Neurochemie:

Neuropřenašeče: neuropeptidy a puriny

6. přednáška

Purinergní neuropřenašeče, zejména adenosin a ATP, nebyly v rámci přenosu nervového impulsu dlouho vůbec uvažovány.

úloha neuropeptidů v CNS spíše modulační

fungují jako neuropřenašeče, ale mnoho jejich dalších funkcí zatím neobjasněno

především látky centrálně zapojené do intermediátního metabolismu

přesto koncentrovány na určitých typech synapsí a po patřičném stimulu se z nich uvolňují, aby vyvolaly patřičnou odpověď

malé molekuly složené z aminokyselin navzájem kovalentně propojených peptidickou vazbou

neuropeptidy je rezervován pro malé proteiny, které mají neurotransmiterům podobnou funkci v rámci nervového systému (De Vied 1969)

neuropeptidy = malé proteiny, které mají neurotransmiterům podobnou funkci v rámci nervového systému (CNS i PNS)

nejen neuropřenašeče: některé jsou neurony uvolňovány přímo do krevního řečiště a slouží jako hormony

jiné jako hormony uvolňovány endokrinními žlázami

popsána zatím asi stovka

NEUROPEPTIDY

Progress in Brain Research, Vol. 72, Chapter 9, David de Wied

Prekurzorové proteiny

proteinový produkt uvolněný z ribosomu = velký prekurzorový polypeptid vyžadující posttranslační úpravy (prepropeptid)

syntéza neuropeptidu vyžaduje transkripci DNA, její přepis do mRNA a tvorbu proteinu

Noradrenalin GABA ACh Dopamin Adrenalin Serotonin galanin somatostatin VIP cholecystokinin neuropeptid Y TRH

enkephalin cholecystokinin substance P neurotensin neurotensin substance P neuropeptid Y neuropeptid Y enkephalin

opioidní peptidy - endorphin, dynorphin, enkephaliny neurohypofysální peptidy vasopresin, oxytocin, neurophysiny, thyrotropin

(TSH), prolaktin, luteinizační hormon (LH), FSH, ACTH, růstový hormon (GH), -melanocyty stimulující hormon (-MSH)

hypothalamické peptidy kortikotropin-relaeasing faktor (CRF), gonadotropin-releasing hormon (GnRH), hormon uvolňující růstový hormon (GHRH), somatostatin, thyrotropn-releasing hormon (TRH)

tachykininy substance P, neurokinin A (NKA, = substance K, SK), neurokinin B (NKB, = substance P, SP), kassinin, eledosin

gastriny (gut-brain peptidy) gastrin, cholecystokininy (CCKs), galanin, gastrin-uvolňující protein (GRP), neurotensin

od glukagonu odvozené VIP (vasoactive intestinal polypeptide), glukagon od pankreatických polypeptidů odvozené neuropeptid Y (NPY), insuln jiné bombesin, bradykinin, angiotensin, CGRP

(calcitonin gene-related peptide), neuromedin K

Klasifikace neuropeptidů

tradičně se dělí do skupin podle oblastí, ve kterých byla jejich funkce poprvé popsaná, nebo podle svého účinku nepřesné: ACTH a -MSH se nachází nejen v neurohypofýze, ale i non- neuroendokrinních neuronech a mají i non-neuroendokrinní funkce mohou koexistovat s „klasickými“ neuropřenašeči

Prekurzorové proteiny

syntéza neuropeptidu vyžaduje transkripci DNA, její přepis do mRNA a tvorbu proteinu proteinový produkt uvolněný z ribosomu = velký prekurzorový polypeptid vyžadující posttranslační úpravy (prepropeptid)

POMC = prekurzor mnoha aktivních peptidů jeho produkty zahrnují např. adrenokortikotropní hormon (ACTH), -melanocyty-stimulující hormon nebo -endorfin prepropeptid obsahuje N-koncovou signální sekvenci (nasměruje nově vzniklý protein z ribosomů do lumen ER) po transportu do ER signální sekvence odštěpena signální peptidasou vzniká propeptid propeptid je přenesen do Golgiho aparátu uskladněn do velkých denzních váčků v těch dále zpracováván ve váčcích z těla buňky transportován na synapsi

Vznik a zpracování prepropeptidu proopiomelanokortinu (POMC)

Proteolytické zpracování

propeptidové prekurzory konvertovány na aktivní neuropeptidy sérií kroků zahrnuje štěpení konvertasami a modifikaci na specifických aminokyselinových zbytcích endoproteasy rozpoznávají a štěpí dibasické aminokyselinové páry (Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg nebo Arg-Lys) vzniklé peptidy jsou dále zpracovány exopeptidasami a různými modifikujícími enzymy fenomén zpracování prohormonů konvertasami popsán Donaldem F. Steinerem během studia vzniku insulinu (1967)

dva klíčové enzymy: konvertasa prohormonů 1 a 2 (PC1 a PC2) náleží do velké rodiny prohormonových konvertas zahrnující (zatím) 9 členů označovány též PCSK1-9, přičemž PSK1 = PC1 (PC3) a PCSK2 = PC2 postupují krokově, nejprve rozštěpí v závislosti na typu tkáně patřičný dibasický pár následně pokračují v dalších štěpeních

