Nghiên cứu Protein y sinh học

8/12/2019 Nghiên cứu Protein y sinh học

http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-protein-y-sinh-hoc 1/120

LÔØI MÔÛ ÑAÀU

-1-

LÔØI MÔÛ ÑAÀU

Cuøng vôùi glucid vaø lipid, protein ñoùng moät vai troø quan troïng trong s

sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa moïi sinh vaät. Nhieàu nghieân cöùu ñaõ laøtính chaát, chöùc naêng cuûa protein, töø ñoù môû ra khaû naêng öùng duïng roätrong dinh döôõng, coâng ngheä thöïc phaåm, saûn xuaát hoaù chaát, y hoïc, döôïc

Baûn luaän vaên naøy seõ ñi vaøo giôùi thieäu veà nguoàn goác, öùng duïng phaùp saûn xuaát protein y sinh hoïc.

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON



CHÖÔNG 1: GIÔÙI THIEÄU

-2-

CHÖÔNG 1 : GIÔÙI THIEÄU1.1. KHAÙI QUAÙT:

Caùc phaân töû protein laø cô sôû cuûa söï ña daïng veà caáu truùc vaø chmoïi sinh vaät trong töï nhieân. Chuùng coù caáu truùc phöùc taïp hôn raát nhieàulipid vaø caû nucleic acid. Caùc protein coù caáu truùc khoâng gian 3 chieàu phödaïng töï nhieân (native) vaø ôû daïng naøy môùi coù hoaït tính sinh hoïc. Proteinphaân töû hieän thöïc hoùa thoâng tin di truyeàn chöùa treân nucleic acid [8].

Protein y sinh hoïc laø nhöõng protein maø ngoaøi giaù trò dinh döôõng, chumoät soá aûnh höôûng ñaëc bieät ñeán chöùc naêng sinh lyù cuûa cô theå, töø ñoù

roäng raõi trong y döôïc hoïc. Protein ñaõ ñöôïc con ngöôøi söû duïng töø laâu, nhnhaän chuùng deã daøng vôùi soá löôïng lôùn vaø nhieàu chuûng loaïi töøng laø thnhaø khoa hoïc. Ngaøy nay, vôùi söï phaùt trieån maïnh meõ cuûa kyõ thuaät di ngheä protein ñang coù nhöõng böôùc tieán vöôït baäc vôùi nhieàu thaønh töïu ngo

1.2. PHAÂN LOAÏI CAÙC DAÃN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC:1.2.1. Theo caáu taïo hoùa hoïc:

Amino acid: laø ñôn vò caáu truùc cuûa protein. Chuùng laø nhöõng hôïp c

maïch thaúng hoaëc maïch voøng, trong phaân töû chöùa ít nhaát moät nhoùm nhoùm carboxyl. Ña soá caùc protein ñeàu ñöôïc caáu taïo töø 20 L--amino acid vaø 2amide töông öùng. Caùc amino acid coù hoaït tính sinh hoïc ñaëc bieät laø(taêng chuyeån hoaù cô baûn, kích thích cho treû em lôùn taêng cöôøng haáplysine, valine, cysteine, histidine (taêng cöôøng khaû naêng haáp thu khoaùng)

Peptide: laø chuoãi amino acid lieân keát vôùi nhau baèng lieân keát peptidemoät maïch polypeptide coù khoaûng 40 ñeán 500 amino acid. Nhieàu pephoaït tính sinh hoïc nhö insulin, glucagons, oxytocin, enkephalin, bradykinin…

Protein: phaân töû protein coù theå coù 4 baäc caáu truùc nhö sau:- Caáu truùc baäc 1: trình töï caùc amino acid theo maïch thaúng.- Caáu truùc baäc 2: söï saép xeáp thích hôïp trong khoâng gian cuûa m

polypeptide, taïo thaønh caáu truùc xoaén oác vaø gaáp neáp.- Caáu truùc baäc 3: caáu truùc khoâng gian 3 chieàu phöùc taïp coù daïn

hay khoái caàu.- Caáu truùc baäc 4: caùc “phaàn döôùi ñôn vò” coù caáu truùc baäc 3 l

nhau baèng lieân keát phi ñoàng hoùa trò (lieân keát hydro, töông taùc





CHÖÔNG 1: GIÔÙI THIEÄU

-3-

töông taùc kî nöôùc…). Caùc phaàn döôùi ñôn vò naøy coù theå gioáng khaùc nhau vaø söï saép xeáp cuûa chuùng khoâng baét buoäc phaûi ñoái

1.2.2. Theo chöùc naêng sinh hoïc:

Hormone: laø nhöõng chaát höõu cô ñöôïc saûn xuaát vôùi moät löôïng raát nbaøo noäi tieát, baøi tieát tröïc tieáp vaøo maùu vaø vaän chuyeån tôùi caùcnhau cuûa cô theå, töø ñoù taïo ra nhöõng taùc duïng sinh hoïc. Chöùc naêng heä noäi tieát laø kieåm soaùt caùc quaù trình chuyeån hoùa khaùc nhau cuûa trong teá baøo, quaù trình vaän chuyeån vaät chaát qua maøng teá baøo haykhaùc cuûa hoaït ñoäng teá baøo nhö phaùt trieån vaø baøi tieát. Heä noäi tieánaêng naøy thoâng qua caùc saûn phaåm cuûa noù laø hormone. Caùc hormchaát hoùa hoïc protein thöôøng laø caùc hormone cuûa vuøng döôùi ñoài, tuyeán tuî nhö insulin, hormone taêng tröôûng…

Khaùng theå: laø nhöõng globulin xuaát hieän trong maùu cuûa ñoäng vaät khnguyeân vaøo cô theå vaø coù khaû naêng lieân keát ñaëc hieäu vôùi caùc khkích thích sinh ra noù. Nhö vaäy, khaùng theå nhö nhöõng “lính gaùc” baûo bieát vaät laï ñeå loaïi tröø chuùng ra khoûi cô theå. Trong maùu ngöôøi coù ctheå IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.

Enzyme: laø nhöõng protein ñaëc bieät coù chöùc naêng xuùc taùc caùc phaûncaùc phaûn öùng cuûa cô theå soáng töø ñôn giaûn nhö phaûn öùng hydrat hokhöû nhoùm carboxyl ñeán phöùc taïp nhö sao cheùp maõ di truyeàn… ñeàu xuùc taùc.

1.2.3. Theo khaû naêng öùng duïng:- Ñieàu trò: insulin, hormone taêng tröôûng, insulin…- Chaån ñoaùn: khaùng theå ñôn doøng…- Phaân tích: glucose oxidase, cholesterol oxidase…- Thöïc phaåm chöùc naêng- Myõ phaåm: collagen.- Moät soá lónh vöïc khaùc





Chöông 2: KHAÛ NAÊNG ÖÙNG DUÏNG CUÛA PROTEIN Y SINH H

-4-

CHÖÔNG 2 : KHAÛ NAÊNG ÖÙNG DUÏNGCUÛA PROTEIN Y SINH HOÏC

2.1. TRONG ÑIEÀU TRÒ:2.1.1. Insulin:Beänh tieåu ñöôøng laø moät trong nhöõng caên beänh ñe doïa nghieâm tro

khoeû cuûa con ngöôøi. Treân theá giôùi, con soá nhöõng ngöôøi maéc beänh titính khoaûng töø 151 trieäu ñeán 171 trieäu (naêm 2000), vaø döï kieán con soá ntrieäu (naêm 2010), naêm 2030 seõ leân ñeán 366 trieäu ngöôøi. Vaø ñöông nhietaêng con soá nhöõng ngöôøi maéc beänh tieåu ñöôøng seõ keùo theo söï gia ta

chöùng cuûa caên beänh naøy nhö beänh tim maïch vaø ñoät quî, beänh thaän, muveà thaàn kinh, nhieãm truøng lôïi vaø hoaïi töû… Theo öôùc tính, soá ngöôøi töûgiôùi do beänh tieåu ñöôøng trong naêm 2000 laø 2,9 trieäu vaø con soá naøy setaêng. Ñieàu ñoù ñoøi hoûi phaûi tìm ra nhöõng höôùng tieáp caän môùi cho vieäñieàu trò caên beänh naøy.

Coù 3 loaïi beänh tieåu ñöôøng laø tieåu ñöôøng type I, type II vaø tieåu ñöthai ngheùn:

Tieåu ñöôøng type I (tieåu ñöôøng phuï thuoäc insulin), tröôùc ñaây ñöôïc gñöôøng ôû tuoåi vò thaønh nieân, thöôøng ñöôïc phaùt hieän ôû treû em, thanTrong loaïi tieåu ñöôøng naøy, caùc teá baøo beta cuûa tuyeán tuïy khoâng cinsulin nöõa bôûi vì heä mieãn dòch cuûa cô theå ñaõ taán coâng vaø huyû die

Tieåu ñöôøng type II (tieåu ñöôøng khoâng phuï thuoäc insulin), tröôùc ñaây tieåu ñöôøng taán coâng ôû ngöôøi lôùn, laø daïng phoå bieán nhaát. Con ngöbeänh daïng naøy ôû baát kì löùa tuoåi naøo, thaäm chí khi môùi maáy thaùntieåu ñöôøng naøy xaûy ra do cô theå khoâng söû duïng insulin moät caùchthöôøng baét ñaàu baèng söï roái loaïn tieát insulin (do taêng ñöôøng huyeátaêng noàng ñoä acid beùo töï do), ñeà khaùng insulin ngoaïi bieân (chuû yegan) vaø gan taêng saûn xuaát glucose quaù möùc.

Tieåu ñöôøng ôû thôøi kì thai ngheùn xaûy ra ôû moät soá phuï nöõ trong nhcuoái cuûa thai kì. Maëc duø daïng tieåu ñöôøng naøy thöôøng maát ñi sau ñöôïc sinh ra, nhöng moät phuï nöõ töøng bò loaïi beänh naøy coù nhieàu khñeå tieán trieån thaønh tieåu ñöôøng type II trong töông lai. Tieåu ñöôøng ôû

ngheùn gaây ra bôûi hormone do mang thai, hay do söï thieáu huït cuûa insulin






-5-

Hình 2.1. Caáu truùc ñaûo Langerhans cuûa tuyeán tuïy (Pancreas)Haøm löôïng ñöôøng trong maùu ñöôïc duy trì ôû möùc bình thöôøng laø

baèng giöõa caùc yeáu toá laøm taêng löôïng ñöôøng trong maùu (nhö glucagocatecholamine…) vôùi caùc yeáu toá laøm giaûm löôïng ñöôøng trong maùu [2]. ñöôøng trong maùu taêng coù theå gaây ra söï baøi tieát ñöôøng qua nöôùc tieåumaát glucose, ñoù chính laø beänh tieåu ñöôøng. Insulin laø hormone duy nhaát cgiaûm löôïng ñöôøng trong maùu baèng caùch:

Taêng tính thaám glucose qua maøng teá baøo, ñoàng thôøi cuõng laøm taêthaáu cuûa caùc ion K+ vaø phosphate voâ cô, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi chophosphoryl hoùa vaø söû duïng glucose. Caàn chuù yù raèng, coù moät soá tonhaïy caûm vôùi insulin, do vaäy ôû nhöõng toå chöùc naøy insulin khoâng lnoàng ñoä glucose trong teá baøo (nhö toå chöùc thaàn kinh, baïch caàu, phonhaát laø gan). ÔÛ gan, glucose thaám qua maøng teá baøo moät caùch töï dkhoâng coù maët insulin.

Taùc duïng tröïc tieáp chuyeån glycogen synthetase töø daïng khoâng hoaït ñodaïng hoaït ñoäng, do ñoù taêng cöôøng quaù trình chuyeån glucose thaønh gly

Kích thích söï toång hôïp glucosekinase ôû gan, öùc cheá toång hôïp moät sxuùc taùc söï taân taïo ñöôøng nhö pyruvat carboxylase…

Giaûm taùc duïng cuûa glucose 6-phosphatase. ÖÙc cheá phaân huûy lipid, cho neân taêng cöôøng ñoát chaùy glucose.

Do ñoù, khi khaû naêng tieát hormone naøy giaûm ñi (do moät soá nguyeâninsulin khoâng cung caáp ñuû cho cô theå, töø ñoù gaây ra beänh tieåu ñöôøng.






-6-

Insulin ngöôøi- coâng thöùc hoùa hoïc: C257H383N65O77S6 - laø moät polypeptide baogoàm moät chuoãi A vôùi 21 amino acid vaø moät chuoãi B vôùi 30 amino acid, cnoái disulfide trong chuoãi A vaø 2 caàu noái disulfide noái giöõa hai chuoãi A, Bhoùa insulin naèm treân nhieãm saéc theå soá 11, vò trí locus 11p15.5. Khi con nhoaù thöùc aên, insulin ban ñaàu ñöôïc toång hôïp ôû daïng preproinsulin (tieàn insulin) treânribosome ôû teá baøo beta trong ñaûo Langerhans cuûa tuyeán tuïy. Preproinsuliphaân töû daïng thaúng bao goàm: moät peptide tín hieäu chöùa 24 amino acid (SPpeptide C vôùi 31 amino acid (C) vaø chuoãi A noái vôùi nhau theo thöù töï SP-Bvaän chuyeån qua löôùi noäi chaát, peptide tín hieäu bò phaân caét bôûi enzypeptidase taïo ra proinsulin (B-C-A). Proinsulin hình thaønh caàu noái disulfidelöôùi noäi chaát, taïo neân caáu truùc baäc ba, sau ñoù bò phaân caét bcarboxypeptidase taïi lieân keát giöõa peptide vôùi chuoãi A vaø chuoãi B. Keácuøng cuûa quaù trình phaân caét taïo thaønh insulin.

Hình 2.2. Caáu truùc cuûa phaân töû insulin

Hình 2.3. Quaù trình hình thaønh insulin






-7-

Trong naêm 2005, nhu caàu insulin trò beänh tieåu ñöôøng öôùc tính khoaûñeán 5.000 kg vaø döï kieán naêm 2010 laø 16.000 kg. Nhu caàu insulin cuûa thequa con soá vaøi taán/naêm vaø vì theá, nguoàn cung caáp insulin ñang thieáu hnieân 1920 ñeán nhöõng naêm ñaàu cuûa thaäp nieân 1980, insulin ñöôïc taïo ra baèng caùch coâlaäp töø tuyeán tuïy cuûa ñoäng vaät nhö heo, boø. Tuy nhieân, insulin ngöôøi coùtrong thaønh phaàn amino acid so vôùi insulin boø (hai vò trí trong chuoãi A, mtrong chuoãi B) vaø insulin heo (moät vò trí trong chuoãi B). Vì theá gaây ra nduïng khoâng mong muoán (nhö dò öùng) khi söû duïng insulin coù nguoàn goácboø. Ngoaøi ra, quaù trình saûn xuaát vaø tinh saïch insulin töø ñoäng vaät cuõng gaëkhaên. Sau ñoù, caùc phöông phaùp baùn toång hôïp insulin ngöôøi töø insulin heo vñöôïc phaùt trieån baèng caùch söû duïng phaûn öùng chuyeån peptide (transpeptidation) vôùitrypsin, nhöng vaãn khoâng ñem laïi hieäu quaû cao. Söï ra ñôøi cuûa kó thuaätDNA ñaõ taïo neân moät cuoäc caùch maïng thaät söï trong vieäc saûn xuaát insulilaàn ñaàu tieân Coâng ty Genetech (Mó) ñöa ra thò tröôøng saûn phaåm insulinbaèng kó thuaät di truyeàn. Ñaây cuõng laø laàn ñaàu tieân trong lòch söû, caùc nöùng duïng coâng ngheä sinh hoïc vaøo döôïc phaåm thaønh coâng. Keå töø ñoù, ixuaát chuû yeáu baèng phöông phaùp naøy, vôùi chi phí thaáp vaø hieäu quaû cao.

2.1.2. Hormone taêng tröôûng:Hormone taêng tröôûng cuûa caùc loaøi vaät ñeàu coù caáu truùc phaân töû

nhöng khoâng hoaøn toaøn gioáng nhau. Ñieàu ñaëc bieät laø hormone taêng tröôûcoù taùc duïng leân söï phaùt trieån cuûa chuoät; nhöng ngöôïc laïi, hormone taênñoäng vaät nhö chuoät thì khoâng coù taùc duïng treân ngöôøi. Hormone taêngngöôøi ( Human Growth Hormone-hGH ) laø moät chuoãi 191 amino acid vôùi 2 caàdisulfide (giöõa amino acid 53 vaø 165, amino acid 182 vaø 189), coù phaân töû lökilodalton, ñöôïc tieát ra töø thuøy tröôùc cuûa tuyeán yeân [2]. Gene maõ hoùa hG

nhieãm saéc theå soá 17, vò trí locus 17q22-17q24.Do caáu truùc phöùc taïp, hGH khoâng theå ñöôïc saûn xuaát baèng phöông

hôïp hoaù hoïc bình thöôøng. Tröôùc naêm 1985, hGH phaûi ñöôïc trích ly töø tuycuûa xaùc ngöôøi ñeå chöõa trò cho treû em taêng tröôûng chaäm do khoâng theå Tuy nhieân, ñeán khoaûng ñaàu thaäp nieân 80, ngöôøi ta phaùt hieän ra moät soátrò lieäu baèng hGH (laáy töø xaùc ngöôøi) bò nhieãm beänh Creutzfeldt-Jakob (mlieân heä ñeán beänh “boø ñieân” hay Mad Cow disease). Ñieàu naøy ñaõ gaây htrong giôùi y hoïc ñöông thôøi. May maén thay, cuøng luùc ñoù kó thuaät taùi tñöôïc khaùm phaù; nhôø vaäy coâng ngheä sinh hoïc ñaõ ñöôïc aùp duïng ñeå gheù






-8-

hGH vaøo vi khuaån E. Coli. Töø ñoù, vieäc saûn xuaát hGH treân quy moâ lôùn vaø hGH trích ly töø xaùc ngöôøi khoâng coøn ñöôïc pheùp söû duïng nöõa. Hieäñöôïc Cô quan quaûn lyù thöïc phaåm vaø döôïc phaåm Hoa Kyø (FDA) cho phetrong tröôøng hôïp treû em bò beänh chaäm lôùn hay ngöôøi lôùn khoâng coù khtieát hGH. Ñaây laø moät protein coù phaân töû löôïng cao neân khoâng theå ñthaønh thuoác vieân ñeå uoáng vì noù seõ bò phaân huûy bôûi acid vaø caùc enzytrong bao töû vaø cô quan tieâu hoaù. Do ñoù, ñeå söû duïng, beänh nhaân phahoaëc truyeàn thuoác naøy thaúng vaøo ñöôøng maùu.

Hình 2.4. Tuyeán yeân (Pituitary), vuøng döôùi ñoài (Hypothalamus)vaø vò trí cuûa chuùng ôû naõo boä

Taêng tröôûng laø moät quy tr ình raát phöùc taïp vaø ñoøi hoûi söï tham giaheä thoáng cuûa nhieàu yeáu toá khaùc nhau. Hai nhaø khoa hoïc Salmon vaø Dautröôøng Ñaïi hoïc Washington ñaõ chöùng minh raèng cô cheá chính cuûa hGH trình phaùt trieån cuûa cô theå laø kích thích gan vaø caùc moâ khaùc tieát ra IGF- Insulin-like

Growth Factor–1). Chính IGF-I kích thích söï taêng tröôûng cuûa teá baøo xöông baøo cô baép. Ngoaøi ra, hGH coøn coù taùc duïng tröïc tieáp leân moâ môõ, bieánbeùo töï do ñeå cung caáp naêng löôïng cho caùc teá baøo khaùc taêng tröôûng. ThGH coøn coù aûnh höôûng quan troïng ñeán quaù trình chuyeån hoùa cuûa proglucid. Vì vaäy, hGH coù aûnh höôûng quan troïng ñeán quaù trình phaùt trieån cLöôïng hGH trong maùu ñöôïc ñieàu hoøa bôûi hai kích thích toá ñoái nghòc(Growth Hormone Releasing Factor ) vaø GHIF (Growth Hormone Inhibitory Factor ).






-9-

Hình 2.5. Caáu truùc hGH

Taùc duïng cuûa hGH ñoái vôùi treû em:ÔÛ treû em trong ñoä tuoåi ñang lôùn, hGH ñöôïc ñieàu tieát nhieàu laàn t

nhieàu nhaát laø vaøo ban ñeâm (trong khi nguû). Treû em khoâng tieát ñuû hGthaønh chaäm vaø khoâng theå ñaït ñöôïc chieàu cao bình thöôøng. Neáu naëngñeán hieän töôïng “ngöôøi luøn” (dwarfism). Trong nhöõng thí nghieäm laâm saøng ñöôïc ba

caùo treân caùc taïp chí khoa hoïc, caùc beù ôû Myõ sôùm ñöôïc chaån ñoaùn beäntrò (neáu caàn) vaøo khoaûng luùc 9 tuoåi. Do ñoù, söï taêng tröôûng chieàu cao ctöø 4,4 cm moät naêm ñeán 10 cm moät naêm. Sau taùm naêm trò lieäu caùc em tñaït ñöôïc möùc cao laø 172 cm vaø em gaùi laø 156 cm.

Ñoái vôùi treû em chaäm lôùn nhöng vaãn coù khaû naêng ñieàu tieát hGH mthöôøng thì vieäc trò lieäu laø moät vaán ñeà phöùc taïp vì hieäu quaû cuûa hGHhôïp naøy khoâng ñöôïc xaùc minh moät caùch roõ raøng. Do caùc haõng thuoác nghieäm laâm saøng moät caùch quy moâ neân caùc keát quaû chæ döïa treân basoá baùc só: sau nhieàu naêm trò lieäu, caùc em naøy coù theå cuõng taêng tröôûn






-10-

chieàu cao (khoaûng töø 5 ñeán 6 cm so vôùi treû em cuøng daùng daáp nhöng hGH).

Taùc duïng cuûa hGH ñoái vôùi ngöôøi tröôûng thaønh:

hGH cuõng ñöôïc chaáp thuaän cho ngöôøi tröôûng thaønh söû duïng trong tuyeán tieàn yeân khoâng theå ñieàu tieát chaát naøy. Nhöõng beänh nhaân naøy löôïng môõ cao trong maùu, maäp hôn bình thöôøng, löôïng moâ môõ gia taêng trtích baép thòt giaûm xuoáng, xöông doøn vaø deã gaõy, vaø do ñoù coù nhieàubeänh tim maïch gaây ra. Trong moät thí nghieäm laâm saøng, caùc nhaø nghieân craèng: sau moät naêm chöõa trò baèng hGH, beänh nhaân phuïc hoài söùc khoûe bình thöôøng (löôïng môõ trong maùu cuûa beänh nhaân thuyeân giaûm, löôïng mquanh buïng giaûm xuoáng 61%, theå tích cô baép gia taêng 11%, khaû naêng tataêng töø 11% -19% vaø söùc maïnh cuûa cô baép taêng töø 7% -19%.)

Taùc duïng ñoái vôùi caùc baäc cao nieân:Chuùng ta bieát raèng cô theå ñieàu tieát hGH nhieàu nhaát ôû tuoåi daäy th

giaûm daàn khi lôùn tuoåi. Tuy nhieân, do caùc haõng thuoác khoâng thöû nghieätreân ngöôøi khoâng coù beänh, neân chöa coù döï ñoaùn chính thöùc vaø chaéduïng laâu daøi cuûa hGH ñoái vôùi vieäc choáng laõo hoùa. Caùc cuoäc khaûo sathöïc hieän bôûi caùc chuyeân gia y teá treân caùc baäc cao nieân thöôøng coù glöôïng ngöôøi tham gia vaø thôøi gian theo doõi beänh lyù. Ví duï, vaøo naêm 199thí nghieäm cuûa baùc só Daniel Rudman ñaõ ñöôïc aùp duïng treân 21 ngöôøi ñ60 tuoåi [11]. Trong soá naøy, 12 ngöôøi ñöôïc tieâm hGH 3 laàn moät tuaàn vaø 9khoâng ñöôïc chích thuoác. Sau 6 thaùng theo doõi, nhöõng ngöôøi ñöôïc tieâm hnhöõng daáu hieäu khaû quan: löôïng môõ döôùi da vaø buïng giaûm, löôïng thòda ñaày ñaën hôn (troïng löôïng cô baép trong cô theå taêng 4-7 kg, troïng löôïngcô theå giaûm 3-5 kg, maät ñoä cuûa xöông löng taêng 0,02 g/cm2...). Ngoaøi ra, beänh nhaân

coøn cho bieát laø söùc khoeû ñaõ gia taêng vaø taâm lyù laïc quan hôn. OÂng Ruraèng taùc duïng cuûa hGH treân caùc baäc cao nieân raát ñaùng quan taâm vaø cacöùu theâm. Baøi baùo caùo naøy cuûa oâng ñaõ thu huùt söï chuù yù cuûa coäntheá giôùi vì hoï hy voïng raèng, cuoái cuøng chuùng ta ñaõ coù theå tìm ñöôïc motröôøng sinh”. Nghieân cöùu treân ñaõ bò laïm duïng vì giôùi thöông maïi duøngtaûng cho söï kinh doanh vaø quaûng baù vieäc söû duïng hGH ñeå choáng lanhieân, nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây söû duïng caùc phöông phaùp chính xaù

ngaët hôn vôùi soá löôïng ngöôøi tham gia ñoâng hôn ñaõ keát luaän raèng aûnhGH trong vieäc choáng laõo hoùa khoâng lôùn nhö ngöôøi ta töôûng. Theâm vaø






-11-

ñaõ keát luaän laø theå duïc ñieàu ñoä coù taùc duïng toát ñoái vôùi cô baép (moächí ñeå ño löôøng söï khoûe maïnh) lôùn hôn vieäc söû duïng hGH (moãi ngöôøi ôû Mó coù theå toán 7.000-10.000 USD/naêm). Do nhöõng keát quaû treân chöachính xaùc neân vieäc nghieân cöùu veà aûnh höôûng cuûa hGH ñoái vôùi söï lahöôûng laâu daøi cuûa noù ñoái vôùi söùc khoûe cuûa caùc baäc cao nieân caàn ñöcaùch quy moâ, nghieâm ngaët hôn.

Ñieàu caàn bieát laø hGH cuõng coù nhöõng phaûn öùng phuï khoâng toákhoûe bao goàm chöùng phuø chaân tay, trieäu chöùng vieâm khôùp, nhöùc ñaàutieåu ñöôøng, cao huyeát aùp… vaø coù theå laøm gia taêng nguy cô bò ung thöñoù, neáu ngöôøi bình thöôøng söû duïng hGH thì cô theå seõ töï ñoäng ngönhormone naøy; vaø chæ ñieàu tieát trôû laïi sau khi ngöng söû duïng thuoác mo(khoaûng vaøi thaùng).

Nhieàu döôïc phaåm coù theå kích thích cô theå ñieàu tieát hGH, ví duï nhövaø lysine. Trong moät cuoäc thöû nghieäm ñöôïc thöïc hieän treân nhöõng ngöôbình thöôøng, caùc nhaø nghieân cöùu nhaän thaáy raèng vôùi moät lieàu löôïng tmg arginine coù theå laøm gia taêng söï ñieàu tieát cuûa hGH leân gaáp ñoâi; 12laøm taêng löôïng hGH trong maùu gaáp 3 laàn; toång hôïp cuûa hai lieàu löôïnglaøm taêng löôïng hGH trong maùu gaáp taùm laàn. Tuy nhieân 2400 mg arginin

giaûm löôïng ñieàu tieát cuûa hGH xuoáng thaáp hôn ba laàn. Toùm laïi, nhöõngnaøy coù khaû naêng laøm cô theå ñieàu tieát ra hGH, nhöng phaûn öùng cuûa cô coøn tuøy thuoäc vaøo lieàu löôïng, söï phoái hôïp giöõa caùc amino acid cuõng cuûa cô theå moãi ngöôøi.

2.1.3. Kích toá sinh duïc:Kích toá sinh duïc (Gonadotropin Hormone) bao goàm 2 hormone: hormone kích

thích nang tröùng (Follicle Stimulating Hormone-FSH ) vaø hormone taïo hoaøng theå( Luteinizing Hormone-LH ) ñöôïc tieát ra töø thuøy tröôùc cuûa tuyeán yeân. Chuùngcaáu taïo laø glycoprotein goàm 2 tieåu ñôn vò vaø , trong ñoù tính ñaëc hieäu cuûa moãihormone laø ôû söï khaùc nhau veà caáu truùc chuoãi . FSH goàm 203 amino acid, LH goàm215 amino acid, taùc duïng leân cô quan ñích laø buoàng tröùng vaø tinh hoaøn [3]

Treân buoàng tröùng, FSH kích thích moät soá nang tröùng tröôûng thaønh, tmoät nang tröùng tröôûng thaønh nhanh nhaát, trôû thaønh nang tröùng chín vtröùng. Coøn LH phoái hôïp vôùi FSH gaây ruïng tröùng vaø phaùt trieån ho

thích baøi tieát progesterone vaø moät phaàn nhoû estrogene bôûi teá baøo n






-12-

Cuøng vôùi söï baøi tieát naøy, LH taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï laømtrong töû cung.

Treân tinh hoaøn, FSH kích thích teá baøo Sertoli trong oáng sinh tinh, laømteá baøo naøy phaùt trieån vaø baøi tieát caùc chaát sinh tinh truøng. Chaát hormone testosterone do teá baøo Leydig tieát ra coù taùc duïng dinh döôõntreân oáng sinh tinh, laøm cho caùc teá baøo maàm treân oáng sinh tinh trönhanh choùng, qua caùc giai ñoaïn trung gian ñeå trôû thaønh tinh truøng. Coøthích caùc teá baøo keõ Leydig phaùt trieån vaø baøi tieát ra testosterone.

Söï baøi tieát FSH vaø LH ñöôïc ñieàu hoøa bôûi yeáu toá giaûi pho(Gonadotropin Releasing Factor ) cuûa vuøng döôùi ñoài cuøng noàng ñoä cuûa hormoduïc nöõ progesterone vaø estrogene trong maùu. Gene maõ hoùa FSH naèm tresaéc theå soá 11, vò trí locus 11p13. Gene maõ hoùa LH naèm treân nhieãm saéc ttrí locus 19q13.3.

Hình 2.6. Thöù töï amino acid trong phaân töû FSH






-13-

Hình 2.7. Thöù töï amino acid trong chuoãi vaø cuûa LH

Trong y hoïc, kích toá sinh duïc FSH vaø LH ñöôïc söû duïng ñeå kích thíctröùng khi thuï tinh trong oáng nghieäm (TTTON). Ñöùa beù TTTON ñaàu tieânAnh (1978) laø töø moät chu kyø töï nhieân, khoâng kích thích buoàng tröùng. Tuynay TTTON vôùi chu kyø töï nhieân ít khi ñöôïc söû duïng do tæ leä thaønh coâVieäc aùp duïng caùc phaùc ñoà kích thích buoàng tröùng ñaõ laøm taêng ñaùnthaønh coâng cuûa TTTON.

Muïc ñích cuûa kích thích buoàng tröùng nhaèm taêng soá löôïng nang not

trieån ôû caû hai buoàng tröùng trong chu kyø ñieàu trò TTTON, soá noaõn vañöôïc seõ nhieàu hôn. Töø ñoù coù theå chuyeån vaøo buoàng töû cung nhieàu hô






-14-

coù cô hoäi ñeå choïn löïa ñöôïc nhieàu phoâi chaát löôïng toát, coù khaû naêng lnöõa, soá phoâi toát coøn laïi sau chuyeån phoâi cuõng coù theå tröõ laïnh vaø söûgoùp phaàn gia taêng khaû naêng coù thai cho beänh nhaân vôùi moät laàn kíchtröùng. Ngoaøi ra, söï kích thích buoàng tröùng phuø hôïp seõ taïo ñieàu kieän noäthuaän lôïi cho söï laøm toå cuûa phoâi.

Tröôùc ñaây, kích toá sinh duïc ñöôïc chieát xuaát töø maùu vaø nöôùc tieåphuï nöõ ñang maõn kinh. Tuy nhieân, nöôùc tieåu ngöôøi thöôøng chöùa nhieàu khoâng theå loaïi ñöôïc hoaøn toaøn trong quaù trình chieát xuaát. Ngöôøi ta cuõtaïp nhieãm trong nöôùc tieåu ngöôøi trong quaù trình thu thaäp, quaûn lyù vaøgonadotropins. Ñoàng thôøi ñeå ñaûm baûo nguoàn cung caáp oån ñònh phuïc vuduïng ngaøy caøng taêng, vaøo ñaàu nhöõng naêm 90, kích toá sinh duïc ngöôøi titoång hôïp baèng kó thuaät taùi toå hôïp DNA ñaõ ñöôïc giôùi thieäu vaø ñöa vaøthích buoàng tröùng.

2.1.4. Oxytocin:Ñaây laø hormone coù maët ôû thuøy sau tuyeán yeân. Tuyeán yeân sau coø

thaàn kinh, bao goàm caùc teá baøo yeân, nhöng chuùng khoâng baøi tieát caùc sau maø chæ coù vai troø trôï giuùp nhöõng taän cuøng thaàn kinh cuûa caùc sôïi tñi xuoáng [3].

