Nghiên cứu khoa học chuyên ngành

93

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MARKER VI VỆ TINH (MICROSATELLITE)TRÊN GEN QUY ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMYLOSE

TRONG HẠT GẠO Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L.)

Ths. Nguyễn Tiến Huyền*, GS.TS Nguyễn Thị Lang**

Trong các tính trạng về phẩm chất cơm, hàm lượng amylose được xem là một tính trạngquan trọng, có ý nghĩa quyết định đến sự mềm cơm hoặc ngược lại. Hàm lượng amylosecòn có tính trội không hoàn toàn so với hàm lượng amylose thấp, nó do một gen điều khiểnkèm theo một số gen phụ có tính chất cải tiến với gen Wx (gen điều khiển hàm lượngamylose) đã được công bố.

Mục tiêu nghiên cứu quy trình ứng dụng MAS nhằm xác định gen Waxy điều khiển hàmlượng amylose trong cây lúa với SSR marker có tính đa hình phủ trên 2 nhiễm sắc thể 5 và6 liên kết với gen Wx đã được công bố.

Hai marker WxF-R và RM42 được sử dụng cho kết quả đa hình trên các giống lúa mùađịa phương. Sử dụng marker RM42 và WxF-R để phát hiện gen amylose cao và thấp trênquần thể phân ly từ tổ hợp IR64/Jasmine 85. Kết quả phân tích từ sản phẩm PCR cho thấymarker này phân ly như một marker đồng trội (codominant), là điều kiện thuận lợi cho việcxác định các cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử một cách chính xác hơn. Marker WxF-R có tỷlệ ứng dụng di truyền đạt 98,33% và một QTL kiểm soát trên gen quy định hàm lượngamylose với kiểu hình góp phần 14,21%. Việc sử dụng RM42 để phát hiện gen hàm lượngamylose kết quả cho thấy đây là một marker đồng trội có độ chính xác cao.

Như vậy, với tính trạng hàm lượng amylose việc kết hợp phương pháp chọn giốngtruyền thống với phương pháp sử dụng marker phân tử cho việc phát hiện nhanh và chínhxác gen mục tiêu, nâng cao hiệu quả và rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống,đáp ứng được những yêu cầu cho việc xuất khẩu gạo.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

SSR là chuỗi mã di truyền lặp lại rấtđơn giản, xảy ra trên hầu hết bộ genomethực vật và có thể khuyếch đại trong ốngnghiệm nhờ kỹ thuật PCR. SSR phong phúvà phân bố rộng trong genome cây lúa vìthế chúng được sử dụng để phân tích đadạng di truyền giữa các giống lúa.

Dựa vào hàm lượng amylase, các giốnglúa được phân ra làm hai nhóm: waxy (1 -2%) và nonwaxy>2%. Ứng dụng SSR,người ta đã phân loại các nhóm amylosetrong quỹ gen cây lúa và đã xác định bagen: “wx gene granule”, “bound starchsynthase”, và “SSE” gen mã hóa men tổnghợp tinh bột có trong 56 giống lúa. Haialen khác nhau Wxa và Wxb địnhvị tại

locus “waxy” điều khiển mức độ số lượngprotein Wx và hàm lượng amylose. Genđiều khiển sự tăng giảm hàm lượngamylose ae nằm trên nhiễm thể số 2. Năm1999, He và ctv đã phát hiện hàm lượngamylose được kiểm soát bởi gen chính địnhvị trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 với gen wx.Di truyền tính trạng hàm lượng amylose rấtphức tạp vì mô hình 3 alen của nó. Hàmlượng amylose chịu ảnh hưởng của tươngtác tính cộng x tính cộng, tương tácepistasis và tương tác trội x trội.

Đề tài được nghiên cứu với các mụctiêu sau:

* Đa dạng di truyền quần thể lúa mùa địaphương thông qua đánh giá hàm lượngamylose

*. Trường Cao đẳng Nông nghiệp Nam Bộ**. Trưởng BM Di truyền giống – Viện lúa ĐBSCL

Nghiên cứu khoa học chuyên ngành

94

* Đề suất một số vật liệu lai có hàmlượng amylose trung bình, thấp.