PC1 a PC2 štěpí různými způsoby POMC stejnou proteolytickou aktivitu vykazují na proinsulinu a proglukagonu v pankreatu PC2 hraje větší roli než PC1 v případě proinsulinu než proglukagonu PC1 je naopak pro štěpení glukagonu důležitější a méně využívaná pro štěpení proinsulinu než PC2 výsledek proteolytické aktivity PC1 i PC2 na POMC = malé peptidy, jejichž C nebo N konce obsahují lysinové nebo argininové zbytky

PC1

karboxypeptidasa E pak odstraňuje C-koncové zbytky zatím neidentifikovaná aminopeptidasa odstraňuje zbytky N-koncové.

další úpravy po konvertasach a peptidasach: N-koncová acetylace, které často reguluje aktivitu neuropeptidu (zesílení biologické aktivity -MSH nebo její pokles v případě -endorfinu) peptidy obsahující C-terminální glycin: -amidací pomocí enzymu peptidglycin -amidující monooxygenasy (PAM); tento amidační krok podstupuje např. -MSH

konvertasy prohormonů antagonisticky ovlivňují mnohé malé peptidy inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu (ACE): captopril klinicky využíván v léčbě hypertenze (angiotenzin fyziologicky zvyšuje cévní tonus) nebo diabetické nefropatie

Proteolytické zpracování

Diversita neuropeptidů

jediný propeptid = několik bioaktivním neuropeptidům jednotlivé kroky proteolytického štěpení tkáňově specifické v předním laloku podvěsku mozkového POMC typicky konvertován na ACTH v intermediátním laloku a v neuronech produkujících POMC hlavními koncovými produkty -MSH a -endorfin tkáňově specifická exprese různých konvertas prohormonů konvertasy jsou vysoce citlivé na pH a Ca2+, jejich aktivita závisí i na změnách těchto parametrů uvnitř váčků

alternativní sestřih prvně zjištěn u kalcitoninu a kalcitoninovému genu příbuzného peptidu (calcitonin gene-related peptide, CGRP) tachykininy = produkce několika zástupců své rodiny alternativním sestřihem dvou preprotachykininových genů jeden z genů je alternativně sestřižen nejméně ve tři prepropeptidy, které dále posttranslačně produkuji pět rozdílných bioaktivních peptidů včetně neurokininu A a substance P

Diversita neuropeptidů

Skladování a výlev

oproti např. acetylcholinu vznikají transkripcí, translací a dále jsou upravovány posttranslačně tyto procesy probíhají v somatu i axonu neuropeptidy obsaženy ve velkých denzních vesikulech skládaných v Golgiho komplexu a transportovaných na synapsi mnoho neuronů obsahuje v synaptickém zakončení OBA typy váčků neuropeptidy poměrně typicky kolokalizovány s „klasickými“ neuropřenašeči oba typy váčků uvolňovány odlišným mechanismem a často za jiných fyziologických podmínek a potřeb k výlevu neuropeptidů je potřeba delšího a většího zvýšení hladiny Ca2+ typický vzorec vzruchové aktivity může tedy vést k preferenčnímu výlevu jednoho nebo druhého typu neurotransmiteru, případně za sebou mohou následovat neuropeptidy modulují postsynaptický účinek klasických neuropřenašečů, a to buď stimulačně nebo inhibičně silně stimulovaných zakončení

Vzhledem k tomu, že k výlevu

neuropeptidů je potřeba delší

vzruchová aktivita, mohou pozitivní i negativní zpětnou vazbou regulovat

aktivitu silně stimulovaných

zakončení.

Neuropeptidy vs.

monoaminy

Neuropeptidová signalizace „na dálku“

oproti klasickým neuropřenašečům nejsou rychle odstraňovány ze synaptické štěrbiny deaktivace probíhá štěpením endoproteasami a exoproteasami lokalizovanými na extracelulárních membránách (nezaměňovat s konvertasami!)

mohou urazit značnou vzdálenost, než doputují ke svým receptorům (lokalizace mnoha neuropeptidů neodpovídá lokalizaci jejich receptorů) substance P vysoce koncentrována v substantia nigra, ale její receptory v této struktuře téměř chybí, zatímco v jiných částech mozku jsou detekovány hojně

většina receptorů pro neuropeptidy spřažena s G-proteiny mají pro své ligandy podstatně větší afinitu než receptory pro neuropřenašeče „klasické“ (ACh R afinita 100 M – 1 mM, neuropeptidové Rs v řádu nanomolů)

interakce mezi neuropeptidy a jejich receptory je poměrně komplexní molekula noradrenalinu = jen těch několik atomů iontově nebo stericky interaguje s patřičným vazebným místem na odpovídajících receptoru, vs. interakce neuropeptidu Y (NPY) o délce 36 aminokyselin: jak se takové molekula vůbec „vejde“ do vazebného místa receptoru spřaženého s G-proteinem? Která konformace bude mít nejvyšší afinitu pro vazbu? Který aminokyselinový zbytek je pro vazbu kritický? A z kterého farmakologického pohledu mohou být připravovány nové látky, které budou dané vazebné místo antagonizovat nebo na něj budou působit agonisticky? v praxi zatím v rovině modifikovaných peptidových analogů syntetické peptidy jsou degradovány různými peptidasami, neprochází skrze hematoencefalickou bariéru, užitečné v podpůrné léčbě poruch zasahujících CNS

