% phenyl)

30m x 0,25 mm x 0,25 µm

Khí mang Khí N2

Tốc độ khí mang 1,4 ml/phút

Chƣơng trình nhiệt độ 80˚C giữ 1 phút, tăng 40˚C/phút lên

180˚C giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C

giữ 2 phút, tăng 3˚C/phút đến 265˚C giữ 2

phút, tăng 4˚C/phút lên 280˚C giữ 15 phút.

Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 250˚C

Nhiệt độ ECD 280˚C

Thể tích bơm mẫu 1µl

Kiểu bơm Không chia dòng

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0uV(x10,000)

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

lam

bd

a-cy

hal

oth

rin

per

met

hri

n

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin cy

per

met

hri

ncy

per

met

hri

n

cyp

erm

eth

rin

del

tam

eth

rin

del

tam

eth

rin

Hình 3.7: Sắc đồ các hoạt chất pyrethroid chuẩn nồng độ λ-cyhalothrin

0,5mg/l, cypermethrin 1,0mg/l, deltamethrin 1,0mg/l và permethrin 1,0mg/l

theo điều kiện sắc ký tối ƣu.


41

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích

3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn

Lập đƣờng chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phƣơng pháp

phân tích. Từ đƣờng chuẩn ta có thể biết đƣợc khoảng tuyến tính của chất phân tích,

từ đó đƣa ra nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Các dung dịch dùng

để dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng bằng n-hexan từ các dung dịch chuẩn gốc.

Nồng độ các dung dịch này đƣợc biểu diễn trong bảng 8. Mỗi dung dịch đƣợc bơm

trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc sẽ là số liệu để dựng đƣờng

chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.

Bảng 3.6: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất

Nồng độ

C(µg/l)

Diện tích píc

λ-cyhalothrin Permethrin Cypermethrin Deltamethrin

10 8015

20 16876 3264 7858 5072

50 45579 16297 47868 16342

100 97636 28409 55242 39633

500 430926 140990 238933 194172

1000 818713 247564 467070 409190

1500 1235225 362668 690062 631490

2000 1616145 477305 937156 837320

2500 2047550 602356 1167456 1022873

3000 2392762 718664 1336550 1165755

4000 2950711 908764 1687451 1424067

5000 3388756 1016422 1897575 1654565


42

Kết quả trên cho thấy khoảng tuyến tính xác định nồng độ của cypermethrin,

permethrin, deltamethrin là 100 – 2500µg/l và của λ-cyhalothrin là 50 – 2500µg/l,

Từ đó xây dựng đƣợc các phƣơng trình đƣờng chuẩn:

0 1000 2000 3000 4000 5000-500000

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

S pic

C(µg/l)

0 500 1000 1500 2000 2500

0

500000

1000000

1500000

2000000

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 18680.77581 8869.17029

B 807.11978 5.85665

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99989 4006.9249 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

S pic

C(µg/l)

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của λ-cyhalothrin và

đƣờng chuẩn của λ -cyhalothrin


43

0 1000 2000 3000 4000 5000

0

200000

400000

600000

800000

1000000S pi

c

C(µg/l)

0 500 1000 1500 2000 2500

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 12532.39839 5469.11814

B 234.74969 3.61147

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99953 2112.33048 6 <0.0001

------------------------------------------------------

Spi

c

C (µg/l)

Hình 3.9: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của permethrin

và đƣờng chuẩn của permethrin


44

0 1000 2000 3000 4000 5000

0

500000

1000000

1500000

2000000

S pic

C(µg/l)

0 500 1000 1500 2000 2500

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 5509.7629 4772.88994

B 463.53427 3.15172

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99991 4107.63911 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Sp

ic

C(µg/l)

Hình 3.10: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ cypermethrin

và đƣờng chuẩn của cypermethrin


45

0 1000 2000 3000 4000 5000

0

400000

800000

1200000

1600000

C(µg/l)

Spi

c

0 500 1000 1500 2000 2500

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A -4253.48387 8313.41786

B 415.81565 5.48967

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99965 3160.82333 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

C(µg/l)

Spi

c

Hình 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ deltamethrin

và đƣờng chuẩn của deltamethrin


46

Từ kết quả thu đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn của các hoạt chất pyrethroid.

Bảng 3.7: Phƣơng trình đƣờng chuẩn của các hoạt chất

Hoạt chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y = a + bx) Hệ số tƣơng quan R

λ-cyhalothrin y = (18680 ± 8869) + (807 ± 5,85)x R = 0,99989

Permethrin y = (12532 ± 5469) + (234 ± 3,61)x R = 0,99953

Cypermethrin y = (5509 ± 4772) + (463 ± 3,15)x R = 0,99991

Deltamethrin y = (- 4253 ± 8313) + (415 ± 5,48)x R = 0,99965

3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) [11]

Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống

phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay

tín hiệu nền.

Tức là: yL = by + k.Sb

Với by là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm (lớn hơn 20 thí

nghiệm), Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lƣợng số học đƣợc

chọn theo độ tin cậy mong muốn.

1

1 bn

bjb

jb

y yn

bn

i

bbi

b

b xxn

S1

22 )(1

1

Nhƣ vậy : . bL b

k Sy y

b

Mẫu trắng đƣợc pha với nồng độ chất phân tích xb = 0.