* Ứng dụng đánh dấu SSR trong đánhgiá hàm lượng amylose quần thể F2 tổ hợpIR64/Jasmine 85.

2. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

- Gồm 200 mẫu giống lúa mùa địaphương tại ngân hàng gen Viện lúaĐBSCL. Quần thể lai F2 (IR64/Jasmine 85).

- Đánh giá hàm lượng amylose bằngphương pháp sinh hóa

- Phân tích di truyền:+ Ly trích ADN theo Nguyễn Thị

Lang, 2002+ Khuyếch đại DNA bằng phương

pháp PCR- Phân tích số liệu:+ Phân tích số liệu sinh hoá bằng phần

mềm Microsoft Excel 2000.+ Phân tích di truyền

+ Phân tích đa dạng di truyền

+ Phân nhóm di truyền trên cơ sở điệndi và biểu hiện đa hình.3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN3.1 Đánh giá hàm lượng amylose thôngqua kiểu hình

Các giống có gen Waxy thường có hàmlượng amylose rất thấp (2 – 3%). Nhưngkhi phân tích các giống nếp địa phương tạiĐBSCL thì hàm lượng amylose biến độngrất cao (bảng 1).

48%

37%

11% 4%

Hình 1. Đánh giá kiểu hình trên tính trạnghàm lượng amylase trên 199 giống lúa mùa địaphương

Bảng 1. Phân tích hàm lượng amylose của cc giống la nếp

Số thứ tự M

(Acc No)

Tên giống Hàm lượng

amylose (%)

1 2 Nếp thơm 24.08

2 7Nếp móng

ngựa23.94

3 11 Nếp sáp 10.88

4 92 Nếp nhung 18.60

5 93 Nếp than 9.30

6 156Nếp phụng

tiên25.68

Như vậy, các giống nếp địa phươngkhô và cứng cơm, nguyên nhân có thể dođiều kiện đất đai, phân bón, và lai tạptrong quá trình canh tác. Nghĩa là biếnđộng do môi trường rất cao (Nguyễn Thị

Lang và ctv, 2005). Kết quả phân tíchtrình bày trong bảng 2 còn cho thấy hàmlượng amylose và mùi thơm của một sốgiống như ở bảng 2.

Nghiên cứu khoa học chuyên ngành

95

Bảng 2. Đánh giá giống lúa có hàm lượng amylose và mùi thơm

Đánh giáS TT Mã (Acc No) Tên giống

Mùi thơm Amylose (%)

1 70 Nàng phật đơn 1 28,60

2 527 Nếp thơm 1 24,69

3 537 Nếp sáp 1 10.88

4 540 Nàng thơm chợ đào 1 22,07

5 569 Thơm sớm 1 31,26

6 577 Nhỏ thơm 1 22,50

7 584 Nàng thơm chợ đào 1 21,77

8 592 Thơm lúa mùa 1 5,56

9 603 Nếp móng ngựa 1 26,07

10 1626 Khao dawk mali 2 18,90

11 1538 Nếp Than 0 9,30

Ghi chuù: Acc No - Accession number(0): khoâng thôm (1): thôm nheï (2): thôm

Một số trường hợp khi đánh giá hàmlượng amylose cùng một giống và khác mãsố thì hàm lượng amylose lại khác nhau,kết quả ghi nhận ở bảng 3.

Do vậy, việc chọn lựa các giống cóhàm lượng amylose thấp cần phải xem xét

kỹ các mã của giống cũng như số liệu gốcban đầu của vùng thu hoạch mẫu để từ đócó vật liệu chính xác phục vụ cho chươngtrình lai tạo giốngBảng 3. Cùng giống nhưng khác nhau về hàmhàm lượng amylase khi phân tích về kiểu hình

STT Mã(Acc No)

Tên giống Hàm lượng amylose (%)

1 31 Nanh chồn 34.92

2 8 Nanh chồn 22.71

3 6 Nàng hương 20.86

4 22 Nàng hương 30.95

5 10 Nhỏ thơm 22.63

6 42 Nhỏ thơm 32.08

7 45 Nàng hương chợ đào 18.86

8 80 Nàng hương chợ đào 26.64

Ghi chuù: Acc No - Accession number3.1.2 Phân tích đa dạng hàm lượngamylose thông qua phân nhóm kiểu hình

Kết quả ghi nhận cho thấy: cácgiống cho hàm lượng amylose thấp, trungbình và cao phân nhóm rất đa dạng và phânra hai nhóm chính, 5 nhóm phụ.