Receptorové typy a subtypy

neuropeptidové receptory příliš početné rozděleny do jednotlivých rodin některé neuropeptidy (TRH) se sice váží jen na jediný receptor, ale mnoho jiných (např. somatostatin) obsazuje až pět receptorových typů

v rámci každé receptorové rodiny vykazují jednotlivé subtypy receptorů své vlastní vzorce exprese v CNS i PNS CRF1R a CRF2R = dva receptory pro kortikotropin-uvolňující faktor (corticotropin- releasin factor, CRF) svou expresí alterují: tam, kde se vyskytuje jeden, není téměř detekovatelný ten druhý liší se afinitou k ligandům (CRF1R stejně silně váže CRF i příbuzný peptid urocortin, zatímco CRF2R má vyšší afinitu k urocortinu než CRF) tato rozdílná distribuce má fyziologický význam

i další neuropeptidergní receptory mohou vázat víc než jeden peptid receptory melanokortinové rodiny = MC1-5 receptory každý z těchto receptorů může s různou potencí aktivovat ACTH, -MCH a -MCH MC4 receptor může být antagonizován také vzdáleně příbuzných endogenním peptidem nazvaným agouti-related peptid MC4 receptor = první receptor, u kterého byl v mozku nalezen endogenní agonista i antagonista.

Receptorové typy a subtypy

Receptorové typy a subtypy

Specifita receptoru pro ten který peptid je dána výhradně vnitřními vlastnostmi receptoru?

mnohé domény na extracelulárních i transmembránových doménách byly známy jako specifická vazebná místa pro určité ligandy: proteiny modifikujících aktivitu receptoru (receptor activity modifying proteins, RAMPs): ovlivňují transport CGRP receptoru do membrány a jeho glykosylaci podmiňují afinitu CGRP receptoru k příbuznému proteinu adrenomedullinu asi regulují funkce VIP, sekretinového a glukagonového receptoru (GPCRs skupiny B)

peptidergní receptory nejen na synapsi v menší míře i na plasmatické membráně axonů, těl neuronů i dendritů u některých subtypů je možná jejich extrasynaptická lokalizace primární po delší vazbě ligandu na tyto receptory spřažené s G-proteiny receptory internalizovány následně buď recyklovány, nebo degradovány výjimky: receptor pro neurotensin je i s navázaným ligandem transportován do těla neuronu a byl prokázán poblíž jádra nepotvrzeno, ale peptidergní receptory by mohly hrát i roli v kontrole genové transkripce

RAMP1(isoformy RAMp1-3)

u většiny malých neuropřenašečů popsána poměrně záhy (množství agonistů a antagonistů, kteří mohli mimikovat jejich působení, nebo naopak simulovat jejich nedostatek) v případě neuropeptidů množství těchto farmakologických nástrojů poněkud limitované jen někteří z peptidergních agonistů a antagonistů procházejí přes hematoencefalickou bariéru

stanovení tkáňové koncentrace neuroppetidů? pokud je neuronální aktivita inhibována, může koncentrace neuropeptidů v tkáni růst, protože neuropeptidy se v „tichých“ buňkách akumulují naopak, vyšší aktivita neuronů může vést až ke tkáňovému vyčerpání neuropeptidů vzrůst nebo pokles hladiny neuropeptidů? ... mikrodialýza alespoň umožňuje přesně a přímo změřit extracelulární koncentrace neuropeptidů ve vybraných mozkových oblastech

většina prací zabývajících se funkcí neuropeptidů postavena na přímé injikaci neuropeptidů do specifických oblastí mozku či míchy pozorování fyziologických a behaviorálních změn tímto podáním vyvolaným injikované dávky jsou často miligramové, což je vzhledem k nannomolové afinitě neuopeptidergních receptorů nefyziologické, nicméně takto byly popsány první účinky neuropeptidů

Funkce neuropeptidů

JEDNOTLIVÉ SYSTÉMY NEUROPEPTIDŮ - opioidní peptidy

Opiodní peptidy jsou farmakologicky jedny z nejdůkladněji studovaných látek – primárně kvůli svým silným analgetickým vlastnostem, ale také

kvůli svému působení proti kašli (antitussika) a průjmu (antidiarhoetika).