Do đó giới hạn phát hiện: . bk S

LODb

Trong trƣờng hợp không phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn

của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín

hiệu khi phân tích mẫu nền yb = a. Khi đó tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát

hiện YLOD = a + k.Sy, độ tin cậy 95%, k = 3. Sau đó dùng phƣơng trình hồi quy có

thể tìm đƣợc LOD.


47

xLOD=b

S y.3

Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống

phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng

với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền,

YQ = by + K.Sb

Thông thƣờng LOQ đƣợc tính với K = 10 tức là CQ = 10.SB/b

Hay S/N = 10 nên suy ra LOQ = 3,33 LOD.

Từ sự phụ thuộc của diện tích pic các chất THSG và EM vào nồng độ ta tính đƣợc

LOD, LOQ của các chất nhƣ trong bảng 3.8.

Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các chất

Hoạt chất

Sy (độ lệch chuẩn của

phƣơng trình hồi quy)

(µg/l)

b (độ dốc của

phƣơng trình hồi

quy)

LOD

(µg/l)

LOQ

(µg/l)

λ-cyhalothrin 4006 807 14,9 49,6

Permethrin 2112 234 30,1 100,2

Cypermethrin 4107 463 29,6 98,5

Deltamethrin 3160 415 25,4 84,5

Với các giới hạn phát hiện và định lƣợng tính đƣợc ở trên, khi xử lý mẫu

thực cần pha loãng cho phù hợp để quá trình tính toán kết quả là hợp lý nhất.

3.2.3. Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn

3.2.3.1. Kiểm tra sự khác nhau có ý nghĩa giữa hệ số a trong phương trình đường

chuẩn và giá trị 0

Trong phƣơng trình hồi qui y = a + bx, trƣờng hợp lý tƣởng xảy ra khi a=0.

Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thƣờng mắc sai số ngẫu nhiên luôn


48

làm cho a0. Nếu giá trị a khác không có nghĩa thống kê thì phƣơng pháp phân tích

sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trƣớc khi sử dụng đƣờng chuẩn cho phân tích công

cụ cần kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 không có ý nghĩa thống

kê không.

Nếu xem a0 thì phƣơng trình y=a+bx đƣợc viết thành phƣơng trình y=b'x.

Bảng 3.9: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phƣơng trình đƣờng chuẩn λ-

cyhalothrin với giá trị 0

100 500 1000 1500 2000 2500 S2

Y 97636 430926 818713 1235225 1616145 2047550

B’ 789,6 824,5 800 811 798,7 811,5 7,6.108

B 976,4 861,9 818,7 823,5 808,1 819 6,8.109

Phƣơng sai của 2 phƣơng trình đƣợc tính nhƣ sau:

2

)(

2

)ˆ( 22

2

n

bxay

n

yyS

iiii

y =7,6.108

3

)(

3

)ˆ( 2'2'

2'

n

xby

n

yyS

iiiiy = 6,8.10

9

Tính đƣợc chuẩn F:

2

2'

y

y

tinhS

SF =0,11

So sánh F-tính với giá trị F tra bảng F(P,f1, f2) với

P=0,95 và f1 = n-3 = 3, f2 = n-2 = 2.

Có F(P,f1, f2)= 6,59

Ta thấy F-tính<F-tra bảng. Vì vậy có thể kết luận đƣợc giá trị a và 0 khác

nhau không có ý nghĩa thống kê, hay phƣơng pháp xác định λ-cyhalothrin không

mắc sai số hệ thống.

Tƣơng tự với các hợp chất khác ta có:


49

Bảng 3.10: Chuẩn F-tính của các chất BVTV

Hoạt chất S2. E+10 S’

2. E+10 Ftính Ftra bảng

λ-cyhalothrin 6,8E+09 7,6E+08 0,11 6,59

Permethrin 3,6E+08 8,1E+08 2,28 6,59

Cypermethrin 1,4E+08 8,9E+08 6,54 6,59

Deltamethrin 1,3E+08 2,7E+08 2,03 6,59

Nhận thấy tất cả các giá trị F-tính đều nhỏ hơn F-tra bảng (Ftính < Fbảng), vì vậy có

thể kết luận phƣơng pháp này không mắc sai số hệ thống.

3.2.3.2. Kiểm tra sự sai khác giữa b và b’.

Khi không có sai số hệ thống thì phƣơng trình y = a + bx trở thành phƣơng

trình y = b’x, tức là sự khác nhau giữa b và b’ không có ý nghĩa thống kê. Do đó có

thể dùng chuẩn t để kiểm tra sự khác nhau của 2 giá trị trung bình.

Trƣớc tiên kiểm tra xem 2 phƣơng sai của chúng có đồng nhất không, nếu

chúng đồng nhất thì ta kết luận luôn 2 giá trị b và b’ là khác nhau không có nghĩa

thống kê, hay chúng giống nhau.

Dựa vào phần mềm Minitab 16, so sánh 2 giá trị trung bình b và b’. Kiểm tra

xem chúng có phƣơng sai tƣơng đồng nhau không. Kết quả so sánh giữa b và b’

trong phƣơng trình hồi quy của các hoạt chất nhóm pyrethroid đƣợc chỉ ra ở bảng

3.10.