Oxytocin ñöôïc taïo thaønh chuû yeáu töø nhaân caïnh naõo thaát vaø moät ítthò cuûa vuøng döôùi ñoài, ñöôïc vaän chuyeån ôû daïng keát hôïp vôùi moät pneurophysin. Khi xung ñoäng thaàn kinh daãn truyeàn xuoáng doïc theo sôïi töø nnaõo thaát vaø nhaân treân thò, oxytocin ñöôïc giaûi phoùng tröïc tieáp töø nhöõtrong taän cuøng thaàn kinh vaø ñöôïc haáp thu vaøo mao maïch beân caïnhneurophysin vaø oxytocin ñöôïc baøi tieát cuøng nhau, nhöng vì chuùng chæ gaéleûo vôùi nhau neân oxytocin seõ taùch ra ngay. Coøn neurophysin khoâng coù

sau khi rôøi taän cuøng thaàn kinh, neân chuùng seõ bò thoaùi hoùa. Gene maõ naèm treân nhieãm saéc theå soá 20, vò trí locus 20p13.






-15-

Hình 2.8. Söï lieân quan vuøng döôùi ñoài vôùi tuyeán yeân sau

Oxytocin laø peptide coù 9 amino acid:

Hình 2.9. Caáu taïo phaân töû oxytocin

Oxytocin coù taùc duïng gaây co cô trôn daï con, nhaát laø trong luùc coù thmaïnh laø trong luùc chuyeån daï. Nhieàu thí nghieäm chöùng toû raèng hormontraùch nhieäm moät phaàn trong cô cheá ñeû:

ÔÛ con vaät bò caét tuyeán yeân, thôøi gian ñeû keùo daøi. Löôïng oxytocin huyeát töông taêng leân trong khi ñeû, ñaëc bieät laø trong tröôùc khi thai ñöôïc ñaåy ra ngoaøi.






-16-

Söï kích thích coå daï con ôû ngöôøi coù thai taïo ra nhöõng daáu hieäu thaànñöôïc ñöa leân vuøng döôùi ñoài, gaây taêng baøi tieát oxytocin.

Oxytocin laøm taêng söï chuyeån daï baèng 2 caùch: taùc ñoäng tröïc tieáp lecung laøm co thaét; kích thích taïo ra prostaglandins ôû maøng ruïng, prostaglandinduïng taêng co thaét leân cô töû cung voán ñang chòu taùc ñoäng cuûa oxytocin.

Oxytocin ñöôïc duøng ñeå gaây chuyeån daï trong nhöõng tröôøng hôïp caànmaø chöa chuyeån daï (phaù thai, thai cheát löu), hoã trôï chuyeån daï trong tröôøco töû cung yeáu vaø thöa, phoøng vaø ñieàu trò baêng huyeát sau ñeû (do oxytmaïch cô töû cung, khi co laøm cho caùc maïch maùu xen keõ giöõa caùc thôù cô neân caàm maùu).

2.1.5. Cytokine:Nhieàu hoaït ñoäng cuûa heä mieãn dòch trong maïng töông taùc ñeå hìnhñieàu hoøa moät ñaùp öùng mieãn dòch ñöôïc thöïc hieän thoâng qua moät taäp htoá hoøa tan ñöôïc goïi chung döôùi caùi teân cytokine [4]. Trong khoaûng 3 thaäp nieân gaànñaây, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ taäp trung raát nhieàu trí tueä vaø coâng söùc ñeå thoaït ñoäng cuûa cytokine cuøng caùc tieàm naêng söû duïng chuùng trong y hocytokine khoâng nhöõng aûnh höôûng leân heä mieãn dòch maø coøn taùc ñoängtrình sinh hoïc khaùc cuûa cô theå nhö söï lieàn veát thöông, quaù trình taïo mathaønh maïch maùu môùi… Caùc nghieân cöùu öùng duïng cytokine taäp trung thesau:

Duøng cytokine ñeå kích thích caùc hoaït ñoäng sinh lyù cuûa cô theå: erythtrong ñieàu trò thieáu maùu, caùc yeáu toá kích thích taïo khuaån laïc trong ñiebaïch caàu.

Duøng cytokine trong ñieàu trò nhieãm virus, ñieån hình laø ñieàu trò vieâminterferon.

Duøng cytokine trong ñieàu trò beänh ung thö. Ñaây coù theå xem laø öùng troïng nhaát cuûa cytokine.

Ung thö (Cancer ) laø moät nhoùm caùc beänh lieân quan ñeán vieäc phaân chia teá baøomoät caùch voâ toå chöùc vaø nhöõng teá baøo ñoù coù khaû naêng xaâm laán nhöõng moâ khaùc baèngcaùch phaùt trieån tröïc tieáp vaøo moâ laân caän hoaëc di chuyeån ñeán nôi xa (di

Nguyeân nhaân gaây ung thö laø söï sai hoûng cuûa DNA, taïo neân caùc ñoät bieán ôûcaùc gene thieát yeáu ñieàu khieån quaù trình phaân baøo cuõng nhö caùc cô cheá quan troïng

khaùc. Moät hoaëc nhieàu ñoät bieán ñöôïc tích luõy laïi seõ gaây ra söï taêng sinsoaùt vaø taïo thaønh khoái u. Khoái u (tumor ) laø moät khoái moâ baát thöôøng, coù theå aùc tính



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=B%E1%BB%87nh&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ph%C3%A2n_b%C3%A0o&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%BF_b%C3%A0o

http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%B4

http://vi.wikipedia.org/wiki/DNA

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=%C4%90%E1%BB%99t_bi%E1%BA%BFn&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/Gene


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Kh%E1%BB%91i_u&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=%C3%81c_t%C3%ADnh&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=%C3%81c_t%C3%ADnh&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Kh%E1%BB%91i_u&action=edit


http://vi.wikipedia.org/wiki/Gene

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=%C4%90%E1%BB%99t_bi%E1%BA%BFn&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/DNA

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Di_c%C4%83n&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%B4

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%BF_b%C3%A0o


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=B%E1%BB%87nh&action=edit




-17-

(malignant ), töùc ung thö hoaëc laønh tính (benign), töùc khoâng ung thö. Chæ nhöõng khou aùc tính thì môùi xaâm laán moâ khaùc vaø di caên. Khaùi nieäm aùc tính hay laneân hieåu veà maët giaûi phaãu beänh hoïc nhieàu hôn laø veà khaû naêng gaây cheát ngöôøi. Thaätvaäy, moät ngöôøi coù theå soáng nhieàu naêm vôùi moät ung thö haéc toá da, trong khi moät khoáiu "laønh tính" trong hoäp soï coù theå cheøn eùp naõo gaây taøn pheá hoaëc töû vong.

Hình 2.10. Cô cheá sinh ung thö

Ung thö coù theå gaây ra nhieàu trieäu chöùng khaùc nhau phuï thuoäc vaøo vò trí, ñaëñieåm vaø khaû naêng di caên cuûa khoái u. Neáu khoâng ñöôïc chöõa trò sôùm, h

ung thö coù theå gaây töû vong. ÔÛ Myõ vaø caùc nöôùc phaùt trieån khaùc, ung thökhoaûng 25% tröôøng hôïp cheát do moïi nguyeân nhaân. Theo thoáng keâ hkhoaûng 0,5% daân soá theá giôùi ñöôïc chaån ñoaùn ung thö. Haàu heát caùc beätheå chöõa trò vaø nhieàu beänh coù theå chöõa laønh, neáu ñöôïc phaùt hieän vaø ñieàu trò sôùm.

Ngaøy nay, treân 100 caùc yeáu toá khaùc nhau trong nhoùm cytokine ñaõ ñeán. Nhöõng ñaëc ñieåm toång quaùt cuûa cytokine coù theå toùm taét nhö sau:

Baûn chaát laø caùc peptide hay glycoprotein coù troïng löôïng phaân töû

thaáp, khoaûng töø 6 ñeán 80 kilodalton. Hoaït tính raát cao, noàng ñoä coù taùc duïng sinh hoïc vaøo khoaûng 10-10ñeán 10-15M.



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=L%C3%A0nh_t%C3%ADnh&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Gi%E1%BA%A3i_ph%E1%BA%ABu_b%E1%BB%87nh_h%E1%BB%8Dc&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%E1%BA%BFt

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ung_th%C6%B0_h%E1%BA%AFc_t%E1%BB%91_da&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=H%E1%BB%99p_s%E1%BB%8D&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/N%C3%A3o

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=T%C3%A0n_ph%E1%BA%BF&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/Tri%E1%BB%87u_ch%E1%BB%A9ng

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%AD_vong

http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90i%E1%BB%81u_tr%E1%BB%8B

http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90i%E1%BB%81u_tr%E1%BB%8B

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%AD_vong

http://vi.wikipedia.org/wiki/Tri%E1%BB%87u_ch%E1%BB%A9ng

http://vi.wikipedia.org/wiki/H%C3%ACnh:Normal_cancer_cell_division_from_NIH-vi.png

http://vi.wikipedia.org/wiki/H%C3%ACnh:Cancer_requires_multiple_mutations_from_NIH-vi.png

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=T%C3%A0n_ph%E1%BA%BF&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/N%C3%A3o

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=H%E1%BB%99p_s%E1%BB%8D&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ung_th%C6%B0_h%E1%BA%AFc_t%E1%BB%91_da&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%E1%BA%BFt

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Gi%E1%BA%A3i_ph%E1%BA%ABu_b%E1%BB%87nh_h%E1%BB%8Dc&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=L%C3%A0nh_t%C3%ADnh&action=edit




-18-

Cô cheá hoaït ñoäng nhôø lieân keát vôùi caùc thuï theå ñaëc hieäu coù treânbaøo nhieàu loaïi thuoäc heä mieãn dòch hay caùc teá baøo khaùc.

Coù thôøi gian baùn huûy raát ngaén, bôûi vaäy chuû yeáu chuùng chæ coù tvaø theo caùch cuûa moät paracrine hay autocrine (töùc laø taùc ñoäng leân laân caän hay leân chính teá baøo saûn xuaát ra chuùng). Chæ moät vaøi cytduïng xa nhö TGF-, EPO, SCF, M-SCF.

Taùc duïng chuû yeáu leân söï taêng tröôûng, bieät hoùa, di ñoäng vaø chöùcteá baøo ñích.

Moät cytokine coù theå caûm öùng ñeå saûn xuaát ra caùc cytokine khaùc vHieäu quaû sinh hoïc cuûa moät nhoùm cytokine coù theå hieäp ñoàng ñoäclaäp vôùi nhau khoâng nhöõng do söï coù maët cuûa chuùng maø coøn phuï thtrình töï cuûa töøng cytokine cuõng nhö traïng thaùi cuûa teá baøo ñích.

Nhöõng ñaëc ñieåm treân cho thaáy vieäc ñieàu phoái hoaït ñoäng cuûa teá bcaùc cytokine laø raát phöùc taïp. Ñeå hieåu roõ vaø ñieàu khieån ñöôïc hoaït ñcytokine laø coâng vieäc voâ cuøng khoù khaên, coøn caàn nhieàu thôøi gian. Phaàcuûa cytokine ñaõ ñöôïc taùi toå hôïp thaønh coâng, do ñoù chuùng ta coù theå sbaèng coâng ngheä di truyeàn vôùi soá löôïng lôùn ñeå deã daøng nghieân cöùu v Baûng 2.1 giôùi thieäu toång quaùt moät soá cytokine ñaõ ñöôïc nghieân cöùu töông

Baûng 2.1. Moät soá cytokine chính vaø hoaït tính cuûa chuùng

NGUOÀN PHAÙT SINH CAÙC TAÙC DUÏNG CHÍNHIFNvaø

Ñaïi thöïc baøo, baïch caàuña nhaân trung tính vaø moätsoá teá baøo khaùc

- Taùc duïng choáng sieâu vi.- Taêng bieåu hieän khaùng nguyeân phuø hôïp m

lôùp I.- Hoaït hoùa ñaïi thöïc baøo vaø teá baøo NK.

IFN Teá baøo TH1 hoaït taùc vaøteá baøo NK hoaït taùc - Taêng bieåu hieän khaùng nguyeân phuø hôïp lôùp I, II.- Hoaït taùc ñaïi thöïc baøo, teá baøo NK, baïch c

ña nhaân trung tính.- Thuùc ñaåy mieãn dòch teá baøo.- Haïn cheá mieãn dòch dòch theå.

IL-1 vaø

Ñôn nhaân thöïc baøo - Ñoàng kích thích caùc ñôn nhaân thöïc baøbaøo T, laøm taêng sinh teá baøo B vaø saûn xukhaùng theå.






-19-

- Kích thích saûn xuaát protein pha caáp, hoaïthoùa thöïc baøo.

- Gaây vieâm vaø soát.

IL-2 Teá baøo TH1 hoaït hoùa, teá baøo Tc, NK - Taêng sinh teá baøo T ñaõ hoaït taùc.- Taêng chöùc naêng teá baøo Tc, NK.- Taêng sinh teá baøo B vaø saûn xuaát IgG2.- Taêng bieåu loä IL-2R.

IL-3 Teá baøo T - Taêng tröôûng caùc tieàn thaân teá baøo taïIL-4 Teá baøo Th2, teá baøo phì - Taêng sinh teá baøo B, saûn xuaát IgE b

khaùng nguyeân phuø hôïp moâ lôùp II.- Taêng sinh vaø taêng hoaït tính teá baøo TH2, T- Taêng tröôûng vaø taêng hoaït tính teá baøo öa

kieàm, öa acid vaø teá baøo phì.IL-5 Teá baøo TH2, teá baøo phì - Taêng tröôûng vaø taêng chöùc naêng t

acid.IL-6 Teá baøo TH2 ñaõ hoaït taùc,

ñôn nhaân thöïc baøo- Taùc duïng hieäp ñoàng vôùi IL-1 vaø TNF.- Kích thích saûn xuaát protein ôû pha caáp.- Taêng sinh teá baøo B vaø saûn xuaát khaùng th

IL-7 Teá baøo ñeäm tuûy xöông vaøteá baøo tuyeán öùc

- Taïo teá baøo doøng lympho.- Taêng chöùc naêng teá baøo Tc.

IL-8 Ñôn nhaân thöïc baøo - Hoùa öùng ñoäng baïch caàu trung tính, tIL-9 Teá baøo T nuoâi caáy - Taùc duïng taïo teá baøo maùu vaø teá b

öùc.IL-10 Teá baøo TH2, TCD 8, B,

ñaïi thöïc baøo hoaït taùc- ÖÙc cheá saûn xuaát cytokine cuûa teá baøo TH

NK, ñôn nhaân thöïc baøo, taêng sinh vaø taêng

saûn xuaát khaùng theå töø teá baøo B.- Traán aùp ñaùp öùng mieãn dòch teá baøo.- Taêng tröôûng teá baøo phì.

IL-11 Teá baøo ñeäm - Hieäp ñoàng trong taùc duïng taïo huyeátieåu caàu.

IL-12 Teá baøo B, ñôn nhaân thöïcbaøo

- Taêng sinh vaø taêng hoaït tính teá baøo Tc vabaøo NK ñaõ hoaït taùc.

- Saûn xuaát IFN.- Caûm öùng teá baøo TH1 vaø öùc cheá teá baøo






-20-

IL-13 Teá baøo TH2 - Taùc duïng töông töï IL-4.TNF Ñaïi thöïc baøo hoaït taùc vaø

moät soá teá baøo khaùc- Taùc duïng töông töï IL-1.- Huyeát khoái vaø hoaïi töû khoái u.

TNF Teá baøo TH1 hoaït taùc - Taùc duïng töông töï IL-1.- Huyeát khoái vaø hoaïi töû khoái u.

Hình 2.11. Nguoàn goác caùc teá baøo mieãn dòch

2.1.5.1. Caùc interferon (IFN):IFN ñöôïc phaùt hieän vaøo naêm 1957 do hoaït tính ngaên caûn söï nhaân l

sieâu vi ôû caùc teá baøo môùi bò nhieãm. Ngaøy nay, ngöôøi ta bieát raèng IFN lcoù nhieàu loaïi phaân töû khaùc nhau, khoâng nhöõng coù taùc ñoäng leân söï nhamaø coøn ngaên caûn söï taêng sinh cuûa moät soá teá baøo (keå caû teá baøo ung

ñaùp öùng mieãn dòch.Caên cöù vaøo ñaëc ñieåm toång quaùt, IFN chia laøm 2 type: IFN type I (chhoaït tính choáng sieâu vi) vaø IFN type II (chuû yeáu coù hoaït tính bieán ñieäu m

2.1.5.1.1. IFN type I: IFN type I coù 2 daïng chính laø IFN, IFN .

IFN ñöôïc baøi tieát chuû yeáu töø baïch caàu, coù phaân töû löôïng khokilodalton. Coù 13 daïng IFN ñaõ ñöôïc nghieân cöùu, goàm töø 156-166 amino aGene maõ hoùa IFN naèm treân nhieãm saéc theå soá 9, vò trí locus 9p22.






-21-

IFN ñöôïc tieát chuû yeáu töø nguyeân baøo sôïi ( fibroblast ), coù phaân töû löôïngkhoaûng 22,5 kilodalton, goàm khoaûng 166 amino acid. Gene maõ hoùa IFN cuõngnaèm treân nhieãm saéc theå soá 9, vò trí locus 9p22.

Hình 2.12. Phaân töû INF vaø IFN

Hình 2.13. Thöù töï amino acid trong moät soá phaân töû INF

Caû 2 daïng cuûa IFN type I coù chung moät loaïi thuï theå, caùc thuï theåbieåu loä treân haàu heát caùc loaïi teá baøo. Khi IFN type I lieân keát vôùi thuï thteá baøo seõ daãn ñeán gia taêng bieåu loä cuûa nhieàu gene, trong ñoù coù gene chôïp moâ lôùp I. Söï bieåu loä nhieàu caùc phaân töû khaùng nguyeân phuø hôïp mtaêng hieäu quaû trình dieän khaùng nguyeân laï (virus, vi khuaån) cho lympho ba+.Keát quaû cuoái cuøng laø taêng söï tieâu dieät teá baøo bò nhieãm sieâu vi qua cô






-22-

baøo cuûa lympho TCD8+. Hôn nöõa, IFN type I coøn caûm öùng ñeå teá baøo saûn xloaïi enzyme:

Proteine kinase ñaëc hieäu hoaït ñoäng baèng caùch phosphoryl hoùa yeáu(eukaryotic initiation factor 2) cuûa boä maùy dòch maõ teá baøo, do ñoù laøm ngtoång hôïp protein.

Oligoadenylate synthetase gaén vaøo vaø hoaït hoùa men endoribonuclease, nphaân caét caùc RNA maïch ñôn.

Chính nhôø caûm öùng taïo 2 enzyme treân neân IFN type I coù taùc duïnkhoâng ñaëc hieäu ñoái vôùi söï nhaân leân cuûa caùc sieâu vi. Ngoaøi ra, IFN tngöng söï taêng tröôûng nhöng khoâng laøm cheát moät soá teá baøo aùc tính valeân quaù trình bieät hoùa cuûa nhieàu loaïi teá baøo. Do ñoù, IFN type I ñöôïc öyeáu trong ñieàu trò vieâm gan sieâu vi B vaø C maõn tính.

Beänh vieâm gan coù nghóa ñôn giaûn laø gan bò söng do sieâu vi, hoùa chathuoác uoáng hoaëc thuoác chích, hoaëc nhöõng yeáu toá khaùc. Vieâm gan maõdaãn ñeán caùc bieán chöùng xô gan, suy gan vaø ung thö gan.

Hình 2.14. Tieân löôïng vieâm gan sieâu vi B

Vieâm gan sieâu vi B vaø C laø daïng beänh vieâm gan do virus vieâm gan B( Hepatitis B Virus), virus vieâm gan C ( Hepatitis C Virus) gaây ra, truyeàn nhieãm theoñöôøng maùu vaø sinh duïc. Virus vieâm gan B laø DNA virus, sôïi ñoâi, coù voû, thuoHepadnaviridae. Virus vieâm gan C laø virus sôïi ñôn RNA, coù voû, thuoäc hoï Fl



http://vi.wikipedia.org/wiki/Vi%C3%AAm_gan

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Truy%E1%BB%81n_nhi%E1%BB%85m&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%A1u

http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BB%87nh_l%C3%A2y_truy%E1%BB%81n_theo_%C4%91%C6%B0%E1%BB%9Dng_sinh_d%E1%BB%A5c

http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BB%87nh_l%C3%A2y_truy%E1%BB%81n_theo_%C4%91%C6%B0%E1%BB%9Dng_sinh_d%E1%BB%A5c

http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%A1u

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Truy%E1%BB%81n_nhi%E1%BB%85m&action=edit

http://vi.wikipedia.org/wiki/Vi%C3%AAm_gan

http://vi.wikipedia.org/wiki/H%C3%ACnh:HBV_tienluong.svg




-23-

Hình 2.15. Virus vieâm gan B vaø vieâm gan C

Hieän nay, hôn 3% daân soá theá giôùi bò nhieãm virus vieâm gan sieâu vi Ctyû ngöôøi bò nhieãm virus vieâm gan sieâu vi B. Tính rieâng taïi Vieät Nam, soá nhieãm virus vieâm gan sieâu vi B vaø vieâm gan sieâu vi C chieám ñeán hôn 25Hôn theá nöõa, theo ñaùnh giaù cuûa caùc nhaø kinh teá thì thò tröôøng cuûa döôïcvieâm gan C taêng töø 2,2 tæ USD naêm 2005 leân 4,4 tæ USD vaøo naêm 2010 vaø 8,8 tæ Uvaøo naêm 2015. Töø ñoù coù theå thaáy nhu caàu interferon, voán ñöôïc xem laøbaûn vaø duy nhaát ñöôïc söû duïng roäng raõi trong ñieàu trò beänh vieâm ganvieâm gan sieâu vi C, laø raát cao. Chæ trong naêm 2005, toång doanh thu cuûa ntheá giôùi cho saûn phaåm interferon alpha laø 2,1 tyû USD vaø interferon beta l3,8 tyû USD.

Ngoaøi ra, moät soá beänh ung thö nhö ung thö teá baøo haéc toá, ung thöcuõng ñaõ ñöôïc thöû nghieäm laâm saøng ñieàu trò vôùi IFN type I ñôn thuaàn hvôùi caùc cytokine khaùc.

2.1.5.1.2. IFN type II: Hieän chæ bieát 1 daïng cuûa IFN type II laø IFN coù caáu truùc vaø chöùc naêng kha

IFN type I. IFN coù phaân töû löôïng khoaûng 18 kilodalton vaø coù thuï theå rieâtreân nhieàu loaïi teá baøo. Gene maõ hoùa IFN naèm treân nhieãm saéc theå soá 12, vò trí lo12q15.






-24-

Hình 2.16. Phaân töû IFN

IFN ñöôïc saûn xuaát töø lympho baøo: haàu heát teá baøo TCD8+, moät soá teá baøoTCD4+ vaø teá baøo NK. Caùc loaïi teá baøo naøy chæ saûn xuaát ra khi ñöôïc hoaï

trong quaù trình hình thaønh ñaùp öùng mieãn dòch).Taùc duïng sinh hoïc chính cuûa IFN bao goàm:

Laøm taêng bieåu loä khaùng nguyeân phuø hôïp moâ lôùp I vaø do ñoù (cuõtype I) caùc teá baøo trình dieän khaùng nguyeân cho cô cheá gaây ñoäc tlympho TCD8+hieäu quaû hôn.

Laøm taêng bieåu loä khaùng nguyeân phuø hôïp moâ lôùp II khoâng nhöõngcoù chöùc naêng trình dieän khaùng nguyeân “chuyeân nghieäp” maø caû ôû m

bình thöôøng khoâng bieåu loä khaùng nguyeân moâ lôùp II nhö teá baøo noätoå chöùc lieân keát. Vì theá caùc teá baøo “khoâng chuyeân nghieäp” naøy ctrình dieän khaùng nguyeân cho lympho TCD4+ laøm khueách ñaïi ñaùp öùng mieãn dòctaïi choã.

Ngoaøi ra, IFN laø cytokine coù khaû naêng hoaït taùc maïnh nhaát ñoái vôùthöïc baøo: laøm cho khaû naêng dieät khuaån cuûa ñaïi thöïc baøo taêng leân, ñoàbaøo cuõng ñöôïc caûm öùng ñeå saûn xuaát ra caùc cytokine khaùc nhö IL-1, ITNF .

IFN coøn hoaït taùc caùc teá baøo NK, baïch caàu ña nhaân trung tính. Vôùimaïc, IFN laøm cho caùc teá baøo naøy bieåu loä caùc phaân töû baùm dính ñeå nhaân trung tính, lympho baøo deã baùm vaøo roài thoaùt maïch.

Vôùi lympho baøo, IFN khoâng laøm taêng sinh nhöng giuùp teá baøo B bieät hthuùc ñaåy hoaït tính gaây ñoäc teá baøo cuûa lympho TCD8+ . Rieâng ñoái vôùi lympho baøoTCD4+ IFN thuùc ñaåy hoaït tính cuûa nhoùm teá baøo TH1 laøm taêng ñaùp öùnteá baøo, nhöng laïi öùc cheá nhoùm teá baøo TH2 laøm giaûm ñaùp öùng mieãn d

ñoù haïn cheá ñaùp öùng quaù maãn töùc thì type I. Vì vaäy, gaàn ñaây IFN ñöôïc thöû nghieäm






-25-

nhaèm ñieàu bieán mieãn dòch: haïn cheá ñaùp öùng mieãn dòch dòch theå, taêng mieãn dòch teá baøo.

IFN khoâng coù taùc duïng choáng ung thö khi söû duïng ñôn thuaàn. Noù ñnghieân cöùu ñeå söû duïng phoái hôïp vôùi caùc loaïi thuoác sinh hoïc khaùc. Hmôùi ñöôïc duøng trong beänh daïng u haït (granulomatous disease) maõn tính do coù taùcduïng phoøng ngöøa laøm giaûm khaû naêng nhieãm truøng naëng.

2.1.5.2. Caùc interleukin (IL):2.1.5.2.1. IL-1: IL-1 ñöôïc saûn xuaát töø nhieàu loaïi teá baøo coù nhaân nhö caùc ñôn nha

lympho B, teá baøo NK, nguyeân baøo sôïi, teá baøo noäi maïc… Coù 2 daïng IL-1 vaøIL-1 . Hai daïng IL-1 naøy laø caùc polypeptide coù 151 vaø 153 amino acid. Veà chuoãi amino acid cuûa 2 daïng chæ töông ñoàng vôùi nhau khoaûng 26%, tuy nhlaïi gioáng nhau veà hoaït tính sinh hoïc vaø coù cuøng thuï theå. Phaàn lôùn catoång hôïp IL-1 khi coù caùc kích thích töø ngoaøi nhö lipopolysaccharid, caùc haGene maõ hoùa IL-1 naèm treân nhieãm saéc theå soá 2, vò trí locus 2q13.

Hình 2.17. Phaân töû IL-1 vaø IL-1

IL-1 ñoùng vai troø quan troïng trong quaù trình vieâm, gaây soát vaø giaûiprotein pha caáp (acute phase protein), söûa chöõa toå chöùc sau khi toån thöông. IL-1 c

coù caùc tính chaát kích thích mieãn dòch giuùp hoaït hoùa teá baøo lympho T vaøcytokine khaùc. Ngoaøi ra, noù coù taùc duïng kích thích vaø hieäp ñoàng vôùi catröôûng cuûa heä taïo maùu nhö yeáu toá kích thích doøng baïch caàu haït, yeáu doøng baïch caàu ñôn nhaân. Treân thöïc nghieäm, IL-1 toû ra laø yeáu toá baûochoáng laïi taùc duïng suy tuûy cuûa hoùa chaát vaø tia xaï [5].

Bôûi caùc taùc duïng noùi treân, IL-1 ñöôïc nghieân cöùu thöû nghieäm lathöông, hoã trôï cho caùc vaccine vaø duøng phoái hôïp vôùi hoùa chaát, tia xaï t

ung thö.






-26-

2.1.5.2.2. IL-2: IL-2 tröôùc ñaây ñöôïc goïi laø yeáu toá taêng tröôûng teá baøo T, ñöôïc saû

teá baøo T ñöôïc hoaït taùc. Ñaây laø moät cytokine coù taàm quan troïng ñaëc bieaûnh höôûng roäng lôùn leân heä thoáng mieãn dòch neân ñöôïc taäp trung nghieân

IL-2 laø moät polypeptide goàm 133 amino acid, coù phaân töû löôïng kilodalton. Bình thöôøng lympho T khoâng saûn xuaát IL-2 nhöng khi chuùng ñötaùc bôûi khaùng nguyeân ñaëc hieäu trình dieän qua phaân töû nhoùm phuø hôïñoàng kích thích khaùc hoaëc ñöôïc hoaït taùc bôûi caùc chaát gaây phaân b( polyclonal mitogens) thì IL-2 ñöôïc saûn xuaát vaø tieát ra ngoaøi. Ñænh cuûa söï sñaït ñöôïc khoaûng 12 giôø sau roài giaûm ñi nhanh choùng. Quaàn theå lympho s2 chuû yeáu laø TCD4+, nhöng TCD8+ vaø teá baøo NK cuõng coù theå saûn xuaát moät

nhoû IL-2. Gene maõ hoùa IL-2 naèm treân nhieãm saéc theå soá 4, vò trí locus 4q

Hình 2.18. Phaân töû IL-2

Taùc ñoäng cuûa IL-2 leân teá baøo T vaø caùc teá baøo khaùc: Teá baøo TCD4+ khi ñöôïc hoaït taùc seõ saûn xuaát IL-2, ñoàng thôøi bieåu loä lethuï theå cuûa IL-2. Khi coù söï keát hôïp giöõa IL-2 vaø thuï theå aùi löïc choaït tính protein tyrosin kinase taêng leân töùc thì, daãn ñeán söï hoaït taùcsinh teá baøo. Caùc teá baøo TCD8+ töï noù khoâng saûn xuaát ñuû IL-2 ñeå töï hoaït ta

caàn coù theâm IL-2 töø teá baøo TCD4+.

Khi ñöôïc hoaït taùc, teá baøo NK taêng hoaït tính gaây ñoäc teá baøo. Taêng sinh vaø bieät hoùa teá baøo B ñeå saûn xuaát ra khaùng theå, hoaït taùthöïc baøo, thuùc ñaåy khaû naêng dieät khuaån vaø gaây ñoäc teá baøo.

Taùc ñoäng leân caùc teá baøo treân ñeå saûn xuaát caùc cytokine khaùc nhö , TNF,IFN , IL-3, IL-4…

Vôùi caùc taùc ñoäng treân, IL-2 ñöôïc söû duïng ñôn thuaàn trong ñieàu hoaëc keát hôïp vôùi caùc vaccine choáng ung thö. Treân caùc thöû nghieäm laâm






-27-

khi duøng ñôn thuaàn coù taùc duïng choáng ung thö bieåu moâ teá baøo thaän vatoá. Taùc duïng choáng u cao nhaát khi ñieàu trò IL-2 lieàu cao.

2.1.5.2.3. IL-6:

IL-6 ñöôïc saûn xuaát töø nhieàu loaïi teá baøo nhö nguyeân baøo sôïi, ñônbaøo, lympho baøo, teá baøo bieåu moâ… Noù coù taùc duïng leân söï tröôûng thabaøo B (neân coøn goïi laø yeáu toá taêng tröôûng töông baøo), leân söï bieät hoùgaây ñoäc. IL-6 laø cytokine chính caûm öùng teá baøo gan saûn xuaát ra caùc pronhö C reactive protein, haptoglobin, fibrinogen… Gene maõ hoùa IL-6 naèm nhieãm saéc theå soá 7, vò trí locus 7p15.3. Cuõng nhö IL-1 vaø TNF, IL-6 laø mosoát noäi sinh, coù taùc duïng hieäp löïc vôùi 2 cytokine treân.

Hình 2.19. Phaân töû IL-6 Ngoaøi ra, caùc interleukin khaùc cuõng ñang ñöôïc nghieân cöùu söû duïng

hoaëc phoái hôïp vôùi caùc thuoác khaùc trong ñieàu trò ung thö.

2.1.5.3. Yeáu toá hoaïi töû khoái u (Tumor Necrosis Factor-TNF):IL-1 vaø TNF laø 2 cytokine coù caáu truùc khaùc bieät nhau vaø coù thu

song veà taùc duïng sinh hoïc laïi gioáng nhau ôû nhieàu ñieåm. Coù theå thaáy snaøy qua baûng 2.2 sau.

Baûng 2.2. Taùc ñoäng cuûa IL-1 vaø TNF leân moät soá teá baøo ñích

Teá baøo ñích Taùc duïng IL-1 TNF Lympho T Ñoàng kích thích hoaït taùc.

Caûm öùng taïo thuï theå IL-2. Caûm öùng taïo cytokine.

+++

+++

Lympho B Thuùc ñaåy taêng sinh. + + Ñôn nhaânthöïc baøo

Hoùa öùng ñoäng. Hoaït taùc tieàm naêng gaây ñoäc teá baøo.

-+

++






-28-

Caûm öùng taïo prostaglandin, IL-1, IL-6,GM-CSF.

+ +

Baïch caàu

trung tính

Hoaït taùc taïo cytokine. + +

Teá baøonoäi maïc

Taêng bieåu loä phaân töû ICAM-1. Caûm öùng taïo cytokine vaø bieåu loänhoùm phuø hôïp moâ lôùp I.

Caûm öùng phaân baøo vaø taïo vi maïch moâ.

++

+

++

+

ÔÛ ngöôøi coù 2 daïng TNF coù caáu truùc khaùc nhau laø TNF vaø TNF. TNFñöôïc saûn xuaát chuû yeáu töø caùc ñôn nhaân thöïc baøo ñöôïc hoaït taùc, coøn ñöôïc saûn

xuaát töø caùc lympho T ñöôïc hoaït taùc. TNF vaø TNF ñöôïc maõ hoùa bôûi 2 gene khaùcnhau song ñeàu naèm trong vuøng gene cuûa nhoùm phuø hôïp moâ chính (ôû nghôïp gene HLA). Caû 2 daïng TNF coù chung moät thuï theå neân taùc duïng singioáng nhau. Vì theá, khi noùi ñeán TNF, ngöôøi ta thöôøng ngaàm hieåu laø TNF.