např. morfin byl užíván už v 19. století velká spotřeba opiátových analgetik spolu s rizikem vzniku závislosti na nich = vývoj opiátových farmak, která by závislost nezpůsobovala ani dnes sice nelze oddělit nejúčinnější analgetické vlastnosti opiátů od těch, které navozují závislost nicméně i tak objevení malých, lipofilních molekul jako naloxon a nalotrexon naloxon se užívá v léčbě předávkování opiáty nalotrexon = jehož působení je déledobější, při léčbě závislostí na opitátech a při léčbě alkoholismu

opioidní = spojeno s endogenními peptidy, které vykazují podobnou farmakologii jako opiát opiáty = morfin a jemu příbuzná nonpeptidová analoga

všechny známé opiodní peptidy jsou produkty tří velkých prekurzorových proteinů každý z nich je kódován vlastním genem:

• POMC, z něhož jsou odvozeny ACTH, -endorfin a několik nonopiodních petidů,

• proenkefalin, z něhož pochází met-enkefalin a leu-enkefalin a

• prodynorfyn, který je prekurzorem dynorfinu a jemu příbuzných proteinů

naloxon

opioidní peptidy sdílejí určité stejné aminokyselinové sekvence velmi často obsahují např. sekvenci čtyřech aminokyselin Tyr-Gly-Gly-Phe na svém N-konci, která bývá následována buď Met nebo leucinem morfinu podobné opiátové alkaloidy z opia pravděpodobně mimikují konformaci N-koncového tyrosinu endogenních peptidů

tři typy opiodních receptorů: a + NOR (orfaninový R, R pro nocicceptin)

pravděpodobně vznikají i jejich podtypy a receptory jsou schopny formovat heterodimery receptory spřaženy s G-proteiny, konkrétně s Gi/o rodinou

morfinu podobné opiáty se preferenčně váží na receptory spojeny se sestupnými drahami bolesti (periakaveduktální šedá hmota, rostroventrální medulla, thalamus či zadní rohy míšní) i v jiných oblastech mozku (ventrální tegmentum, ncl. accumbens), kde jsou zodpovědné za zesílený efekt opiátů receptory se také vyskytují ve striatu (motorická kontrola) a locus coeruleus, ve kterém mohou vyvolávat mnohé somatické projevy závislosti na opiátech a opiátové abstinence nejdůležitější role v supraspinální analgesii vysoká afinita k benzomorfanové třídě opiodních látek (pentazocin)

pentazocin

morfin

receptory jsou hlavními vazebnými partnery enkefalinů tyto receptory nejen z zadních kořenech míšních, ale i v oblastech mozku, které nejspíše nehrají v nocicepci žádnou úlohu klinické využití agonistů receptorů zatím není známo

receptory = preferenční vazebné místo endogenních opioidních peptidů -endorfiny receptory = vykazuje k nim nejvyšší afinitu dynorfin tyto peptidy se ovšem váží s různou afinitou ke všem třídám opiodních Rs

nociceptiny (orphaniny) = látky se zajímavými antiopioidní efekty váží se na receptory spřaženéné s G-proteiny, které vykazují vysokou míru homologie s receptory opioidními zvyšují vnímavost k bolestivým stimulům v hypothalamu, mozkovém kmeni, koncovém mozku, obou rozích míšních

JEDNOTLIVÉ SYSTÉMY NEUROPEPTIDŮ - Opiodní peptidy

orphanin FQ17 AA

Kortikotropin uvolňující faktor (corticotropin-releasing factor (CRF)

CRF = peptid o délce 41 aminokyselin prvně izolován jako hypothalalmický faktor napomáhající podobně jako vasopressin sekreci ACTH (sekvenován prvně u ovcí, 1981) syntetizován populací neuronů paraventrikulárního jádra hypothalamu odtud uvolňován do portálního spojení s hypofýzou nejen secernován do této portální cirkulace - neurony paraventrikulárního jádra hypothalamu projkují do různých mozkových struktur syntetizován také mimo hypothalamus, např. v centrálním jádře amygdaly sekvence: SQEPPISLDLTFHLLREVLEMTKADQLAQQAHSNRKLLDIA

CRF uvolňovaný z amygadaly hraje kritickou roli v odpovědi mozku na stres zřejmě přispívá i ke vzniku pocitů strachu a úzkosti částečně zodpovědný za negativní projevy odvykacího syndromu závislých jedinců může být také zapojen do long-term deprese v mozečku

dva subtypy CRF receptorů. CRF1 R je široce exprimován v celém mozku. Jeho antagonisté mohou sloužit jako látky v terapii úzkosti a deprese. CRF2 R je koncentrován v bočních jádrech septa. Laterální septum je spojeno s emocemi, strachem a kognitivními funkcemi. Endogenním ligandem CRF2 R je urocortin (a urocortin II, jemu příbuzný).