+ Nhóm I: Có hai giống.

+ Nhóm II: Có ba nhóm phụ, trong đócó nhóm lúa nếp (Nếp Sáp, Nếp Than).

+ Nhóm III: Chia ra hai nhóm phụ,hàm lượng amylose biến động 20 – 22%.

+ Nhóm IV: Chia thành nhiềunhóm nhỏ có 18 giống, hàm lượng amylosetrung bình là 23%.

Nghiên cứu khoa học chuyên ngành

96

+ Nhóm V: Chia thành nhiều nhómnhỏ và có 14 giống, hàm lượng amylose >25%.+ Ngoài ra phân tích hàm lượng amylosetrên 200 giống lúa mùa địa phương cũngđược phân nhóm và chi tiết số liệu thôngqua phụ lục 1.3.1.3 Đánh giá hàm lượng amylose

thông qua kiểu gen

Hình 2 Giản đồ phân nhóm di truyền của40 mẫu giống lúa mùa địa phương tại 18 locikhác nhau của 6 marker SSR.

Theo He và ctv (1997), Lang và ctv(2004) hàm lượng amylose được kiểm soátbởi gen chính định vị trên nhiễm thể số 5và 6 với gen wx và các alen chính giảithích sự biến thiên di truyền 91,1% qua 2marker RM42 định vị trên nhiễm thể số 5và WxF-R trên nhiễm thể số 6.

Hình 3. Marker RM 42 trên các giống lúa mùađịa phương

Riêng ba marker RM175, 218, và 425chưa ghi nhận liên kết với gen hàm lượng

amylose. Tuy nhiên, ghi nhận đa hình trêncác gen trên, trong đó sản phẩm PCR trêngel agarose 3% của marker RM145 chotính đa hình với trên 3 loci, ghi nhận ở hình4.

Hình 4. Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% đánhgiá sự đa hình kiểu gencủa nguồn vật liệu ban đầuvới marker RM 175.

Hình 5. Giản đồ phân nhóm di truyền của 40mẫu giống lúa mùa địa phương tại 18 loci khácnhau của 6 marker SSR.Ghi nhận ở hình 5 cho thấy:

- Nhóm I: Là nhóm có liên kết với genWx gồm: Jasmine 85, Ba Xe, Thơm LúaMùa, Bằng Tây Mễ, Nếp Than, Hạt Lựu,và Ngọc Bích. Có khoảng cách di truyềnliên kết với hàm lượng amylose thấp.

- Nhóm II: Có 1 giống Lúa Thơm.

- Nhóm III: Có 2 nhóm phụ: nhómphụ thứ nhất có ba giống, nhóm phụ thứhai có bốn giống.

- Nhóm IV: Có 11 giống

- Nhóm V: Có 4 giống

Nghiên cứu khoa học chuyên ngành

97

Mức độ dung hợp di truyền của các nhómgiống cũng khác nhau.

3.2 Đánh giá trên quần thể lai3.2.1 Đánh giá hàm lượng amylose thôngqua kiểu hình

Kết quả phân tích hàm lượngamylose trên bố mẹ IR64 và Jasmine 85cho phân biệt rất rõ hàm lượng amylosetrung bình và thấp hình 3.6.

Hình 6. Phaûn öùng maøu saéc cuûa haøm löôïngamylose

Hình 7. Bieán ñoäng haøm löôïng amylose treântheá heä con lai F2 cuûa toå hôïp IR64/Jasmine 85

Sự phân ly ở thế hệ F2 ghi nhận trênhình 3.7 cho thấy: Xu hướng hàm lượngamylose nghiêng về bố nhiều hơn mẹ. Tỷlệ phân ly hướng về bố 17,64% và mẹ là10,78%. Dị hợp tử con lai giữa bố và mẹchiếm 52,94%. Hướng phân ly này chothấy việc chuyển gen để giảm hàm lượng

amylose là việc làm rất cần thiết và hiệuquả trên cặp lai này.