Hình 2.20. Phaân töû TNF

TNF coù khoaûng 212 amino acid. Gene maõ hoùa TNF naèm treân nhieãm saéctheå soá 6, vò trí locus 6p21.3. TNF coù theå gaây ñoäc tröïc tieáp cho moät soá teá baøxuaát huyeát vaø hoaïi töû khoái u. TNF khoâng coù hoaït tính choáng ung thö, coù leõ do ñoäc tính, chuû yeáu laø haï huyeát aùp, ñaõ laøm giôùi haïn lieàu. Gaàn ñaây, TNthaønh coâng trong ñieàu trò ung thö haéc toá taùi phaùt ôû da.

2.1.5.4. Yeáu toá kích thích taïo khuaån laïc (Colony Stimulating Factor-CSF):Ñaây laø caùc cytokine kích thích caùc teá baøo maàm ña naêng hay caùc t

dueä taïo ra nhieàu doøng teá baøo vôùi soá löôïng lôùn nhö hoàng caàu, tieåu caàtrung tính, baïch caàu öa acid, baïch caàu öa kieàm. Vì theá CSF coøn goïi laø ye






-29-

tröôûng heä taïo maùu. Döïa vaøo ñaëc ñieåm kích thích doøng teá baøo naøo mateân goïi töông öùng. Taát caû caùc yeáu toá kích thích taïo khuaån laïc CSF ñeàtöông öùng treân caùc teá baøo ñích rieâng bieät, song keát quaû taùc ñoäng cuoáilaëp vôùi nhau treân nhieàu phöông dieän.

2.1.5.4.1. Erythropoietin (EPO): Ñaây laø moät glycoprotein coù phaân töû löôïng 38 kilodalton, ñöôïc saûn x

thaän, coøn laïi ôû gan vaø caùc moâ khaùc. Gene maõ hoùa erythropoietin naèmsaéc theå soá 7, vò trí locus 7q22.1. Khi cô theå thieáu maùu hay thieáu oxy, noùphöùc hôïp caän tieåu caàu baøi tieát erythrogenin. Erythrogenin hoaït ñoäng enzyme, taùc duïng leân moät globulin coù saün trong huyeát töông do gan saûn xthaønh chaát kích thích sinh hoàng caàu erythropoietin. Chaát naøy theo maùuxöông, taùc ñoäng treân nhöõng teá baøo goác nhaïy vôùi erythropoietin trong bieán teá baøo naøy thaønh tieàn thaân doøng hoàng caàu. Roài teá baøo naøy trañoaïn trung gian ñeå chuyeån thaønh hoàng caàu tröôûng thaønh ra maùu ngoaïi bnaøy coù theå laøm giaûm nhu caàu truyeàn maùu, ñöôïc nghieân cöùu vôùi caùtrong caùc tình traïng suy tuûy.

Hình 2.21. Phaân töû EPO

Ngaøy nay, ngöôøi ta coù theå saûn xuaát erythropoietin ngöôøi baèng kó thhôïp DNA. Ñaây laø moät cuoäc caùch maïng lôùn ñeå kieåm soaùt tình traïng nhöõng ngöôøi suy thaän maïn ñang chuaån bò ñöôïc gheùp thaän.

2.1.5.4.2. Yeáu toák ích th ích doøng baïch caàu : GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor ): ñöôïc saûn xuaátbôûi caùc teá baøo lympho T, teá baøo noäi maïc, teá baøo sôïi, teá baøo bieåuNoù kích thích taïo baïch caàu haït vaø baïch caàu ñôn nhaân. Gene maõ hoùnaèm treân nhieãm saéc theå soá 5, vò trí locus 5q31.1.






-30-

G-CSF (Gralulocyte Colony Stimulating Factor ): ñöôïc saûn xuaát bôûi baïch caàuñôn nhaân, ñaïi thöïc baøo, teá baøo noäi maïc, teá baøo sôïi. Noù kích thích thaït. Gene maõ hoùa G-CSF naèm treân nhieãm saéc theå soá 17, vò trí locus 1

M-CSF ( Macrophage Colony Stimulating Factor ): ñöôïc saûn xuaát bôûi baïch caàuñôn nhaân, ñaïi thöïc baøo, teá baøo noäi maïc, teá baøo sôïi, coát baøo. Noùbaïch caàu ñôn nhaân. Gene maõ hoùa M-CSF naèm treân nhieãm saéc theå locus 1p21.

Yeáu toá kích thích doøng baïch caàu giöõ vai troø quan troïng trong thöïc tiethoâng qua caùc taùc ñoäng:

Kích thích teá baøo goác chaïy ra maùu ngoaïi vi, laøm taêng thu hoaïch caùctrong moãi laàn gaïn loïc, do vaäy laøm giaûm soá laàn gaïn vaø giaûm thôøiñeå laáy ñuû teá baøo goác ngoaïi vi. Teá baøo goác naøy seõ ñöôïc gheùp vanhaèm phuïc hoài toå chöùc taïo maùu sau khi ñieàu trò ung thö baèng hoùa ch

Kích thích sinh baïch caàu haït trong tröôøng hôïp giaûm sinh baïch caàu . Kích thích sinh baïch caàu sau khi gheùp tuûy vaø hoùa trò baèng caùc thuoác

Hình 2.22. Phaân töû GM-CSF vaø G-CSF

2.1.5.4.3. Thrombopoietin (TPO):

Ñaây laø yeáu toá kích thích taïo tieåu caàu. Thrompoietin coù phaân töûkilodalton, ñöôïc saûn xuaát bôûi teá baøo gan, teá baøo oáng thaän, ngoaøi ra chutaïo ra ôû tuûy xöông, laùch, cô. ÔÛ ngöôøi, thrompoietin ñöôïc saûn xuaát chuGene maõ hoùa TPO naèm treân nhieãm saéc theå soá 3, vò trí locus 3q27. Khi löôïng TPO giaûm raát thaáp hoaëc khoâng tìm thaáy, ñöa ñeán tình traïng giaûmYeáu toá naøy ñaõ ñöôïc phaân laäp vaø ñöa vaøo caùc thöû nghieäm laâm saøngñieàu trò giaûm tieåu caàu.






-31-

Hình 2.23. Thöù töï amino acid trong phaân töû EPO vaø TPO

2.1.5.4.4 . Caùc yeáu toákhaùc :

IL-3 cuõng ñöôïc xem laø “CSF ña naêng” (multi CSF ) vì noù coù khaû naêng kích thíchsaûn sinh moïi doøng teá baøo töø teá baøo maàm ña naêng. Caùc taùc duïnGM-CSF treân caùc teá baøo naøy coù theå taêng leân nhôø IL-1 vaø IL-6. Trcoù theå phoái hôïp caùc chaát treân ñeå taêng hieäu quaû ñieàu trò.

SCF (Stem Cell Factor ) laø moät yeáu toá môùi ñöôïc phaùt hieän gaàn ñaây. Nduïng maïnh nhaát so vôùi caùc CSF treân caû doøng teá baøo tuûy vaø teá bavaäy maø laøm taêng moïi loaïi teá baøo coù nguoàn goác töø tuûy xöông.

2.1.6. Khaùng theå:Khaùng theå ( Antibody) laø caùc phaân töû immunoglobulin (coù baûn

glycoprotein), do caùc teá baøo lympho B cuõng nhö caùc töông baøo (bieät hoùaB) tieát ra ñeå heä mieãn dòch nhaän bieát vaø voâ hieäu hoùa caùc taùc nhaân laïvi khuaån hoaëc virus. Moãi khaùng theå chæ coù theå nhaän dieän moät epitope kduy nhaát [4].

2.1.6.1. Caáu truùc ñieån hình:






-32-

Phaân töû khaùng theå caáu taïo töø 4 chuoãi polypeptide, goàm hai chuoãi nchuoãi nheï lieân keát vôùi nhau bôûi caùc caàu noái disulfide. Moät phaàn caáuchuoãi laø coá ñònh nhöng phaàn ñaàu cuûa hai "caùnh tay" chöõ Y laïi bieán ñkhaùng theå khaùc nhau, ñeå taïo neân caùc vò trí keát hôïp coù khaû naêng phaûvôùi caùc khaùng nguyeân töông öùng. Ñieàu naøy töông töï nhö moät enzyme tcô chaát cuûa noù. Coù theå taïm so saùnh söï ñaëc hieäu cuûa phaûn öùng khnguyeân vôùi oå khoùa vaø chìa khoùa.

Phaân töû khaùng theå cuûa ngöôøi chæ coù 2 loaïi chuoãi nheï laø vaø ; trong khi coùtôùi 5 loaïi chuoãi naëng laø , , , vaø . Chính söï khaùc nhau veà chuoãi naëng laøm ccaùc lôùp khaùng theå (isotype) coù söï khaùc nhau veà thuoäc tính sinh hoïc. Ngoaøi rachuù yù laø moãi moät phaân töû khaùng theå bao giôø cuõng chæ goàm 2 chuoãivaø 2 chuoãi nheï gioáng nhau.

Hình 2.24. Caáu truùc 1 phaân töû khaùng theå

Caùc caàu noái disulfide trong phaân töû khaùng theå phaân boá caùch nhañeàu (khoaûng 100-110 amino acid), laøm cho chuoãi polypeptide cuoän laïi thaønlaø domain. Caùc domain haèng ñònh (constant ) ñaëc tröng bôûi caùc chuoãi amino acid khagioáng nhau giöõa caùc khaùng theå. Domain haèng ñònh cuûa chuoãi nheï kyù hiL. Caùcchuoãi naëng chöùa 3 hoaëc 4 domain haèng ñònh, tuøy theo lôùp khaùng theå CH1, CH2, CH3vaø CH4. Caùc domain haèng ñònh khoâng coù vai troø nhaän dieän khaùng nguylaøm nhieäm vuï caàu noái vôùi caùc teá baøo mieãn dòch cuõng nhö caùc boå th"chaân" cuûa chöõ Y coøn ñöôïc goïi laø Fc ( fragment cristallisable- phaàn hoaït ñoäng sinhhoïc cuûa khaùng theå)

Caùc domain bieán thieân (variable) naèm ôû hai ñaàu "caùnh tay" cuûa chöõ Y. Söïhôïp giöõa 1 domain bieán thieân treân chuoãi naëng (VH) vaø 1 domain bieán thieân treân






-33-

chuoãi nheï (VL) taïo neân vò trí nhaän dieän khaùng nguyeân (coøn goïi laø paratovaäy, moãi immunoglobulin coù hai vò trí gaén khaùng nguyeân. Hai "caùnh tay" coøn goïi laø Fab ( fragment antigen binding- phaàn nhaän bieát khaùng nguyeân). Domainkhaùng nguyeân nôi gaén vaøo khaùng theå goïi laø epitope. Caùc domain sôû dóthieân vì chuùng khaùc nhau raát nhieàu giöõa caùc khaùng theå. Chính söï bieán naøy giuùp cho heä thoáng caùc khaùng theå nhaän bieát ñöôïc nhieàu loaïi taùc nkhaùc nhau.

Hình 2.25. Sô ñoà caùc domain cuûa 1 phaân töû khaùng theå

2.1.6.2. Tính ñaëc hieäu cuûa phaûn öùng khaùng theå-khaùng nguyeân:Paul Erhlich, vaøo ñaàu theá kyû 20, ñaõ ñeà xuaát raèng caùc khaùng theå ñ

saün trong cô theå, ñoäc laäp vôùi moïi kích thích töø beân ngoaøi. Vai troø cuûa klaø ñaåy maïnh söï saûn xuaát khaùng theå ñaëc hieäu töông öùng.

Moâ hình cuûa Erhlich ñaõ ñöôïc chöùng minh laø ñuùng maëc duø ôû thngöôøi ta chöa phaân bieät ñöôïc 2 loaïi lympho B vaø lympho T. Cô theå ñaõ chukhaùng theå cho haàu nhö moïi "keû xaâm nhaäp" tieàm naêng.

Trong quaù trình phaùt trieån vaø bieät hoùa caùc teá baøo lympho B, coù scaùc gene maõ hoùa immunoglobulin. Trong moãi teá baøo lympho B, toå hôïpphaàn bieán thieân chæ xaûy ra 1 laàn seõ giöõ nguyeân ñeán heát ñôøi soáng cuûvöôït qua ñöôïc caùc cô cheá choïn loïc, lympho B seõ tieáp tuïc soáng:

Lympho B seõ toàn taïi ôû daïng naive cho ñeán khi gaëp khaùng nguyeân töô Neáu khoâng gaëp khaùng nguyeân, lympho B hoaït ñoäng caàm chöøng naive ñeán heát ñôøi cuûa noù.

Khi gaëp khaùng nguyeân ñaëc hieäu, vôùi söï trôï giuùp cuûa lympho THcytokine, lympho B seõ phaân chia thaønh doøng. Moät soá bieät hoùa thaønhnhaèm saûn xuaát khaùng theå haøng loaït, moät soá khaùc seõ trôû thaønh teghi nhôù vaø tieáp tuïc phaân baøo, duy trì söï toàn taïi cuûa doøng teá baøo ñ






-34-

Caùc teá baøo B ghi nhôù naøy seõ giuùp cô theå khi tieáp xuùc laïi vôùi ktöông öùng seõ coù ñaùp öùng nhanh, maïnh vaø hieäu quaû hôn. Öu ñieåm nöùng mieãn dòch ñaëc hieäu laø nguyeân taéc cuûa vieäc ngöøa beänh baèng v

Lieân keát giöõa khaùng theå vaø khaùng nguyeân, töông töï nhö giöõa enzchaát, coù tính thuaän nghòch. Lieân keát maïnh hay yeáu tuøy vaøo soá löôïng liehieäu giöõa vuøng nhaän dieän khaùng nguyeân treân khaùng theå vaø caáu truùöùng.

AÙi löïc cuûa khaùng theå ñoái vôùi khaùng nguyeân laø hôïp löïc cuûa cayeáu khoâng ñoàng hoùa trò (lieân keát hydro, lieân keát tónh ñieän, lieân keát Valieân keát kî nöôùc). Caùc löïc lieân keát yeáu naøy chæ coù taùc duïng trong moädo ñoù söï ñaëc hieäu (hay tính chaát boå sung) trong caáu truùc khoâng gian 3 cvuøng phaân töû coù vai troø quyeát ñònh ñoái vôùi aùi löïc cuûa khaùng theå vôùi

Moät khaùng theå nhaát ñònh coù theå keát hôïp vôùi moät hay nhieàu epihình khoâng gian töông töï ôû moät möùc ñoä naøo ñoù vaø ngöôïc laïi, moät eptheå keát hôïp vôùi moät hay nhieàu vò trí keát hôïp khaùng nguyeân cuûa caùc ptheå khaùc nhau. Tuy nhieân trong nhöõng tröôøng hôïp nhö vaäy, löïc lieân keát thay ñoåi tuøy theo caáu hình boå tuùc cuûa chuùng phuø hôïp vôùi nhau cao hahình boå tuùc caøng phuø hôïp cao thì löïc lieân keát caøng maïnh vaø ngöôïc laïi.

2.1.6.3. Vai troø cuûa khaùng theå:Trong moät ñaùp öùng mieãn dòch, khaùng theå coù 3 chöùc naêng chín

khaùng nguyeân, kích hoaït heä thoáng boå theå vaø huy ñoäng caùc teá baøo mieã

2.1.6 .3.1. L ieân keát vôùi k h aùng n guyeân : Caùc immunoglobulin coù khaû naêng nhaän dieän vaø gaén moät caùch ña

khaùng nguyeân töông öùng nhôø caùc domain bieán thieân. Moät thí duï ñeå micuûa khaùng theå laø trong phaûn öùng choáng ñoäc toá vi khuaån. Khaùng theå gñoù trung hoøa ñoäc toá, ngaên ngöøa söï baùm dính cuûa caùc ñoäc toá treân leâbaøo. Nhôø vaäy, teá baøo cô theå traùnh ñöôïc caùc roái loaïn do caùc ñoäc toá ño






-35-

Hình 2.26. Cô cheá choáng ñoäc toá cuûa khaùng theå

Töông töï nhö vaäy, nhieàu virus vaø vi khuaån chæ gaây beänh khi baùm caùc teá baøo cô theå. Vi khuaån söû duïng caùc phaân töû baùm dính laø adhesinhöõu caùc protein coá ñònh treân lôùp voû ngoaøi. Caùc khaùng theå khaùng-adheprotein capside virus seõ ngaên chaën caùc vi sinh vaät naøy gaén vaøo caùc teá bchuùng.

2.1 .6.3.2. Ho aït hoùa boåth eå: Moät trong nhöõng cô cheá baûo veä cô theå cuûa khaùng theå laø vieäc ho

boå theå. Boå theå laø taäp hôïp caùc protein huyeát töông khi ñöôïc hoaït hoùa sevi khuaån xaâm haïi baèng caùch ñuïc thuûng maøng teá baøo vi khuaån, taïo ñhieän töôïng thöïc baøo, hieän töôïng mieãn dòch keát dính, hoaït tính phaûn veä thích caùc phaân töû hoùa höôùng ñoäng.

2.1 .6.3.3. Hoaït h oùa c aùc teáb aøo m ieãn dòch : Sau khi gaén vaøo khaùng nguyeân ôû ñaàu bieán thieân (Fab), khaùng theå

keát vôùi caùc teá baøo mieãn dòch ôû ñaàu haèng ñònh (Fc). Nhöõng töông taquan troïng ñaëc bieät trong ñaùp öùng mieãn dòch. Nhö vaäy, caùc khaùng theå gakhuaån coù theå lieân keát vôùi moät ñaïi thöïc baøo vaø khôûi ñoäng hieän töôïnteá baøo NK coù theå thöïc hieän chöùc naêng ñoäc teá baøo vaø ly giaûi ca

opsonine hoùa bôûi caùc khaùng theå. 2.1.6.4. Caùc lôùp khaùng theå (isotype):

Caùc khaùng theå ñöôïc phaân thaønh 5 lôùp hay isotype, tuøy theo caáu tadomain haèng ñònh cuûa caùc chuoãi naëng.

Ngoaøi ra, caùc dò bieät tinh teá hôn cuõng toàn taïi beân trong moät soá lôùÔÛ ngöôøi, coù 4 loaïi IgG (IgG1, IgG2, IgG3 vaø IgG4) vaø 2 loaïi IgA (IgA1 vaø

Ñeå tieâu dieät taùc nhaân gaây beänh bò gaén khaùng theå, nhieàu baïch caà

FcR (thuï theå cuûa Fc) beà maët töông öùng vôùi töøng lôùp IgG, IgA, IgM, IgE v






-36-

Baûng 2.3. Caùc thuoäc tính cô baûn cuûa caùc lôùp khaùng theå

IgG IgA IgM IgE IgDChuoãi naëng

Phaân töû löôïng(kilodalton)

150 160 900 200 180

Chuoãi phuï 0 J vaø S J 0 0Tæ leä trong toångimmunoglobulin

(%)80 13 6 < 1 < 1

Phaân boá Noäi maïch,

dòch moâ

Noäi maïch,

dòch tieát

Noäi maïch Baïch caàu

öa kieàm, teá baøo phì

Beà maët

lympho B

Qua nhau thai ++ 0 0 0 0Coù trong söõa + ++ 0 0 0

Hoaït hoùa boå theå + 0 +++ 0 0Gaén leân thuï theå

Fc++ 0 0 ++ 0

Khaû naêng ngöngkeát + + +++ 0 0

Hoaït tính choángsieâu vi

+++ +++ ++ 0 0

Hoaït tính choángvi khuaån

+++ ++ +++ 0 0

Hoaït tính choángñoäc toá

+++ 0 0 0 0

Hoaït tính gaây dòöùng

+ 0 0 +++ 0

2.1.6.4.1. IgG : Ñaây laø moät monomer phoå bieán nhaát trong huyeát töông, dòch gian b

naõo tuûy… , coù 4 döôùi lôùp IgG1 (66%), IgG2 (23%), IgG3 (7%), IgG4 (4%isotype duy nhaát coù theå xuyeân qua nhau thai, qua ñoù baûo veä treû trong nhöñaàu tieân sau khi sinh khi heä mieãn dòch cuûa treû chöa phaùt trieån. Caùc chöhoïc cuûa IgG:






-37-

Ngöng keát caùc khaùng nguyeân ña hoùa trò ôû daïng haït hoaëc gaây keát tunguyeân ôû daïng hoøa tan, nhôø ñoù giuùp thöïc baøo thaâu toùm caùc khaùtan höõu hieäu hôn.

Khi IgG lieân keát vôùi epitope ôû phaàn Fab thì phaàn Fc trôû thaønh coùopsonine hoùa. Luùc naøy, phaàn Fc gaén vaøo thuï theå Fc treân beà maët ñôbaøo, baïch caàu trung tính, nhôø ñoù caùc khaùng nguyeân bò thöïc baøo hieä

Gaây ñoäc teá baøo phuï thuoäc khaùng theå ( Antibody Dependent Cell Mediated Cytotoxicity-ADCC ): vi sinh vaät hay teá baøo ung thö coù epitope ñaëc hieäukhaùng theå lôùp IgG seõ ñöôïc phaàn Fab nhaän dieän, phaàn Fc seõ ñöôïcNK coù thuï theå Fc nhaän bieát. Teá baøo NK seõ cho caùc tín hieäu gaây huûvaät hay teá baøo ung thö. Khaùc vôùi hieän töôïng opsonine hoùa, trong cô ckhoâng xaûy ra hieän töôïng thöïc baøo.

Hoaït hoùa boå theå (tröø döôùi lôùp IgG4). Trung hoøa ñoäc toá baèng caùch phong toûa vò trí hoaït ñoäng, gaây baát hoñoäc toá trôû neân voâ haïi. IgG laø lôùp khaùng theå coù khaû naêng toát trung hoøa moät soá ñoäc toá nhö noïc raén, noïc boø caïp, ñoäc toá uoán vaùn

Baát ñoäng vi khuaån do khaùng theå ñaëc hieäu vôùi caùc roi hay loâng cuNgoaøi ra IgG coøn coù theå phong toûa vieäc baùm cuûa sieâu vi leân caùc

hieäu. Töø ñoù haïn cheá söï xaâm nhaäp vaø taïo ñieàu kieän tieâu dieät vi khcô cheá khaùc.

2.1.6.4.2. IgA : IgA coù chuû yeáu trong caùc dòch tieát nhö nöôùc boït, dòch nhaày, moà h

söõa…, coù 2 daïng laø IgA1 (90%) vaø IgA2 (10%). Khaùc vôùi IgA1, caùc chunheï cuûa IgA2 khoâng noái vôùi nhau baèng caùc caàu disulfide maø baèng ckhoâng ñoàng hoùa trò.

Trong huyeát töông, IgA chuû yeáu ôû daïng monomer vaø chöùc naêng cchöa ñöôïc bieát roõ. Trong dòch tieát, noù ôû daïng dimer nhôø söï noái keát bômoät chuoãi polypeptide coù phaân töû löôïng 15 kilodalton, giaøu cysteine, do ttieát ra) vaø chuoãi S (secretory component, coù phaân töû löôïng 70 kilodalton, xuaát töø caùc teá baøo nieâm maïc). Chuoãi S coù chöùc naêng gaén vaø vaän loøng cuøng vôùi dòch tieát, ñoàng thôøi baûo veä phaân töû IgA khoâng bò phmen coù trong dòch tieát. Ngoaøi ra IgA coøn toàn taïi döôùi daïng trimer vaø tet

Ñaây laø lôùp khaùng theå coù vai troø chính trong vieäc baûo veä beà maët duï, tröïc khuaån taû chæ baùm vaøo thuï theå ôû nieâm maïc ruoät vaø giaûi ph






-38-

khoâng thaâm nhaäp vaøo teá baøo. Khaùng theå ñaëc hieäu lôùp IgA baûo veä btoûa ñaëc hieäu leân caáu truùc cuûa tröïc khuaån taû laøm chuùng maát khaû naê

IgA khoâng hoaït hoùa boå theå nhöng vôùi söï coù maët cuûa lysozyme cmoät soá vi khuaån gram aâm. Ngoaøi ra, IgA coù theå ngaên caûn söï xaâm nhavaøo caùc teá baøo ñích cuõng nhö coù khaû naêng ngöng keát virus xaâm nhanieâm maïc.

2.1.6.4.3. IgM : Bình thöôøng trong huyeát töông IgM ôû daïng pentamer nhôø caùc ca

disulfide giöõa caùc chuoãi naëng vaø moät chuoãi J. Vì laø moät phaân töû khoâng coù khaû naêng xuyeân thaám, noù haàu nhö chæ coù maët trong loøngthuyeát, do coù 5 ñôn vò phaân töû neân IgM coù 10 vò trí keát hôïp khaùng ngtreân thöïc teá, do vò trí khoâng gian chæ cho pheùp toái ña 5 vò trí keát hôïp khmaø thoâi.

ÔÛ caùc teá baøo doøng maàm, maûng gene maõ hoùa vuøng haèng ñònh cuûa chuoãinaëng ñöôïc giaûi maõ tröôùc caùc maûng khaùc. Do ñoù, IgM laø immunoglobuñöôïc saûn xuaát bôûi teá baøo B tröôûng thaønh.

Chöùc naêng chính cuûa IgM: Laø lôùp khaùng nguyeân coù khaû naêng ngöng keát maïnh nhaát do coù n

cho pheùp taïo neân caùc caàu noái giöõa caùc epitope ôû xa nhau, thuoäc nguyeân khaùc nhau cuõng nhö caùc khaùng nguyeân coù caáu taïo epitope lapolysaccharide).

Ngöng keát toá töï nhieân cuûa nhoùm maùu ABO. IgM ñöôïc goïi laø khnhieân vì noù toàn taïi trong maùu ngay caû khi khoâng coù baèng chöùng vevôùi khaùng nguyeân. Moät ngöôøi thuoäc nhoùm maùu O seõ coù saün tronkhaùng theå thuoäc lôùp IgM choáng khaùng nguyeân nhoùm maùu A vaø B…

Do ôû daïng pentamer neân chæ moät IgM vôùi toái thieåu 2 phaàn Fab keepitope töông öùng laø ñaõ coù theå hoaït hoùa boå theå. Vì theá, IgM laø lôcoù khaû naêng hoaït hoùa boå theå maïnh nhaát, coù hieäu quaû cao trong vievi khuaån hay teá baøo ñích thoâng qua boå theå.

Khaû naêng trung hoøa ñoäc toá, phong toûa vi khuaån hay virus khoâng hieäu

2.1.6.4.4. IgE: IgE coù caáu truùc monomer, deã bò huûy bôûi nhieät. Chuoãi naëng coù thuï theå aùi löïc

cao treân beà maët baïch caàu öa kieàm vaø teá baøo phì, do ñoù chuùng coù matreân teá baøo naøy.






-39-

IgE thöôøng taêng cao trong tröôøng hôïp nhieãm kyù sinh truøng nhö giun nhieân IgE laø khaùng theå chính trong beänh lyù quaù maãn type I hay dò öùnkhaùng nguyeân töông öùng coù theå lieân keát cheùo, IgE seõ hoaït taùc teá baøo,hoùa chaát trung gian nhö histamine, heparine… taïo ra tình traïng quaù maãn.

2.1.6.4.5. IgD : IgD laø loaïi immunoglobulin monomer chieám chöa ñaày 1% treân maøng

lympho B. Chöùc naêng cuûa IgD chöa ñöôïc hieåu bieát ñaày ñuû, noù thöôønñoàng thôøi vôùi IgM vaø ñöôïc xem nhö moät chæ daáu (marker ) cuûa teá baøo B tröôûng thaønhnhöng chöa tieáp xuùc khaùng nguyeân. Coù leõ noù tham gia vaøo cô cheá bieäbaøo B thaønh töông baøo vaø teá baøo B ghi nhôù.

Hình 2.27. Caáu truùc caùc lôùp khaùng theå

2.1.6.5. Söï toång hôïp khaùng theå:Caùc taùc nhaân gaây beänh laø muoân hình vaïn traïng, do ñoù soá löôïn

nguyeân maø cô theå coù theå gaëp phaûi laø raát lôùn. Moãi lympho B laïi chæ coloaïi khaùng theå ñaëc hieäu ñoái vôùi 1 epitope khaùng nguyeân nhaát ñònh, do

coù haøng trieäu lympho B khaùc nhau. Soá löôïng naøy vöôït quaù soá löôïng gngöôøi. Vaäy caùch hieåu coå xöa veà moät gene saûn xuaát moät khaùng theå khvöõng. Naêm 1976, Susumu Tonegawa ñaõ khaùm phaù raèng cô theå duøng côhôïp gene ñeå taïo ra soá khaùng theå ñaëc hieäu khoång loà noùi treân. Tonegawagiaûi Nobel veà Y hoïc vaø Sinh hoïc naêm 1987 cho khaùm phaù naøy.

Heä mieãn dòch ngöôøi coù khaû naêng saûn xuaát ra treân 1012 loaïi khaùng theå ñaëchieäu khaùc nhau. Coù nhieàu gene maõ hoùa cho phaàn bieán thieân immunoglobulin, chuùng taùi toå hôïp vôùi nhau moät caùch ngaãu nhieân ñeå taphaåm lôùn hôn nhieàu so vôùi soá gen voán coù. Trong moãi teá baøo lympho B






-40-

hôïp duy nhaát cuûa phaàn haèng ñònh moãi chuoãi (naëng vaø nheï) ñöôïc thaønhthay ñoåi suoát cuoäc ñôøi noù.

2.1.6.5.1. Toåchöùc , t aùi toåhôïp vaø g iaûi m aõ caùc gen e chuoãi

naëng : Phaàn haèng ñònh C cuûa chuoãi naëng ñöôïc maõ hoùa bôûi 1 trong soá 9 glôùp (isotype) khaùng theå: µ cho IgM; 1 - 4 cho IgG1 - IgG4; 1, 2 cho IgA1 vaøIgA2; cho IgD vaø cho IgE.

Caùc gene maõ hoùa chuoãi naëng cuûa khaùng theå naèm treân nhieãm saécnhöõng teá baøo maàm, chuùng saép xeáp thaønh 4 vuøng taùch bieät: caùc aminocuûa phaàn bieán thieân (V) ñöôïc maõ hoùa bôûi chöøng 51 gene V (variable); tieáp theo, caùcaa 96 - 101 do khoaûng 27 gene D (diversity) maõ hoùa; caùc aa 102 - 110 ñöôïc maõ hobôûi 6 gene J ( joining); cuoái cuøng laø gene maõ hoùa phaàn haèng ñònh C.

Moãi gene V ñeàu coù moät chuoãi L (leader ). Trong quaù trình tröôûng thaønh cuûa tebaøo lympho B, moät gene D seõ lieân keát vôùi moät gen J baèng caùch caét botrung gian giöõa chuùng. Sau ñoù, moät gene V cuøng vôùi ñoaïn L töông öùng cugaén vaøo ñoaïn DJ keå treân (taùi toå hôïp VDJ). Gen VDJ môùi toå hôïp vaø g ñöôïcgiaûi maõ taïo ra protein VDJ-C. Chuoãi L sau ñoù ñöôïc caét ra, protein luùc naøy chínchuoãi naëng cuûa IgM.

Vaäy rieâng caùc gene treân NST 14 ñaõ coù khaû naêng taïo ra 8262 chuoãinhau (51V × 27D × 6J).






-41-

Hình 2.28. Quaù trình taùi toå hôïp, giaûi maõ caùc gene chuoãi naëng

2.1.6.5.2. Toåchöùc , t aùi toåhôïp vaø g iaûi m aõ caùc gen e chuoãi nheï :

Caùc gene cuûa chuoãi nheï thuoäc nhieãm saéc theå soá 2. Taïi phaàn bieán thieâcaùc amino acid (aa) 1 - 95 ñöôïc maõ hoùa bôûi 40 gene VL vaø caùc aa töø 96 - 110 bôûi 5

gene JL. Chæ 1 gene C maõ hoùa cho phaàn haèng ñònh cuûa chuoãi nheï naøy. Nhötoå hôïp ngaãu nhieân cuûa moät gene VL vôùi moät gene JL coù theå taïo ra 200 chuoãi nheï

khaùc nhau (40 × 5).

2.1.6.5.3. Toåchöùc , taùi toåhôïp vaø g iaûi m aõ caùc gen e chuoãi nheï :

Caùc gene cuûa chuoãi nheï thuoäc nhieãm saéc theå soá 22. Töông töï chuoãi nh ,phaàn bieán thieân (V) cuûa chuoãi nheï cuõng ñöôïc maõ hoùa bôûi caùc gene VL vaø caùc

gene JL. Soá löôïng caùc gene chöa ñöôïc thoáng keâ ñaày ñuû, ngoaøi ra coøn coù






-42-

C coù ñoaïn gene L ñi tröôùc. Öôùc tính, toå hôïp caùc gene coù theå taïo ra 116 chuoãi nheï khaùc nhau.

Trong tröôøng hôïp bình thöôøng, söï taùi toå hôïp gene caùc chuoãi naëng

ra 2,6 × 106

khaùng theå khaùc nhau (8262H × (200L + 116L)).Tuy nhieân, soá loaïi khaùng theå coù theå taïo ra theo lyù thuyeát coù th

(1012), nhôø caùc cô cheá boå sung sau: Caùc ñoät bieán trong quaù trình tröôûng thaønh (tröôùc khi coù söï toå hôïpbaøo lympho.

Nhöõng loãi trong quaù trình toå hôïp gene V, D, J. Caùc ñoät bieán xaûy ra trong quaù trình toå hôïp gene.

