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522
Nested-PCR法 に よ る イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス の 検 出
川崎市衛生研究所
清 水 英 明
神奈川県衛生研究所
渡 辺 寿 美 今 井 光 信
(平成9年2月12日 受付)
(平成9年3月19日 受理)
Key words : influenza, nested-PCR, serotype
要 旨
イ ンフルエ ンザ ウイ ルス の迅速,高 感度 な検 査法 として のNested-PCR法 の検 討 を行 った.さ らに,
この 方法 を用 いて イ ンフルエ ンザ の血清 抗体 上昇 が認 め られ た ものの,ウ イル ス分離 試験 で陰 性 の検体
にっ いてNested-PCR法 に よるウ イル スRNAの 検 出 を行 った.近 年 の ワクチ ン株 と川崎 市衛 生研 究所
で分 離 され た株 の感染 細胞 上清 を用 い,プ ラ イマ ーの特 異 性 を先 に調 べ た結 果,型 特異 性 が高 く,各型 間
で の非特 異反 応 はみ られ なか った.検 討 した プ ライマ ー を用 い,検 出感 度 につ いて ワ クチ ン株 で測 定 した
結 果・AH1型 は1stPCRで90PFU/assey,2ndPCRで0 .9PFU/assey,AH3型 は1stPCRで100PFU/
assey,2ndPCRで1 .OPFU/assey,B型 は1stPCRで180PFU/assey ,2ndPCRで1.8PFU/asseyで あっ
た.血 清 抗体価 の上 昇 が み られ た に もか かわ らず,分 離陰 性 で,AH1型 に感 染 を受 けた もの と血清 学 的
に診 断 され た臨床 検体 で は20検 体 中17件(85 .0%),AH3型 で は19検 体 中15件(78 .9%),B型 で は7検
体 中6件(85.7%)で,合 計46検 体 中38件(82 .6%)がPCR陽 性 とな った.こ の こ とか ら,本 方法 は インフルエ ンザ の早期 診 断 に用 い るこ とが で きる もの と考 え られ た
.
序 文
インフルエンザは毎年冬期 に流行を繰 り返す公
衆衛生上重要なウイルス感染症 であ り,現 在,
AH3(香 港)型,AH1(ソ 連)型,B型 ウイルス
の3種 類がヒトか ら分離されている.さ らに,高
齢者,呼 吸器 ・循環器等基礎疾患を持つハイリス
クグループ,特 に高齢者福祉施設や病院の小児病
棟等基礎疾患を持つ閉鎖集団で,イ ンフルエンザ
ウイルスは急速に拡散するため,そ の集団のほと
ん どの者が感染する危険性がある1)~4).重 症例 と
しては細菌 との合併症による肺炎が多 く,そ の他
にライ症候群や脳症,熱 性痙攣の報告 も見られて
いる5)~7).
インフルエンザウイルスの検査法 としては,一
般的に発育鶏卵やMDCK細 胞 を用いてウイルス
を分離するか,急 性期 と回復期のペア血清を用い
た抗体価の上昇で診断する方法が用 い られてい
る.し かし,結 果を得 るために長期間を有 し,治
療 には役立たせることができない.ま た,冬 期の
集団かぜ患者において,流 行株のインフルエンザ
に対す る血清診断で抗体価 の上昇が認 められて
も,ウ イルスが分離 されないことをしばしば経験
する.そ こで,迅 速,高 感度なインフルエンザウ
イルスの検査法 としてNested-PCR法 について,
検出感度 を測定するとともに,こ の方法を用いて
ペア血清で抗体上昇が認められた ものの,ウ イル
ス分離陰性の検体からのインフルエンザウイルス
の遺伝子検出を試みた.