substance P, neurokinin A (NKA, dříve označovaný jako substance K) a neurokinin B (NKB), kassinin, eledoisin = tachykininy všechny tachykininy sdílejí stejnou C-koncovou sekvenci Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2

substance P a NKA kódovány genem pro preprotachykinin A vznikají alternativním sestřihem NKB je kódován genem pro preprotachykinin B všechny známé tachykininové receptory jsou spřažené s Gq proteiny označovány jako NK1, NK2 a NK3 receptory

Tachykininy

substance P vykazuje nejvyšší afinitu k NK1

receptoru, NKA preferenčně váže NK2 receptor a NKB zejména NK3 receptory

Substance P a neurokinin A

substance P: už v 70. letech se věřilo, že by mohla být hlavním transmiterem nocicepce synapse primárních aferentních noiceptorů zadních kořenů míšních obsahují značné množství neuropeptidů, z nichž nejhojnější jsou calcitonin gene-related peptid (CGRP), ! substance P a NKA substance P v nocicepčních C vláknech kolokalizována s glutamátem její výlev z velkých denzních váčků vyžaduje silnější stimulus, než který by stačil pro klasický výlev glutamátu uvolňuje se i retrográdně z volných nervových zakončení nocicepčních neuronů přispívá k fenoménu neurogenního zánětu, při kterém interaguje s peptidem bradykininem

myši knock-outované pro NK1 receptor nebo gen pro preprotachykinin A: nevykazovaly projevy neurogenního zánětu, ale jejich nocicepce byla omezena jen v určitých nocicepčních drahách žádnou změnu oproti přirozenému fenotypu např. nevykazovaly v mechanické hypersenzitivitě navozené zánětem deficity v nocicepci vykazovaly jen při aplikaci nocicepčních stimulů se vzrůstající intenzitou

Roli substance P v nocicepci tedy evidentně mohou přebírat i jiné nocicepční neuropřenašeče.

substance P a NK1 Rs se nacházejí v amygdale antagonista NK1 Rs v pokusech prováděných na mládětech morčat izolovaných od matky snižoval zvukové projevy jejich stresu antagonisté NK1 Rs testováni jako antidepresiva a anxiolytika; slibní i v léčbě chemotarapií navozené nausey (oproti antagonistům 5-HT3 receptorů (ondasetron) blokují nejen časnou, ale i pozdní fázi tohoto fenoménu)

substance P

Aprepitant

Antagonisté NK1 Rs - ANTIEMETIKA

Antagonisté NK1 Rs:

• potenciální analgetika• potenciální antidepresiva• potenciální hypnotika• možná role v etiologii bipolární poruchy (studie z r. 2008, Arch. Gen. Psychiatry 65 (1): 53–61 )

peptid o délce 13 aminokyselin vzniká z prekurozru obsahujícího také peptid neurotensinu podobný 6 aminokyselin) NT exprimován v mozku, nadledvinách a střevu, a to v mírně odlišných formách podle své tkáňové distribuce jeho C-konce obsahuje alternativně jednu ze tří Lys-Arg sekvencí, které jsou podle typu tkáně rozdílně štěpeny v mozku z prekurzoru vzniká NT a neuromedin N v nadledvinách vzniká delší forma neuromedinu N, neurotensin a jeho o něco delší štěpný produkt ve střevu vzniká NT a delší forma neuromedinu N

Neurotensin (NT)

dva typy receptorů pro neurotensin : NTS1 a NTS2 receptory NTS1 mRNA je produkována v substantia nigra, ale ne ve striatu kupodivu, vlastní protein NTS1 receptorů se na dopaminergních terminálách striata nachází NT tak zřejmě moduluje dopaminergní transmisi exprese mRNA pro neurotensin je ve striatu vyvolaná antagonisty D2

receptorů, z nichž mnohé souží jako antipsychotika a nebo psychostimulační drogy (kokain, amfetamin)

Byl naklonován i NTS2 receptor, ale jeho úloha zatím zůstává nejasná.

neurotensin

jedním s řady navzájem příbuzných peptidů, které tvoří rodinu pankreatických polypetidů 36 AA izlován r. 1982 jejími dalšími členy jsou pankreatický polypeptid (PP) a polypeptid YY (PYY) NPY je nejhojnějším neuropeptidem mozkové kůry koncentrován je i zadních rozích míšních a v hypothalamu v sympatiku i v CNS bývá kolokalizován s noradrenalinem

NPY a jemu peptidy se u savců váží na receptory označované Y1 až Y5

(u lidí jen čtyři - Y1, Y2 , Y4, Y5)

receptory vykazují různou afinitu pro NPY, PP i PYY nacházejí se presynapticky i postsynapticky v různých oblastech mozku aktivace Y1 receptoru zřejmě souvisí s poklesem úzkostného chování, asi na úrovni amygdaly a kůry mozkové agonisté Y1 receptoru by mohla být slibná anxiolytika, a vykazují i určitý antinocicepční efekt naproti tomu aktivace Y5 receptoru vede ke zvýšení příjmu potravy (nejspíše na úrovni hypothalamu) antagonisté Y5 receptorů by tedy mohli být úspěšní v léčbě obezity