2.1.6.6. ÖÙng duïng cuûa khaùng theå:Trong y hoïc vaø sinh hoïc, khaùng theå ñôn doøng (monoclonal antibody) ñöôïc söû

duïng phoå bieán nhaát. Veà baûn chaát, khaùng theå ñôn doøng laø taäp hôïp caùctheå ñoàng nhaát veà maët caáu truùc vaø tính chaát ñöôïc taïo bôûi moät doøng tökhaùng theå ñôn doøng chæ nhaän bieát moät epitope treân moät khaùng nguyeân c

Hình 2.29. Khaùng theå ñôn doøng lieân keát vôùi 1 epitope ñaëc hieäuTröôùc ñaây, vieäc saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng raát khoù khaên do ñ

nguûi cuûa caùc töông baøo. Khaùng theå chæ thu ñöôïc baèng caùch tieâm moät cuï theå vaøo moät ñoäng vaät roài chieát laáy khaùng theå trong maùu. Phöông phkeùm nhöng chæ thu ñöôïc löôïng khaùng theå raát ít, khoâng thuaàn nhaát vaø bò

Moät tieán boä to lôùn ñaõ ñaït ñöôïc vaøo naêm 1975 bôûi Cesar Milstein vKohler vôùi kyõ thuaät hybridoma (teá baøo lai giöõa 1 lympho B coù khaû naêng saûnkhaùng theå vôùi 1 teá baøo ung thö coù ñôøi soáng khaù daøi), cho pheùp saûn ñôn doøng vôùi soá löôïng lôùn, chaát löôïng toát.



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Hybridoma&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Hybridoma&action=edit




-43-

2.1.6.6.1. ÖÙng du ïng khi caáy gh eùp cô qu an tron g cô theångöôøi:

Khi coù moät cô quan, boä phaän ñöôïc gheùp vaøo cô theå khoâng coù cnguyeân töông hôïp toå chöùc HLA, caùc ñaïi thöïc baøo cuûa cô theå nhaän ra. baøo teá baøo laï vaø trình dieän khaùng nguyeân vôùi lympho T. Khi moät teá baøkích thích bôûi khaùng nguyeân töông öùng, noù seõ phình to ra vaø phaân chia rataïo ra moät loaït caùc teá baøo gioáng nhau veà maët di truyeàn goïi laø moät clonteá baøo trong clone saûn sinh ra khaùng theå nhöng khaùng theå vaãn coøn dính teá baøo, khoâng ñöôïc giaûi phoùng ra. Thay vaøo ñoù, caùc teá baøo T (luùc n“teá baøo T gieát”) di chuyeån ñeán khu vöïc gheùp, tieâu dieät caùc teá baøo laïloaïi maûnh gheùp [6].

Baûn chaát cuûa phöông phaùp laø ngöôøi ta söû duïng khaùng theå ñôn doøthuï theå ñaëc hieäu IL-2R, TCR cuûa teá baøo lympho T, qua ñoù öùc cheá slympho T nhaèm loaïi boû phaûn öùng thaûi loaïi khi gheùp caùc cô quan cuûa ngö

Naêm 1985, caùc nhaø khoa hoïc Phaùp ñaõ thöïc hieän vieäc truyeàn khaùnnhoùm cuûa khaùng theå baïch caàu ngöôøi (HPLA-1-CD-18) cho 7 beänh nhaân suy giaûm mieãn dòch baåm sinh nhaèm taïo ñieàu kieän cho vieäc gheùp tuûy chocho khoâng töông hôïp. Keát quaû coù 5 beänh nhaân ñaõ soáng soùt.

Ngaøy nay, khaùng theå ñôn doøng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong caùc caáy gheùp cô quan, ñaëc bieät laø gheùp thaän. Nhöõng beänh nhaân ñaàu tieân ñôû Vieät Nam hieän vaãn duøng thuoác khaùng theå ñôn doøng ñeå traùnh nguy côñaøo thaûi.

2.1.6.6.2. ÖÙng du ïng trong ñieàu trò ung thö: Caùc khaùng theå ñôn doøng gaén vôùi caùc khaùng nguyeân treân beà ma

theå phaù huûy teá baøo u qua moät soá cô cheá bao goàm hoaït hoùa boå theå vaøqua trung gian teá baøo phuï thuoäc khaùng theå (ADCC) [5].

Ngoaøi ra, khaùng theå ñôn doøng coøn coù theå söû duïng nhö nhöõng pchuyeân chôû caùc ñoàng vò phoùng xaï, caùc chaát ñoäc hoaëc thuoác ñeán khoágiaûm ñöôïc söï tieáp xuùc vôùi toaøn thaân. Baûn chaát cuûa vaán ñeà laø ngöôønaêng caùc phaân töû khaùng theå gaén raát ñaëc hieäu vôùi teá baøo ôû vò trí xaùcô theå (trong ñoù coù teá baøo ung thö) ñeå ñònh höôùng thuoác chöõa beänh. Nhhieäu quaû chöõa trò leân nhieàu laàn. Cho ñeán nay, moät soá thaønh töïu ban ñvöïc naøy ñaõ ñaït ñöôïc, tuy nhieân vaãn coøn nhieàu vaán ñeà phaûi nghieân cöù






-44-

Hình 2.30. ÖÙng duïng cuûa khaùng theå ñôn doøng trong ñieàu trò ung thö Baûng 2.4. Moät soá cheá phaåm khaùng theå ñôn doøng ñöôïc FDA cho pheùp löu h

Cheá phaåm Teân thöôngmaïi

Naêm löuhaønh

Ñích taùcñoäng

Ñieàu trò

Adalimumab Humira 2002 TNFBeänh vieâm (lieân quan ñeán

suy giaûm mieãn dòch baåmsinh)

Alemtuzumab Campath 2001 CD52 Beänh baïch caàu lymphomaïn

Basiliximab Simulect 1998 IL-2R Phaûn öùng thaûi loaïi khi gheùpcô quan

Daclizumab Zenapax 1997 IL-2R Phaûn öùng thaûi loaïi khi gheùpcô quan

Efalizumab Raptiva 2002 CD11a Beänh vaûy neán

Ibritumomab tiuxetan Zevalin 2002 CD20 U lympho khoâng Hodgkin

Infliximab Remicade 1998 TNFBeänh vieâm (lieân quan ñeánsuy giaûm mieãn dòch baåm

sinh) Muromonab-

CD3Orthoclone

OKT3 1986 TCR CD3 Phaûn öùng thaûi loaïi khi gheùp

cô quan



http://en.wikipedia.org/wiki/Adalimumab

http://en.wikipedia.org/wiki/Alemtuzumab

http://en.wikipedia.org/wiki/CD52

http://en.wikipedia.org/wiki/Chronic_lymphocytic_leukemia

http://en.wikipedia.org/wiki/Basiliximab

http://en.wikipedia.org/wiki/Daclizumab

http://en.wikipedia.org/wiki/Efalizumab

http://en.wikipedia.org/wiki/CD11a

http://en.wikipedia.org/wiki/Ibritumomab_tiuxetan



http://en.wikipedia.org/wiki/Infliximab

http://en.wikipedia.org/wiki/Muromonab-CD3


http://en.wikipedia.org/wiki/T_cell



http://en.wikipedia.org/wiki/T_cell



http://en.wikipedia.org/wiki/Infliximab




http://en.wikipedia.org/wiki/CD11a

http://en.wikipedia.org/wiki/Efalizumab

http://en.wikipedia.org/wiki/Daclizumab

http://en.wikipedia.org/wiki/Basiliximab

http://en.wikipedia.org/wiki/Chronic_lymphocytic_leukemia


http://en.wikipedia.org/wiki/Alemtuzumab

http://en.wikipedia.org/wiki/Adalimumab




-45-

Gemtuzumab ozogamicin Mylotarg 2000 CD33 Beänh baïch caàu tuûy caáp

Rituximab Rituxan,

Mabthera 1997 CD20 U lympho khoâng Hodgkin

Tositumomab Bexxar 2003 CD20 U lympho khoâng Hodgkin

Trastuzumab Herceptin 1998 HER-2/neu Ung thö vuù

2.1.7. Caùc chaát lieân quan ñeán quaù trình ñoâng maùu: 2.1.7.1. Yeáu toá VIII:

Ñoâng maùu laø hieän töôïng thay ñoåi tính chaát hoùa lyù cuûa maùu töø trsang traïng thaùi gel do sôïi fibrin ôû theå khoâng hoøa tan taïo thaønh moät maïcöùng caùc thaønh phaàn cuûa maùu, bieåu hieän baèng söï taïo thaønh cuïc maùutraïng thaùi naøy xaûy ra bôûi moät quaù trình bieán ñoåi caùc protein trong maùu ñöôïc ñieàu khieån bôûi nhieàu chaát bao goàm caùc chaát gaây ñoâng maùu vaø cchuùng. Yeáu toá ñoâng maùu hoaït hoùa tröôùc seõ hoaït hoùa yeáu toá tieáp theohaäu quaû cuûa söï hoaït hoùa con ñöôøng ñoâng maùu noäi sinh hoaëc ngoaïi sinoäi sinh ñöôïc hoaït hoùa khi maùu ñeán tieáp xuùc vôùi thaønh maïch bò toån th

ngoaïi sinh ñöôïc hoaït hoùa khi maùu tieáp xuùc vôùi tinh chaát cuûa moâ, xaûynhieàu so vôùi noäi sinh. Böôùc cuoái cuøng cuûa caû 2 ñöôøng laø hoaït hoùa yñoù prothrombinthrombin, fibrinogenfibrin vaø cuïc maùu ñoâng ñöôïc hình thaønh



http://en.wikipedia.org/wiki/Gemtuzumab_ozogamicin



http://en.wikipedia.org/wiki/Rituximab


http://en.wikipedia.org/wiki/Tositumomab



http://en.wikipedia.org/wiki/Tositumomab


http://en.wikipedia.org/wiki/Rituximab







-46-

Hình 2.31. Sô ñoà quaù trình ñoâng maùu

Yeáu toá VIII ( Anti-Hemophilic A -Yeáu toá choáng huyeát höõu A) ñöôïc saûn xuaátbaèng coâng ngheä taùi toå hôïp DNA duøng trong ñieàu trò beänh Hemophilia. laø beänh di truyeàn maùu khoù ñoâng coù lieân quan ñeán giôùi tính, mang tính

phaùi nam. 90% tröôøng hôïp saûn xuaát khoâng ñuû yeáu toá VIII, 10% ôû khuyeát. Tæ leä yeáu toá VIII bình thöôøng trong tuaàn hoaøn cho bieát möùc ñcuûa beänh. 5-10% laø nheï, 1-5% laø trung bình, döôùi 1% laø daïng naëng. ÔÛ vöøa khoâng coù bieåu hieän chaûy maùu tröø khi coù veát thöông. Ngöôïc laïi, tluùc nhoû ñaõ coù bieåu hieän chaûy maùu nhö khi nhoå raêng, caét da qui ñaàu, maùu ôû moâ meàm nhö ñuøi, goái, coå chaân, xuaát huyeát tieâu hoùa. Neáu coùtruyeàn yeáu toá VIII ngay.

Yeáu toá VIII laø moät phaân töû phöùc taïp goàm 3 thaønh phaàn: Ñoaïn glycoprotein goàm 216 amino acid laø phaàn chöùc naêng ñöôïc saûngan vaø teá baøo noäi moâ. Gene maõ hoùa ñoaïn protein naøy naèm treân nhgiôùi tính X, vò trí locus Xq28.

Yeáu toá Von Willebrand ñöôïc toång hôïp bôûi teá baøo noäi moâ vaø caùc mgaén vaøo vaø laøm beàn vöõng yeáu toá VIII trong tuaàn hoaøn vaø caàn thibaùm dính. Phaân töû Von Willebrand monomer laø moät protein goàm camino acid, chia laøm nhieàu vuøng domain ñaëc hieäu, trong ñoù vuøng






-47-

D’/D3 hình thaønh lieân keát vôùi yeáu toá VIII. Gene maõ hoùa yeáu toá nanhieãm saéc theå soá 12, vò trí locus 12p13.31.

Khaùng nguyeân cuûa yeáu toá VIII. Chöùc naêng cuûa noù trong ñoâng maroõ.

2.1.7.2. Chaát hoaït hoùa plasminogen tPA (Tissue Type Plasminogen Activator):Söï tan cuïc maùu xaûy ra moät thôøi gian ngaén sau khi cuïc maùu ñoâng ñ

laäp ñeå taùi laäp doøng maùu vaø söï söûa chöõa moâ ñöôïc tieán haønh. Quaù tmaùu goïi laø söï tieâu sôïi huyeát ( fibrinolysis). Cuõng nhö khi ñoâng maùu, tan cuïc maùcuõng tuaàn töï töøng böôùc ñöôïc kieåm soaùt bôûi caùc chaát hoaït hoùa vaø öùc

Plasminogen laø tieàn enzyme cho quaù trình tieâu sôïi huyeát. Bình thplasminogen coù saün trong maùu döôùi daïng khoâng hoaït ñoäng, noù ñöôïc cdaïng hoaït ñoäng plasmin bôûi caùc chaát hoaït hoùa plasminogen. Plasmin seõ tifibrin cuõng nhö vaøi yeáu toá ñoâng maùu nhö fibrinogen, yeáu toá V, VIII. Plhaønh nhanh choùng bò baát hoaït bôûi 2 plasmin inhibitor, do ñoù giôùi haïn tieâu sôïi huychæ coù taïi choã maø khoâng lan traøn ôû taát caû heä tuaàn hoaøn.

Hình 2.32. Sô ñoà tieâu sôïi huyeát

Tissue type plasminogen activator (tPA) laø chaát hoaït hoùa sinh lyù ñöôxuaát ôû gan, huyeát töông, teá baøo noäi maïc maïch maùu, coù phaân töû löôïkilodalton. Ñaây laø moät daïng serine protease duøng ñieàu trò beänh nhoài maùu

Treân theá giôùi moãi naêm coù 2,5 trieäu ngöôøi cheát do beänh nhoài maùuñoù 25% cheát trong giai ñoaïn caáp tính cuûa beänh. Trong voøng naêm sau ñoù5-10% nöõa. Nguyeân nhaân chính gaây ra nhoài maùu cô tim laø do maùu ñoâng hình thaønhlaøm taéc ngheõn ñoäng maïch vaønh nuoâi quaû tim, khi maûng xô vöõa bò nöùt, vôõ ra xaûy ra treân neàn cuûa beänh caûnh ñoäng maïch vaønh bò heïp do môõ tuï tronmaùu vaø xô vöõa töø tröôùc). Ngoaøi ra, tình traïng co thaét maïch vaønh cuõnngöøng treä doøng maùu daãn ñeán nuoâi cô tim.



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=M%C3%A1u_%C4%91%C3%B4ng&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=%C4%90%E1%BB%99ng_m%E1%BA%A1ch&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=%C4%90%E1%BB%99ng_m%E1%BA%A1ch&action=edit

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=M%C3%A1u_%C4%91%C3%B4ng&action=edit




-48-

Hình 2.33. Caáu truùc phaân töû tPA

2.2. TRONG CHAÅN ÑOAÙN:Hieän nay, phöông phaùp phaân tích söû duïng khaùng theå ñôn doøng ñan

choùng thay theá caùc phöông phaùp phaân tích mieãn dòch vaø huyeát thanh tru

trong chaån ñoaùn phaùt hieän ung thö. Baûn chaát cuûa vaán ñeà laø khi coù söï hu, trong maùu seõ xuaát hieän moät soá taùc nhaân ñaùnh daáu. Ngöôøi ta seõ söûñôn doøng trong phaân tích mieãn dòch ñònh löôïng khaùng nguyeân töông öùng hieän trieäu chöùng ung thö. Treân cô sôû ñoù, caùc phöông phaùp chaån ñoaùn nhaäp hôn vaø coù tính xaùc thöïc hôn ñöôïc thöïc hieän ñeå xaùc nhaän chaån ññöa ra höôùng ñieàu trò thích hôïp. Vieäc chöõa trò sôùm beänh ung thö mang laïicoâng raát cao [5,6].

Phöông phaùp phaân tích mieãn dòch söû duïng khaùng theå ñôn doøng coù cao do phaûn öùng ñaëc hieäu giöõa khaùng nguyeân-khaùng theå. Trong phöông






-49-

tích mieãn dòch phoùng xaï RIA ( Radio Immuno Assay), RAST ( Radio Allergo Sorbent Test ) vaø RIST ( Radio Immuno Sorbent Test ), haøm löôïng khaùng nguyeân ñöôïc xaùñònh baèng caùch ño ñoä phoùng xaï (ñeám ñoàng vò phoùng xaï) cuûa phöùc kkhaùng theå. Coøn trong phöông phaùp ELISA ( Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay),ngöôøi ta xaùc ñònh haøm löôïng khaùng nguyeân baèng caùch ño ñoä maøu donguyeân-khaùng theå taïo ra nhôø enzyme ñaëc hieäu gaén treân noù.

Hình 2.34. Nguyeân taéc tieán haønh phöông phaùp RIA






-50-

Hình 2.35. Nguyeân taéc tieán haønh phöông phaùp ELISA

Sau ñaây laø moät soá khaùng nguyeân tieâu bieåu cuûa moät soá daïng ung 2.2.1. PSA vaø ung thö tieàn lieät tuyeán:Ung thö tuyeán tieàn lieät laø loaïi ung thö coù tæ leä maéc cao nhaát ôû

nguyeân nhaân gaây töû vong ñöùng haøng thöù hai trong caùc beänh ung thö ôû nleä 10%, sau ung thö phoåi). Beänh thöôøng gaëp ôû ngöôøi treân 50 tuoåi. Theo cuûa Toå chöùc Y teá Theá giôùi (WHO), ñeå chaån ñoaùn ung thö tuyeán tieàn lnaêm neân tieán haønh thaêm khaùm tröïc traøng baèng tay keát hôïp vôùi ñònhñaøn oâng 50 tuoåi trôû leân. Neáu ung thö tuyeán tieàn lieät ñöôïc tieán haønh phkhi di caên thì tæ leä khoûi beänh töø 85-90% vaø thôøi gian soáng trung bình laø

vì 3 naêm.PSA (Prostate Specific Antigen) laø khaùng nguyeân ñaëc hieäu cuûa tuyeán tieà

ñöôïc tìm thaáy vaøo naêm 1971 trong tinh dòch ngöôøi. Naêm 1980, ngöôøi tlöôïng ñöôïc PSA trong huyeát thanh vaø cho ñeán naêm 1988 PSA môùi ñöôïcroäng raõi treân laâm saøng.

PSA laø protein mang tính khaùng nguyeân ñöôïc caùc teá baøo bieåu moâ lieät naèm thaønh chuøm nang tieát ra, ñöôïc baøi tieát vaøo caùc oáng vi quaûnphaàn lôùn tieát vaøo tinh dòch qua oáng daãn tinh, coøn laïi tieát vaøo huyeát t






-51-

baïch huyeát maø cô cheá vaãn chöa roõ raøng. Gene kieåm soaùt vieäc toång htreân nhieãm saéc theå soá 19, vò trí locus 19q13.3.

Veà caáu taïo, PSA laø glycoprotein, coù phaân töû löôïng 34 kilodalton, phalaø moät chuoãi coù 240 amino acid, phaàn glucid laø 4 chuoãi hydratcarbon chiequyeát ñònh tính khaùng nguyeân cuûa PSA. Cuõng gioáng nhö caùc khaùng nguyôû tuùi tinh, PSA laø enzyme doøng serine protease coù nhieäm vuï laøm loaõng txuaát tinh vaø bieán ñoåi caùc peptide nhoû nhö seminogene, fibronectine cuûa tincô theå bình thöôøng, PSA ñöôïc tieát vaøo huyeát thanh moät löôïng raát nhoû, thhuûy laø 2,5 ngaøy. Khi coù beänh veà tieàn lieät tuyeán nhö ung thö, u phì ñaïi…tieát ra raát nhieàu vaø noàng ñoä cuûa chuùng trong huyeát thanh taêng leân cao. Nchæ taêng nheï trong caùc tröôøng hôïp u phì ñaïi tuyeán tieàn lieät, nhoài maùu tuvieâm tuyeán tieàn lieät…

Theo Stamey vaø Partin (1990), noàng ñoä PSA coù lieân quan tröïc tieáp tích cuûa khoái u: neáu noàng ñoä PSA <15ng/mL, beänh ôû giai ñoaïn coøn tronoàng ñoä >75 ng/mL, khoái u nhieàu khaû naêng lan toûa ra ngoaøi bao xô. Nong/mL, beänh chöa coù xaâm laán haïch, neáu noàng ñoä >50 ng/mL, bao xô bò x78%, tuùi tinh hoaøn bò xaâm laán tôùi 90% vaø caùc haïch bò xaâm laán 60%.

Theo Smith (1993), nhöõng beänh nhaân ñaõ phaãu thuaät caét boû toaøn bo

lieät neáu ñònh löôïng PSA coù noàng ñoä 10 ng/mL tieân löôïng beänh coøn döông tính 24%neáu noàng ñoä 10 ng/mL beänh coøn döông tính tôùi 61%.Noàng ñoä PSA taêng sôùm hôn khi chöa coù bieåu hieän laâm saøng, vì

löôïng PSA raát coù yù nghóa trong vieäc chaån ñoaùn sôùm ung thö tieàn lieätñoaùn phaân bieät giöõa beänh aùc tính vaø laønh tính cuûa tuyeán tieàn lieät. Kung thö tieàn lieät tuyeán thì xeùt nghieäm ñònh löôïng PSA coù theå coi nhö chua

2.2.2. AFP vaø ung thö gan:

ÔÛ Myõ coù hôn 16.000 ngöôøi bò ung thö gan moãi naêm. Nguyeân nhaâncuûa ung thö gan chöa ñöôïc bieát roõ, nhöng vieâm gan maõn tính vaø xô gan nguy cô ung thö gan. Treân 80% ung thö gan laø ung thö teá baøo gan nguyeân pñaàu xaûy ra töø teá baøo gan. Ung thö naøy xaûy ra ôû nam gaáp ñoâi nöõ vaø thötreân 50. Ngoaøi ra coøn coù ung thö di caên gan. Ung thö naøy xuaát phaùt töø teáphaàn khaùc cuûa cô theå lan ñeán gan.

AFP ( -fetoprotein) laø moät loaïi protein huyeát thanh maùu coù chuû yeáu nhi. Noù ñöôïc tieát ra töø tuùi noaõn hoaøng, daï daøy, gan cuûa thai nhi. Trong bgiöõ nhieäm vuï lieân keát vôùi hormone progesterone vaø estrogene. Chöùc n






-52-

döôõng cuûa töû cung ñöôïc duy trì trong suoát thôøi kì mang thai nhôø 2 hormongöôøi tröôûng thaønh bình thöôøng, AFP khoâng giöõ vai troø naøo, do ñoù ntrong maùu raát thaáp. Gene maõ hoùa AFP naèm treân nhieãm saéc theå soá 44q11.

Veà caáu taïo, AFP laø moät glycoprotein coù 590 amino acid. Baèng phöôRIA, ngöôøi ta phaùt hieän haøm löôïng protein naøy taêng cao ôû 50-70% beänthö gan. Do ñoù, noàng ñoä AFP trong maùu ñöôïc söû duïng laøm yeáu toá chaån gan.

2.2.3. hCG vaø ung thö tinh hoaøn:Ung thö tinh hoaøn chieám khoaûng 10% trong toång soá caùc loaïi ung th

Theo ghi nhaän ung thö ôû Haø Noäi, tæ leä maéc ung thö tinh hoaøn laø 0,8/100Ñaây laø beänh ung thö coù khaû naêng chöõa trò cao. tính chung cho caùc giai ñocoù theå chöõa khoûi 90% soá beänh nhaân, ôû giai ñoaïn lan traøn cuûa beänh cuõchöõa khoûi 80%.

hCG ( Human Chorionic Gonadotropin) laø moät glycoprotein coù khoaûng 244amino acid, phaân töû löôïng 36,4 kilodalton. Noù ñöôïc taïo ra bôûi laù nuoâiTöông töï caùc hormone cuûa tuyeán yeân, noù ñöôïc caáu taïo töø 2 tieåu ñôn vaø .Chuoãi goàm 92 amino acid, coù caáu taïo raát gioáng chuoãi cuûa LH vaø FSH. Tính ñaëchieäu cuûa hCG ñöôïc quyeát ñònh bôûi caáu truùc chuoãi . Gene maõ hoùa chuoãi naèm treânnhieãm saéc theå soá 19, vò trí locus 19q13.33.

Taùc duïng chuû yeáu cuûa hCG laø kích thích quaù trình taïo theå vaøng ôûsau khi phoùng noaõn (laøm phaùt trieån maïch maùu, laøm phì ñaïi teá baøo, laømvaø duy trì theå vaøng. Saùu ngaøy sau khi thuï tinh, löôïng hCG trong maùu cohieän ñöôïc baèng phöông phaùp RIA. Söï hieän dieän cuûa chaát naøy ôû nöôùc tthai kì laø cô sôû cho caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn thai. Baèng caùc xeùt nghie

ta coù theå chaån ñoaùn thai ñöôïc sôùm nhaát laø 14 ngaøy sau khi thuï tinh.hCG khoâng phaûi chæ tieát ra khi coù thai. Nhôø phöông phaùp RIA, ngöôphaùt hieän noàng ñoä hCG taêng cao ôû beänh nhaân ung thö tinh hoaøn. Vì theduøng nhö moät chaát ñaùnh daáu u tinh hoaøn.

Noàng ñoä caùc chaát ñaùnh daáu u noùi treân khoâng phaûi luoân luoân tösöï phaùt trieån cuûa khoái u. Vaãn coù nhöõng tröôøng hôïp beänh nhaân ung thcaùc chaát ñaùnh daáu u ôû möùc bình thöôøng. Maët khaùc, xeùt nghieäm caùc c

phaùt hieän nhöõng ung thö nhoû maø seõ khoâng bao giôø trôû neân ñe doïa ñenhöng khi ñaõ chaån ñoaùn seõ daãn ñeán ñieàu trò. Tình traïng naøy goïi laø ch






-53-

möùc, ñöa con ngöôøi ñoái dieän vôùi nguy cô caùc bieán chöùng cuûa ñieàu trthieát nhö phaãu thuaät hay xaï trò. Do ñoù, sau khi phaùt hieän noàng ñoä caùc ccao neân tieán haønh tieáp caùc bieän phaùp sieâu aâm, chuïp caét lôùp ñieän tohöôûng töø, sinh thieát ñeå ñöa ra phöông phaùp ñieàu trò thích hôïp nhaát.

Baûng 2.5. Noàng ñoä caùc chaát ñaùnh daáu u trong maùu

Chaát ñaùnhdaáu

Ñôn vò Noàng ñoäbình thöôøng

Noàng ñoä giataêng vöøa phaûi

Noàng ñoänguy cô

PSA ng/mL < 4 4-10 10-1.000 AFP ng/mL < 15 15-200 200-10.000 hCG ng/mL < 5 5-10 10-100.000

2.3. TRONG PHAÂN TÍCH:Tính ñaëc hieäu cao cuûa enzyme laø moät trong nhöõng khaùc bieät chuû

enzyme vôùi caùc chaát xuùc taùc khaùc. Moãi enzyme chæ coù khaû naêng xuchuyeån hoùa moät hay moät soá chaát nhaát ñònh theo moät kieåu phaûn öùng nñaëc hieäu naøy coù lieân quan ñeán caáu truùc khoâng gian 3 chieàu cuûa enzymtaùc giöõa enzyme vaø cô chaát chæ xaûy ra khi moät cô chaát naøo ñoù töông taùtöông öùng veà caáu truùc khoâng gian (nhö hình daïng hay vò trí caùc nhoùm tílaáp ñaày beà maët cuûa enzyme ñoù. Ngöôøi ta lôïi duïng tính chaát naøy cuûa ecaùc thí nghieäm phaân tích hoùa sinh [1,7,9].

Hieän nay con ngöôøi ñaõ phaùt hieän ñöôïc 2.000 loaïi enzyme khaùc nhachæ coù khoaûng 140 loaïi coù theå thöông maïi ñöôïc. Naêm 1997 toaøn boä thò khoaûng 150 trieäu USD. Caùc loaïi enzyme sau ñöôïc saûn xuaát vôùi soá löôïntrong phaân tích: glucose oxidase, cholesterol oxidase, alcohol dehydrogenase.enzyme naøy ñeàu thuoäc lôùp oxidoreductase, xuùc taùc cho phaûn öùng oxi hoùa

2.3.1. Glucose oxidase:Glucose oxidase (EC 1.1.3.4) ñöôïc thu nhaän töø naám moác Aspergillus niger ,

Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum, Penicillium vitale, khi coù maët oxy seõchuyeån glucose thaønh acid gluconic vaø H2O2. Ñaây laø moät flavoprotein (protein phöùctaïp), trong ñoù phaàn protein lieân keát vôùi 2 phaân töû coenzyme flavin dinucleotide (FAD).






-54-

Hình 2.36. Caáu taïo FAD

Hình 2.37. Caáu truùc glucose oxidaseEnzyme naøy coù tính ñaëc hieäu cao, chæ oxi hoùa -D-glucose thaønh acid

gluconic neân ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh glucose trong caùc hoãn hôïp ñöôøvaø trong caùc heä thoáng sinh hoïc. Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp döïa treân

phaûn öùng sau:






-55-

H2O2 + Chaát tieáp nhaän sinh maøu peroxydase Chaát tieáp nhaän sinh maøudaïng oxy hoaù (coù maøu xanh)

Chaát tieáp nhaän sinh maøu coù theå duøng laø:

hoaëcOrthotoluidin Orthodiazine

Ñeå xaùc ñònh glucose trong dòch sinh hoïc moät caùch nhanh choùng, ngtheå duøng giaáy chæ thò (kieåu giaáy pH taåm dung dòch 2 enzyme). Sau ñoù vaøo dòch sinh hoïc (nöôùc tieåu), neáu coù chöùa glucose thì sau 1-2 phuùt se

maøu xanh.Ñoái vôùi beänh nhaân tieåu ñöôøng, ñeå ñònh löôïng chính xaùc haøm löôtrong maùu coù theå söû duïng biosensor. Biosensor laø thieát bò phaân tích dötöông taùc sinh hoïc ñeå cho keát quaû veà maët ñònh tính vaø ñònh löôïng. Moät bgoàm 2 thaønh phaàn chuû yeáu: bioreceptor (thuï theå sinh hoïc) vaø transduchuyeån tieáp). Bioreceptor laø phaân töû sinh hoïc nhaän bieát ñöôïc nhaân toátieâu) vaø söï nhaän bieát ñoù ñöôïc nhaân toá chuyeån tieáp bieán thaønh tín hñöôïc. Söï keát hôïp naøy giuùp ño ñöôïc nhaân toá ñích caàn phaân tích maø khchaát phaûn öùng. Noàng ñoä glucose trong maùu coù theå ño tröïc tieáp nhôø bicaùch nhuùng ñaàu doø vaøo maãu caàn ño. Ñieàu naøy thuaän lôïi hôn nhieàu snghieäm qua nhieàu böôùc vaø moãi böôùc phaûi söû duïng moät chaát phaûn öùngiaûn vaø nhanh choùng laø öu ñieåm chính cuûa biosensor.

Hình 2.38. Heä thoáng biosensor

Trong biosensor ñònh löôïng glucose, enzyme glucose oxidase ñöôïc söû dnhö moät bioreceptor. Ñeå ño noàng ñoä glucose coù theå söû duïng 3 transducer k

Oxygen sensor chuyeån noàng ñoä O2 thaønh doøng ñieän.






-56-

pH sensor chuyeån söï bieán thieân pH (do saûn phaåm laø acid gluconic) thñoåi ñieän theá.

Peroxide sensor chuyeån noàng ñoä H2O2 thaønh doøng ñieän.

2.3.2. Cholesterol oxidase:Cholesterol oxidase (EC 1.1.3.6) ñöôïc thu nhaän töø vi khuaån Rhodococcusequi, Nocardia rhodocrous, Brevibacterium steolicum. Ñaây cuõng laø moätflavoprotein vôùi coenzyme laø FAD.

Hình 2.39. Caáu truùc cholesterol oxidase

Enzyme mang tính ñaëc hieäu cao, oxi hoùa cholesterol thaønh cholest-4-one.

Töông töï glucose oxidase, cholesterol oxidase cuõng ñöôïc duøng nhö bioreceptor trong biosensor ñònh löôïng cholesterol trong maùu.

2.3.3. Alcohol dehydrogenase:Alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1) ñöôïc thu nhaän töø naám m

Saccharomyces cerevisiae vaø moät soá vi khuaån. Ñaây laø enzyme coù chöùcoenzyme laø nicotine amide adenine dinucleotide (NAD+).






-57-

Hình 2.40. Caáu taïo phaân töû NAD+

Enzyme naøy mang tính ñaëc hieäu cao, xuùc taùc cho phaûn öùng:CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+

Döïa vaøo tính chaát treân, alcohol dehydrogenase ñöôïc öùng duïng biosensor xaùc ñònh noàng ñoä coàn trong maùu ( Blood Alcohol Concentration-BAC ) khibò ngoä ñoäc röôïu. BAC > 0,5% coù theå daãn ñeán töû vong.