材料 と方法
検体
別刷請求先:(〒210)川 崎市川崎 区大島5-13-10
川崎市衛生研究所 清水 英明
感染症学雑誌 第71巻 第6号
イ ン フル エ ンザ ウイル ス のNested-PCR法 523
用 い た ウイ ル ス は,川 崎 市 で 分 離 さ れ たAH1型
(A/kawasaki/76/92), AH3型(A/kawasaki/
161/94),B型(B/kawasaki/47/93)お よび1995
年 度 の ワ クチ ン株(A/yamagata/32/89, A/kita-
kyusyu/159/93, B/mie/1/93)のMDCK感 染 細
胞 上 清 を用 い て プ ライ マ ー の 特 異 性 を 調 べ た.検
体 か らの ウ イ ル ス検 出 に は,1992~1994年 に採 取
され た イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス分 離 陽性 の 咽 頭 ぬ
ぐい液23件(AH1型3件,AH3型10件,B型10件),
血 清 抗 体 価 の上 昇 が み られ 分 離 陰 性 で あ った うが
い液46件(AH1型20件,AH3型19件,B型7件)
を 用 い た.な お,検 体 の うが い液 は急 性 期 の血 液
と同 日 に採 取 した.ま た,ワ ク チ ン株 に つ い て は
MDCK細 胞 を用 い た ウ イ ル ス の プ ラー ク 定 量 法
を行 い,PCR法 の 検 出感 度 を測 定 した.
プ ラ イ マ ー
プ ラ イ マ ー の設 定 は,イ ン フル エ ン ザ ウイ ル ス
HA1遺 伝 子 中 の 変 異 の 少 な い領 域 で,す で に報 告
さ れ て い る も の8)9),ま た 自 ら設 定 し た もの を用
い,1stPCRの プ ラ イ マ ー は3種 類 の型 が 泳 動 す
る際 に判 別 しや す い よ うに,増 幅DNAの サ イ ズ
を変 えて 作 製 し,混 合 して使 用 した(Table1).
PCR
RNAの 抽 出 は ホ ッ ト フ ェ ノ ー ル 法10)を 用
い,-20.Cで 一晩 静 置 後,エ タ ノ ー ル 沈 殿 を 行 い
RNAを 回 収 し,そ の 沈 渣 に10μlの 減 菌 蒸 留 水 を
加 えた.RT反 応 はRNA10μlにRTBuffer(100
mMTris-HCI, 500mMKC1, 15mMMgC12, 100
mMDTT)2μl, 10mMdNTPs4μl, 20UReverse
Transcriptase1μl, 40URNaselnhibitor, 20μM
senseprimers各0.5μlに 蒸 留 水 を 加 え 総 量20μ1
と し て,42.C60分, 95℃5分 イ ン キ ュ ベ ー ト し
cDNAを 作 製 し た. lstPCRはcDNA20μ1に
PCRbuffer(100mMTris-HC1, 500mMKC1,
15mMMgC12)3μ1, 5UTaqDNAPolymerase
0.3μ1, 20μManti-senseprimers0.5μ1お よ び 蒸
留 水 を 加 え,総 量50μ1と し て,94℃1分, 55℃1
分,72.C1分 を30サ イ ク ル 行 っ た. 2ndPCRは1
stPCR product 5μ1にPCR buffer 4.5μ1, 5UTaq
DNA Polymerase 0.3μ1, 10mM dNTPs 4μ1,
20μM sense primer, antisense primer各0.5μ1お
よ び 蒸 留 水 を加 え,総 量50μ1と し て,94℃1分,
55℃1分,72℃1分 を30サ イ ク ル 行 っ た.増 幅
DNAバ ン ド の 検 出 はlstPCR, 2ndPCR product
にlordingbufferを 加 え,3%NuSieveで100V
30分 間 泳 動 し,ethidiumbromideで 染 色 後,紫 外
線 を 照 射 し 確 認 し た.