3.2.2 Đánh giá sự liên kết marker phântử với hàm lượng amylose4.2.2.1 Phân tích sự đa hình trên markerRM42

Kết quả đã ghi nhận sự đa hình vớichiều dài của band không tách rõ giữaIR64 và Jasmine 85 (hình 3.8), điều nàycũng phù hợp với ghi nhận của Nguyễn ThịLang và ctv (2004).

Hình 8. Sản phẩm PCR trên gel agarose 3%với marker RM42 trên quần thể phân ly F2 giữaIR64/Jasmine 85 (1-21 các dòng F2)

Khi dung điện di đứng với gel 5%polysacrylamide và nhuộm bạc mảnh ADNđã tách được đồng hợp và dị hợp tử của bốmẹ, đồng thời tách cả 102 cây F2 (hình3.9)

Hình 9. Sản phẩm PCR trên gel agarose 3%với marker RM42 trên quần thể phân ly F2

giữa IR64/Jasmine 85 (1-21 các dòng F2)

Đa hình giữa bố mẹ đã được ghinhận và con lai liên kết với marker thể hiệnhàm lượng amylose cao và thấp tươngquan với alen cao có kích thước 250 bp, vàhàm lượng cao thấp tách các alen có kích

thước 200 bp. Nhưng hàm lượng amylosebiến động rất lớn do môi trường và là tínhtrạng đa gen (Lang và ctv, 2004b) nên phảiphân tích thêm di truyền số lượng phối hợpvới sự liên kết với gen amylose trong đánh

Nghiên cứu khoa học chuyên ngành

98

giá loci bằng số lượng. Anh hưởng QTL vàhoạt động của gen amylose: Số liệu phântích trên cho tần số biến động bình thườngtheo phân bố chuẩn tại vị trí locus RM42.

Phân tích đường tuyến tính marker đơntheo Tinker (1996), các marker có ý nghĩacao trên quần thể con lai F2, chứng tỏ có sựquan hệ marker với số lượng QTL (bảng 4).

Baûng 4. Phöông trình vôùi haøm löôïng amylose ôû theá heä F2 vôùi RM42

Nguoàn Ñoä töï do Trung bìnhbình phöông

Giaù tròF

YÙ nghóa

Phöông trình tuyeán tính 1 11,258 21,087 < 0,01Heä soá caën 112 0,7324

Toång soá 113

Với giá trị R2 là 0,142%, sự liên kếtcủa QTL và kiểu hình đóng góp 14,21%trên biến động hàm lượng amylose giữa bốmẹ. Điều này cũng phù hợp với các kết quảcủa nhiều báo cáo trước đây (Nguyễn ThịLang, 2004).

3.2.2.2 Phân tích sự đa hình trên markerWxF-R

Quần thể F2 đã được đánh giá trêngen Wx cho thấy chúng tách và thể hiện đahình trên cả IR64 và Jasmine 85 khá cao sovới RM42. Vị trí phân tử có chiều dài là310 bp cho Jasmine 85 và 194 bp cho IR64.

Con lai dị hợp tử nghiêng về cả hai vị tríphân tử cha và mẹ cũng cho thấy rất rõ.

Hình 10. Saûn phaåm PCR treân gel agarose 3%vôùi marker wxF-R treân quaàn theå phaân ly F2(IR64/Jasmine 85)

3.2.3 Kiểm tra mức độ chính xác giữa marker WxF-R với sự liên kết của gen hàmlượng amylose

Baûng 5. Lieân keát marker WxF-R vaø quaàn theå F2 (IR64/Jasmine 85)

Alen Kích thöôùcsaûn phaåm

PCR

IR64 Jasmine85

F2 Toångsoá

Tyû leä(%)

A 310bp 0 1 59 60 98,33

B 194bp 1 0 18 20 90,00

AB 310 - 194bp 17 18 94,40

Như vậy, có sự liên quan rất lớn giữakiểu hình (amylose) và kiểu gen, và cho thấyquá trình biểu hiện từ kiểu gen ra kiểu hìnhlà một quá trình phức tạp gồm nhiều nhân tốquyết định trong đó quan trọng nhất là sựtương tác giữa kiểu gen và môi trường.Phương pháp này cho thấy khả năng dự đoán

kiểu gen và kiểu hình có độ chính xác rấtcao. Nên có thể áp dụng trong chọn lọcgiống với mục đích cải thiện hàm lượngamylose cao và thấp thông qua marker phântử. Việc cải tiến giống lúa theo hướng cóhàm lượng amylose trung bình còn nhiềuvấn đề phải được tiếp tục hoàn thiện, bởi vì

Nghiên cứu khoa học chuyên ngành

99

nó không đơn thuần là đơn gen waxy, màcòn nhiều gen phụ có tính chất cải tiến cùngtác động ảnh hưởng. Những gen phụ nàychịu ảnh hưởng bởi môi trường, cho dùtrong phân tích hệ số di truyền nó đạt giá trịkhá cao (Nguyễn Thị Lang và ctv, 2004).

4. KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luậnTính đa dạng di truyền của các nhóm

giống khác nhau thể hiện rõ qua các tínhtrạng cùng giống nhưng lại khác nhau rất lớn.

Sử dụng phương pháp SSR vớimarker WxF-R đã thể hiện gen amylose caovà thấp trên các con lai F2 từ tổ hợp laiIR64/Jasmine 85, tạo điều kiện thuận lợi choviệc xác định các cá thể đồng hợp tử và dịhợp tử một cách chính xác.

Ứng dụng phương pháp SSR vớimarker RM42 để phát hiện gen hàm lượngamylose trên các giống lúa mùa địa phươngcũng cho thấy đây là một marker đồng trộivà có độ chính xác cao.

Trên cặp lai giữa IR64/Jasmine 85được ghi nhận cả hai marker (RM42, WxF-R) đa hình tách cả gen amylose cao và thấp.Tuy nhiên, có khả năng áp dụng cao chochọn giống là marker WxF-R, vì tỷ lệ ứngdụng di truyền 98,33% so với đánh giá kiểuhình và kiểu gen.

Một di truyền số lượng QTL kiểmsoát trên gen quy định hàm lượng amylosevới kiểu hình góp phần là 14,21%. Riêngmarker RM42, sự liên kết liên quan với đagen thông qua di truyền số lượng nên việcchọn giống bằng marker này có phức tạphơn. Do vậy, chọn lọc dựa trên các markerphân tử không bị ảnh hưởng bởi các yếu tốmôi trường bên ngoài so với việc chọn lọcthông qua kiểu hình.

4.2. Đề nghịCó thể sử dụng phương pháp SSR

marker vào việc đánh giá tính trạng amylose

và các tính trạng khác liên quan với phẩmchất ở cây lúa.

Tính trạng hàm lượng amylose chịuảnh hưởng rất lớn bởi môi trường nên việcđánh giá kiểu hình hàm lượng amylose phảikết hợp với đánh giá kiểu gen.

Sử dụng các giống lúa mùa địaphương đã được kiểm tra, đặc biệt là cácgiống Nàng Hương, Nếp Sáp, Một Bụi...làmvật liệu lai cho các chương trình lai tạogiống lúa có chất lượng cao.

Sử dụng marker WxF-R trong chọngiống có hàm lượng amylose trung bình,thấp ở các thế hệ phân ly nhằm rút ngắn thờigian với độ tin cậy cao.

Tiếp tục trồng và theo dõi con lai đãđược chọn trong quần thể F2 của tổ hợp laitrên ngoài đồng ruộng, kết hợp đánh giá mộtsố tính trạng khác để đưa ra những dòng cótriển vọng.

Tiếp tục nghiên cứu để ứng dụng cácphương pháp marker phân tử vào các tínhtrạng khác ở cây lúa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004.Di truyền phân tử. NXB Nông nghiệptrang 156 – 185.

[2]. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003.Giáo trình di truyền số lượng. NXBNông nghiệp, trang 25 – 40.

[3]. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1995.Ứng dụng công nghệ sinh học trong cảitiến giống lúa. Giáo trình cao học nôngnghiệp. NXB Nông nghiệp.

[4]. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọngiống thực vật. NXB Khoa học và Kỹthuật Hà Nội. Việt Nam, trang 129 – 155.