2.4. TRONG THÖÏC PHAÅM CHÖÙC NAÊNG:Thoâng tö 08 (naêm 2004) cuûa Boä Y teá ñònh nghóa: “Thöïc phaåm chöù

thöïc phaåm duøng ñeå hoã trôï chöùc naêng cuûa caùc boä phaän trong cô theåduïng dinh döôõng, taïo cho cô theå tình traïng thoaûi maùi, taêng söùc ñeà khaùngnguy cô gaây beänh”. Do ñoù, thöïc phaåm chöùc naêng khaùc vôùi thöïc phaåm ôû choã ñöôïc saûn xuaát, cheá bieán theo coâng thöùc: boå sung moät soá thaøhoaëc loaïi boû moät soá thaønh phaàn baát lôïi cuûa thöïc phaåm. Vieäc boå sunphaûi ñöôïc chöùng minh vaø caân nhaéc moät caùch khoa hoïc, ñöôïc cô quan n

thaåm quyeàn cho pheùp. Do ñoù, thöïc phaåm chöùc naêng coù taùc duïng vôùi shôn caùc chaát dinh döôõng thoâng thöôøng vaø lieàu söû duïng thöôøng nhoû, ttính baèng milligram hoaëc gram.

Saûn xuaát vaø kinh doanh thöïc phaåm chöùc naêng hieän laø moät trong ncoâng nghieäp coù toác ñoä taêng tröôûng nhanh nhaát theá giôùi, vôùi doanh thuhôn 65.000 tæ USD treân toaøn caàu. Protein, vôùi vai troø ña daïng cuûa mìnhthaønh phaàn quan troïng trong nhieàu loaïi thöïc phaåm chöùc naêng.






-58-

Baûng 2.6. Moät soá thöïc phaåm chöùc naêng coù thaønh phaàn chính laø protein

Teân saûn phaåm

Loaïi saûn phaåm- Caùch thu nhaän

saûn phaåm

Thaønh phaàn protein

Chöùc naêng coù lôïi Nhaø saûn xuaát

Calpis Söõa chua Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro coù töø -casein vaø -casein.

Giaûm huyeát aùp. CalpisCo., Nhaät

Evolus Söõa leân menuoáng giaøu Ca.Leân men nhôø vikhuaån L.

helveticus.

Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro coù töø -casein vaø -casein.

Giaûm huyeát aùp. Valio Oy,Phaàn Lan

Biozate Saûn phaåm thuûyphaân wheyprotein isolate,söû duïngenzyme thuûyphaân.

Caùc ñoaïn cuûa -lactoglobulin.

Giaûm huyeát aùp. Davisco,Mó

BioPURE-GMP

Whey proteinisolate, coù ñöôïctöø whey trongquaù trình saûnxuaát phoâ mai.

Saûn phaåm chöùa toáithieåu 90% -casein (ñoaïn 106-109).

Ngöøa saâu raêng,aûnh höôûng tôùi söïñoâng maùu, baûo veäcô theå khoûi virusvaø vi khuaån.

Davisco,Mó

PeptoPro Saûn phaåm thuûyphaân vaø caùcthaønh phaàn.

Peptide töø casein. Cô baép nhanhchoùng phuïc hoài khimeät moûi.

DMVInternati-onal, HaøLan

Vivinal Alpha

Saûn phaåm thuûyphaân vaø caùcthaønh phaàn.

Peptide töø huyeátthanh söõa.

Deã nguû, thö giaõn. BorculoDomoIngredie-nts, HaøLan

Phyto Opti Zymes

Enzyme chieátxuaát töø thöïcvaät.

Amylase, protease,lipase, lactase.

Tieâu hoùa vaø haápthu toát thöùc aên, caûithieän tình traïng aênkhoâng tieâu.

New SpiritNaturals,Mó

Söû duïng thöïc phaåm chöùc naêng coù taùc duïng toát cho söùc khoûe

khoâng neân duøng quaù möùc hoaëc laïm duïng, ñoàng thôøi phaûi hieåu bieát tö










-61-

Cheá phaåm protease duøng trong coâng nghieäp ñeàu thu ñöôïc töø canh trömoác ( Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus), vi khuaån ( Bacillus subtilis, Bacillusthermophilus)… Trong y hoïc, caùc cheá phaåm protease ñöôïc duøng ñeå saûn xmoâi tröôøng dinh döôõng hoãn hôïp coù protein ñeå nuoâi caáy vi khuaån vaø ckhaùc, chaúng haïn moâi tröôøng nuoâi caùc vi sinh vaät saûn xuaát ra khaùng sinñoäc… Dó nhieân caùc protein coù trong moâi tröôøng phaûi ôû daïng deã ñoàng sinh vaät. Do ñoù phaûi thuûy phaân sô boä caùc protein baèng protease.

Ngoaøi ra ngöôøi ta coøn duøng caùc cheá phaåm protease ñeå coâ ñaëc vhuyeát thanh khaùng ñoäc ñeå chöõa beänh (huyeát thanh mieãn dòch).

Huyeát thanh khaùng ñoäc thöôøng ñöôïc öùng duïng roäng raõi ñeå chöõnhieãm truøng naëng vaø nguy hieåm. Ngöôøi ta thu ñöôïc huyeát thanh naøy töøcuûa maùu ñoäng vaät ñaõ ñöôïc gaây mieãn dòch ñoái vôùi moät beänh naøo ñoùnhöõng ñoäng vaät nhö theá coù chöùa chaát khaùng ñoäc (khaùng theå) trung hoøcaùc vi sinh vaät gaây beänh. Ñeå thu vaø söû duïng chaát khaùng ñoäc, ngöôøi tñoäng vaät vaø taùch huyeát thanh ra. Tuy nhieân trong ñoù vaãn coøn chöùa nñeäm laøm giaûm noàng ñoä chaát khaùng ñoäc. Do ñoù khi ñöa vaøo cô theå ngtheå gaây ra beänh. Ñeå traùnh hieän töôïng naøy caàn phaûi tinh cheá huyeát thaphaåm protease trong tröôøng hôïp naøy raát coù hieäu quaû. Trong nhöõng ñieà

ñònh, protease seõ phaân huûy caùc protein ñeäm maø haàu nhö khoâng aûnh höôkhaùng ñoäc [1].





Chöông 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC

-62-

CHÖÔNG 3 : PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁTPROTEIN Y SINH HOÏC

3.1. PHÖÔNG PHAÙP TOÅNG HÔÏP HOÙA HOÏC:Phöông phaùp naøy duøng ñeå saûn xuaát caùc peptide ñôn giaûn nhö oxytocLieân keát peptide ñöôïc hình thaønh töø söï keát hôïp giöõa nhoùm carboxy

acid thöù nhaát vôùi nhoùm amino cuûa amino acid thöù hai vaø loaïi ñi moät phaâSöï hình thaønh lieân keát peptide döôùi ñieàu kieän oân hoøa chæ coù the

nhoùm carboxy cuûa amino acid ñöôïc hoaït hoùa (baèng caùch cho taùc duïng vôhalogenua nhö PCl3, PCl5, SOCl2); ñoàng thôøi, amino acid coøn laïi taán coâng vaøo n

carboxy naøy (theo cô cheá aùi nhaân) vaø töø ñoù hình thaønh dipeptide.

Khaùc vôùi nhieàu loaïi hôïp chaát höõu cô khaùc, caùc phaûn öùng toång hpeptide raát phöùc taïp. Khoâng theå toång hôïp ñöôïc peptide mong muoán nhôtruøng ngöng caùc phaân töû amino acid khaùc nhau vì seõ taïo ra hoãn hôïp caùcduï tröôøng hôïp ñôn giaûn nhaát laø ngöng tuï 2 phaân töû amino acid seõ tadipeptide:

Gly + Ala 2 H O Gly-GlyGly + Ala 2 H O Ala-Ala

Gly + Ala 2 H O Gly-Ala

Gly + Ala 2 H O Ala-GlyVì vaäy, ñeå toång hôïp moät peptide coù traät töï xaùc ñònh caùc ñôn vò

trong phaân töû thì caàn phaûi “baûo veä” nhoùm amino hay nhoùm carboxyl naøo ñoù khikhoâng caàn chuùng tham gia phaûn öùng taïo ra lieân keát peptide.

Quaù trình toång hôïp hoùa hoïc peptide caàn traûi qua 3 böôùc: Böôùc 1: Baûo veä nhoùm amino hay carboxy khoâng caàn tham gia phaûn ö

lieân keát peptide. Böôùc 2: Hình thaønh lieân keát peptide, goàm 2 böôùc nhoû:






-63-

- Amino acid coù nhoùm amino ñöôïc baûo veä phaûi ñöôïc hoaït hoùcarboxy ñeå coù theå chuyeån thaønh daïng trung gian coù hoaït tính cao.

- Hình thaønh lieân keát peptide.

Hai böôùc nhoû naøy coù theå dieãn ra lieân tuïc hay taùch rôøi. Böôùc 3: Taùch rôøi caùc nhoùm baûo veä (moät phaàn hoaëc toaøn boä). Maëctaùch caùc nhoùm naøy sau khi toaøn boä chuoãi peptide ñöôïc hình thaønh, nta thöôøng taùch choïn loïc trong quaù trình toång hôïp ñeå coù theå tieáp tutruøng ngöng.

Nhoùm baûo veä caàn phaûi thoûa maõn moät soá tieâu chuaån sau:- Deã gaén vaøo phaân töû amino acid.- Baûo veä ñöôïc nhoùm chöùc trong ñieàu kieän hình thaønh caùc lieân keát- Trong quaù trình thöïc hieän khoâng xaûy ra hieän töôïng racemic hoùa.- Deã loaïi ra maø khoâng aûnh höôûng ñeán söï toàn taïi cuûa caùc lieân k

caùc nhoùm baûo veä baùn vónh vieãn.

3.1.1. Baûo veä nhoùm amino:Nhoùm amino thöôøng ñöôïc baûo veä bôûi nhoùm benzyloxicarbonyl (C6H5 –CH2–

COO–) baèng caùch cho amino acid phaûn öùng vôùi benzyl clofomiat (C6H5–CH2– COO–Cl) trong dung dòch kieàm.

Sau khi toång hôïp ñöôïc peptide, nhoùm baûo veä thöôøng ñöôïc loaïi ra ktöû peptide baèng phaûn öùng hydro hoùa.

3.1.2. Baûo veä nhoùm carboxyl:Nhoùm carboxyl thöôøng ñöôïc baûo veä baèng caùch chuyeån thaønh metyl

benzyl este. Nhoùm este thöôøng ñöôïc loaïi ra khoûi phaân töû peptide baèng cphaân bôûi dung dòch kieàm.








-65-

Baûng 3.2. Ví duï veà moät soá nhoùm coù taùc duïng baûo veä nhoùm C- carboxy

Quaù trình toång hôïp peptide trôû neân phöùc taïp hôn bôûi moät soá aminserine, threonine, tyrosine, aspartate, glutamate, lysine, arginine, histidine,cysteine... coù caùc nhoùm chöùc khaùc caàn phaûi baûo veä. Do ñoù, caàn phanhoùm chöùc ñöôïc baûo veä taïm thôøi vaø moät soá nhoùm chöùc ñöôïc baû






-66-

vieãn”. Nhöõng nhoùm coù nhieäm vuï baûo veä taïm thôøi caùc nhoùm chöùc amcoù lieân quan ñeán söï hình thaønh lieân keát peptide sau naøy (intermediary / temporary / transient group) caàn phaûi ñöôïc “thaùo ra” vôùi ñieàu kieän khoâng laøm aûnh höô

oån ñònh cuûa caùc lieân keát peptide ñaõ ñöôïc hình thaønh vaø caùc nhoùm bavieãn. Caùc nhoùm baûo veä baùn vónh vieãn thöôøng ñöôïc thaùo ra ôû cuoái quapeptide hoaëc coù theå ôû moät soá giai ñoaïn trung gian cuûa quaù trình.

Söï taùch rôøi caùc nhoùm baûo veä thöôøng laø böôùc cuoái cuøng cuûa qupeptide (ngoaïi tröø dipeptide). Tuøy thuoäc vaøo muïc ñích ta muoán maø nhoùñaàu N-amino seõ ñöôïc taùch choïn loïc hay nhoùm baûo veä ñaàu C-carboxy seõ ñöôïctaùch choïn loïc.

3.1.3. Phöông phaùp toång hôïp peptide pha raén: 3.1.3.1. Giôùi thieäu:

Trong nhöõng giai ñoaïn ñaàu cuûa hoùa hoïc toång hôïp peptide, nhöõng toång hôïp peptide ñeàu thöïc hieän trong dung dòch. Vieäc toång hôïp peptide trdòch toán raát nhieàu coâng söùc, ñoøi hoûi phaûi coù kieán thöùc vöõng vaøngmuïc tieâu vaø nhoùm baûo veä, phöông phaùp keát noái cuõng nhö giaûi quyeát vtrong dung moâi höõu cô. Moät trong nhöõng öu ñieåm chính cuûa phöông phaùptrong dung dòch laø saûn phaåm coù ñoä tinh saïch cao (maëc duø ñieàu naøy covaøo quaù trình tinh saïch saûn phaåm).

Phöông phaùp toång hôïp peptide treân chaát mang raén (Solid Phase PeptideSynthesis - SPPS ) ñöôïc giôùi thieäu laàn ñaàu tieân vaøo naêm 1963 bôûi RoberMerrifield. Ngaøy nay, phöông phaùp naøy ñöôïc nhaéc ñeán nhö laø phöông phaùMerrifield.

3.1.3.2. Nguyeân taéc:Phöông phaùp toång hôïp peptide pha raén dieãn ra nhö sau:

Chuoãi peptide seõ ñöôïc gaén vôùi chaát mang polymer khoâng tan, ñaây lanhaân taïo coù chöùa caùc nhoùm hoaït ñoäng (X) (ví duï nhoùm -OH). Caùphaûn öùng deã daøng vôùi nhoùm carboxyl cuûa amino acid ñaõ ñöôïc baûo ñoù hình thaønh lieân keát giöõa phaân töû amino acid vaø polymer.

Nhoùm (Y) baûo veä ñaàu N coù theå ñöôïc loaïi boû vaø moät phaân töû ambaûo veä ñaàu N thöù 2 coù theå ñöôïc keát hôïp tieáp tuïc. Quaù trình ñöôïc cho tôùi khi ñöôïc maïch peptide theo yeâu caàu.

Cuoái quaù trình toång hôïp, moät taùc nhaân ñöôïc söû duïng ñeå phaân huûñuoâi C cuûa peptide vaø chaát mang raén, töø ñoù peptide ñi vaøo dung dòch






-67-

Hình 3.1. Sô ñoà quaù trình toång hôïp peptide pha raén

3.1.3.3. Chaát mang raén: Yeâu caàu: caàn phaûi trô veà maët hoùa hoïc, beàn cô hoïc, khoâng tan tronñöôïc söû duïng vaø coù theå taùch ra deã daøng trong quaù trình loïc. Ngoa

phaûi coù ñuû soá löôïng caùc vuøng hoaït hoùa ñeå coù theå gaén caùc amincuûa chuoãi peptide vaøo.

Moät soá vaät lieäu laøm chaát mang ñöôïc söû duïng: polyethylene, ccontrolled pore glass (CPG), chitin…

Moät soá hình daïng chaát mang: daïng maøng moûng, daïng haït, daïng sôïi. Möùc ñoä amino acid ñaàu tieân gaén vaøo chaát mang coù giaù trò toái ömmol/g chaát mang. Toác ñoä taêng tæ leä khoái löôïng giöõa peptide/chaát mkhoâng laøm giaûm hieäu quaû cuûa quaù trình toång hôïp maëc duø khi ñoù tínôû trong dung moâi khoâng phaân cöïc cuûa chaát mang bò giaûm ñi roõ reä






-68-

lieäu phaân cöïc hôn (ví duï polyamide) thöôøng duøng ñeå toång hôïp caùc pedaøi hôn.

Nhoùm chöùc hoaït ñoäng treân chaát mang: coù theå xem nhö laø töông öùn

baûo veä ñaàu C cuûa peptide (töùc laø coù taùc duïng baûo veä ñaàu C cuûathuoäc vaøo ñaàu C cuûa peptide naøo maø ngöôøi ta caàn 1 carboxcarboxamide, 1 ester hoaëc 1 alcohol. Trong haàu heát caùc tröôøng hôïp, amiñaàu tieân ñöôïc gaén vôùi chaát mang nhôø lieân keát ester. Vieäc löïa choïngiuùp quaù trình gaén vaø taùch peptide khoûi chaát mang thuaän lôïi, ñoàngñöôïc hieän töôïng racemic hoùa (trong quaù trình gaén amino acid ñaàu tieân)

Chaát mang ñaàu tieân ñöôïc söû duïng trong SPPS laø 1 copolymer cuûa pvaø 1-2% divinyl benzene. Haït chaát mang khoâ coù ñöôøng kính khoaûng 20-80 m vaø coùtheå phoàng leân ñeán theå tích lôùn hôn theå tích ban ñaàu töø 5-6 laàn tuøy lo(dung moâi duøng cho toång hôïp peptide). Do ñoù, chaát mang polymer (thöôøntrong dung moâi) khoâng phaûi daïng maïng raén (solid matrix) maø ôû daïngsolvate hoùa toát vaø chuoãi polymer khaù linh ñoäng. Ñieàu naøy giuùp cho caöùng deã khueách taùn tôùi caùc vuøng phaûn öùng. Ngöôøi ta nhaän thaáy coù1012 chuoãi polypeptide giöõ treân haït chaát mang polystyrene/divinylbenzeñöôøng kính 50 m vaø coù theå chöùa 0,3mmol peptide/g chaát mang.

Hình 3.2. Chaát mang Polystyrene/Divinylbenzene

3.1.3.4. Ví duï:Ñeå toång hôïp oxytocin (hình 2.9), chaát baûo veä nhoùm N-amino ñöôïc söû duïng

laø 9-fluorenylmethoxy carbonyl (Fmoc), chaát mang raén laø nhöïa 2-chlorochloride trong dung moâi diisopropyl carbodiimide/1-hydroxy benzotriazo(DIC/HOBt). Caùc böôùc tieán haønh töông töï nguyeân taéc ñaõ neâu ôû treân vôamino acid ñöôïc gaén laàn löôït laø glycine, leucine, praline, cysteine, asparag






-69-

glutamine, isoleucine, tyrosine vaø cuoái cuøng laø cysteine. ÔÛ moãi giai ñoaïnveä Fmoc ñöôïc thaùo ra khi tieán haønh xöû lyù vôùi dung dòch dimethyl formamchöùa 20% piperidine trong 30 phuùt.

Cuoái quaù trình, chaát mang ñöôïc taùch ra baèng caùch xöû lyù vôùi hoãn trifluoroacetic acid/ 1,2-ethanedithiol/ triethylsilane/ anisole/ nöôùc (90:5:2:2:1, vtæ leä 15 mL/g chaát mang gaén peptide trong voøng 4 giôø ôû nhieät ñoä phoøngcaàu noái disulfide giöõa 2 amino acid cysteine ôû vò trí 4 vaø 9 baèng caùch oxdung dòch dimethyl sulfoxid (DMSO) 25%. Phaûn öùng naøy tieán haønh trong vogiôø ôû nhieät ñoä phoøng.

Tieán haønh xöû lyù sô boä dung dòch baèng phöông phaùp saéc kyù loïctónh laø Sephadex G-15 (1 loaïi gel dextran) vaø pha ñoäng laø acetic acid. Sauduïng phöông phaùp saéc kí loûng pha ñaûo vôùi pha ñoäng laø acetonitrile/nöôùcLichrosorb C18 (5 m, 250 x 8 mm), detector UV ôû böôùc soùng 254 nm ñeå hoaøquaù trình tinh saïch oxytocin.

Baèng phöông phaùp khoái phoå, ngöôøi ta xaùc nhaän saûn phaåm thu ñöôcoù ñoä tinh saïch > 98%.

Öu ñieåm cuûa phöông phaùp SPPS so vôùi phöông phaùp toång hôïp trong dun- Trong quaù trình toång hôïp ta khoâng phaûi thöïc hieän vieäc taùch vaø la

saûn phaåm trung gian raát toán thôøi gian nhö khi laøm trong dung dòch. Ôphaùp naøy, saûn phaåm cuûa phaûn öùng ñöôïc giöõ laïi treân chaát manchaát tham gia phaûn öùng coøn dö hoaëc saûn phaåm phuï seõ ñöôïc loaïi bloïc.

- Chu kì saûn xuaát ngaén hôn, naêng suaát cao hôn. Nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp SPPS:- Ñeå coù theå coù phaûn öùng xaûy ra hoaøn toaøn thì caàn coù moät löôïng

acid moãi loaïi.- Vaãn coù theå xaûy ra caùc phaûn öùng khoâng mong muoán (bôûi caùc nhtrong maïch cuûa amino acid) trong quaù trình hoaït hoùa, keát noái, thaùo baûo veä.

- Vieäc theo doõi tieán trình phaûn öùng vaø phaân tích xem phaûn öùng ñachöa thì raát khoù thöïc hieän.

- Söï tröông phoàng (swelling) cuûa polymer vaø söï khueách taùn cuûa caùc chaátöùng trong quaù trình toång hôïp laø ñieàu heát söùc quan troïng.

- Hieän töôïng keát tuï cuûa chuoãi peptide laøm cho vieäc toång hôïp trôû ne






-70-

- Ñieàu kieän phaûn öùng ñeå giaûi phoùng peptide khoûi polymer coù theå saûn phaåm.

- Coù theå xaûy ra hieän töôïng raùp maïch khoâng ñuùng nhö sau:

Ñieàu naøy xaûy ra khi coù söï acyl hoùa khoâng hoaøn toaøn, vieäc loaïi caveä khoâng hoaøn toaøn hoaëc coù moät vaøi amino acid thaønh phaàn khoâng

maïch. Vieäc taùch caùc saûn phaåm khoâng mong muoán naøy toán nhieàu thôøi do ñoù caàn coù bieän phaùp phoøng traùnh nhöõng hieän töôïng naøy xaûy ra.

3.1.4. Phöông phaùp toång hôïp peptide pha loûng:Phöông phaùp toång hôïp peptide pha loûng ( Liquid Phase Peptide Synthesis) laø

phöông phaùp toång hôïp peptide döïa treân chaát mang polymer hoøa tan. Vieäcpolyethyleneglycol (PEG) laø moät böôùc tieán quan troïng trong toång hôïp peploûng. Trong phöông phaùp naøy, caùc chaát phaûn öùng dö coù phaân töû löôïn

taùch bôûi quaù trình sieâu loïc. Sau naøy ñeå thöïc hieän quaù trình taùch ngöôøi phöông phaùp keát tuûa: khi theâm dung moâi höõu cô thích hôïp (ví duï diethylaøm keát tuûa caùc peptidyl-PEG bôûi söï hình thaønh caùc caáu truùc xoaén, cocoù phaân töû löôïng thaáp thì khoâng bò keát tuûa, töø ñoù chuùng ñöôïc taùch ra

Nhöõng peptide coù ít hôn 30 amino acid coù theå toång hôïp baèng phöônaøy. So vôùi phöông phaùp SPPS thì phöông phaùp naøy coù toác ñoä phaûn öù(do phaûn öùng ñoàng theå nhanh hôn dò theå). Nhöng nhöôïc ñieåm chính cuûa pnaøy laø thôøi gian tieán haønh keùo daøi vaø khoù töï ñoäng hoùa.






-71-

3.2. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT COLLAGEN:

Ñaây laø qui trình coâng ngheä saûn xuaát collagen töø da ñoäng vaät (thöheo). Da heo taùch ra ñöôïc röûa saïch baèng nöôùc noùng, caïo loâng roài laøm

Da heo

Taùch beùo

Laøm saïch

Röûa laïi

Kieàm hoaù

Axít hoaù

Röûa

öûa boå sun

EÙp, keát thaønh taám, saáy

Maøi

Chuaån bò khoái loûn

Ñoàng hoaù

Collagen membrane






-72-

nhanh. Tröôùc khi ñi vaøo quaù trình taùch beùo, da heo seõ ñöôïc raõ ñoâng. Tgiai ñoaïn laøm saïch, xöû lyù loaïi boû caùc chaát phi collagen; da heo ñöôïc maøgel, sau ñoù troän theâm caùc chaát laøm meàm khoái collagen. Collagen thu ñöôï

hoùa coù theå boå sung vaøo kem döôõng da. Coøn collagen membrane coù theåmaët naï chaêm soùc da.

3.3. PHÖÔNG PHAÙP TAÙI TOÅ HÔÏP DNA:Ñaõ töø laâu caùc nhaø khoa hoïc mong muoán saûn xuaát protein vôùi so

Naêm 1955, laàn ñaàu tieân Sanger xaùc ñònh ñöôïc trình töï amino acid cuûa insumaõi ñeán naêm 1965, vieäc toång hôïp hoùa hoïc 2 maïch A vaø B cuûa insulin mhieän nhôø 3 nhoùm nghieân cöùu cuûa Mó, Ñöùc vaø Trung Quoác. Quaù trình

hoïc moät phaân töû protein loaïi nhoû nhö insulin phöùc taïp ñeán noãi caàn 170 giaù thaønh raát cao, khoâng cho pheùp öùng duïng ôû qui moâ coâng nghieäp.Kó thuaät taùi toå hôïp DNA ( Recombinant DNA Technology) ra ñôøi döïa treân cô

sôû haøng loaït thaønh töïu cuûa sinh hoïc phaân töû trong vieäc taùch, caét, noái, chvaø bieåu hieän gene mong muoán ñaõ cho pheùp saûn xuaát nhieàu loaïi proteinvôùi soá löôïng lôùn maø coøn coù theå bieán ñoåi chaát löôïng protein. Noù coù vhoùa ñoái vôùi söï phaùt trieån sinh hoïc, ñoàng thôøi taïo “quyeàn löïc gheâ gôùmtrong vieäc caûi taïo sinh giôùi vaø baûn thaân mình.

Caùc böôùc cô baûn cuûa phöông phaùp taùi toå hôïp DNA [8]:1. Choïn vector chuyeån gene vaø nuoâi teá baøo cho (nhö teá baøo ngöôøi).2. Taùch DNA plasmid vaø DNA teá baøo cho.3. Caét caû hai loaïi DNA baèng cuøng moät loaïi enzyme restriction endonucl

caùc ñaàu so le coá keát (cohesive ends).4. Troän chung hai loaïi DNA ñeå chuùng gaén vaøo nhau, theâm enzyme noái

lieân keát hoaù trò thaønh DNA taùi toå hôïp hoaøn chænh.5. Bieán naïp DNA taùi toå hôïp vaøo trong teá baøo nhaän.6. Choïn loïc vaø taïo doøng teá baøo nhaän, sau ñoù taïo ñieàu kieän ñeå gene b

hôïp protein.7. Taùch saûn phaåm protein.

3.3.1. Thu nhaän gene:Coù theå thu nhaän gene ñeå thöïc hieän kó thuaät taùi toå hôïp DNA baèn

phaùp sau: 3.3.1.1. Taùch caùc ñoaïn DNA töø boä gene:






-73-

Ñaây laø phöông phaùp ñöôïc söû duïng roäng raõi ngay töø buoåi ñaàu cuûakó thuaät taùi toå hôïp DNA. Toaøn boä DNA cuûa moät sinh vaät ñöôïc caét ñoaïncô hoïc hay bôûi caùc restriction endonuclease roài gaén vaøo caùc vector taïo doø

phaùp naøy coù nhieàu baát lôïi vì soá ñoaïn DNA taïo ra coù theå raát lôùn, phatrieäu doøng vi khuaån mang caùc ñoaïn DNA naøy, trong soá ñoù coù nhöõng doñoaïn DNA truøng laép. Beân caïnh ñoù, phaàn lôùn DNA cuûa Eukaryotae baäc cao dö thöøa,töùc khoâng maõ hoaù cho vieäc toång hôïp protein, nhöõng ñoaïn naøy laøm toákhi taïo doøng. Phöông phaùp naøy chæ söû duïng coù hieäu quaû trong vieäc lacuûa DNA boä gene ( Bank of Genomic DNA) hay thö vieän cuûa DNA boä gene(Genomic DNA Libraries).

3.3.1.2. Toång hôïp gene baèng phöông phaùp hoaù hoïc:Muoán thöïc hieän phöông phaùp naøy phaûi bieát trình töï nucleotide cuûa

hoaøn thieän caùc phöông phaùp nghieân cöùu caáu truùc cuûa protein vaø caùc scuûa gene, cuøng vôùi caùc phöông phaùp xaùc ñònh trình töï nucleotide ñaõ thuùchoùng vieäc toång hôïp nhaân taïo caùc gene. Ngaøy nay ñaõ coù maùy töï ñoäng toång hôïpDNA. Ví duï ñieån hình cuûa phöông phaùp naøy laø vieäc toång hôïp insulin (seõhôn ôû sau).

3.3.1.3. Laäp ngaân haøng c-DNA:Trong thöïc teá, phöông phaùp taïo gene töø caùc mRNA thoâng tin cuûa ch

söû duïng roäng raõi. Phöông phaùp naøy döïa vaøo quaù trình phieân maõ ngöôïenzyme phieân maõ ngöôïc reverse transcriptase. Enzyme naøy coù teân goïi ñuùngDNA-polymerase phuï thuoäc RNA ( RNA-dependent DNA-polymerase) laàn ñaàu tieânñöôïc phaùt hieän khi nghieân cöùu sao cheùp RNA cuûa retrovirus gaây ung thö. naêng toång hôïp neân DNA moät maïch ñöôïc goïi laø c-DNA (complementary DNA) töøkhuoân mRNA hoaëc töø moät ñoaïn polyribonucleotide toång hôïp hoùa hoïc. Nh

naøy coù theå toång hôïp haàu nhö baát cöù gene rieâng bieät naøo mieãn coù mgene ñoù. Caùc c-DNA maïch ñôn coù theå ñöôïc bieán thaønh maïch keùp polymerase vaø ñöôïc goïi laø c-DNA keùp (c-DNA duplex). Ñoaïn cDNA-keùp ñöôïc gaénvaøo plasmid vaø bieán naïp vaøo vi khuaån ñeå taïo doøng c-DNA.






-74-

Hình 3.3. Sô ñoà taïo c-DNA töø mRNA

Ñeå thu nhaän mRNA, ta caàn choïn moâ, cô quan coù söï hieän dieän cumuïc tieâu, ñoàng hoùa chuùng trong dung dòch coù chaát öùc cheá Rnase roàmRNA baèng saéc kyù coät oligo(dT) cellulose.

Caùc doøng DNA cuûa boä gene laø nhöõng ñoaïn ngaãu nhieân cuûa taát canucleotide doïc theo DNA cuûa sinh vaät vaø haàu nhö khoâng phuï thuoäc vaøo naøo duøng ñeå laáy DNA. Ngöôïc laïi, caùc doøng c-DNA chæ chöùa nhöõng ññöôïc phieân maõ ra mRNA vaø vì teá baøo cuûa caùc moâ ñaõ ñöôïc bieät hoùamRNA khaùc nhau neân ngaân haøng c-DNA nhaän ñöôïc seõ phuï thuoäc vaøo ñöôïc söû duïng.

Vieäc söû duïng ngaân haøng c-DNA seõ coù nhieàu öu theá: Caùc doøng c-DNA chöùa trình töï maõ hoùa lieân tuïc cuûa moät gene. Nh Eukaryote laø giaùn ñoaïn, coù chöùa nhieàu intron khoâng maõ hoùa. Sau quatieàn mRNA vaø noái laïi, caùc ñoaïn intron bò loaïi vaø mRNA tröôûng thaøn

maõ hoùa lieân tuïc ñöôïc taïo thaønh. c-DNA ñöôïc taïo ra töø khuoân mR






-75-

thaønh neân caùc doøng c-DNA coù theå toång hôïp protein caàn thieát vôùi nhö mong muoán.

Nhieàu protein ñöôïc toång hôïp vôùi soá löôïng lôùn do nhöõng teá baøo chuy

vaäy, trong caùc teá baøo naøy, mRNA cuûa “protein giaøu” ñoù seõ coù tæ lehaøng c-DNA ñöôïc taïo ra töø caùc teá baøo naøy seõ coù nhieàu c-DNA maprotein töông öùng. Söï doài daøo cDNA moät vaøi loaïi naøo ñoù laøm giaûmvieäc xaùc ñònh ñuùng doøng mong muoán töø ngaân haøng gen. Ví duï, heñöôïc taïo ra vôùi soá löôïng lôùn ôû hoàng caàu, caùc mRNA globine coù tæcaùc gene globine thuoäc soá nhöõng gene ñaàu tieân ñöôïc taïo doøng.

3.3.2. Vector chuyeån gene:Vector chuyeån gene laø phaân töû DNA coù khaû naêng töï taùi sinh, toàn

trong teá baøo vaø mang ñöôïc gene caàn chuyeån. Caùc vector chuyeån gene pmaõn yeâu caàu toái thieåu:

Coù caùc trình töï khôûi söï sao cheùp (ori) ñeå coù theå töï sao cheùp maø toàn taïi ñoäc Coù caùc trình töï nhaän bieát ( palindrome), nôi maø caùc restriction endonucleasenhaän bieát ñeå caét hôû laøm choã raùp ñoaïn gene laï vaøo. Caùc trình tönaèm xa ñieåm xuaát phaùt sao cheùp ñeå traùnh bò caét nhaàm.

Caùc trình töï ñieàu hoaø ( promoter ) taïo thuaän lôïi cho söï phieân maõ gene laï. Ñaûm baûo söï di truyeàn beàn vöõng cuûa DNA taùi toå hôïp ôû daïng ñoävaøo nhieãm saéc theå cuûa teá baøo chuû.

Coù caùc gene ñaùnh daáu ñeå deã daøng phaùt hieän ra chuùng hoaëc caùcvaøo.

Ngoaøi ra chuùng coøn phaûi coù nhöõng ñaëc tính boå sung khaùc ñeå cdoøng deã thöïc hieän:

Chöùa caùc gene laøm voâ hieäu hoaù ñoaïn DNA khoâng mong muoán bò ga

Coù nhieàu baûn sao ñeå taùch ñöôïc ra khoûi teá baøo vôùi soá löôïng lôùn khueách ñaïi cuûa gene gaén vaøo. Coù caùc trình töï nucleotide caàn thieát cho söï bieåu hieän cuûa gene nhö trình töï gaén vôùi ribosome ñeå dòch maõ (ribosome binding site).