50

Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa b và b’ trong phƣơng trình hồi quy

Hoạt chất Giá trị b Trung bình Độ lệch chuẩn

λ-cyhalothrin b 805,9 12,3

b’ 851,2 64,0

Permethrin b 225,4 33,9

b’ 255,8 21,3

Cypermethrin b 468,8 14,5

b’ 482,2 34,9

Deltamethrin b 417,4 14,1

b’ 407,1 12,7

Nhận thấy P – value = 0,093 > 0,05 nên kết luận đƣợc rằng 2 phƣơng sai của

b và b’ là khác nhau không có nghĩa hay chúng giống nhau. Sử dụng chuẩn t để xem

xét tiếp. Tính độ lệch hợp nhất của 2 phƣơng sai trên Spooled của 2 giá trị trên.

1

2 2

2 2

1 ¹ 1

( ) ( )( 1) ( 1)

2 2

A B

A B

n n

Ai A Bi B

i A A B Bpooledx x

A B A B

x x x xn S n S

S Sn n n n

Với số thí nghiệm nhỏ hơn 30 dùng chuẩn t 2 phía để so sánh.

.A BA B

thucnghiem

pooled A B

x x n nt

S n n

=

Bảng 3.12: Các giá trị để so sánh chuẩn t 2 phía

Hoạt chất Spooled tthực nghiệm

λ-cyhalothrin 49,9 -1,7

Permethrin 62,1 -1,8

Cypermethrin 25,3 -0,8

Deltamethrin 13,8 1,3


51

So sánh giá trị t tính đƣợc từ thực nghiệm và t tra bảng

t(P,f = n1+n2-2) = t (0,95;10) = 2,228

Suy ra tthực nghiệm < tbảng => kết luận đƣợc rằng 2 giá trị trung bình của hệ số

b, b’ của đƣờng chuẩn của của các hoạt chất BVTV khác nhau không có nghĩa. Hay

phƣơng pháp xác định các TBVTV không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống

biến đổi và không đổi).

Nhƣ vậy, khi so sánh giá trị a trong phƣơng trình đƣờng chuẩn với giá trị 0

và so sánh giá trị b trong phƣơng trình đƣờng chuẩn với các giá trị b’ của phƣơng

trình đƣờng chuẩn với a = 0 đề cho kết quả sự khác nhau giữa a và 0; b và b’ là khác

nhau không có nghĩa (hay nói cách khác là chúng giống nhau). Điều đó có thể kết

luận phƣơng pháp GC-ECD xác định các hoạt chất BVTV mục tiêu không mắc sai

số hệ thống.

3.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phép đo

Một phƣơng pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phƣơng pháp

ngƣời ta còn chú ý độ lặp lại của phƣơng pháp. Độ lặp lại của hệ thống sắc ký đƣợc

khảo sát bằng cách bơm 4 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp pyrethroid 1,0mg/l vào

máy sắc ký khí. Các mẫu đƣợc phân tích theo đúng điều kiện chạy máy đã nêu ở

mục 3.1.6. Kết quả đƣợc đáng giá thông qua độ lệch chuẩn (S) và độ lệch chuẩn

tƣơng đối (RSD) của diện tích pic sắc ký Spic theo công thức (2.9) và (2.10). Các số

liệu đƣợc ghi chi tiết ở bảng 3.13.


52

Bảng 3.13: Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau

Nồng

độ

(µg/l)

Diện tích pic Si xTB S

RSD

(%) Lần đo 1 2 3 4

100

λ-cyhalothrin 97636 93011 93985 96159 95198 2091 2,2

Permethrin 28409 27962 28998 29595 28741 710 2,5

Cypermethrin 55242 56521 52787 53736 54572 1647 3,0

Deltamethrin 39633 38141 38835 40684 39323 1093 2,8

500

λ-cyhalothrin 430926 469927 455795 440555 449301 17144 3,8

Permethrin 140990 135991 142977 147770 141932 4877 3,4

Cypermethrin 238933 248934 240680 229863 239602 7822 3,3

Deltamethrin 194172 204173 193420 186840 194651 7151 3,7

1000

λ-cyhalothrin 818713 793591 828713 846200 821804 21973 2,7

Permethrin 249564 254685 270059 257221 257882 8720 3,4

Cypermethrin 467070 435505 467071 455718 456341 14886 3,3

Deltamethrin 409190 438997 429190 430742 427030 12648 3,0

Nhận xét: Theo kết quả khảo sát ta thấy hệ thống sắc ký khí có độ lặp lại tốt.

Độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của phép đo tại 3 mức nồng độ 100µg/l, 500µg/l,

1000µg/l đều có giá trị từ 2,2 – 3,8 đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC.

Qui trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thật.

3.3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Quy trình dự kiến sử dụng để phân tích dƣ lƣợng thuốc BVTV nhóm

pyrethroid:

Đồng nhất mẫu: Mẫu phân tích đƣợc chuẩn bị, đƣa về nhiệt độ phòng, xay

mẫu, cân khoảng 20g mẫu cho vào cốc 250ml, thêm 100ml dung môi acetone, đồng


53

hóa trong 5 phút. Dịch đồng hóa đƣợc lọc qua lớp trợ lọc CeliteTM

và giấy lọc. Rửa

lại lớp CeliteTM

bằng 50ml acetone. Dịch lọc đƣợc chuyển vào cầu 250ml (A).