Neuropeptid Y (NPY)

NPY

dusíkaté heterocykly tvořené kondenzovaným pyrimidinovým a imidazolovým kruhem v purinergní transmisi využívány nukleosidové a nukleotidové deriváty samotného purinu v nukleových kyselinách jsou využívány dva purinové deriváty (adenin a guanin) v rámci signalizace mezi neurony využívány hlavně adenosin a ATP využíván i jim příbuzný je adenindinukleotid (ApnA) = molekula sestávající ze dvou adenosinů kovalentně spojených řetězcem dvou až šesti fosfátů.

na neurotransmisi se do určité míry mohou podílet i nukleotidové deriváty pyrimidinového typu

PURINY

Puriny nejsou jen stavebními kameny RNA a DNA, metabolickými kofaktory nebo druhými posly jako cAMP nebo cGMP. Hrají také důležitou roli v

signalizaci mezi neurony.Biochemie purinů

adeninguanin

adenosin a ATP vykazují i odlišné vlastnosti

ATP a ApnA skladovány v malých synaptických váčcích a uvolňovány exocytosou navozenou depolarizací a vtokem Ca2+ do zakončení často jsou také detekovány ve stejných synaptických váčcích na stejné synapsi

adenosin uvolňován z nonvesikulárních cytoplasmatických zásob mimo cytoplasmu jej mohou uvolňovat obousměrné nukleosidové transportéry může vznikat rovnou v synaptické štěrbině, kam je uvolňován ve formě ATP a během sekundy metabolizován na membráně navázaná ectodiphosphohydrolasa konvertuje ATP na ADP a AMP AMP rozpustnou či s membránou asociovanou ecto-5´-nukleotidasou konvertován na adenosin výlev ATP tedy rovněž může být vydatným zdrojem extracelulárního adenosinu ApnA je hydrolyzován pomaleji a zůstává v synaptické štěrbině delší dobu

Skladování a výlev purinů

Purinové transportéry

nukleosidové transportéry = k membráně vázané proteiny sloužící k přenosu purinových a pyrimidinových nukleosidů dovnitř a ven z mnoha typů buněk liší se svou substrátovou specifitou (jsou purin- nebo pyrimidinselektivní) některé koncentrují nukleosidy v buňce v závislosti na Na+

jiné transportují nukleosidy ve směru jejich koncentračního gradientu

jiné transportují nukleosidy ve směru jejich koncentračního gradientu farmakologicky bylo odlišeno nejméně sedm nukleosidových transportérů čtyři i klonováni u lidí 3 koncentrační transportéry (CNT - přenáší proti gradientu; AZT!) 4 ekvilibrační (ENT - po konc. gradientu), jejich inhibitory (dilazep) jsou vazodialtancia

farmakologie zahrnuje některé terapeuticky využitelné látky:• několik chemoterapeutik nádorového bujení (gemcitabin) a • silná antivirotika jako zidovudin (AZT) či Zalcitabin, užívané v

léčbě AIDS obvykle nukleosidové analogy potenciálně i farmaka užitečná v léčbě neuropsychiatrických poruch

Purinové transportéry

Kredit:Mol Aspects Med. 2013 Apr-Jun;34(2-3):529-47

Charakteristiky některých purinových Rs

• purinergní signalizace se objevuje už u bakterií, améb, bičíkovců, řas, hub, žahavců, žebernatek, ploštěnců, hlístic, korýšů, měkkýšů, kroužkovců, ostnokožců a hmyzu

• u rostlin zvyšuje extracelulárně podané ATP a jiné nukleotidy cytoplasmatickou koncentraci vápníku, čímž ovlivňuje růst rostliny a její odpověď na různé stimuly

.

váží adenosin a jeho analoga spřaženy s G-proteiny vyklonovány čtyři subtypy A1 subtyp je nejrozšířenější v mozku a v páteřní míše nejvyšší afinitu vykazuje k adenosinu aktivace A1 subtypu anxiolytické, antikonvulzivní, analgestické a sedační účinky adenosinu antagonisté A1 receptoru stimulační efekty v nižších dávkách např. zvyšují pozornost (kofein), ve vyšších dávkách

vyvolávají pocity úzkosti a podráždění

Purinové receptory

kofein

Purinové receptory tvoří relativně velkou a různorodou skupinu proteinů, dělenou do dvou hlavních podskupin, označovaných jako P1 a P2 receptory.