Giaù trò cuûa caùc vector chuyeån gene ôû choã noù ñöôïc caáu taïo nhö thuaän tieän cho muïc ñích söû duïng. Khoâng coù vector toaøn naêng cho chuyecaàn coù söï löïa choïn tuøy ñoái töôïng, tuøy kích thöôùc ñoaïn gene ñöôïc taïo ñöôïc caáu taïo vôùi nhieàu tính chaát chuyeân bieät ñeå mang ñöôïc caùc trình tönhö mong muoán.






-76-

3.3.2.1. Plasmid:ÔÛ caùc sinh vaät Prokaryotae, caùc vector thöôøng söû duïng laø caùc vector cuû

khuaån vaø bacteriophage. Ñaây laø vector chuyeån gene ñaàu tieân ñöôïc söû du

chöùa ñoaïn DNA laï coù chieàu daøi khoaûng 3-10 kb. Chuùng ñöôïc caûi bieán ñthuaän tieän hôn cho kó thuaät taùi toå hôïp DNA.Theá heä ñaàu tieân laø caùc plasmid töï nhieân haàu nhö khoâng coøn söû d

heä thöù hai laø caùc plasmid ñöôïc caáu taïo phöùc taïp hôn, ñöôïc söû duïng roäpBR322, baét nguoàn töø moät plasmid nhoû ColE1. Noù ñöôïc caáu taïo töø nhicaùc plasmid khaùc nhau ñeå vöøa coù ñöôïc caùc gene khaùng thuoác vöøa coù cbieát ñaëc hieäu cho caùc enzyme restriction endonuclease nhö EcoRI, HinBamHI... Plasmid naøy coù khaû naêng sao cheùp ñoäc laäp vôùi teá baøo E.coli vaø toàn taïi vôùisoá löôïng trung bình 20-30 baûn sao cho moãi teá baøo. Trong nhöõng ñieàu kienhaát ñònh coù theå khueách ñaïi coù choïn loïc laøm taêng soá plasmid ñeán hôncho moät teá baøo.

Theá heä thöù ba laø caùc plasmid ña naêng vaø chuyeân duïng ( polycloning plasmid ).Ñeå tieän cho vieäc söû duïng nhieàu loaïi restriction endonulease khaùc nhau, caûtöï nhaän bieát cuûa chuùng ñöôïc xeáp noái tieáp nhau thaønh moät ñoaïnpolylinkers. Moät soá plasmid thoâng duïng thuoäc loaïi naøy nhö hoï pUC, hoï Ge

3.3.2.2. Phage :Caùc phage, virus cuûa vi khuaån cuõng ñöôïc duøng laøm vector chuyeån

nhieàu phage coù khaû naêng taûi naïp mang gene töø teá baøo cho sang teá baøo nhaän. Vectorphage ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå laäp ngaân haøng gene vì noù mang ñöôïclôùn hôn plasmid (15-23 kb), deã baûo quaûn, deã taùch ra ñeå phaân tích. Öu ñiecuûa caùc phage laø chuùng coù heä thoá ng töï ñoäng xaâm nhaäp vaø sinh saûn trong teá bakhuaån vôùi hieäu quaû cao hôn nhieàu so vôùi vieäc ñöa plasmid vaøo teá baø

bieán naïp. Tuy nhieân thao taùc ban ñaàu phöùc taïp hôn. 3.3.2.3. Plasmid Ti:

Plasmid ñöôïc söû duïng roäng raõi trong chuyeån gene ôû thöïc vaät baét nkhuaån trong ñaát laø Agrobacterium tumefaciens coù khaû naêng taïo khoái u ôû thöïc vNhaân toá gaây khoái u laø plasmid Ti (tumor-inducing) coù DNA voøng troøn khoaûng 200kb. T-DNA laø phaàn quan troïng cuûa plasmid, noù ñöôïc chuyeån vaø gaén xen vaøo boä gene cuûa teá baøo thöïc vaät chuû. Caùc chöùc naêng thöïc hieän chuyeå

DNA nhöng treân plasmid Ti. Nay ñaõ coù nhieàu caûi tieán ñöôïc thöïc hieän ñeåtrôû thaønh vector thuaän tieän trong chuyeån gene vaøo thöïc vaät.






-77-

3.3.2.4. Nhieãm saéc theå nhaân taïo cuûa naám men YAC:Cho ñeán nay, ôû Eukaryotae chæ tìm ñöôïc moät loaïi plasmid duy nhaát laø

voøng troøn 2m daøi khoaûng 6300 caëp base, coù nhieàu trong teá baøo naá

Saccharomyces cerevisiae. Söï caûi tieán plasmid naøy qua nhieàu böôùc taïo thaønh saéc theå nhaân taïo ôû naám men YAC (Yeast Artificial Chromosome). YAC coù khaû naêngchöùa caùc ñoaïn DNA laï daøi ñeán 2000 kb.

Treân cô sôû ñoù, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ taïo ñöôïc nhieãm saéc theå nhkhuaån BAC, nhieãm saéc theå nhaân taïo MAC duøng cho teá baøo ñoäng vaät co

Hình 3.4. Caùc vector chuyeån gene






-78-

3.3.3. Enzyme caét restriction endonuclease:Naêm 1962, laàn ñaàu tieân V.Arber chöùng minh raèng coù nhöõng enzym

hoaït ñoäng trong teá baøo vi khuaån, coù khaû naêng phaân bieät DNA cuûa mìn

cuûa phage. Caùc enzyme naøy haïn cheá khaû naêng sinh saûn cuûa phage trongkhuaån baèng caùch phaân huyû chuùng moät caùch ñaëc hieäu, do ñoù ñöôïc goenzyme. Caùc restriction enzyme caét ôû giöõa phaân töû DNA moät caùch ñaëc restriction endonuclease, hay enzyme haïn cheá.

Caùc restriction endonuclease nhaän bieát DNA maïch keùp ôû nhöõng trìnhnhaän bieát vaø caét DNA ôû ngaøy ñieåm naøy hay keá caän. Caùc ñieåm nhaän coù trình töï 4-6 caëp nucleotide ñoái xöùng ñaûo ngöôïc nhau, goïi laø palindrrestriction endonuclease coù trình töï nhaän bieát ñaëc tröng.

Hình 3.5. Cô cheá caét cuûa BamHI

Caùc enzyme EcoRI vaø BamHI khi caét DNA maïch keùp taïo ra caùc ñaàukeát (cohesive ends) vì caùc base boå sung deã baét caëp ñeå gaén laïi vôùi nhau nhö bò caét rôøi. Neáu coù moät ñoaïn DNA laï khaùc cuøng bò caét bôûi moät loaïi eví duï EcoRI thì nhôø caùc ñaàu coá keát, ñoaïn DNA laï coù theå xen vaøo giöõcaùc ñoaïn DNA do enzyme HaeIII caét laïi coù ñaàu taø (blunt ends)

Ngaøy nay coù hôn 500 loaïi restriction endonuclease ñaõ ñöôïc phaùt hieän120 trình töï nhaän bieát khaùc nhau. Caùch ñaët teân nhö sau, qua ví duï EcoEscherichia, co töø coli, R laø doøng vi khuaån R vaø I laø thöù töï restriction endñöôïc phaùt hieän.






-79-

3.3.4. Taïo plasmid taùi toå hôïp:Böôùc tieáp theo laø gaén caùc ñoaïn DNA vaøo vector chuyeån gene ñeå ta

coù mang gene laï goïi laø plasmid taùi toå hôïp (recombinant plasmid ) hay khaûm

(chimeric). Phaûn öùng sau cuøng ñöôïc thöïc hieän nhôø enzyme noái DNA ligase.Ligase xuùc taùc phaûn öùng noái baèng caùch hình thaønh caàu phosphodcaùc nucleotide keà caän hay chuïm ñaàu vôùi nhau. Hai DNA ligase cuûa E.coli vaø phageT4 ñöôïc söû duïng phoå bieán.

Coù nhieàu phöông phaùp gaén DNA vaøo vector chuyeån gene: 3.3.4.1. Phöông phaùp ñôn giaûn duøng caùc ñaàu coá keát:

Vector chuyeån gene laø DNA voøng troøn ñöôïc caét bôûi moät loaïi reendonuclease chuyeån thaønh daïng thaúng coù 2 ñaàu coá keát. Caùc phaân töûbaøo cho ñöôïc caét bôûi cuøng loaïi enzyme taïo ra nhieàu ñoaïn DNA thaúng coùkeát. Troän laãn DNA cuûa vector chuyeån gene vôùi caùc ñoaïn DNA laï, caùc cuûa 2 loaïi DNA boå sung seõ baét caëp vôùi nhau.

Hình 3.6. Phöông phaùp gaén DNA laï duøng caùc ñaàu coá keát






-80-

3.3.4.2. Phöông phaùp duøng caùc ñoaïn noái:

Hình 3.7. Duøng caùc ñoaïn noái taïo DNA taùi toå hôïp

Caùc ñoaïn oligonucleotide (ñoaïn DNA ngaén coù 10-20 nucleotide) ñöôïhôïp hoaù hoïc nhaân taïo sao cho ôû giöõa coù trình töï palindrome ñaëc hieäu restriction endonuclease coù theå duøng laøm ñoaïn noái. DNA ligase cuûa phag

ñaëc tính noái caùc ñoaïn DNA ñoù laïi vôùi nhau. Nhôø vaäy, ñoaïn DNA laï coùcaùc ñoaïn oligonucleotide vôùi trình töï caàn thieát. Caùc ñoaïn noái seõ gaén vaø






-81-

ñoaïn DNA laï vaø khi caét baèng restriction endonuclease (ví duï EcoRI), noù seõcoá keát cuûa EcoRI. Noù coù theå gaén vaøo vector chuyeån gene cuõng bò caét bduø baûn thaân coù tröôùc ñoù khoâng coù caùc trình töï nhaän bieát ñaëc hieäu vô

3.3.4.3. Phöông phaùp duøng enzyme terminal transferase:

Hình 3.8. Duøng terminal transferase gaén DNA laï






-82-

Phöông phaùp naøy döïa vaøo khaû naêng ñaëc bieät cuûa enzyme nucleotidyl transferase coù theå gaén cuøng moät loaïi nucleotide thaønh(homopolymer) vaøo ñaàu muùt 3’OH cuûa maïch DNA.

Moät ñoaïn DNA coù ñaàu 3’OH hôû do bò caét bôûi nuclease ñöôïc uû vôtransferase vaø ñöôïc theâm vaøo moät loaïi nucleotide. Plasmid coù ñieåm nhaähieäu do enzyme PstI caét, sau khi uû vôùi terminal transferase , taïo 2 ñaàu mGGGGG. Ñoàng thôøi DNA laï cuõng ñöôïc caét vaø xöû lyù vôùi terminal trankhaùc laø theâm vaøo loaïi nucleotide baét caëp boå sung taïo caùc ñuoâi 3’-CCClaãn 2 loaïi DNA vôùi nhau, caùc ñaàu muùt cuûa 2 loaïi homopolymer coù trìnhvôùi nhau seõ baét caëp (---GGGGG 3’/3’ CCCCC---) neân ñoaïn DNA laï coù thplasmid. Enzyme DNA polymerase I seõ gaén caùc nucleotide töông öùng vaøo ctroáng vaø enzyme ligase seõ haøn dính laïi. Treân plasmid khaûm coù 2 ñieåm nhPstI, taïo thuaän lôïi veà sau khi muoán caét ñoaïn DNA laï rôøi ra.

Caùc phöông phaùp keå treân coù theå söû duïng ñeå gaén caùc ñoaïn DNAvector chuyeån gene naøo. Neáu ôû giöõa caùc DNA laï coù caùc ñieåm nharestriction endonuclease thì noù coù theå bò caét ôû giöõa. Ñeå traùnh ñieàu naøduïng enzyme methylase ñeå methyl hoaù ñoaïn ñoù.

3.3.5. Bieán naïp DNA taùi toå hôïp vaøo teá baøo nhaän: 3.3.5.1. Hoaù bieán naïp:

Soá löôïng lôùn teá baøo vi khuaån ñöôïc xöû lyù CaCl2 laïnh, keøm soác nhieät (42oCtrong 2 phuùt) ñöôïc uû vôùi DNA taùi toå hôïp. Hieäu quaû taïo caùc theå bieán n5-106

theå/1 mg cuûa DNA sieâu xoaén). Töø naêm 1970, vieäc ñöa DNA taùi toå hôïp vkhuaån ñöôïc thöïc hieän deã daøng.

Ñoái vôùi teá baøo ñoäng vaät coù vuù, ñeå thöïc hieän hoaù bieán naïp coù phaùp haáp thuï DNA qua trung gian phosphate calcium. Nhöng caùch naøy cho h

thaáp, toát nhaát chæ 1-2% teá baøo haáp thuï. 3.3.5.2. Ñieän bieán naïp:

Söû duïng doøng ñieän cao theá cuïc boä theo xung coù theå laøm teá baøo hHieäu quaû bieán naïp cao, coù theå ñeán 109-1010theå/1 mg DNA, gaáp 10-20 laàn so vôùi hoabieán naïp; ñoaïn DNA bieán naïp coù kích thöôùc lôùn (25-135 kb). Tuy nhieân tcheát ñaùng keå (50-70% khi hieäu quaû bieán naïp cao). Khoù khaên khaùc laø pcuï chuyeân bieät taïo doøng ñieän coù ñieän theá cao cho moät khoái löôïng xöû

L).






-83-

3.3.5.3. Vi tieâm:Ñaây laø phöông phaùp thoâng duïng coù hieäu quaû trong chuyeån gene

ñoäng vaät coù vuù, taïo caùc ñoäng vaät chuyeån gene (transgenic animals). DNA taùi toå hôïp

ñöôïc tieâm thaúng vaøo teá baøo nhôø kim tieâm raát maûnh. Nhöôïc ñieåm cuûlaø phuï thuoäc nhieàu vaøo kó thuaät cuûa ngöôøi thöïc hieän, chæ coù theå tieâmbaøo neân soá löôïng teá baøo ñöôïc xöû lyù nhoû.

3.3.5.4. Baén DNA vaøo teá baøo:Vôùi teá baøo thöïc vaät , muoán thöïc hieän bieán naïp phaûi taïo teá baøo

teá baøo thì DNA môùi ngaám ñöôïc vaøo trong. Vieäc taïo teá baøo traàn raát pbaøo thöôøng coù söùc soáng keùm, khoù phaân chia ñeå töï taùi sinh. Ñeå khaécphöông phaùp baén DNA taùi toå hôïp tröïc tieáp vaøo teá baøo thöïc vaät ñöôïcbieán ñeå taïo caùc thöïc vaät chuyeån gene (transgenic plants). Caùc haït kim loaïi tungstenhay vaøng (ñöôøng kính trung bình 4 m) mang DNA ñöôïc baén (baèng suùng baén genvôùi toác ñoä nhanh xuyeân thuûng vaùch teá baøo ñöa vaøo trong.

Ngoaøi ra coøn moät soá phöông phaùp khaùc nhö: Söû duïng maøng lipid bao DNA ñeå ñöa vaøo teá baøo. Ví duï: söû duïng caátöï liposome.

Duøng tinh truøng mang DNA taùi toå hôïp xaâm nhaäp vaøo teá baøo tröùng Duøng vector virus töï ñoäng thöïc hieän taûi naïp.

Nhö vaäy, ñeán nay ñaõ coù nhieàu phöông phaùp hoaù lyù, cô hoïc vaø sinhDNA taùi toå hôïp vaøo teá baøo nhaän. Tuyø ñoái töôïng vaø yeâu caàu cuï theå, pñoù coù hieäu quaû vaø ñöôïc söû duïng nhieàu hôn.

3.3.6. Heä thoáng teá baøo nhaän:Nhieàu heä thoáng teá baøo nhaän khaùc nhau ñöôïc söû duïng trong kó thua

DNA. Tuøy muïc ñích söû duïng maø choïn heä thoáng ñôn giaûn hay phöùc taïp.

3.3.6.1. Vi khuaån Escherichia coli (E.coli):Teá baøo lí töôûng laø teá baøo deã nuoâi caáy, deã nhaân gioáng vaø deã d

nhieàu loaïi vector. Vi khuaån E.coli ñaùp öùng raát toát caùc yeâu caàu naøy. E.coli laø vi khuaån gram aâm, hình que, kích thöôùc khoaûng 1 m, khoâng ñoäc,

thöôøng gaëp trong ruoät ngöôøi. Boä gene laø phaân töû DNA voøng troøn khoaû6 caëpbase, naèm ôû vuøng nhaân cuûa teá baøo. Caùc quaù trình phieân maõ vaø dòchnhau, mRNA vöøa ñöôïc toång hôïp môùi tham gia ngay vaøo dòch maõ. Khoâng

ñoåi sau phieân maõ nhö thöôøng xaûy ra ôû teá baøo nhaân chuaån Eukaryotae, toác ñoä phaânbaøo raát nhanh (1 teá baøo E.coli sau 12 giôø phaân baøo cho ra 16 trieäu teá E.coli






-84-

môùi). Vì vaäy, E.coli coù theå xem laø moät trong nhöõng teá baøo nhaän ñôn giaûnphoå bieán nhaát.

Hình 3.9. Vi khuaån E.coli

Ngoaøi ra, caùc vi khuaån Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces cuõng ñöôïc duønglaøm teá baøo nhaän nhöng coù nhieàu haïn cheá do coù raát ít vector chuyeån gen

3.3.6.2. Naám men Saccharomyces cerevisiae:Saccharomyces cerevisiae ñöôïc söû duïng roäng raõi laøm teá baøo nhaän tr

thuaät taùi toå hôïp DNA vì nhieàu lí do: Laø vi sinh vaät nhaân chuaån Eukaryotae ñôn baøo, kích thöôùc khoaûng 5 m, boägene coù khoaûng 1,3x107 caëp base, ñöôïc bieát raát chi tieát veà di truyeàn vaø sineân laø ñoái töôïng moâ hình nghieân cöùu sinh vaät coù nhaân. Coù theå nunaám men qui moâ lôùn trong caùc bioreactor vaø deã daøng thu sinh khoái teá

Vaøi promoter maïnh ñöôïc phaân laäp töø S.cerevisiae, ñaëc bieät laø plasmid voøng 2m duøng laøm vector YAC.

S.cerevisiae coù khaû naêng thöïc hieän caùc bieán ñoåi sau dòch maõ nhö ñöphosphoryl hoaù… ñeå protein coù ñuû hoaït tính sinh hoïc. Teá baøo E.coli vaø caùcProkaryotae khaùc khoâng coù khaû naêng thöïc hieän caùc bieán ñoåi naøS.cerevisiae coù nhieàu lôïi theá trong vieäc bieåu hieän gene cuûa teá baøo Eukaryotae.

S.cerevisiae bình thöôøng tieát ra raát ít loaïi protein. Khi ñöôïc thieát keá saû

protein taùi toå hôïp ngoaïi baøo, saûn phaåm deã tinh saïch. Ñöôïc söû duïng nhieàu trong saûn xuaát baùnh mì vaø bia. Do ñoù FDA ñöasaùch sinh vaät an toaøn, ít ñoøi hoûi thöû nghieäm cao veà ñoäc toá.

Moät soá naám men khaùc cuõng ñöôïc söû duïng nhö Pichia pastoris, Aspergillusnidulans, Neurospore crassa …






-85-

Hình 3.10. Naám men S.cerevisiae

3.3.6.3. Teá baøo thöïc vaät:Xu höôùng gaàn ñaây laø chuù troïng chuyeån gene ngöôøi vaøo thöïc vaä

ñieåm:

Coù theå troàng ôû quy moâ lôùn nhôø naêng löôïng maët trôøi, ít toán keùm. Virus thöïc vaät khoâng ñaùng sôï cho ngöôøi. Cho gene bieåu hieän ôû moâ taïo daàu thöïc vaät neân raát deã taùch vaø thu

Moät vaøi thaønh quaû ban ñaàu ñaõ ñaït ñöôïc nhö enkephalin ôû caây cachaát giaûm ñau; serum albumin ôû khoai taây ñeå taêng maùu; chuyeån gene taïovaøo caây thuoác laù (naêng suaát ñaït ñöôïc laø 1,3% khoái löôïng khoâ); gioánglysozyme vaø lactoferrin laøm tan maùu ñoâng… Thöïc vaät höùa heïn seõ cungprotein y sinh hoïc quan troïng cho con ngöôøi.

3.3.6.4. Teá baøo ñoäng vaät:Nhieàu protein cuûa ñoäng vaät coù vuù khoâng giöõ nguyeân taát caû caùc

chuùng khi caùc gene töông öùng ñöôïc cho bieåu hieän ôû teá baøo vi khuaån Prokaryote hay Eukaryote baäc thaáp nhö naám men. Trong phieân maõ, dòch maõ vaø sau dòch ma Eukaryote baäc cao coù nhieàu bieán ñoåi quan troïng nhö söï caét bôûi protease, hoaù, hydroxyl hoaù vaø söï cuoän laïi thaønh caáu truùc baäc 3. Caùc teá baøo nuoâi thöïc hieän toát caùc bieán ñoåi caàn thieát ñoái vôùi caùc protein taùi toåchuùng laø heä thoáng teá baøo nhaän toát cho vieäc saûn xuaát moät soá protein ñ

Con ngöôøi ñaõ tieán khaù xa trong vieäc chuyeån gene vaøo ñoäng vaät nheo, thoû vaø cho bieåu hieän ôû tuyeán söõa ñeå coù theå thu nhaän nhieàu laàdaøng vôùi soá löôïng ñaùng keå. ÔÛ ñaây, tuyeán söõa trôû thaønh bioreactor saNeáu moät con boø söõa gioáng toát cho 10.000L söõa/naêm, maø moãi lít coù hieäu suaát tinh saïch chæ 50%, thì töø 20 con coù theå thu ñöôïc 100 kg proteinbeänh maùu khoù ñoâng hemophilia, moät con boø chuyeån gene ñuû cung caáp

laøm ñoâng maùu ñaùp öùng nhu caàu cho caû naêm.






-86-

Baûng 3.3. Caùc protein y sinh hoïc ñöôïc bieåu hieän ôû tuyeán söõa vaät nuoâi

1. Erythropoietin2. Factor IX

3. Factor VIII4. Fibrinogen5. Insulin6. Interleukin-2

7. Hemoglobin8. Lactoferrin

9. Lysozyme10. Protein C11. hGH12. G-CSF

13. t-PA14. Peptide töông töï

glucagon15. Albumin huyeát

töông ngöôøi16. Khaùng theå ñôn doøng

Nhieàu thaønh töïu ñaùng keå trong vieäc taïo thöïc vaät vaø ñoäng vaät chudaãn ñeán söï ra ñôøi cuûa phöông phaùp “chaên nuoâi gene” (Gene Farming). Chaên nuoâigene coù theå ñöa ñeán söï saûn xuaát ôû qui moâ coâng nghieäp caùc protein ph

bieåu hieän ñöôïc ôû vi khuaån vaø naám men.3.3.7. Choïn loïc, taïo doøng vaø söï bieåu hieän cuûa gene:Coâng vieäc tieáp theo laø kieåm tra söï hieän dieän cuûa gene mong muoán

ñuùng doøng teá baøo nhö yù. Khi xaùc nhaän DNA taùi toå hôïp ñaõ xaâm nhaämang ñuùng gene caàn thieát thì cho chuùng sinh saûn ñeå taïo doøng vaø taïo ñigene bieåu hieän. 3.3.7.1. Xaùc ñònh doøng vi khuaån chöùa plasmid taùi toå hôïp:

Trong thí nghieäm taïo plasmid taùi toå hôïp, doøng vi khuaån moïc leân goà Teá baøo vi khuaån khoâng nhaän ñöôïc plasmid. Teá baøo nhaän ñöôïc plasmid nhöng khoâng coù gene laï. Teá baøo vi khuaån nhaän ñöôïc ñuùng plasmid taùi toå hôïp.

Vì vaäy, vieäc xaùc ñònh ñuùng doøng vi khuaån chöùa plasmid taùi toå hnhieàu coâng söùc. Coù 3 höôùng chính ñeå choïn loïc doøng:

Lai nucleic acid: laøm tan khuaån laïc vi khuaån treân giaáy loïc nitrocellulose, thoaùt ra gaén treân giaáy loïc. DNA coù theå ñöôïc lai vôùi caùc maãu thöûmang daáu phoùng xaï ñeå xaùc ñònh ñuùng doøng muïc tieâu.

Phaùt hieän kieåu hình: phöông phaùp naøy ñoøi hoûi doøng muïc tieâu phaûi coù bra ôû daïng protein deã phaùt hieän baèng caùc pheùp thöû (ví duï nhö bieán cho cô chaát thích hôïp).

Phaûn öùng mieãn nhieãm: ñoøi hoûi doøng muïc tieâu phaûi bieåu hieän ra daïng gaén ñaëc hieäu vôùi caùc khaùng theå maãu.

Söï choïn löïa phöông phaùp tuyø thuoäc vaøo muïc tieâu, chi phí vaø thônghieäm.






-87-

3.3.7.2. Söï bieåu hieän cuûa gene ñöôïc taïo doøng:Muoán gene taïo doøng coù bieåu hieän toång hôïp protein caàn caáu taïo v

caùc yeáu toá phieân maõ vaø dòch maõ, goïi laø vector bieåu hieän.

Muïc ñích cuûa vieäc taïo doøng caùc gene cuûa ñoäng vaät coù vuù, nhaát laø taïo ra saûn phaåm gioáng nhö trong cô theå vôùi soá löôïng lôùn vaø coù giaùSöï bieåu hieän caùc gene sinh vaät nhaân chuaån Eukaryotae trong teá baøo vi khuaån nhieàukhi gaëp trôû ngaïi, do ñoù caàn phaûi tìm caùc yeáu toá cho gene bieåu hieän toái

Soá löôïng hôïp lyù caùc baûn sao cuûa vector plasmid ñoái vôùi moät teá baø Choïn promoter maïnh ñeå phieân maõ toát. Coù trình töï taïo ñieåm baùm vaøo ribosome vaø DNA phuï cho dòch maõ toá Choïn löïa caùc codon toát cho dòch maõ trong gene ñöôïc taïo doøng. DNA taùi toå hôïp coù söï oån ñònh laâu daøi. Traùnh söï thuyû giaûi protein do caùc enzyme cuûa teá baøo.

3.3.8. Ví duï:Naêm 1982, insulin ngöôøi saûn xuaát töø phöông phaùp taùi toå hôïp ñaõ ñ

maïi hoùa bôûi taäp ñoaøn Eli Lilly. Phöông phaùp saûn xuaát naøy bieåu hieänchuoãi B rieâng bieät baèng caùch söû duïng hai heä thoáng bieåu hieän Escherichia coli, tinhsaïch roài troän hai chuoãi vôùi nhau in vitro taïo caàu noái disulfide nhôø caùc d

S-sulfonate ñeå hình thaønh insulin coù hoaït tính. Öu ñieåm cuûa phöông phaùkhoâng phaûi söû duïng caùc enzyme ñaét tieàn ñeå loaïi boû ñoaïn peptide C nñieåm laø hieäu suaát thaáp, ñoä chính xaùc cuûa quaù trình taïo caáu noái S-S khlaãn daïng insulin gaáp cuoän khoâng chính xaùc, gaây ñaùp öùng mieãn dòch ñaëtroïng cho beänh nhaân khi söû duïng. Do ñoù, Eli Lilly phaùt trieån moät phöôngcaûi tieán hôn, bieåu hieän proinsulin thay vì bieåu hieän hai chuoãi A vaø B rieâphöông phaùp cuõ, taïo caàu noái disulfide in vitro, sau ñoù phaân caét ñoaïn pephai ñoaïn A vaø B baèng trypsin vaø carboxypeptidase, taïo thaønh insulin.

Moät phöông phaùp khaùc ñöôïc phaùt trieån bôûi taäp ñoaøn Novo Nordiskmini-proinsulin bao goàm chuoãi A vaø chuoãi B noái vôùi nhau baèng 2 amino bieåu hieän trong naám men, sau ñoù xöû lí mini-proinsulin in vitro baèng trypsin insulin. Phöông phaùp naøy coù nhieàu thuaän lôïi nhö caàu noái disulfide ñöôïc trong quaù trình bieåu hieän vaø quaù trình tieát mini-proinsulin, mini-proinsulin chieát taùch vaø tinh saïch deã daøng do ñöôïc tieát thaúng ra moâi tröôøng nuoâi c

Hieän taïi, ngöôøi ta vaãn tieáp tuïc phaùt trieån nhöõng phöông phaùp saûn

taùi toå hôïp. Coâng ty Hoechst ñaõ ñöa ra moät phöông phaùp saûn xuaát insuli






-88-

bieåu hieän moät daïng daãn xuaát môùi cuûa insulin hoaëc bieåu hieän preproi E.coli; taïo caàu noái disulfide in vitro; sau ñoù xöû lyù baèng lysylendopeptidaclostripain/carboxypeptidase; cuoái cuøng taïo ra insulin.

Gaàn ñaây, coâng ty Bio-Technology Geneeral ñaõ ñöa ra moät phöông phaùTrong phöông phaùp naøy, moät daïng protein dung hôïp bao goàm superoxide di(SOD) gaén vôùi proinsulin ñöôïc bieåu hieän trong teá baøo E.coli. Baèng caùch naøy, hieäusuaát cuûa quaù trình bieåu hieän protein vaø hieäu quaû cuûa quaù trình hình thnoái ñöôïc cao hôn. Sau ñoù, proinsulin ñöôïc chuyeån thaønh insulin nhôø xöû lyùvaø carboxypeptidase. Baèng nhöõng caùch töông töï nhö theá, ngöôøi ta ñaõ ñöcaøng nhieàu caùc phöông phaùp saûn xuaát insulin taùi toå hôïp vaø caûi tieánnaâng cao hieäu quaû cuûa quaù trình bieåu hieän protein, hình thaønh caàu nochuyeån proinsulin thaønh insulin [20].

Muïc ñích cuûa nhöõng nghieân cöùu, phaùt minh hieän taïi laø muoán phaheä thoáng bieåu hieän vaø moät phöông phaùp saûn xuaát insulin coù naêng suaásaûn xuaát phaûi ngang baèng hay vöôït troäi so vôùi nhöõng heä thoáng saûn xuañaây. Caùc nghieân cöùu trong giai ñoaïn naøy nhaèm caûi tieán phöông phaùp coåcaùc tieàn chaát cuûa insulin thaønh insulin; nghieân cöùu ra moâi tröôøng toái öu thaønh caùc caàu noái caàn thieát cho vieäc bieåu hieän hoaït tính cuûa insulin; tìm

bieåu hieän insulin cho naêng suaát cao, saûn löôïng cao.Sau ñaây xin giôùi thieäu phöông phaùp nuoâi caáy Escherichia coli ñeå toång hôïp

mini-proinsulin (MPI) baèng heä thoáng leân men töï ñoäng [14,15,16].Mini-proinsulin (MPI) coù caáu truùc töông töï vôùi proinsulin, chæ khaùc la

ñoaïn peptide C töï nhieân cuûa proinsulin goàm 31 amino acid baèng moät ñoaïnngaén hôn (9 amino acid), giuùp deã daøng cho vieäc tinh cheá vaø gia taêng hiecuoän daãn ñeán taêng hieäu suaát hình thaønh insulin coù hoaït tính hôn moâ hình

Ñoaïn peptide C trong MPI laø moät trình töï 9 amino acid bao goàm Argmoät trình töï mini: Tyr-Pro-Gly-Asp-Val vaø Lys-Arg. Trong ñoù trình töï mini neân caáu truùc -turn naèm giöõa 2 vò trí amino acid Arg-Arg vaø Lys-Arg, ñöôïc ndieän vaø phaân caét bôûi trypsin cuøng carboxypeptidase. Caáu truùc -turn seõ “gaáp ñoâi”caáu truùc MPI giuùp cho hai chuoãi A vaø B ñöôïc tieáp xuùc vôùi nhau toát hhình thaønh caùc caàu noái disulfide cuõng seõ chính xaùc hôn.

3.3.8.1. Toång hôïp gene mpi maõ hoaù cho MPI bieåu hieän trong E.coli baèng phö phaùp PCR:






-89-

Thoâng thöôøng caùc gene cuûa teá baøo Eukaryote bieåu hieän keùm hieäu quaû trongcaùc heä thoáng bieåu hieän ôû vi khuaån (Prokaryote). Moät nguyeân nhaân gaây ra söï bieåuhieän keùm naøy laø do caùc codon treân boä gene cuûa teá baøo Eukaryote khoâng ñöôïc “öa

thích” ôû teá baøo vi khuaån. Do ñoù ngöôøi ta thieát keá moät gene toång hôïp ñbieåu hieän protein cuûa Eukaryote coù mang caùc codon ñöôïc “öa thích” ôû Prokaryote.Ñieàu naøy ñöôïc thöïc hieän nhanh choùng baèng phöông phaùp PCR hai böôùtwo-stepPCR). Trong phöông phaùp naøy, caàn bieát tröôùc trình töï gene caàn toång hôïp,caùc caëp moài coù trình töï töông öùng vôùi gene caàn toång hôïp vaø coù khaû nnhau trong khoaûng 10-20 nucleotide (ôû ñaây moài cuõng ñoàng thôøi laø maïchsöï khueách ñaïi). Hai phaûn öùng PCR ñöôïc thöïc hieän lieân tieáp, phaûn öùngra DNA baûn maãu ñuùng vôùi gene caàn toång hôïp maø sau ñoù ñöôïc khueáphaûn öùng thöù hai.