Chiết lỏng-lỏng: Dung dịch A đƣợc cô bớt dung môi bằng thiết bị cô quay

ở nhiệt độ 40°C đến khi thể tích của dung dịch A còn khoảng V<100ml. Chuyển

toàn bộ dịch còn lại vào phễu chiết 500ml, thêm vào 300ml nƣớc, 50ml dung dịch

NaCl 10%, 50ml dung môi diclomethan. Tiến hành lắc 15 phút, để yên cho đến

khi các lớp dung môi đƣợc phân tách hoàn toàn. Loại lớp nƣớc, lớp dung môi

diclomethan phía dƣới đƣợc lọc qua muối natri sunphat khan để loại nƣớc vào

bình cầu 250ml (B).

Làm sạch và làm giàu mẫu:

Cô quay chân không dung dịch B ở nhiệt độ 40°C đến khi còn khoảng 2ml-

3ml, thổi khô bằng khí nitơ sạch, cho thêm 5ml dung môi n-hexan vào để hòa tan

cặn (C).

Cột Florisil đƣợc hoạt hóa bằng 50ml dung môi thích hợp. Cho toàn bộ 5ml

dung dịch C vào cột, rửa giải bằng 50ml dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải khoảng

2 giọt/giây.

Dung dịch rửa giải đƣợc cô quay chân không ở nhiệt độ 40°C, thổi khô bằng

khí nitơ sạch, cho chính xác 1ml n-hexan vào, chuyển vào lọ đựng mẫu và bơm vào

máy GC-ECD.

3.3.1. Khảo sát dung môi chiết và thể tích dung môi chiết

Từ các tài liệu tham khảo [16], [22], [23], [26] chúng tôi chọn dung môi để

đồng nhất mẫu là aceton. Đây là dung môi đƣợc dùng khá rộng rãi trong các phòng

thí nghiệm với hiệu suất thu hồi cho phân tích thuốc bảo vệ thực vật cao.

Chiết tách là bƣớc cơ bản trong quá trình phân tích, mục đích của bƣớc này

là sử dụng dung môi thích hợp cho việc chuyển toàn bộ chất cần phân tích vào dung

môi chiết. Có nhiều loại dung môi có thể sử dụng, tuy nhiên dung môi lựa chọn cần

hòa tan tốt nhất các chất cần thiết và không tạo phản ứng hóa học với chất chiết.

Trên cơ sở tài liệu tham khảo và thực tiễn nghiên cứu, chúng tôi chọn dung môi

diclomethan để tiến hành tách chiết các hoạt chất nhóm pyrethroid khỏi nền mẫu

với các thể tích khác nhau.


54

Quá trình tiến hành khảo sát thể tích dung môi chiết đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Cân 20g mẫu trắng (mẫu không chứa các loại thuốc BVTV) vào cốc 250ml, bổ sung

0,5ml hỗn hợp pyrethroid 1mg/l đã chuẩn bị sẵn, thêm 100ml acetone vào, đồng hóa

mẫu bằng máy đồng hóa tốc độ cao (6000-8000v/ph); lọc hỗn hợp qua phễu lọc, sử

dụng trợ lọc celite; tráng rửa cốc nghiền mẫu và lớp celite bằng 50ml acetone. Lấy

toàn bộ dịch lọc cho vào bình cầu 250ml, cô bớt dung môi acetone đến khi thể tích

còn dƣới 100ml. Lấy toàn bộ dịch chiết còn lại chuyển vào phễu chiết 500ml, thêm

300ml nƣớc, 50ml dung dịch NaCl 10%, và tiến hành chiết 2 lần với dung môi chiết

diclomethan ở các thể tích khác nhau. Hỗn hợp thu đƣợc ở cả 2 lần chiết tách đƣợc

loại nƣớc bằng natri sulfate khan. Sau khi loại nƣớc đem dịch thu đƣợc cô quay

chân không ở 40oC, hòa tan cặn thu đƣợc bằng 1ml hexan rồi đem đo GC-ECD. Kết

quả thu đƣợc nhƣ sau:

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát thể tích dung môi diclomethane (DCM) đối với

các hoạt chất pyrethroid

DCM

(ml) mlt(µg/kg)

λ-

cyhalothrin Permethrin Cypermethrin Deltamethrin

25 500

112833 46671 93431 51894 Spic

128,0 154,6 195,6 121,2 m (µg/kg)

25,6 30,9 39,1 24,2 R(%)

30 500

249564 75344 143539 118223 Spic

283,0 249,5 300,5 276,0 m (µg/kg)

56,6 49,9 60,1 55,2 R(%)

40 500

358032 115054 169595 172623 Spic

406,0 381,0 355,1 403,0 m (µg/kg)

81,2 76,2 71,0 80,6 R(%)

50 500

419321 133052 220085 200037 Spic

475,5 440,6 460,8 467,0 m (µg/kg)

95,1 88,1 92,2 93,4 R(%)

60 500

424612 129247 222831 195196 Spic

481,5 428,0 466,5 455,7 m (µg/kg)

96,3 85,6 93,3 91,1 R(%)


55

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết pyrethroid vào thể

tích dung môi chiết DCM

Nhận xét: Thể tích dung môi DCM dùng để chiết pyrethroid là 50 ml và 60

ml thì hiệu suất chiết là tốt nhất (>85%), chúng tôi chọn thể tích DCM là 50 ml để

tiết kiệm dung môi cho các lần khảo sát sau.