成 績
PCR法 の 特 異 性 の 検 討
1stPCR産 物 はAH1型(A/kawasaki/76/92,
A/yamagata/32/89)で431bp, AH3型(A/
kawasaki/161/94, A/kitakyusyu/159/93)で578
bp, B型(B/kawasaki/47/93, B/mie/1/93)で
329bpにDNAバ ン ド が 検 出 さ れ た(Fig.1).2
ndPCR産 物 はAHI型 で197bp, AH3型 で232bp,
B型 で195bpにDNAバ ン ド が 検 出 さ れ た(Fig.
Table 1 Sequence of PCR primers used to detect HA gene of influenza virus
平成9年6月20日
524 清水 英明 他
Fig. 1 Detection of PCR product (lstPCR)
Fig. 2 Detection of PCR product (2ndPCR)
AH3 AH1 B AH3 AH1 B AH3 AH1 B primer
2).1stPCR,2ndPCR共 ,各 型 間 で の 交差 反 応 は
み られ ず プ ラ イ マ ー の 特 異 性 が 証 明 さ れ た .
PCR法 の検 出 感 度 の検 討
PCR法 の 検 出 感 度 に つ い て プ ラ ー ク 法 を用 い
定 量 し た ウ イ ル ス で 検 討 を 行 っ た .AH1型 はl
stPCRで90PFU/assey, 2ndPCRで0 .9PFU/
assey, AH3型 は1stPCRで100PFU/assey ,2
ndPCRで1.OPFU/assey,B型 は1stPCRで180
PFU/assey, 2ndPCRで1 .8PFU/asseyで あ っ
た.
ウ イ ル ス分 離 陽 性 検 体 とPCR法 との比 較
ウ イ ル ス分 離 陽 性 の 咽 頭 ぬ ぐい液23件 は全 て分
離 ウ イ ル ス と同 じ型 の プ ラ イ マ ー に の みDNAバ
ン ドの 増 幅 が み られ た .
ウ イ ル ス 分 離 陰 性 検 体 とPCR法 との 比 較
イ ン フ ル エ ンザ 流 行 時 に採 取 され,イ ン フル エ
ンザ 分 離 陰 性 で ペ ア血 清 で 抗 体 価 の 上 昇 が み られ
た うが い液 で は,AH1型 は1stPCRで20検 体 中1
件(5.0%),2ndPCRで17件(85.0%)でDNAバ
Table 2 Results of antibody titer and PCR
method (AH1 type)
ン ドが検 出 さ れ た(Table 2) .AH3型 は1stPCR
で19検 体 中3件(15 .8%),2ndPCRで15件
(78.9%)でDNAバ ン ドが 検 出 さ れ た(Table
3).B型 で は1stPCRで7検 体 中3件(42 .9%),
2ndPCRで6件(85.7%)でDNAバ ン ドが検 出 さ
れ た(Table 4) .合 計1stPCRで46検 体 中7件
(15.2%),2ndPCRで38件(82 .6%)がPCR陽 性
で あ った.ま た,PCR陽 性 検 体 に つ い て抗 体 上 昇
が み られ た 型 とPCRでDNAバ ン ドが 増 幅 さ れ
た 型 は全 て一 致 し た.
PCR陽 性 は発 病 後2~9日 まで に 採 取 さ れ た
血 清 で,1stPCRで 陽 性 で あ っ た7件 は す べ て 急
性 期 の 抗 体 価 が32倍 以 下 で あ った .ま た,急 性 期
の 抗 体 価 が32倍 以 下 か ら256倍 ま で,抗 体 価 の 比 較
的 高 い検 体 か ら も,DNAバ ン ドが 検 出 され た .