Trong tröôøng hôïp gene mpi, döïa vaøo trình töï gene insulin ngöôøi ñöôïc coângtreân ngaân haøng gene (GeneBank NM_000207), boä maõ cuûa E. coli, caùc nhaø khoa hoïcñaõ thieá t keá hai caëp moài Ins1F/Ins2R vaø Ins3F/Ins4R. Phaûn öùng PCR thöù nthöïc hieän rieâng reõ cho töøng caëp moài. Saûn phaåm thu nhaän cuûa moãi ptroän chung vôùi nhau theo tæ leä 1:1 ñeå laøm khuoân maãu cho phaûn öùng PCcaëp moài Ins1F/Ins4R. Saûn phaåm thu ñöôïc cuûa laàn PCR thöù hai chính laø g mpi.

Baûng 3.4. Moài duøng ñeå toång hôïp gene mpi






-90-

Hình 3.11. Sô ñoà minh hoïa vieäc toång hôïp gene mpi baèng phöông phaùp PCR hai böChuù thích: 1 – Moài Ins1F; 2 – Moài Ins2R; 3 – Moài Ins3F; 4 – Moài Ins4R

Phaûn öùng PCR1: dNTP (2mM moãi loaïi) 10L Ñeäm PCR (10X) 10L Moài Ins1F/ Ins3F (100 pmol) 1L Moài Ins2R/ Ins4R (100 pmol) 1L Pfu DNA polymerase 2,5U Nöôùc caát ñuû 100L

Saûn phaåm PCR thu ñöôïc töông öùng vôùi moãi caëp moài ñöôïc ñaët teSP34, ñöôïc tinh cheá qua coät GFX vaø ñöôïc duøng laøm khuoân cho phaûn öùn

Phaûn öùng PCR2: dNTP (2mM moãi loaïi) 10L Ñeäm PCR (10X) 10L SP12 (100ng/ L) 1 L SP34 (100ng/ L) 1 L Moài Ins1F (10 pmol) 2L Moài Ins4R (10 pmol) 2L Pfu DNA polymerase 2,5U Nöôùc caát ñuû 100L

Saûn phaåm thu ñöôïc töø PCR2 chính laø gene mpi, ñöôïc ñieän di kieåm tra treân gelagarose 1,5% vaø tinh cheá giöõ laïi cho muïc ñích taïo doøng.






-91-

3.3.8.2. Taïo plasmid taùi toå hôïp, bieán naïp vaøo teá baøo E.coli: Plasmid pET 43.1.a coù kích thöôùc 7275bp bao goàm trình töï sao cheùp orkhaùng ampicillin, trình töï promoter T7 lac, gene lacIq, vuøng MCS, ñöôïc cung

caáp töø coâng ty Novagene. Heä thoáng pET laø heä thoáng taïo doøng vaprotein taùi toå hôïp raát maïnh trong E.coli. Moät trong nhöõng chuûng E.coli ñöôïc öùng duïng roäng raõi cho muïc tieâu bieåu caùc protein taùi toå hôïp laø E.coli BL21. Taát caû caùc chuûng E.Coli BL21 ñeàukhoâng coù protease ñöôïc maõ hoaù bôûi gene lon vaø thieáu protease maøng ngoaøiñöôïc maõ hoaù bôûi gene ompT . Vì vaäy, protein taùi toå hôïp seõ toàn taïi beàn vtrong teá baøo BL21 so vôùi nhöõng chuûng chuû khaùc coù nhöõng proteae naøy

E.coli BL21(DE3) laø chuûng chuû E.coli BL21 coù chöùa theå tieàm tan cuûa thöïckhuaån theå DE3 (moät chuyeån theå cuûa thöïc khuaån theå ) mang ñoaïn DNA chöùa genelacI , promoter lacUV5 vaø gene maõ hoaù T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerañöôïc ñaët döôùi söï kieåm soaùt phieân maõ cuûa promoter lacUV5. Ñaây laø moät promoterñöôïc caûm öùng bôûi lactose hoaëc thio--D-galactosidase (IPTG). Do vaäy, khi boå dungIPTG vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy, gene maõ hoaù cho T7 RNA polymerase seõhoaù, T7 RNA polymerase taïo thaønh xuùc taùc vieäc phieân maõ gene muïc tieâubieåu hieän.

Chuûng chuû E. coli BL21(DE3) ñöôïc duøng ñeå bieåu hieän gene trong plasmidpET 43.1.a cuõng ñöôïc cung caáp bôûi Novagene.

Caét plasmid pET 43.1.a baèng enzyme caét EcoRV. Thu nhaän plasmid DNAgel agarose 0,8% vaø tinh cheá. Ñoaïn DNA cuûa gene mpi thu nhaän ôû treân ñöôïcnoái vaøo pET 43.1.a taïo plasmid taùi toå hôïp ñaët teân pET43Ins. Ñieänhoãn hôïp dòch noái vaøo teá baøo E. coli BL21(DE3).

Khi ñoaïn gene maõ hoaù cho MPI ñöôïc cheøn vaøo vuøng MCS cuûa ve

43.1.a thì söï bieåu hieän cho gene maõ hoaù cho MPI chòu söï kieåm soaùpromoter. Promotor naøy seõ hoaït ñoäng khi T7 RNA polymerase cuûa teá b E.coliBL21(DE3) baùm vaøo. Treân caùc vector pET 43.1.a cuõng chöùa gene lacI maõ hoaù cho moät protein öùc cheá gaén vaøo vuøng operator lac treân promotor T7,ngaên caûn söï phieân maõ cho ñeán khi coù söï caûm öùng bôûi IPTG. Proñöôïc bieåu hieän theo cô cheá kieåm soaùt aâm cuûa heä thoáng operon lac khi chaátcaûm öùng IPTG ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy.

3.3.8.3. Nuoâi caáy E.coli bieåu hieän MPI baèng heä thoáng leân men töï ñoäng:






-92-

Heä thoáng leân men töï ñoäng BioTron – LiFlusGX 05-08GX-05 laø mbioreactor ñöôïc öùng duïng ñeå nuoâi caáy nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau nhsinh vaät, teá baøo thöïc vaät vaø teá baøo ñoäng vaät.

Heä thoáng naøy coù theå thöïc hieän caùc kieåu nuoâi caáy nhö: nuoâi caculture), nuoâi caáy lieân tuïc (continuous culture) vaø nuoâi caáy fed-batch döôùkhieån cuûa heä vi xöû lyù, coù theå kieåm soaùt vaø ñieàu chænh caùc giaù tròoxy hoøa tan… trong quaù trình nuoâi caáy.

Hình 3.12. Caùc boä phaän chính cuûa heä thoáng leân men töï ñoäng BioTron-LiFlus GX 05-08GX-08

Sô löôïc moät quy trình leân men mini-proinsulin trong moâi tröôøng loûnkhí- coù khuaáy troän, coù kieåm soaùt bao goàm caùc böôùc sau:

Chuaån bò gioáng, moâi tröôøng vaø thieát bò leân men. Leân men. Ly taâm thu dòch nuoâi caáy. Tinh saïch mini-proinsulin baèng ñieän di mao quaûn.

3.3.8.3.1. Chuaån bò gioáng: Giöõ gioáng:

Ñaây laø böôùc quan troïng trong hoaït ñoäng vaän haønh moät heä thoáng leGiöõ gioáng phaûi baûo ñaûm moät soá yeâu caàu sau nhö: duy trì hoaït tínhthôøi gian daøi (khoâng xaûy ra hieän töôïng thoaùi hoùa, khoâng laøm giaûm ktröôûng vaø naêng löïc saûn xuaát cuûa gioáng) vaø khoâng bò taïp nhieãm.

Caáy chuyeàn:Böôùc naøy nhaèm hoaït hoùa gioáng sau thôøi gian caát giöõ ôû nhieät ño

khi ñöa vaøo caùc böôùc nhaân gioáng. Caáy chuyeàn thöôøng ñöôïc thöïc hietröôøng thaïch nghieâng, uû trong tuû aám ôû nhieät ñoä thích hôïp ñeán khi vi trieån thaønh moät lôùp treân maët thaïch. Moâi tröôøng nuoâi caáy trong giai ñ






-93-

baûo ñaûm caùc yeáu dinh döôõng caàn thieát, ñieàu kieän nuoâi caáy nhö nhieätthoaùng khí phaûi ñaït giaù trò toái öu cho chuûng.

Nhaân gioáng:

Muïc ñích cuûa nhaân gioáng laø taïo moät löôïng sinh khoái ñuû lôùn ñeåtrình saûn xuaát. Quaù trình nhaân gioáng thöôøng döøng laïi ôû giai ñoaïn cuoái ckhi ñoù hoaït tính cuûa gioáng laø maïnh nhaát. Quaù trình nhaân gioáng thöôøng cgiai ñoaïn:

Nhaân gioáng caáp 1:Thöôøng laø thoâng qua hoaït ñoäng nuoâi caáy laéc trong bình tam giaùc. N

caáp 1 vôùi muïc ñích laø taêng sinh khoái vaø ñaùnh giaù chuûng tröôùc khi ñöa vxuaát.

Nhaân gioáng caáp 2:Thöïc hieän trong noài caáy maàm vôùi theå tích baèng khoaûng 1020% theå tích noài

leân men chính. Giai ñoaïn naøy cung caáp ñaày ñuû caùc ñieàu kieän toái öu nhaádinh döôõng trong moâi tröôøng nuoái caáy, pH, nhieät ñoä, …) ñeå taêng tröôûng max.

3.3.8.3.2. Chuaån bò moâi tröôøng vaø thieát bò leân men Thieát keá moâi tröôøng nuoâi caáy:

Tuøy theo chuûng vi sinh vaät vaø phöông phaùp leân men maø choïn moâi t

caáy thích hôïp. Vieâc thieát keá thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vbaûo ñuû löôïng ñeå phuïc vuï cho vieäc taêng sinh khoái, taïo caùc chaát trao ñoånaêng löôïng cho vieäc duy trì teá baøo vaø söï sinh toång hôïp. Caên cöù vaøo thaøm löôïng caùc chaát trong teá baøo maø thieát keá ñuû thaønh phaàn vaø löôïngthu nhaän ñöôïc sinh khoái theo yeâu caàu vaø ñaûm baûo saûn xuaát.

Thaønh phaàn moâi tröôøng duøng nuoâi caáy E.coli ñeå saûn xuaát MPI theo kieåu leânmen fed-batch: 1,5g (NH4)2SO4, 211gcao naám men, 5gMgSO4.7H2O vaø 274g glucose.

Thanh truøng moâi tröôøng vaø thieát bò:Muïc ñích cuûa thanh truøng moâi tröôøng vaø thieát bò leân men laø loaïi b

gaây taïp nhieãm sinh hoïc (nhö naám moác, naám men, vi khuaån, phage).

3.3.8.3.3. Leân menTrong quaù trình tieán haønh nuoâi caáy E.coli ñeå saûn xuaát MPI taùi toå hôïp chuùng

caàn kieåm soaùt chaët cheõ caùc thoâng soá sau: Kieåm soaùt toác ñoä naïp lieäu trong quaù trình leân men:

Quaù trình leân men saûn xuaát MPI taùi toå hôïp ñöôïc tieán haønh theo kiefed-batch do vaäy kieåm soaùt toác ñoä naïp lieäu trong quaù trình leân men laø






-94-

nhöõng vaán ñeà quan troïng. Toác ñoä naïp lieäu caàn ñöôïc kieåm soaùt sao chdinh döôõng cuûa caùc chaát trong moâi tröôøng leân men khoâng quaù thöøa hoñaëc bieät laø caùc cô chaát giôùi haïn vaø phaûi luoân baûo ñaûm moät soá yeáu t

Chæ naïp theo yeâu caàu söû duïng cuûa chuûng, khoâng naïp quaù daãn ñeoxy cung caáp. Khoâng naïp thieáu laøm haïn cheá toác ñoä taêng tröôûng vaø toác ñoä

chuûng. Kieåm soaùt taêng tröôûng teá baøo:

Laø hoaït ñoäng nhaèm haïn cheá söï taêng tröôûng cuûa chuûng trong nhöõcaàn thieát cuûa quaù trình. Trong thöïc teá, ngöôøi ta thöôøng söû duïng caùc ptheo doõi taêng tröôûng nhö ñeám teá baøo, phaân tích troïng löôïng teá baøo khothoâng qua maùy ño quang phoå (OD). Ñoä haáp thu cuûa aùnh saùng ôû böôùc(OD600) phaûn aùnh maät ñoä teá baøo vi khuaån E.coli trong dòch leân men. Neáu maät ñoä tebaøo vi khuaån E.coli cao thì OD600 cao. Do ñoù coù theå ño OD600 ñeå xaùc ñònh maät ñoä teá baøo E.coli.

Kieåm soaùt taêng tröôûng teá baøo baèng caùch: boå sung caùc chaát ötröôûng (Tween 40, 60, penicilin), thay ñoåi yeáu toá sinh lyù (nhieät ñoä), haïnlöôïng cô chaát giôùi haïn.

Kieåm soaùt pH:Vi sinh vaät noùi chung vaø E.coli noùi rieâng raát nhaïy caûm vôùi söï thay ñoåi pH

moâi tröôøng. Khi teá baøo sinh tröôûng, nhöõng saûn phaåm trao ñoåi chaát ñöôïvaøo moâi tröôøng, trong ñoù coù nhöõng chaát laøm thay ñoåi pH cuûa moâi tröDo ñoù, pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy phaûi ñöôïc ño vaø ñieàu chænh baèng caùch theâm acidhoaëc base ñeå duy trì pH thích hôïp nhaèm baûo ñaûm pH sinh lyù cuûa teá baøtrình phaùt trieån vaø sinh toång hôïp caùc chaát. Ñoái vôùi leân men saûn xuaáthôïp söû duïng E.coli laøm teá baøo chuû, caàn phaûi kieåm soaùt pH töø 7,0 0,2 vaø noàng ñoäacid acetic khoâng ñöôïc lôùn hôn 0,9gL-1 . Taùc nhaân duøng ñeå chænh pH laø acid (H2SO4,HCl, …) hoaëc base (NaOH, KOH, NH3, urea, …). Trong qui trình leân men MPI baèngheä thoáng leân men töï ñoäng BioTron – LiFlusGX 05-08GX-05 thì giaù trò pH ñsoaùt töï ñoäng. Heä thoáng naøy bao goàm:

Ñieän cöïc ño pH (electrode) gaén tröïc tieáp vaøo boàn leân men trong quaù tnuoâi caáy.

Heä thoáng trung chuyeån vaø khuyeách ñaïi tín hieäu (transmiter ).






-95-

Heä thoáng ñieàu khieån (controller ): cho pheùp caøi ñaët giaù trò pH caàn kieåm shieån thò giaù trò pH hieän taïi ôû trong boàn leân men, so saùnh söï cheânhñöa tín hieäu ñieàu khieån ñeå môû hay ñoùng van naïp taùc nhaân (H+, OH-) hieäu

chænh pH vaøo. Van töï ñoäng (control valve): cho pheùp naïp hay ngaét taùc nhaân chænh pH vboàn leân men.

Kieåm soaùt nhieät ñoä:Nhieät ñoä nuoâi caáy aûnh höôûng ñeán taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät v

saûn phaåm. E.coli coù nhieät ñoä taêng tröôûng toái öu ôû 37oC. Trong nuoâi caáy caàn ñaûm baûonhieät ñoä toái öu cuûa chuûng, tuy nhieân trong töøng giai ñoaïn, nhieät ñoä coùtrong giôùi haïn cho pheùp.

Trong thöïc teá, ngöôøi ta thöôøng duøng nöôùc laïnh (5-27oC) ñeå giaûi nhieät. Thieát bòtrao ñoåi nhieät coù theå laø daïng oáng ñaët trong noài leân men.

Kieåm soaùt haøm löôïng oxy hoaø tan trong moâi tröôøng leân men: E.coli laø vi khuaån hieáu khí tuøy tieän nhöng trong nuoâi caáy E.coli ñeå saûn xuaát

MPI taùi toå hôïp thì caàn cung caáp oxy trong caû quaù trình. Haøm löôïng oxy catrì lôùn hôn 30% khoâng khí baõo hoaø. Oxy ñöôïc cung caáp baèng caùch khuaáy

3.3.8.3.4. Ly taâm thu dòch nuoâi caáy

Dòch sau nuoâi caáy, tieán haønh ñem li taâm thu sinh khoái, boû dòch noåisau li taâm ñöôïc tinh saïch, thu mini-proinsulin baèng phöông phaùp ñieän di mao

3.4. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT KHAÙNG THEÅ ÑÔN DOØNG:Naêm 1975, kó thuaät taïo khaùng theå ñôn doøng hybridoma ra ñôøi ñaõ ta

cuoäc caùch maïng trong vieäc saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng. Phöông phaùtieán haønh nhö sau:

Tieâm khaùng nguyeân vaøo chuoät. Taùch teá baøo laù laùch chuoät (laø nñöôïc taïo thaønh) troän vôùi teá baøo myeloma (teá baøo baïch caàu ung thöpolyethylene glycol vaøo dòch huyeàn phuø chöùa hoãn hôïp 2 loaïi teá baøohôïp nuoâi caáy taïo ra teá baøo lai.

Nuoâi hoãn hôïp treân trong moâi tröôøng choïn loïc chöùa HAT (moät hohypoxanthine, amionpterin vaø thymidine). Teá baøo laù laùch chuoät (khaùHAT) seõ phaùt trieån bình thöôøng trong moät thôøi gian, coøn teá baøo(khoâng khaùng ñöôïc HAT) seõ cheát ngay. Teá baøo lai phaùt trieån bình thö

2 ñaëc ñieåm: phaân chia voâ haïn (nhaän ñöôïc töø teá baøo myeloma) vaø trao ñoåi caàn thieát (nhaän ñöôïc töø teá baøo laù laùch chuoät).






-96-

Thu nhaän teá baøo lai noåi treân beà maët moâi tröôøng. Tieán haønh taïo doøvitro hoaëc tieâm teá baøo lai vaøo khoang buïng cuûa chuoät. Chuoät seõ snhöõng khoái u coù chöùa chaát dòch giaøu khaùng theå.

Ngaøy nay, beân caïnh söï phaùt trieån cuûa coâng ngheä di truyeàn, con ngduïng phöông phaùp naøy ñeå saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng.

Hình 3.13. Sô ñoà kó thuaät taïo khaùng theå ñôn doøng hybridoma

Ví duï: Saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng ñaëc hieäu vôùi -glytamyl transpeptidase.-glytamyl transpeptidase (EC 2.3.2.2) laø enzyme xuùc taùc cho söï thuyû ph

chuyeån vò cuûa nhoùm -glytamyl. Noù coù lieân quan ñeán quaù trình khöû ñoäc ôû mbaøo, söï vaän chuyeån amino acid, peptide ôû gan vaø söï hình thaønh ammoniaÑeå ñònh löôïng enzyme naøy, ngöôøi ta söû duïng khaùng theå ñôn doøng ñaëc -glytamyl transpeptidase trong phöông phaùp ELISA [17].

Caùc böôùc tieán haønh: Taùch enzyme töø thaän cuûa töû thi, sau ñoù hoaø tan trong papain, xöû lyùdòch ammonium sulfate 60%, tinh saïch baèng phöông phaùp saéc kyù coät (chaát haáp phuï laø Sephadex G-150). Enzyme thu nhaän sau cuøng ñöôïc dukhaùng nguyeân trong phöông phaùp hybridoma.






-97-

Trong tuaàn ñaàu tieân, moãi con chuoät ñöïc ñöôïc tieâm vaøo döôùi da vaø g100 g khaùng nguyeân cuøng vôùi 1 löôïng thích taù döôïc Freund thích hôïpFreund laø moät heä nhuõ töông trong daàu thoâ taïo ñieàu kieän thuaän lôïi

thaønh khaùng theå, coù chöùa Mycobacterium tuberculosis ñaõ voâ hoaït vaø saáy khoâ).Sau ñoù, chuùng tieáp tuïc ñöôïc tieâm 3 laàn trong 2 tuaàn tieáp theo, moãi lg khaùng nguyeân vaø taù döôïc. Laàn tieâm cuoái cuøng seõ thöïc hieän 3 n

tieán haønh taùch teá baøo laù laùch. Troän 4x108 teá baøo laù laùch chuoät vaø 8x107 teá baøo myeloma, boå sung theâm PEG.Tieán haønh nuoâi caáy treân moâi tröôøng DMEM (1 loaïi moâi tröôønglucose, muoái KCl, NaCl, MgSO4, vitamin B2, B3, B9 vaø moät soá amino acid) coboå sung 20% huyeát thanh baøo thai beâ vaø HAT (100M hypoxanthine, 400Maminopterin vaø 16M thymidine). Sau moät thôøi gian tieán haønh thu nhaän telai noåi leân treân beà maët moâi tröôøng roài taïo doøng. Nhaân teá baøo lai khaùng theå ñôn doøng ñaëc hieäu vôùi -glytamyl transpeptidase.

3.5. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT ENZYME TÖØ VI SINH VAÄT:Coù 2 phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät ñeå thu nhaän enzyme [7]:

Nuoâi caáy beà maët: moâi tröôøng nuoâi caáy coù cô chaát chuû yeáu laø caùm mì,

boät ñaäu, boät ngoâ, boät saén… ñaõ ñöôïc haáp chín vaø laøm aåm, phoái tmuøn cöa ñeå taêng ñoä xoáp. Trong nhieàu tröôøng hôïp, ngoaøi moâi tröôøngöôøi ta coøn söû duïng moâi tröôøng loûng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät (chmoác) theo phöông phaùp beà maët.

Nuoâi caáy beà saâu: moâi tröôøng nuoâi caáy laø moâi tröôøng loûng. Thaønh pdöôõng cho caùc loaïi vi sinh vaät khaùc nhau seõ khaùc nhau, thöôøng chöùcaùc daïng boät vaø moät soá vaät lieäu khaùc laøm nguoàn carbon. Nguoàn ncaáp bôûi nöôùc chieát ngoâ, nöôùc chieát malt, dòch töï phaân naám men. Tkhoaùng cuûa moâi tröôøng cuõng coù yù nghóa quan troïng trong vieäc taïomong muoán.

Baûng 3.5. So saùnh ñaëc ñieåm cô baûn cuûa 2 phöông phaùp nuoâi caáy








-99-

caáy naêng. naêng vaø thieát bò.12 Dieän tích xaây

döïngDieän tích lôùn. Dieän tích nhoû.

3.5.1. Thu nhaän enzyme saïch töø phöông phaùp nuoâi caáy beà maë 3.5.1.1. Chieát ruùt enzyme töø canh tröôøng nuoâi caáy beà maët:

Phöông phaùp thuû coâng: cheá phaåm enzyme thoâ ñöôïc nghieàn nhoû baèng cocaùt thaïch anh hay boät thuyû tinh sau khi ñöôïc xöû lyù saïch hoaëc baèng mMuïc ñích cuûa quaù trình naøy laø laøm taêng khaû naêng thu nhaän enzymchieát töø teá baøo vi sinh vaät. Dòch chieát thu ñöôïc töø phöông phaùp naøchöùa nhieàu chaát khaùc nhau.

Phöông phaùp chieát ruùt baèng thieát bò khueách taùn: enzyme ñöôïc chuyeån töø teá baøovaøo nöôùc do söï cheânh leäch noàng ñoä enzyme. Caùc thieát bò khueách tnoái tieáp nhau. Trong quaù trình khueách taùn, nhieät ñoä duy trì ôû 25-28oC, cho theâmfocmalin ñeå traùnh nhieãm truøng. Dòch chieát enzyme ñöôïc coâ ñaëc döôthaáp trong chaân khoâng ñeå haøm löôïng chaát khoâ khoâng ít hôn 50-55%.

3.5.1.2. Tinh cheá enzyme: Phöông phaùp keát tuûa baèng dung moâi höõu cô: thöôøng duøng caùc dung moâi höõu c

nhö etanol, izopropanol, acetone , cho theâm 0,2% CaCl2 ñeå laøm taêng khaû naêngkeát tuûa cuûa enzyme vaø laøm beàn caáu truùc cuûa chuùng. Khi caàn taùch enzyme naøo ñoù ra khoûi hoãn hôïp enzyme keát tuûa treân, ta seõ döïa vaøokhaùc nhau trong hoãn hôïp etanol vaø caùc enzyme ñoù ñeå taùch.

Phöông phaùp keát tuûa baèng muoái trung tính: thöôøng duøng sulfat amon, sulfatnatri, sulfat magie. Toát nhaát laø duøng sulfat amon vì ñoä hoaø tan cao, phkeát tuûa khoâng phuï thuoäc nhieät ñoä, khoâng laøm bieán tính enzyme, keátthu ñöôïc coù hoaït tính cao hôn so vôùi phöông phaùp duøng dung moâi höõu

3.5.2. Thu nhaän enzyme saïch töø phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu 3.5.2.1. Phöông phaùp keát tuûa enzyme baèng dung moâi höõu cô hoaëc muoái trung t

Dung dòch leân men töø phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu, sau khi taùch ssinh vaät coù haøm löôïng chaát khoâ raát thaáp (khoaûng 1-3%). Do ñoù ñeå giaûmoâi hoaëc muoái trung tính trong quaù trình keát tuûa, ta phaûi coâ ñaëc chaânnaøy ôû nhieät ñoä thaáp. Thao taùc töông töï nhö thu nhaän enzyme töø phöôngcaáy beà maët. 3.5.2.2. Phöông phaùp haáp phuï hoaøn toaøn bôûi silicagen:






-100-

Ñöôïc thöïc hieän ôû pH 4,7-4,9. Cho dòch enzyme chaûy qua coät nasilicagen. Ñeå taêng quaù trình haáp phuï coù theå cho theâm 6-20% NaCl.

3.6. NAÂNG CAO CHAÁT LÖÔÏNG PROTEIN:Moät trong nhöõng thaønh quaû quan troïng cuûa kó thuaät taùi toå hôïp

duïng ñoät bieán ñieåm ñònh höôùng (site-directed mutagenesis) thay theá caùc amino acidthen choát ñeå naâng cao chaát löôïng protein. Ñeå choïn ñuùng ñieåm thay theá, scuûa ñieän toaùn laø khoâng theå thieáu, daãn ñeán caùc thí nghieäm in silico (thímaùy ñieän toaùn) maø ñeán nay ñaõ phaùt trieån thaønh chuyeân ngaønh môùi (bioinformatics) [8].

Ví duï ñieån hình laø bieän phaùp thay ñoåi tính oån ñònh vaø ñaëc hieä

(Tissue Plasminogen Activator ). t-PA ñöôïc öùng duïng laøm tan cuïc maùu ñoâng. nhieân, noù deã daøng bò thaûi ra khoûi doøng maùu neân phaûi taêng noàng ñoä lyù, maø ñieàu naøy coù theå gaây thöông toån. Do vaäy t-PA môùi ra ñôøi vôùi th

Thay threonine 103 baèng asparagine laøm taêng tính beàn vöõng leân gaáptrong doøng maùu.

Thay ñoaïn amino acid 296-299 töø lysine-histidine-arginine-arginine thaalanine-alanine-alanine-alanine laøm enzyme coù tính ñaëc hieäu cao hôn vôùicuûa cuïc maùu.

Thay asparagine 117 laøm hoài phuïc hoaït tính phaân huyû fibrin nhö enzynhieân.

Söï toå hôïp cuûa caû 3 ñoät bieán ñieåm treân taïo ra t-PA môùi coù ñoàntính.

Ngoaøi ra coù theå naâng cao chaát löôïng protein baèng caùch caûi tieán catöû. Tröôøng hôïp tieâu bieåu laø interferon alfa.

Gioáng nhö nhieàu loaïi protein laï khaùc, interferon alfa nhanh choùng bò

hoaù khi tieâm vaøo cô theå. Haäu quaû laø noù chæ toàn taïi trong heä tuaàn hoangaén, nhö vaäy chuùng ta caàn tieâm nhieàu laàn trong tuaàn nhaèm duy trì taùthuoác. Bieän phaùp naøy taïo ra noàng ñoä interferon alfa trong maùu cao ngatieâm – gaén lieàn vôùi vieäc taêng caùc taùc duïng phuï - vaø caùc möùc noànkhoaûng thôøi gian giöõa caùc laàn tieâm – gaén lieàn vôùi hieäu quaû ñieàu trò bò

Baèng caùch gaén theâm nhaùnh PEG, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ giaûi quyekhaên treân [18]. PEG (polyethylene glycol) laø moät polymer trô, hoaø tan tron

khoâng gaây ñoäc, ñöôïc taïo ra baèng caùch keát noái nhieàu tieåu ñôn vò ethylengaén keát PEG vaøo protein coù taùc duïng ñieàu trò, noù laøm taêng khaû naêng






-101-

nöôùc, baûo veä phaân töû protein vaø khoâng sinh mieãn dòch. Phaàn taän cuønPEG thöôøng laø nhoùm hydroxyl –OH. Ñeå traùnh keát dính cheùo vaø keát tuï, nhoùm hydroxyl taän cuøng thaønh methoxy khoâng phaûn öùng, taïo neân mo

PEG (mPEG). 2 nhaùnh mPEG coù phaân töû löôïng 20 kilodalton sau khi ñöôïc hbaèng hydroxyl succinimide seõ keát dính vaøo interferon alfa thoâng qua töông amino acid lysine, taïo ra loaïi thuoác môùi PEG interferon alfa 40KD coù hieäu qtrò vieâm gan C cao hôn haún.

Hình 3.14. Sô ñoà caáu taïo PEG interferon alfa 40 KDBöôùc vaøo theá kæ XXI, vôùi söï phaùt trieån maïnh meõ cuûa khoa hoïc k

ngheä cheá taïo protein döïa treân neàn taûng Genomics, Proteomics, coâng nghBioinformatics ñang taïo ra theá heä protein thöù hai, ñoù laø caùc protein ñöôïcnhaèm caûi tieán caáu truùc, söï oån ñònh vaø caùc ñaëc tính sinh hoïc coù lôïi ñequaû söû duïng, ñaùp öùng toát hôn nhu caàu cuûa con ngöôøi.





Chöông 4: TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC

-102-

CHÖÔNG 4 : TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HO

Ñeå thöïc hieän baát cöù quaù trình taùch thu nhaän cheá phaåm naøo thì

cöùu vieäc tinh saïch ôû möùc ñoä phaân tích luoân laø böôùc ñaàu tieân, noù duøquaù trình taùch thu nhaän cheá phaåm.Duø protein ñöôïc taïo baèng phöông phaùp naøo thì noù cuõng coù laãn taïp

saûn phaåmcoù haøm löôïng protein cao, ta phaûi traûi qua quaù trình tinh saïch.Ta coù theå chia laøm 2 möùc ñoä tinh saïch:

Möùc ñoä phaân tích (analytical level): duøng ñeå phaân tích ñònh tính, ñònh löôïng ccaáu töû trong maãu.

Möùc ñoä taùch cheá phaåm ( preparative level): duøng ñeå taùch, laøm saïch vaø thu nhcaùc caáu töû.

Haàu heát vieäc tinh saïch protein hay peptide lieân quan tôùi raát nhieàu gÑaàu tieân, thoâng thöôøng ngöôøi ta seõ taùch choïn loïc baèng phöông phaùp loïc, saéc kyù hoaëc trích ly pha raén ñeå coù ñöôïc moät hoãn hôïp (giaøu proteihôn ban ñaàu). Hoãn hôïp naøy sau ñoù seõ tieáp tuïc ñöôïc tinh saïch ôû möùc(thöôøng söû duïng phöông phaùp RP-HPLC) ñeå coù ñöôïc protein mong muoán.

4.1. XÖÛ LYÙ SÔ BOÄ ÑEÅ LAØM TAÊNG NOÀNG ÑOÄ PROTEIN MTöø hoãn hôïp protein ban ñaàu khoâng theå taùch laáy ngay moät protein c

ñoù maø caàn phaûi qua vaøi böôùc xöû lyù ban ñaàu ñeå laøm taêng daàn noàngmuoán, hay laøm giaûm löôïng taïp chaát.

Keát tuûa: vieäc keát tuûa caùc peptide lôùn vaø protein ñöôïc thöïc hieän vôùi höõu cô (methanol, ethanol hay acetone) hoaëc acid (trichloroacetic acid), homuoái noàng ñoä cao (ví duï ammonium sulphate, muoái naøy coù theå keátnhieàu protein maø khoâng laø aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa chuùng), ho

chænh pH ñeán ñieåm ñaúng ñieän. Phöông phaùp naøy ñôn giaûn vaø hienhieân noù seõ gaëp nhieàu khoù khaên ñoái vôùi nhöõng peptide khoù kepeptide nhoû töø pentapeptide trôû xuoáng)

Phöông phaùp sieâu loïc: duøng nhöõng maøng loïc coù loã loïc raát nhoû, coù theåtaêng noàng ñoä dung dòch peptide vaø protein, khoù coù khaû naêng taùch 11 protein cuï theå naøo ñoù.

Phöông phaùp saéc kyù baûn moûng (Thin-Layer Chromatography): laø kyõ thuaät

taùch peptide ñôn giaûn nhaát, noù thöôøng ñöôïc noái tieáp baèng phöông ph






-103-

Trong tröôøng hôïp coù nhieàu taïp chaát trong hoãn hôïp thì noù caàn phaûitheâm.