3.3.2. Lựa chọn điều kiện làm sạch

Chuẩn bị cột Florisil:

- Phần dƣới của ống thủy tinh đƣợc đặt bông thủy tinh, thêm 1g Na2SO4

khan và đổ hexan ngập bề mặt lớp Na2SO4.

- Hoạt hóa 5g Florisil trong lò 8h ở 130ºC và làm nguội trong bình hút ẩm.

Thêm 20ml hexan vào và đổ vào cột thủy tinh một cách cẩn thận để không tạo ra

bọt khí.

- Mở khóa để cho hexan chảy ra (khoảng 10ml) để ổn định lớp florisil, và

phủ lên trên của lớp florisil 2g Na2SO4 khan.

- Dùng pipet rửa sạch thành bên trong cột bằng một ít hexan. Mở khóa vòi

cho hexan chảy ra đến khi lớp hexan xuống đến bằng phần trên của lớp Na2SO4.

Hoạt hóa cột bằng 50ml n-hexan.


56

Hỗn hợp dung dịch chuẩn để khảo sát lựa chọn điều kiện làm sạch gồm: hỗn

hợp 4 chuẩn có nồng độ cypermethrin, permethrin, deltamethrin 1,0mg/l và λ-

cyhalothrin 0,5mg/l.

3.3.2.1. Khảo sát dung môi rửa giải

Dựa trên độ phân cực và khả năng hòa tan của hỗn hợp các thuốc trừ sâu, các

dung môi rửa giải đƣợc chọn để khảo sát gồm: acetone, hexan và diclomethan

(DCM), toluene.

Quá trình làm sạch các chất phân tích đƣợc tiến hành trên cột florisil theo

nhƣ quy trình của kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), kết quả đƣợc nêu trong bảng 3.15.

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát dung môi rửa giải đối với các hoạt chất

pyrethroid

Tên chất Hiệu suất thu hồi (%)

Toluen Hexan Aceton DCM

λ-cyhalothrin 35,56 76,24 49,2 53,96

Permethrin 29,91 69,99 50,64 64,41

Cypermethrin 28,12 75,29 44,04 70,17

Deltamethrin 40,23 80,44 58,94 68,39

Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các pyrethroid khi rửa giải bằng

toluen, hexan, aceton, DCM


57

Nhận xét: Từ kết quả trên ta thấy, khi rửa giải pyrethroid bằng 4 loại dung môi

khác nhau, hiệu suất thu hồi đối với hexan và DCM cao, ngƣợc lại hiệu suất thu hồi

thấp hơn khi sử dụng dung môi rửa giải là aceton và toluene. Từ đó chúng tôi tiến

hành khảo sát kết hợp hai loại dung môi thuộc các nhóm dung môi có độ phân cực

khác nhau (tỉ lệ 1:1, v/v) trong cùng một dung môi rửa giải và tiến hành khảo sát thu

đƣợc kết quả ở bảng 3.16.

Bảng 3.16: Khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với các hoạt chất pyrethroid

Tên chất

Hiệu suất thu hồi (%)

Hexan:

aceton

Hexan: toluen DCM: acetone DCM: toluen

λ-cyhalothrin 61,28 77,24 49,20 53,96

Permethrin 76,91 80,99 50,64 64,41

Cypermethrin 71,15 75,29 44,04 50,17

Deltamethrin 59,46 81,44 58,94 68,39

Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi khi kết hợp hai loại dung

môi khác nhau

Nhận xét: Khi dùng hỗn hợp dung môi hexan : toluene để rửa giải, hiệu suất

thu hồi của các chất cao và đồng đều nên chọn hỗn hợp dung môi hexan : toluene

làm dung môi rửa giải.


58

3.3.2.2. Khảo sát tỉ lệ hexan: toluen trong hỗn hợp dung môi rửa giải

Hỗn hợp dung môi hexan: toluene (1:1, v/v) dùng làm dung môi rửa giải cho

hiệu suất thu hồi các hoạt chất pyrethroid ra khỏi cột cao và đồng đều. Tuy nhiên

hiệu suất thu hồi này vẫn chƣa đƣợc cao nhƣ mong đợi ở một quy trình phân tích dƣ

lƣợng thuốc bảo vệ thực vật. Để có đƣợc độ thu hồi tốt nhất, chúng tôi tiến hành

khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải hexan: toluene nhƣ sau: các hoạt chất pyrethroid

đƣợc chiết theo quy trình trên và rửa giải bằng dung môi hexan: toluene ở các tỉ lệ

khác nhau. Kết quả đƣợc nêu ở bảng 3.17.

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với các hoạt chất

pyrethroid

Hexan : toluene

(v/v)

Hiệu suất thu hồi (%)


8:2 72,15 61,29 54,12 68,92

6:4 54,43 60,13 71,21 57,61

1:1 76,21 80,12 75,34 81,06

4:6 88,53 92,02 96,51 89,12

2:8 65,12 63,90 70,21 75,61

Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết pyrethroid vào

tỉ lệ dung môi rửa giải

Nhận xét: Từ đồ thị trên ta thấy, độ thu hồi các hoạt chất pyrethroid là tốt nhất tại tỉ lệ

dung môi hexan: toluene = 4 : 6. Do đó, chúng tôi chọn tỉ lệ này cho các lần khảo sát sau.