P1 receptory = adenosinové receptory A1, A2A, B a A3

P2 receptory = dvě rodiny zástupců

• P2Y receptory spřažené s G-proteiny a • P2X receptory, které jsou ligandem ovládané

iontové kanály

P1 receptory = adenosinové receptory A1, A2A, B a A3

A2 receptorů vyklonovány dva podtypy: A2A a A2B

k adenosinu mají poněkud nižší afinitu než A1 receptor A2B receptory široce rozšířené v celém lidském těle jejich exprese v mozku a páteřní míše je ale nízká oproti nim jsou A2A receptory vysoce koncentrovány v zadním striatu, ncl. accumbens a čichovém laloku - třemi mozkovými oblastmi s dopaminergní inervací interakce dopaminu a adenosinu jsou v těchto oblastech popsány ve striatu agonisté A2A receptorů inhibují odpovědi navozené D2 receptory naopak antagonisté je mimikují – i to přispívá se stimulačním účinkům kofeinu a jiných methylxanthinů antagonizací A2A Rs kofein redukuje klidový tok cerebrálními arteriemi o 22-30% inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné v terapii Parkinsonovy choroby

metabolity kofeinu

A3 receptor v nízkých hladinách exprimován v mozku

jeho funkce zatím není do detailů popsána

má neuroprotektivní i neurodegenerativní efekty, může posilovat buněčnou proliferaci i smrt

kardioprotektivní funkce během srdeční ischemie (selektivní agonista CP532,903)

antagonista SSR161421 by mohl být vhodný pro terapii bronchiálního astmatu

agonista CF-101 v klinických pokusech léčby revmatické artritidy (genericky IB-MECA, hotová je fáze II, stejně jako fáye II psoriatické studie) a tzv. syndromu suchého oka (keratoconjunctivitis sicca, fáze III)

ze všech adenosinových receptorů vykazuje k adenosinu nejnižší afinitu

zatímco A1 a A2 receptory váží adenosin s nanomolární afinitou, A3 receptor potřebuje mikromolární koncentrace

P2Y receptory spřažené s G-proteiny a vyklonováno 14 P2Y receptorů váží difosfáty i trifosfáty purinových i pyrimidinových nukleotidů, stejně jako ApnA afinita k různým ligandům se liší např. P2Y1 receptor váže ATP a ADP, ale ne UTP nebo UDP naopak, P2Y2 receptor je aktivován ATP i UTP se stejnou potencí oba P2Y1 i P2Y2 receptory byly detekovány v mozku

Nomenklatura P2Y receptorů je poněkud zmatečná, protože některé subtypy, u kterých se mělo za to, že jsou naklonovány, naklonovány vlastně nebyly :)

Protein Gen Spřežení Nukleotid

P2RY 1 P2RY1 Gq/11 ADP P2RY 2 P2RY2 Gq/11 ATP, UTP P2RY 4 P2RY4 Gi a Gq/11 UTP

P2RY5 / LPA 6 LPAR6 lysofosfatidová kyselina P2RY 6 P2RY6 Gq/11 UDP P2RY 8 P2RY8 orphan receptor

P2RY9 / LPAR 4 / GPR23 LPAR4 lysofosfatidová kyselina P2RY 10 P2RY10 orphan receptor P2RY 11 P2RY11 Gs a Gq/11 ATP P2RY 12 P2RY12 Gi ADP P2RY 13 P2RY13 Gi ADP P2RY 14 P2RY14 Gq/11 UDP-glukosa

Všimněte si, že P2Y3, P2Y5, P2Y7, P2Y8 a P2Y9 , receptory vlastně nejsou ;)

P2Y receptory

Ionotropní purinergní receptory (P2X R)

P2X receptorů bylo charakterizováno 7 subtypů u člověka se nacházejí zejména na chromosomoech 12 a 17 kationtové kanály aktivované ATP nebo ApnA sestávají z více podjednotek dva transmembránové segmenty s C- i N- koncem v cytoplasmě (podobně jako mechanosensitivní kanály vláskových buněk nebo epitheliální Na+ kanály obratlovců) nejspíše trimery, TM2 segment tvoří vnitřní pór in vitro formují homomery s výjimkou P2X6 podjednotky fuknční kanál obvykle heteroromer extracelulární smyčky spojené disulfidickými můstky Na+, K+, Ca2+

evolučně primitivní a nezávisle oddělená receptorová rodina

aktivace P2X receptorů rychlé toky Na+, K+ a Ca2+ depolarizace buňky vyskytují se na periferii, na nervosvalovém spojení, v míše i mnoha oblastech mozku ovlivňují srdeční rytmus, cévní a svalový tonus, kontrakci vas deferens při ejakulaci nebo nocicepci overexprese P2X4 Rs v míše vede k hypersensitizaci citlivé na makrocyklický lakton ivermectin (zvyšuje jejich vodivost a zvyšuje pravděpodobnost otevření kanálu)

P2X4 R

připisovaná celá řada funkcí, ale jen některé byly s určitostí potvrzeny

adenosin má anxiolytické a hypnotické vlastnosti, což potvrdilo i podávání antagonistů adenosinových receptorů kofein a jiné methylxanthinové sloučeniny zvyšují bdělost a kognici antagonisté purinergních receptorů by mohli být využívání jako podpůrná léčba symptomů u deficitů spojených a Alzheimerovou chorobou a jinými formami demence

Neuroprotekční účinky adenosinu: např. po mozkové mrtvici.

mrtvici doprovází ischemie spojená se zvýšením koncentrace glutamátu ten navozuje masivní vtok Ca2+ do buněk a jejich excitotoxickou smrt ideální neuroprotektivum:

• za ischemických podmínek inhibuje presynaptický výlev glutamátu

• zabraňuje depolarizaci postsynaptické membrány a vtoku Ca2+ do postsynaptické buňky

adenosin vyhovuje oběma parametrům aktivace presynaptických A1 receptorů adenosinem blokuje výlev glutamátu aktivace postynaptických A1 receptorů otevírá draslíkové a chloridové kanály a vede k hyperpolarizaci membrány celkový výsledek: snížený vtok vápníku a nižší úmrtnost neuronů pokusy na zvířecích modelech tuto hypotézu potvrzují

Funkce purinů

podání selektivníh agonistů A1 receptorů bezprostředně před ischemickou atakou nebo v jejím průběhuu významné snížení ztráty neuronů a chrání před následnými deficity paměti naopak, podávání selektivních antagonistů ischemické poškození mozku zhoršuje

!POZOR! – množství adenosinu se v mozku během ischemie dramaticky zvyšuje aktivace A1 receptorů může být do určité míry neuroprotekční, na jiných subtypech purinergních receptorů vyvolává opačný efekt aktivace A2 receptorů na modely mozkové mrtvice výrazně negativní dopad podávání selektivní antagonistů A2 receptorů působilo neuroprotekčně stejně tak bezprostřední aktivace A3 receptorů výrazně zvyšovala u pokusných zvířat poškození mozku a úmrtnost kupodivu, dlouhodobé podávání téhož farmaka mělo efekt naprosto opačný na různorodosti těchto pozorování se zřejmě podílí vliv adenosinu na cévní tonus a agregaci krevních destiček

Adenosinová signalizace v léčbě Parkinsonovy nemoci?

ve striatu poměrně hojně exprimovány A2A receptory inhibují odpovědi navozené D2 receptory a naopak antagonisté je mimikují – aktivace A2A receptorů navozuje pokles motorické aktivity inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné v pomocné terapii alespoň těchto projevů popsáno několik látek, které při perorálním podání selektivně blokují A2A receptory při současném podávání s L-dopa snižují její vedlejší účinky u některých parkinsonických pacientů může zmírňovat dyskinesii i theofylin

theofylin

Role purinů v modulaci imunitní odpovědi

• cestou aktivace P2X7 receptorů dochází k poklesu intracelulární hladiny draslíku a formování tzv. inflamosomu

• autokrinní purinergní signalizace = důležitý kontrolní bod při aktivaci leukocytů

• puriny mohou (v závislosti na cytokinovém okolí) fungovat imunosupresivně i imunostimulačně

M koncentrace aktivují A2A a A2B receptory, což vede k inhibici výlevu granulí z neutrofilů a zabraňuje oxidativnímu vzplanutí

X

nM koncentrace ATP naopak stimulují A1 receptory, což vede k chemotaxi neutrofilů do místa zánětlivého stimulu.

Roli hraje také koncentrace ATP:

Role purinů v CNS

• adenosin a ATP slouží také jako mediátor v komunikaci neuron-glie

• oba indukují proliferaci astrocytů

• v mikrogliích jsou exprimovány P2X i P2Y receptory

• P2Y6 receptor, zprostředkovávající primárně odezvu na UDP, hraje důležitou roli ve fagoptóze mikroglií a jejich proliferaci

Kredit: http://journal.frontiersin.org/Journal/10.3389/fncel.2013.00049/full

• P2XR receptory jsou zapojeny do drah neuropatické bolesti

• P2Y12 receptor = specializovaný pattern recognition receptor (receptor rozpoznávající vzorec/motiv), např. molekulární vzorec patogenity v rámci imunitní odpovědi

• ve frontální kůře mozku pacientů s Alzheimerocou chorobou byla prokázána zvýšená hladina A1 a A2A

receptorů, zatímco hladina A1

receptorů ve vnější vrstvě gyrus dentatus hippokampu byla snížena

Kredit: J Neurochem. 2014 Mar;128(5):650-61

Clopidogrel

• agonisté zejména P2Y12 receptoru• Prasugrel, Ticagrelor nebo Ticlopidin• Clopidogrel (prodáván jako Plavix = dříve celosvětově druhý nejpředepisovanější přípravek

• musí být v organismu aktivován CYP2C19 v játrech• 2-14% US populace má sníženou hladinu tohoto jaterního enzymu nižší účinnost a vedlejší účinky• Prasugrel tímto netrpí

Role purinů v antikoalulaci

Prasugrel

Co si pamatovat z dnešní přednášky

neuropeptidy: klasifikace neuropeptidy: vznik a a proteolytické štěpení neuropeptidy: rozdíly v signalizaci oproti „klasice“ neuropeptidy: funkce puriny: skladování a výlev puriny: receptorové třídy puriny: příklad farmakologie receptorů