Saéc kyù trao ñoåi ion (Ion-Exchange Chromatography: IEC): thöôøng duøng ñeå

tinh saïch protein. Coù theå coi ñaây laø 1 daïng ñaëc bieät cuûa saéc kyù htrong ñoù caùc caáu töû maãu mang ñieän coù khaû naêng töông taùc tónh thuaän nghòch vôùi pha tónh laø caùc haït nhöïa mang ñieän traùi daáu, coøncaùc dung dòch ñieän ly. Löïc lieân keát phuï thuoäc vaøo baùn kính ion vaøcuûa pha tónh (soá ñieän tích treân 1 ñôn vò theå tích phaân töû). Phöông phtieàm naêng trong vieäc öùng duïng ôû quy moâ lôùn.

Trong tröôøng hôïp muoán coùù dung dòch cuûa protein noäi baøo thì tröôùcphaûi ñöôïc phaù vôõ ñeå laøm thoaùt dòch beân trong. Nhöõng phaàn khoâng tamembrane, coù theå ñöôïc loaïi boû baèng quaù trình ly taâm hoaëc baèng caùc pkhaùc. Protein hoøa tan coù theå ñöôïc taùch ra vaø tinh saïch töø dung dòch thtrình giaûi laáy nhöõng protein lieân keát vôùi membrane ñoâi khi coù theå thöïc hchaát taåy röûa.

4.2. TINH SAÏCH PROTEIN:Sau khi xöû lyù sô boä, hoãn hôïp ban ñaàu seõ ñöôïc xöû lyù theâm ñeå co

mong muoán. Moät soá phöông phaùp thöôøng söû duïng: Saéc kyù loûng cao aùp pha ñaûo (Reversed-Phase High Pressure Liqui

Chromatography: RP-HPLC): laø phöông phaùp thoâng duïng nhaát ñeå taùch vasaïch protein, thuoäc loaïi saéc kyù coät coù pha ñoäng laø chaát loûng. Hieäu cao cuûa HPLC ñaït ñöôïc laø do vaät lieäu nhoài coät coù kích thöôùc haït r

m) vaø ñoä ñoàng nhaát cao laøm taêng ñaùng keå soá ñóa lyù thuyeát. Vieäccao aùp duy trì aùp suaát cao ôû ñaàu coät nhaèm ñieàu chænh vaø oån ñònh vtaêng toác quaù trình phaân tích. RP-HPLC duøng pha tónh keùm phaân cöï

ñoäng. Khi ñoù caùc dung moâi söû duïng laø dung moâi phaân cöïc, thöôønhôn, reû hôn vaø khoâng gaây oâ nhieãm moâi tröôøng.

Saéc kyù loûng cao aùp pha thuaän (Normal-Phase HPLC): töông töï treân, nhöng phatónh phaân cöïc hôn pha ñoäng. Thöôøng duøng ñeå taùch caùc protein öa nöôù

Saéc kyù aùi löïc (Affinity Chromatography: AC): phöông phaùp naøy döïa treân khaûnaêng giöõ protein baèng nhöõng chaát neàn khoâng hoøa tan, ñöôïc nhoài vacoät saéc kyù.

Phöông phaùp ñieän di mao quaûn (Capillary Electrophoresis – CE): hieän nayñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå taùch protein.






-104-

Xeùt veà maët lyù thuyeát, taát caû caùc phöông phaùp ñieän di (Isotachophoresis: ñieän di ñaúng toác, IEF-Isoelectric Focusing: ñieän di ñaúng ñiecoù theå ñöôïc tieán haønh vôùi coät mao quaûn, treân cuøng 1 loaïi thieát bò ñie

phöông phaùp ñieän di mao quaûn ñöôïc söû duïng phoå bieán nhaát laø phöông pmao quaûn vuøng (Capillary Zone Electrophoresis- CZE ). Khi aùp ñaët ñieän aùp, hai hoaïtñoäng ñieän ñoäng seõ xaûy ra döôùi taùc ñoäng cuûa ñieän tröôøng, ñoù laø söï ñthaåm (Electroosmotic Flow-EOF: söï di chuyeån cuûa 1 lôùp chaát loûng coù ñietaùc duïng cuûa ñieän tröôøng).

Chòu taùc ñoäng ñoàng thôøi cuûa quaù trình ñieän di vaø ñieän thaåm, caùcmaãu mang ñieän tích döông, ñieän tích aâm hoaëc trung hoøa veà ñieän seõ di phía catode vôùi vaän toác khaùc nhau. Caùc phaàn töû mang ñieän tích döông seõnhanh nhaát, hay noùi caùch khaùc, peak cuûa caùc cation treân ñieän di ñoà setröôùc EOF. Caùc anion coù linh ñoä ñieän di nhoû hôn EOF seõ ra sau EOF vaøcoù linh ñoä ñieän di lôùn hôn EOF seõ khoâng phaùt hieän ñöôïc vì di chuyeån veCaùc phaàn töû trung hoøa veà ñieän seõ ñi cuøng vôùi EOF vaø xuaát hieän trecuøng vò trí cuûa EOF.

Löôïng maãu ñöôïc söû duïng khi taùch thöôøng raát nhoû (döôùi 20nL), dkhoù khaên neáu muoán phaùt hieän nhöõng thaønh phaàn coù tæ leä nhoû trong

taïp, chính vì vaäy, tröôùc khi phaân tích ta caàn phaûi laøm giaøu thaønh phaàn ctrong maãu (baèng caùc phöông phaùp xöû lyù sô boä ôû phaàn 4.1).

Saéc kyù raây phaân töû (Size-Exclusion Chromatography: SEC): laø phöông phaùptaùch döïa treân söï khaùc nhau veà kích thöôùc phaân töû cuûa caùc chaát. Vprotein cuï theå khoâng theå thöïc hieän baèng phöông phaùp naøy, noù chænhoùm caùc protein coù kích thöôùc phaân töû gaàn nhau.

Ngöôøi ta cho dung dòch phaân tích ñi qua caùc vaät lieäu coù khaû naêngboä khung gel hoaëc caùc raây phaân töû. Pha tónh trong saéc kyù gel laø dung caùc loã cuûa gel, coøn pha ñoäng cuõng chính laø dung moâi chaïy qua. Noùi catónh vaø pha ñoäng trong saéc kyù gel ñöôïc caáu taïo töø 1 chaát hay töø 1 hoãn h

Caùc phaân töû coù kích thöôùc lôùn hôn loã gel khoâng haáp phuï leânkhueách taùn vaøo caùc khe hôû giöõa caùc haït raén xoáp, coøn caùc phaân töû hôn coù theå ñi xuyeân vaøo caùc loã cuûa gel vaøo saâu beân trong. Khi pha ñoqua, caùc phaân töû seõ ñöôïc röûa giaûi ra khoûi gel theo thöù töï khaùc nhau. Ckích thöôùc lôùn hôn loã gel seõ theo pha ñoäng ñi ra ñaàu tieân, caùc phaân töû c






-105-

beù nhaát seõ ñi ra sau cuøng. Ñoái vôùi caùc phaân töû coù caáu truùc khoângnhau, thöù töï röûa giaûi seõ giaûm theo chieàu giaûm troïng löôïng phaân töû.

4.3. ÑAÙNH GIAÙ KEÁT QUAÛ TINH SAÏCH:Sau khi tinh saïch thì caàn phaûi kieåm chöùng veà möùc ñoä ñoàng

(homogeneity) vaø nhöõng tính chaát veà caáu truùc (structural characterization) ñeå coùñöôïc saûn phaåm theo yeâu caàu. Coù nhieàu phöông phaùp phaân tích ñöôïc söû

Hình 4.1. Moái lieân heä giöõa caùc phöông phaùp phaân tích

Hình treân cho ta thaáy moái lieân heä giöõa caùc phöông phaùp phaân phöông phaùp phaân tích amino acid (amino acid analysis) thích hôïp ñeå phaân tích caáutruùc hoùa trò cuûa phaân töû; trong khi ñoù phöông phaùp phaân tích thöù tsequence

analysis) cho pheùp ñaùnh giaù caû möùc ñoä ñoàng nhaát laãn caáu truùc phaân tökhoái phoå (mass spectrometry) cuõng laø moät phöông phaùp quan troïng ñeå phaânprotein. Phöông phaùp coäng höôûng töø haït nhaân(nuclear magnetic resonance- NMR) laømoät trong nhöõng phöông phaùp chính ñeå phaân tích caáu truùc cuûa protein dòch. Phöông phaùp quang phoå töû ngoaïi (ultraviolet spectroscopy) thöôøng duøng ñeåphaân tích amino acid coù chöùa voøng thôm, ñoàng thôøi cuõng laø coâng cuï kieåm soaùt vieäc tinh saïch protein. Tuy nhieân nhöõng thoâng tin veà caùc lieâncuûa protein thì vaãn coøn nhieàu haïn cheá.

Keát quaû ñaùnh giaù ñònh löôïng quaù trình tinh saïch protein ñöôïc goïitính”. Thuaät ngöõ naøy thöôøng ñöôïc söû duïng cho enzyme. Söï phaân tích entreân nhöõng phaûn öùng xuùc taùc ñaëc hieäu cuûa enzyme, trong khi ñoù, proteinhöõng tính chaát vaät lyù cuûa noù, ví duï döïa treân coäng toá coù khaû naên(highly chromogenic cofactor ) ta coù theå bieát ñöôïc thoâng qua phöông phaùp quphoå. Hoaït tính rieâng laø thöôùc ño cho möùc ñoä tinh saïch, noù ñöôïc ñònh ngiöõa löôïng protein theå hieän hoaït tính trong dung dòch so vôùi toång soá produng dòch. Hoaït tính rieâng gia taêng trong quaù trình tinh saïch do ta ñaõ loaïi b






-106-

protein khaùc khoâng coù hoaït tính naøy. Moät protein hoaøn toaøn tinh saïch nhieänhoaït tính rieâng cuûa protein aáy cao nhaát.





Chöông 5: XÖÛ LYÙ VAØ TOÀN TRÖÕ PROTEIN Y SINH HOÏC

-107-

CHÖÔNG 5 : XÖÛ LYÙ VAØ TOÀN TRÖÕPROTEIN Y SINH HOÏC

5.1. TÍNH OÅN ÑÒNH CUÛA PROTEIN:Noùi chung, protein thu ñöôïc töø quaù trình tinh saïch thöôøng giöõ laïi m

nöôùc vaø acid. Trong quaù trình toàn tröõ moät soá bieán ñoåi coù theå dieãn ra nsöï haáp phuï, söï haáp thuï hay giaûi phoùng aåm, bieán ñoåi do tieáp xuùc vnhieät…. Nhìn chung, traïng thaùi raén beàn hôn so vôùi traïng thaùi dung dòch tötraïng thaùi dung dòch, baûn chaát cuûa dung moâi, noàng ñoä, pH vaø nhieät ñoäraát lôùn ñeán tính oån ñònh. Söï haáp phuï leân beà maët vaät chöùa, söï voâ ho

hoùa, oxi hoùa, deamin hoùa, phaù maïch vaø söï saép xeáp laïi maïch laø nhöõnxaûy ra cho protein neáu noù khoâng oån ñònh trong dung dòch. Coù moät vaøi trökhi ôû daïng raén ngöôøi ta laïi nhaän thaáy noù keùm beàn hôn so vôùi khi ôû daÑoái vôùi daïng raén, söï khoâng oån ñònh neáu xaûy ra thì cuõng töông töï nhö da(phaù maïch, hình thaønh caùc lieân keát, söï saép xeáp laïi, thay theá…).

Nhöõng bieán ñoåi thöôøng xaûy ra trong quaù trình toàn tröõ protein nhö: Söï deamin hoùa cuûa asparagine vaø glutamine. Söï oxi hoùa nguyeân töû löu huyønh cuûa cysteine vaø methionine. Söï thay ñoåi caàu disulide ôû cysteine. Söï phaân huûy lieân keát peptide. Söï dimer hoùa hoaëc söï keát hôïp caùc phaân töû.

Vieäc nhöõng phaûn öùng phaân huûy vaãn coù theå xaûy ra ôû trong caû davaãn chöa ñöôïc hieåu roõ raøng. Söï huùt aåm, nhieät ñoä vaø söï hình thaønh caduï nhö polymer) ñöôïc xem laø nhöõng nhaân toá chính aûnh höôûng ñeán söï khcuûa protein ôû daïng raén.

5.2. HOAØN NGUYEÂN VAØ TOÀN TRÖÕ PROTEIN:Caùc protein khaùc nhau coù nhöõng tính chaát hoøa tan khaùc nhau. Söï

trong vieäc hoøa tan protein coù lieân quan ñeán söï hình thaønh caáu truùc baäcthaønh caáu truùc baäc 2 xuaát hieän vôùi haàu heát caùc protein, ñaëc bieät laø nchöùa nhieàu amino acid öa beùo. Söï hình thaønh naøy coù theå ñöôïc thuùc ñaKhi söû duïng, tröôùc tieân ta caàn hoøa tan protein trong nöôùc caát. Soùng sieâgiuùp taêng khaû naêng hoøa tan cuûa protein.







KEÁT LUAÄN

-109-

KEÁT LUAÄN

Caùc protein y sinh hoïc ñöôïc ñöa ra thò tröôøng trong giai ñoaïn 1982-199

naêm chæ laø 2-7 loaïi. Nhöng töø naêm 1995 ñeán nay taêng leân 16-32 loaïi mnaêm 2005 coù ñeán 85 saûn phaåm môùi. Toång soá caùc protein duøng trong dleân ñeán 300 loaïi, mang laïi giaù trò kinh teá raát cao. Naêm 1999 caû theá giôùñöôïc hôn 1,17 taán nhöng coù giaù trò tôùi 30 tyû USD; naêm 2004 thu ñöôïc hôntrò giaù 43 tyû USD.

Töø caùc soá lieäu noùi treân, ta deã daøng nhaän ra moät xu höôùng môùi döôïc theá giôùi: chuyeån sang saûn xuaát, söû duïng caùc saûn phaåm coù baûn vôùi khaû naêng öùng duïng roäng raõi, ñem laïi hieäu quaû cao.

Ñoù cuõng laø con ñöôøng ñi taát yeáu cuûa caùc nhaø nghieân cöùu sinh hvaø caùc coâng ty döôïc phaåm cuûa nöôùc ta. Chuùng ta ñang bò boû caùch moxa, nhöng tính ña daïng sinh hoïc ôû nöôùc ta chaúng thua keùm baát kyø quoác gibò saûn xuaát cuõng khoâng phaûi laø quaù ñaét tieàn. Döïa treân neàn taûng hieäntheå taäp trung nghieân cöùu kó thuaät taùi toå hôïp DNA treân vi sinh vaät vaø teChæ caàn coù moät caùi nhìn khaùch quan vaø khaån tröông veà chieán löôïc, mcao trong ñaàu tö vaø ñaøo taïo, moät ñònh höôùng ñuùng ñaén trong hôïp taùc q

ñònh chuùng ta seõ saûn xuaát ñöôïc ngaøy caøng nhieàu caùc saûn phaåm protethay theá daàn cho vieäc nhaäp khaåu vôùi giaù raát cao nhö hieän nay.





TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

-110-


1. Leâ Ngoïc Tuù (chuû bieân), Hoaù sinh coâng nghieäp, NXB Khoa hoïc & Kó thuaät,

2002, 443p.2. Nguyeãn Höõu Chaán (chuû bieân), Hoaù sinh, NXB Y hoïc, 2001, 742p.3. Phaïm Ñình Löïu (chuû bieân), Sinh lyù hoïc y khoa taäp 2, NXB Y hoïc, 2003, 401p.4. Phaïm Hoaøng Phieät, Mieãn dòch – Sinh lyù beänh, NXB Y hoïc, 2004, 327p.5. Nguyeãn Baù Ñöùc, Hoaù chaát ñieàu trò beänh ung thö , NXB Y hoïc, 2003, 428p.6. Nguyeãn Vaên Uyeån (chuû bieân), Nhöõng kieán thöùc cô baûn veà coâng ngheä sinh ho,

NXB Giaùo duïc, 1996, 230p.7. Nguyeãn Ñöùc Löôïng,Coâng ngheä sinh hoïc, NXB ÑHQG TPHCM, 2001, 344p.8. Phaïm Thaønh Hoå, Di truyeàn hoïc, NXB Giaùo duïc, 2006, 613p.9. Leâ Xuaân Phöông, Vi sinh vaät coâng nghieäp, NXB Xaây döïng, 2001, 377p.10. Norbert Sewald, Hans-Dieter Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology,

Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, 2002, 543p.11. Daniel Rudman, Axel G.Feller, Hoskote S.Nagraj, Gregory A.Gergans, Effec

of human growth hormone in men over 60 years old, The New England Journal of Medicine, Vol.323, 1990, pp.1-6.

12. Maria Fragiadaki, Vassiliki Magafa, Paul Cordopatis, Synthesis and biologicactivity of oxytocin analogues containing conformationally-restricted residues iposition 7, European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.42, 2007, pp.799-806.

13. A.A.Antonov, A.K.Ivanov, V.P.Pakhomov, Solid-phase synthesis of oxytocand its analysis by high performance liquid chromatography, Chemistry of Natural Compounds, Vol.23, 1988, pp.746-751.

14. Linda M.Keefer, Marie-Agneøs Piron & Pierre De Meyts, Human insulprepared by recombinant DNA techniques and native human insulin interacidentically with insulin receptors, Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.78, 1981, pp.1391-1395.

15. Saran A.Narang, Chemical synthesis, cloning and expression of humapreproinsulin gene, J.Biosci., Vol.6, 1984, pp.739-755.

16. Hoaøng Vaên Quoác Chöông, Nguyeãn Vaên Nhung, Traàn Linh Thöôùc, Ngthaønh phaàn vaø ñieàu kieän nuoâi caáy ñeå toång hôïp mini-proinsulin ngöôtrong Escherichia coli ôû quy moâ pilot, Nhöõng vaán ñeà nghieân cöùu cô baûn trongkhoa hoïc vaø söï soáng, Vol.10., 2005, pp.1157-1159.



http://c/Documents%20and%20Settings/MyCom/Application%20Data/XPPRESP3.USER.002/Application%20Data/Microsoft/Word/tai%20lieu%20tham%20khao/19/









-111-

17. Masahide Shiozawa, Shuji Yamashita, Sadakazu Aiso, Kenjiro Yasuda, Amonoclonal antibody against human kidney gamma-glutamyl transpeptidasepreparation, immunochemical and immunohistochemical characterization, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol.37, 1989, pp.1053-1061.

18. J.Milton Harris, Robert B.Chess, Effect of pegylation on pharmaceutical Nature Publishing Group, 2003, Vol.2, pp.214-221.

19. www.wikipedia.org20. www.hcmbiotech.com.vn21. www.ivftudu.com.vn22. www.vietsciences.org



http://www.wikipedia.org/

http://www.ivftudu.com.vn/

http://www.vietsciences.org/

http://www.vietsciences.org/

http://www.ivftudu.com.vn/

http://www.wikipedia.org/



PROTEIN Y SINH HOÏC

-ii-

LÔØI CAÛM ÔN

Em xin chaân thaønh caûm ôn taát caû caùc Thaày Coâ trong tröôøngCoâ trong khoa Kyõ Thuaät Hoùa Hoïc, ñaëc bieät laø caùc Thaày CoâThuaät Thöïc Phaåm tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa TP. Hoà Chí Minh, daïy, höôùng daãn vaø truyeàn ñaït kieán thöùc laãn kinh nghieäm ñeåthaønh toát chöông trình hoïc cuõng nhö hoaøn taát luaän vaên toát nghiequaù trình coâng taùc sau naøy.

Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh tôùi Coâ Traàn Bíchtình höôùng daãn, chæ baûo, taïo ñieàu kieän vaø giuùp ñôõ em trong su

hieän luaän vaên toát nghieäp.Cuoái cuøng, xin caûm ôn taát caû caùc baïn cuøng lôùp ñaõ saün s

ñoåi vaø giuùp ñôõ toâi trong suoát thôøi gian vöøa qua.






-iii-

TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊNBaûn luaän vaên naøy goàm 5 chöông:

Chöông 1: Giôùi thieäu.Noäi dung chính cuûa chöông 1 goàm coù: Khaùi quaùt veà protein y s

daãn xuaát protein y sinh hoïc. Chöông 2: Khaû naêng öùng duïng cuûa protein y sinh hoïc.

Noäi dung chính cuûa chöông 2 goàm coù: Giôùi thieäu veà caùc öùng dtrong ñieàu trò, chaån ñoaùn, phaân tích, trong thöïc phaåm chöùc naêng vaø m

Chöông 3: Phöông phaùp saûn xuaát protein y sinh hoïc.Noäi dung chính cuûa chöông 3 goàm coù: Phöông phaùp toång hôïp ho

xuaát collagen, phöông phaùp taùi toå hôïp DNA, phöông phaùp saûn xuaát khphaùp saûn xuaát enzyme vaø moät soá bieän phaùp naâng cao chaát löôïng pro

Chöông 4: Tinh saïch protein y sinh hoïc.Noäi dung chính cuûa chöông 4 goàm coù: Caùc phöông phaùp xöû l

protein. Chöông 5: Xöû lyù vaø toàn tröõ protein y sinh hoïc.

Noäi dung chính cuûa chöông 5 goàm coù: Tính oån ñònh cuûa protein, protein.






-iv-

MUÏC LUÏC

Ñeà muïc TrangTrang bìa .....................................................................................................Nhieäm vuï luaän vaênNhaän xeùt cuûa giaùo vieân höôùng daãnNhaän xeùt cuûa giaùo vieân phaûn bieänLôøi caûm ôn ..............................................................................................Toùm taét luaän vaên ..................................................................................Muïc luïc .....................................................................................................

Danh muïc hình ..........................................................................................Danh muïc baûng ........................................................................................

LÔØI MÔÛ ÑAÀU .......................................................................................

CHÖÔNG 1 GIÔÙI THIEÄU ....................................................................1.1. KHAÙI QUAÙT .................................................................................1.2. PHAÂN LOAÏI CAÙC DAÃN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC

1.2.1. Theo caáu taïo hoaù hoïc ...........................................................1.2.2. Theo chöùc naêng sinh hoïc ......................................................1.2.3. Theo khaû naêng öùng duïng ....................................................

CHÖÔNG 2 KHAÛ NAÊNG ÖÙNG DUÏNG CUÛA PROTEIN Y SINH2.1. TRONG ÑIEÀU TRÒ .........................................................................

2.1.1. Insulin ........................................................................................

2.1.2. Hormone taêng tröôûng .............................................................2.1.3. Kích toá sinh duïc .......................................................................2.1.4. Oxytocin .....................................................................................2.1.5. Cytokine .....................................................................................

2.1.5.1. Caùc interferon (IFN) .......................................................2.1.5.2. Caùc interleukin (IL) ........................................................2.1.5.3. Yeáu toá hoaïi töû khoái u (TNF) .....................................2.1.5.4. Yeáu toá kích thích taïo khuaån laïc (CSF) .....................

2.1.6. Khaùng theå ...............................................................................






-v-

2.1.6.1. Caáu truùc ñieån hình ......................................................2.1.6.2. Tính ñaëc hieäu cuûa phaûn öùng khaùng theå-khaùng n2.1.6.3. Vai troø cuûa khaùng theå ................................................2.1.6.4. Caùc lôùp khaùng theå (isotype) .....................................2.1.6.5. Söï toång hôïp khaùng theå ..............................................2.1.6.6. ÖÙng duïng cuûa khaùng theå ........................................

2.1.7. Caùc chaát lieân quan ñeán quaù trình ñoâng maùu .................2.1.7.1. Yeáu toá VIII ....................................................................2.1.7.2. Chaát hoaït hoaù plasminogen tPA ..................................

2.2. TRONG CHAÅN ÑOAÙN .................................................................2.2.1. PSA vaø ung thö tieàn lieät tuyeán ...........................................2.2.2 AFP vaø ung thö gan ..................................................................2.2.3. hCG vaø ung thö tinh hoaøn ......................................................

2.3. TRONG PHAÂN TÍCH ......................................................................2.3.1. Glucose oxidase .........................................................................2.3.2. Cholesterol oxidase ....................................................................2.3.3. Alcohol dehydrogenase .............................................................

2.4. TRONG THÖÏC PHAÅM CHÖÙC NAÊNG ....................................2.5. TRONG MYÕ PHAÅM ......................................................................2.6. MOÄT SOÁ ÖÙNG DUÏNG KHAÙC ..............................................

2.6.1. Khaùng theå ñôn doøng .............................................................2.6.2. Protease ......................................................................................

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT PROTEIN Y SINH HOÏC3.1. PHÖÔNG PHAÙP TOÅNG HÔÏP HOAÙ HOÏC ..............................

3.1.1. Baûo veä nhoùm amino ..............................................................3.1.2. Baûo veä nhoùm carboxyl .........................................................3.1.3. Phöông phaùp toång hôïp peptide pha raén ...............................

3.1.3.1. Giôùi thieäu ......................................................................3.1.3.2. Nguyeân taéc ....................................................................3.1.3.3. Chaát mang raén ...............................................................3.1.3.4. Ví duï ................................................................................

3.1.4. Phöông phaùp toång hôïp peptide pha loûng ............................






-vi-

3.2. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT COLLAGEN .............................3.3. PHÖÔNG PHAÙP TAÙI TOÅ HÔÏP DNA ......................................

3.3.1. Thu nhaän gene ..........................................................................

3.3.1.1. Taùch caùc ñoaïn DNA töø boä gene ...............................3.3.1.2. Toång hôïp gene baèng phöông phaùp hoùa hoïc ............3.3.1.3. Laäp ngaân haøng c-DNA ................................................

3.3.2. Vector chuyeån gene ..................................................................3.3.2.1. Plasmid .............................................................................3.3.2.2. Phage .................................................................................. 3.3.2.3. Plasmid Ti .........................................................................3.3.2.4. Nhieãm saéc theå nhaân taïo cuûa naám men YAC ........

3.3.3. Enzyme caét restriction endonuclease .......................................3.3.4. Taïo plasmid taùi toå hôïp .........................................................

3.3.4.1. Phöông phaùp ñôn giaûn duøng caùc ñaàu coá keát ........3.3.4.2. Phöông phaùp duøng caùc ñoaïn noái .............................3.3.4.3. Phöông phaùp duøng enzyme terminal transferase .........

3.3.5. Bieán naïp DNA taùi toå hôïp vaøo teá baøo nhaän .................3.3.5.1. Hoùa bieán naïp ................................................................3.3.5.2. Ñieän bieán naïp ...............................................................3.3.5.3. Vi tieâm .............................................................................3.3.5.4. Baén DNA vaøo teá baøo .................................................

3.3.6. Heä thoáng teá baøo nhaän ........................................................3.3.6.1. Vi khuaån Escherichia coli .................................................... 833.3.6.2. Naám men Sacchromyces cerevisiae .................................... 843.3.6.3. Teá baøo thöïc vaät ...........................................................

3.3.6.4. Teá baøo ñoäng vaät .........................................................3.3.7. Choïn loïc, taïo doøng vaø söï bieåu hieän cuûa gene ..............3.3.7.1. Xaùc ñònh doøng vi khuaån chöùa plasmid taùi toå hôïp3.3.7.2. Söï bieåu hieän cuûa gene ñöôïc taïo doøng ...................

3.3.8. Ví duï .........................................................................................3.3.8.1. Toång hôïp gen mpi maõ hoùa cho MPI bieåu hieän trong E.coli

baèng phöông phaùp PCR ..................................................3.3.8.2. Taïo plasmid taùi toå hôïp, bieán naïp vaøo teá baøo E.coli ............ 91






-vii-

3.3.8.3. Nuoâi caáy E.coli bieåu hieän MPI baèng heä thoáng leân mñoäng ..................................................................................

3.4. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT KHAÙNG THEÅ ÑÔN DOØN

3.5. PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT ENZYME TÖØ VI SINH VAÄ3.5.1. Thu nhaän enzyme saïch töø phöông phaùp nuoâi caáy beà ma

3.5.1.1. Chieát ruùt enzyme töø canh tröôøng nuoâi caáy beà maë3.5.1.2. Tinh cheá enzyme .............................................................

3.5.2. Thu nhaän enzyme saïch töø phöông phaùp nuoâi caáy beà saâ3.5.2.1. Phöông phaùp keát tuûa enzyme baèng dung moâi hö

muoái trung tính .................................................................

3.5.2.2. Phöông phaùp haáp phuï hoaøn toaøn bôûi silicagen ......3.6. NAÂNG CAO CHAÁT LÖÔÏNG PROTEIN ...................................

CHÖÔNG 4: TINH SAÏCH PROTEIN Y SINH HOÏC ................................4.1. Xöû lyù sô boä ñeå laøm taêng noàng ñoä protein mong muoán .......4.2. Tinh saïch protein ................................................................................4.3. Ñaùnh giaù keát quaû tinh saïch .........................................................

CHÖÔNG 5: XÖÛ LYÙ VAØ TOÀN TRÖÕ PROTEIN Y SINH HOÏC ....5.1. Tính oån ñònh cuûa protein .................................................................5.2. Hoaøn nguyeân vaø toàn tröõ protein .................................................

KEÁT LUAÄN ...............................................................................................

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO ......................................................................






-viii-

DANH MUÏC HÌNHHình 2.1. Caáu truùc ñaûo Langerhans cuûa tuyeán tuïy (Pancreas) ..........

Hình 2.2. Caáu truùc cuûa phaân töû insulin ..............................................Hình 2.3. Quaù trình hình thaønh insulin ....................................................Hình 2.4. Tuyeán yeân (Pituitary), vuøng döôùi ñoài (Hypothalamus) v

chuùng ôû naõo boä ...........................................................................Hình 2.5. Caáu truùc hGH ............................................................................Hình 2.6. Thöù töï amino acid trong phaân töû FSH ...................................Hình 2.7. Thöù töï amino acid trong chuoãi vaø cuûa LH .................................... 13

Hình 2.8. Söï lieân quan vuøng döôùi ñoài vôùi tuyeán yeân sau ...............Hình 2.9. Caáu taïo phaân töû oxytocin ......................................................Hình 2.10. Cô cheá sinh ung thö ...................................................................Hình 2.11. Nguoàn goác caùc teá baøo mieãn dòch .....................................Hình 2.12. Phaân töû IFNvaø IFN .......................................................................... 2Hình 2.13. Thöù töï amino acid trong moät soá phaân töû IFN .................................... 21Hình 2.14. Tieân löôïng vieâm gan sieâu vi B ..............................................Hình 2.15. Virus vieâm gan B vaø vieâm gan C ...........................................Hình 2.16. Phaân töû IFN ........................................................................................Hình 2.17. Phaân töû IL-1vaø IL-1 ........................................................................ 2Hình 2.18. Phaân töû IL-2 .............................................................................Hình 2.19. Phaân töû IL-6 .............................................................................Hình 2.20. Phaân töû TNF .............................................................................Hình 2.21. Phaân töû EPO .............................................................................Hình 2.22. Phaân töû GM-CSF vaø G-CSF ..................................................

Hình 2.23. Thöù töï amino acid trong phaân töû EPO vaø TPO ..................Hình 2.24. Caáu truùc 1 phaân töû khaùng theå ...........................................Hình 2.25. Sô ñoà caùc domain cuûa 1 phaân töû khaùng theå ....................Hình 2.26. Cô cheá choáng ñoäc toá cuûa khaùng theå ................................Hình 2.27. Caáu truùc caùc lôùp khaùng theå ..............................................Hình 2.28. Quaù trình taùi toå hôïp, giaûi maõ caùc gene chuoãi naëng .....Hình 2.29. Khaùng theå ñôn doøng lieân keát vôùi 1 epitope ñaëc hieäu ....Hình 2.30. ÖÙng duïng cuûa khaùng theå ñôn doøng trong ñieàu trò ung thHình 2.31. Sô ñoà quaù trình ñoâng maùu ....................................................






-ix-

Hình 2.32. Sô ñoà tieâu sôïi huyeát ...............................................................Hình 2.33. Caáu truùc phaân töû tPA ............................................................Hình 2.34. Nguyeân taéc tieán haønh phöông phaùp RIA ............................Hình 2.35. Nguyeân taéc tieán haønh phöông phaùp ELISA .......................Hình 2.36. Caáu taïo FAD ..............................................................................Hình 2.37. Caáu truùc phaân töû glucose oxidase ........................................Hình 2.38. Heä thoáng biosensor ...................................................................Hình 2.39. Caáu truùc cholesterol oxidase ....................................................Hình 2.40. Caáu taïo phaân töû NAD+ ......................................................................... 5Hình 2.41. Caáu truùc collagen ......................................................................Hình 3.1. Sô ñoà quaù trình toång hôïp peptide pha raén ...........................Hình 3.2. Chaát mang Polystyrene/Divinylbenzene ....................................Hình 3.3. Sô ñoà taïo c-DNA töø mRNA ....................................................Hình 3.4. Caùc vector chuyeån gene ...........................................................Hình 3.5. Cô cheá caét cuûa BamHI ............................................................Hình 3.6. Phöông phaùp gaén DNA laï duøng caùc ñaàu coá keát ............Hình 3.7. Duøng caùc ñoaïn noái taïo DNA taùi toå hôïp ..........................Hình 3.8. Duøng terminal transferase gaén DNA laï ..................................

Hình 3.9. Vi khuaån E.coli .....................................................................................Hình 3.10. Naám men S.cerevisiae ................................................................Hình 3.11. Sô ñoà minh hoïa vieäc toång hôïp gene mpi baèng phöông phaùp PCR hai

böôùc ................................................................................................Hình 3.12. Caùc boä phaän chính cuûa heä thoáng leân men töï ñoäng BioT

05-08GX-08 .....................................................................................Hình 3.13. Sô ñoà kó thuaät taïo khaùng theå ñôn doøng hybridoma ..........Hình 3.14. Sô ñoà caáu taïo PEG interferon alfa 40KD ...............................Hình 4.1. Moái lieân heä giöõa caùc phöông phaùp phaân tích .................