59

3.3.2.3. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải

Các hoạt chất pyrethroid đƣợc chiết theo quy trình ở trên và đƣợc rửa giải

bằng hỗn hợp dung môi hexan: toluene = 4: 6 tại các thể tích khác nhau. Kết quả thu

đƣợc ở bảng 3.18.

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát thể tích dung môi rửa giải đối với các hoạt

chất pyrethroid

V (ml) Hiệu suất thu hồi (%)


30 58,7 51,6 34,9 40,1

40 78,5 80,1 70,5 87,3

50 93,2 88,4 90,1 95,2

60 92,5 90,7 88,9 94,4

Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi pyrethroid vào thể

tích dung môi rửa giải

Nhận xét: Từ đồ thị trên ta thấy, độ thu hồi pyrethroid tƣơng đối cao bắt đầu

từ thể tích rửa giải bằng 50ml. Do đó, để vừa thu đƣợc hiệu suất thu hồi cao vừa đỡ

tốn dung môi, chúng tôi chọn thể tích rửa giải là 50ml cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.3. Quy trình phân tích dƣ lƣợng pyrethroid trong rau

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đƣa ra quy trình phân tích dƣ

lƣợng pyrethroid trong rau theo sơ đồ sau:


60

Rửa lớp celite với 50ml acetone

Lắc kỹ 15 phút

Lớp trên Loại bỏ

Lớp dƣới

50ml Hexan (hoạt hóa cột) Loại bỏ

5ml hexan chứa chất phân tích

50ml Hexan:Toluen (4:6) Thu lại

1ml hexan hòa cặn Vial 2ml

20g mẫu + 100ml acetone, đồng hóa

5phut, lọc với lớp Celite

Chiết lỏng- lỏng

(dung dịch A + 300ml nƣớc + 50ml

NaCl 10%) + 50ml diclomethan x “2 lần”

Làm sạch mẫu bằng cột Florisil

(5g Florisil + 2g Na2SO4)

Hòa tan cặn bằng 5ml hexan

Cô quay và thổi khô bằng khí N2

GC-ECD

Thu dung dịch vào bình cầu

250ml, cô quay ở 40°C

Thu dịch lọc vào bình cầu

250ml, cô quay ở 40oC

đến V<100ml (A)


61

3.4. Ứng dụng qui trình phân tích các mẫu rau

Sau khi nghiên cứu các điều kiện tách chiết pyrethroid, chúng tôi tiến hành

phân tích một số mẫu thực. Đối tƣợng mẫu là một số loại rau sau: rau dền, cải bắp,

cải thìa, cải canh, rau muống, rau mồng tơi, cà chua…..đƣợc bán tại các chợ Trung

Văn, chợ Kim Giang, chợ Ngã Tƣ Sở. Mua rau với mỗi chủng loại khoảng 2kg một

cách ngẫu nhiên và chuyển ngay về phòng phân tích. Các mẫu rau trƣớc khi đem

phân tích cần phải xử lý sơ bộ. Mẫu rau đƣợc nghiền nhỏ và đồng nhất, sau đó đƣợc

đem cân và tiến hành phân tích nhƣ qui trình ở trên. Mỗi mẫu đƣợc làm lặp lại 3 lần

và lấy giá trị trung bình của 3 lần.

Khi đo mẫu trắng không thấy xuất hiện tín hiệu mũi sắc ký của 4 hoạt chất

pyrethroid khảo sát ở trên nên các hoạt chất sử dụng không ảnh hƣởng đến kết quả

phân tích.

* Tính hàm lƣợng các thuốc bảo vệ thực vật trong mẫu phân tích:

Từ kết quả đo đƣợc kết hợp với các phƣơng trình hồi quy y = a + bx của mỗi hoạt

chất,hàm lƣợng các hoạt chất đƣợc tính nhƣ sau:

Cx = m

VC *

Trong đó:

- Cx: hàm lƣợng hoạt chất pyrethroid có trong mẫu (mg/kg)

- C : hàm lƣợng hoạt chất pyrethroid đƣợc tính toán theo đƣờng chuẩn (mg/l)

- m : khối lƣợng mẫu (g)

- V : Thể tích pha loãng mẫu (ml)

Tra bảng chuẩn t với P = 0,95 và f = 2 đƣợc t = 4,303.

µx = Cx tb ± ε 0.95 , 2

Kết quả hàm lƣợng các hoạt chất thuốc trong các mẫu thể hiện ở bảng :


62

Bảng 3.19: Kết quả phân tích các mẫu rau

Mẫu λ-cyhalothrin

(mg/kg)

Permethrin

(mg/kg)

Cypermethrin

(mg/kg)

Deltamethrin

(mg/kg)

C1 (bắp cải) KPH KPH

0,125

KPH 0,122

0,124

µ1 0,124 ± 0,004

C2 (cải canh) KPH KPH

0,213

KPH 0,215

0,216

µ2 0,215 ± 0,004

C3 (cải chip) KPH KPH KPH KPH

C4 (rau muống) KPH KPH KPH KPH

C5 (đỗ) KPH KPH

0,138

KPH 0,135

0,140

µ5 0,138 ± 0,006

C6(rau ngót) KPH KPH KPH KPH

C7(cải xoong) KPH KPH KPH KPH

C8 (cà chua) KPH KPH KPH KPH

C9 (rau dền) KPH KPH KPH KPH

C10 (rau mồng

tơi) KPH KPH KPH KPH

(-) chú thích: KPH là không phát hiện

* Tính hiệu suất thu hồi của các mẫu:

Hàm lƣợng mẫu thêm chuẩn cũng đuợc tính dựa vào phƣơng trình hồi quy và

công thức

Cx = m

VC *


63

Hiệu suất thu hồi đƣợc tính theo công thức:

Bảng 3.20: Kết quả phân tích các mẫu rau thêm chuẩn

STT Mẫu

Hoạt chất

Lƣợng

thêm vào

(µg/kg)

Lƣợng tìm

thấy

(µg/kg)

Độ thu hồi

R%

1 Cà chua

λ-cyhalothrin 0 KPH -

250 207,1 ± 8,6 82,9

Permethrin 0 KPH -

250 220,4 ± 3,7 88,2

Cypermethrin 0 KPH -

250 214,6 ± 5,2 85,8

Deltamethrin 0 KPH -

250 206,7 ± 4,3 82,7

2 Rau ngót


300 276,5 ± 5,1 92,2

Permethrin 0 KPH -

300 237,1 ± 2,9 79,1


300 241,5 ± 5,0 80,5


300 240,3 ± 4,8 80,1

3 Rau muống


500 427,5 ± 6,0 85,5

Permethrin 0 KPH -

500 434,3 ± 5,7 86,8


64


500 406,8 ± 4,9 81,3


500 416,7 ± 8,1 83,3

4 Cải chíp


700 672,1 ± 5,6 96,0

Permethrin 0 KPH -

700 660,3 ± 2,9 94,3


700 691,0 ± 3,5 98,7


700 653,1 ± 2,7 93,3

5 Đỗ


700 641,2 ± 7,0 91,6

Permethrin 0 KPH -

700 637,6 ± 5,1 91,1


700 629,8 ± 3,6 89,9


700 621,8 ± 3,9 88,8

6 Cải xoong


1000 930,7 ± 2,4 93,1

Permethrin 0 KPH -

750 727,9 ± 2,6 97,0


750 735,2 ± 5,1 98,0


750 703,9 ± 2,8 93,8


65

KẾT LUẬN

Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã xác định đƣợc:

1. Điều kiện tối ƣu để phân tích các thuốc trừ sâu nhóm pyrethroid: λ-cyhalothrin,

cypermethrin,deltamethrin và permethrin có mặt trong cùng một mẫu phân tích

bằng phƣơng pháp sắc ký khí kết hợp với detector bắt điện tử:

Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 250˚C

Nhiệt độ ECD: 280˚C

Khí mang N2(99,9995%), tốc độ khí mang 1,4 ml/phút

Kiểu bơm: không chia dòng.

Thể tích bơm mẫu: 1µl

Chƣơng trình nhiệt

280˚C (15phút)

265˚C (2phút) 4˚C/phút

245˚C (2phút)

3˚C/phút



Ƣu điểm của phƣơng pháp là có độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện LOD từ

15-30µg/l, giới hạn định lƣợng từ 50-100µg/l.

2. Điều kiện tối ƣu để chiết đƣợc dƣ lƣợng thuốc trừ sâu nhóm pyrethroid trong rau:

Dung môi chiết: diclomethane

Làm sạch: cột Florisil

Dung môi hoạt hóa cột Florisil: n-hexan

Dung môi rửa giải: 50ml hexan:toluene (4:6, v/v)


66

Hiệu suất thu hồi của quy trình đạt từ 79,1- 98,7%

3. Quá trình phân tích mẫu thật cho thấy có sự hiện diện của hoạt chất cypermethrin

trong mẫu bắp cải, cải canh và đỗ. Tuy hàm lƣợng thấp nhƣng cũng gây ảnh hƣởng

lâu dài tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng.

Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi nhận thấy có thể áp dụng phân tích dƣ

lƣợng thuốc bảo vê thực vật nhóm pyrethroid trong các loại rau với độ tin cậy cao.

Đây là một phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm mặc dù chi phí phân tích còn khá cao.

Nếu có thể, tôi mong tiếp tục nghiên cứu xác định đồng thời các chất khác thuộc

pyrethroid và mở rộng thêm các nhóm thuốc bảo vệ thực vật khác nhƣ: carbamat,

clo hữu cơ, lân hữu cơ trên các đối tƣợng khác nhƣ: đất, nƣớc, nông sản.


67

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. TIẾNG VIỆT

1. Báo Đại Đoàn Kết (2013), Bế tắc với nạn sử dụng thuốc bảo vệ thực vật.

2. Con ngƣời và thiên nhiên (2007), Hóa chất bảo vệ thực vật và sức khỏe con

người (KỳI).

3. Cổng thông tin điện tử An Giang (2012), Hiệu quả Chương trình quốc gia về

ATTP.

4. Cổng thông tin điện tử Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn (2009), Dư

lượng thuốc trừ sâu ở Ấn Độ tăng cao.

5. Nguyễn Thị Hai (2011), Thực trạng sử dụng hóa chất bảo vệt thực vật và giải

pháp để phát triển bền vững cho sản xuất rau ở Việt Nam, Kỷ yếu hội nghị

Khoa học Môi trƣờng và Công nghệ sinh học năm 2011.