考 察
今 回,迅 速 か つ 高 感 度 の検 査 法 と してNested-
PCR法 に よ る イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル スRNAの
検 出 を ワ ク チ ン株 を用 い て 行 っ た と こ ろ,検 出 感
度 は各 型 で,1stPCRで90~180PFU/assey, 2nd
PCRで0.9~1.8PFU/asseyで あ っ た.こ の こ と
感染症学雑誌 第71巻 第6号
イ ン フル エ ンザ ウイ ル スのNested-PCR法 525
Table 3 Results of antibody titer and PCRmethod (AH3 type)
Table 4 Results of antibody titer and PCR
method (B type)
から検出感度 は細胞培養法に比べ,極 めて高いも
のと判断される.そ こで血清抗体価の上昇がみら
れたが分 離試 験 陰性 であった46検 体 につ いて
Nested-PCR法 を用いたところ38件(82.6%)か ら
インフルエンザ遺伝子が検出された.そ のうち7
件(18.4%)は1stPCR産 物でもDNAバ ンドが検
出された.こ れらの検体 に共通することは急性期
の抗体価が32倍 以下で,こ の ことから感染初期 に
採取 されたものであると推定される.イ ンフルエ
ンザは感染初期 に多量のウイルスが咽頭か ら採取
される11)が,凍結融解によって不活化 され,分 離率
が低下することがある.今 回用いた検体 は医療機
関か ら凍結保存されて搬入 されたため,検 体中の
ウイルスが失活 していたことが考えられる.また,
検体採取が,発 病後9日 目でもPCR陽 性 のもの
がみられた.採 取時期が遅い場合,ウ イルス抗体
複合物が形成 され細胞でのウイルス分離が陰性に
なる可能性がある.PCR法 では保存状態が悪 く,
ウイルスが失活 してしまった検体,ま た,ウ イル
ス抗体複合物が形成 され,ウ イルス分離が困難 な
ものでもインフルエンザウイルスのRNAを 検出
し,同 時に血清型別ができる利点がある.
近年,ア マンタジン,リ マ ンタジン等抗ウイル
ス剤がインフルエンザの治療や事前投与による予
防に有効であると報告されている12)13).今回用い
たNested-PCR法 では検体が搬入された翌日(約
24時間)に インフルエンザウイルス遺伝子を検出
することができ,早 期診断に利用することができ
る.こ のことからインフルエンザウイルスを迅速
に検出す ることのできる本方法は,早 期診断に有
用であると言える.ま た,イ ンフルエンザ感染時
における脳症患者の髄液からPCR法 によるイ ン
フルエンザ遺伝子の検出が報告され,イ ンフルエ
ンザの全身感染 による中枢神経症状 との因果関係
が解明されつつある14)15).本法 はインフルエンザ
脳炎時の髄液や全身感染時における各臓器等,ウ
イルス量が少ない検体か らの遺伝子検出も可能で
あ り,こ の方法 は,今 後,生 体内のウイルスの増
殖,そ の分布等 を解明するうえで有用なもの とな
りうると考えられる.
本論文の要旨は第44回日本ウイルス学会総会(1996年10
月)に おいて発表した.
文 献
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526 清水 英明 他
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Rapid Detection of Influenza Virus A (AH1, AH3) and B by
Nested-Polymerase Chain Reaction
Hideaki SHIMIZU1), Sumi WATANABE & Mitsunobu IMAI2)
Rapid Detection of Influenza Virus A (AH1, AH3) and B by
Nested-Polymerase Chain Reaction
Hideaki SHIMIZU1, Sumi WATANABE & Mitsunobu IMAI2)1)Kawasaki City Institute of Public Health
2)Kanagawa Prefectural Public Health Laboratory
We applied the Nested-polymerase chain reaction (PCR) for laboratory diagnosis of influ-
enza virus infection. We used three primer sets for detection of influenza virus A (AH1 , AH3) andB. The primer sets for each type (AH1, AH3 ,B) was able to detect specifically each type ofinfluenza. We measured the sensitivity for detection of vaccine strains . The PCR method wasable to detect 0.9 PFU/assey of AH1 type, 1.0 PFU/assey of AH3 type and 1.8 PFU/assey ofB type. Out of 46 isolation negative but antibody positive cases , 38 cases were positive for PCR(82.6%).
This method is sensitive and useful for rapid diagnosis of influenza virus infection .
感染症学雑誌 第71巻 第6号