6. Phan Nguyễn Tâm Minh (2009), Nghiên cứu qui trình xác định đồng thời dư

lượng thuốc trừ sâu họ pyrethroid và họ lân hữu cơ trong nước bằng phương

pháp sắc ký khí kết hợp với chiết pha rắn, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

7. Nguyễn Trần Oánh (2007), Giáo trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, NXB

Nông nghiệp Hà Nội.

8. Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm, QĐ

46/2007/ QĐ-BYT.

9. Sở Khoa học và công nghệ tỉnh An Giang (2007), Dư lượng thuốc trừ sâu

trong một số loại rau xanh ngắn ngày tại TP, Long Xuyên.

10. Sở Tài Nguyên và Môi trƣờng tỉnh Vĩnh Phúc (2008), Thuốc bảo vệ thực vật

và những tác động của chúng.

11. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích,

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

12. Giang Tấn Thông (2012), Một số kết quả điều tra, đánh giá tình hình ô nhiễm


68

dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong sản phẩm rau, củ, quả trên địa bàn tỉnh

Quảng Bình, Trung tâm Kỹ thuật Đo lƣờng Thử nghiệm Quảng Bình.

13. Nguyễn Thị Bích Thu (2009), Nghiên cứu ứng dụng sắc ký khí khối phổ để

phân tích dư lượng một số hóa chất bảo vệ thực vật thường dùng, Đề tài cấp

bộ, Viện Dƣợc liệu, Bộ Y Tế.

14. Viện chính sách và chiến lƣợc nông nghiệp nông thôn (2012), hội thảo

“Quản lý an toàn thực phẩm đối với sản xuất và kinh doanh rau quả ở quy mô

nhỏ, tổ chức ngày 19/12/2012.

15. Viện Dinh Dƣỡng (2011), Những điều cần biết về rau quả, cập nhật ngày

29/03/2011.

16. Phạm Hùng Việt (2003), Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký khí, NXB Khoa

học kỹ thuật, Hà Nội.

B. TIẾNG ANH

17. Albaseer Saeed S (2012), “Development of Reversed- Phase High

Performance Liquid Chromatographic Method for Efficient Diastereomeric

Separation and Quantification of Cypermethrin, Resmethrin, Permethrin”,

Centre for Chemical Sciences and Technology, Institute of Science and

Technology, Research Journal of Chemical Sciences, Vol.2(10), 26-31.

18. Alijca Niewiadowska, Tomasz Kiljanek, Stanislaw Semeniuk and Jan

Zmudzki (2010), “Determination of Pyrethroid Residues in Meat by Gas

Chromatography with Electron Capture Detection”, Bull Vet Inst Pulawy 54,

pp 595-599.

19. Anna Balinova, Rosita Mladenova, Deyana Shtereva (2007), Journal of

Chromatography A, 1150, pp.136-144.

20. Denise Zuccari Bissacot and Igor Vassilieff (1997), “HPLC determination of

Flumethrin, Deltamethrin, Cypermethrin, and Cyhalothrin Residues in the

Milk and Blood of Lactating Dairy Cows”, Journal of Analytical Toxicology,

Vol.21.


69

21. Div.Washington.DC (1989), “Pesticide Fact Sheet Number 199:

Cypermethrin”, U.S. Environmental Protection Agency, Office of Pesticide

Programs.

22. Extension Toxicology Network (1995), “Deltamethrin: Pesticide Information

Profile”.

23. Extension Toxicology Network, “Lambda-Cyhalothrin”

http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/haloxyfopmethylparathion/lam

bda-cyhalothrin-ext.html.

24. Hans- Peter Their and Jochen Kirchhoff (1992), “Manual of Pesticide

Residue Analysis volume II”, DFG Deutschen Forschungsgemeinschaft, S

23, pp.333.

25. Kuang Hua, Miao Hong, Hou Xiaolin, Zhao Yunfeng , Wu Yougning and Xu

Chuanlai (2010), “ Simultanueous Determination of 16 Pyrethroid Residues in

Tea Samples Using Gas Chromatography and Ion Trap Mass Spectrometry”,

Journal of Chromatographic Science, Vol.48.

26. Loper & Anderson (2003) “Determination of Pyrethrin and Pyrethroid

Pesticides in Urine and Water Matrixes by Liquid Chromatography with

Diode Array Detection”, Journal of AOAC International, Vol.86, No.6.

27. National Pesticide Information Center (2009), “Permethrin: General Fact

Sheet”.

28. Sannio et Al (2003), “Determination of Pyrethroid Pesticide Residues in

Processed Fruits and Vegetables by Gas Chromatography with Electron

Capture and Mass Spectrometric Detection”, Joural of AOAC International,

Vol.86, No.1.

http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/haloxyfopmethylparathion/lambda-cyhalothrin-ext.html

http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/haloxyfopmethylparathion/lambda-cyhalothrin-ext.html


70

PHỤ LỤC

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu trắng

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu đỗ

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu đỗ thêm chuẩn


71

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu cải chip

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu cải chíp thêm chuẩn

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu cải xoong


72

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu cải xoong thêm chuẩn

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu rau ngót

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ nền rau ngót thêm chuẩn


73

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0uV(x10,000)

Sắc đồ nền cà chua

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ nền cà chua thêm chuẩn

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ nền rau muống


74

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ nền rau muống thêm chuẩn

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu bắp cải

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0uV(x10,000)

Sắc đồ mẫu cải canh

Documents

NGUYỄN THỊ THƠM PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC … (327).pdf · LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn