Savremene metode za Savremene metode za tipizaciju grupe A tipizaciju grupe A

streptokoka i distribucija streptokoka i distribucija serotipova i genotipova u serotipova i genotipova u

Srbiji u periodu od 1991. do Srbiji u periodu od 1991. do 2007. godine2007. godine

Nataša Vučković OpavskiNataša Vučković Opavski

Institut za mikrobiologiju i imunologiju Institut za mikrobiologiju i imunologiju

Medicinski fakultet BeogradMedicinski fakultet Beograd

• S. pyogenes = grupa A streptokoka (GAS) je vrlo važan član roda Streptococcus

• Isključivo je patogen ljudi; prenosi se respiratornim kapima ili

direktno, preko inficiranih rana

• Kolonizuje gušu i kožu

• Najčešće izaziva neinvazivne infekcije guše i kože; sporadični slučajevi teških invazivnih bolesti sa visokim procentom mortaliteta

Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes

Spektar infekcija se kreće od blagih do teških:

- faringitis, impetigo, šarlah

- bakterijemija, pneumonija, meningitis, nekrotizirajući

fasciitis (NF), streptokokni toksični šok sindrom (STŠS)

Klinički tok invazivnih bolesti – STŠS i NF je vrlo dramatičan

sa visokom stopom letaliteta

Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes

• GAS je vrlo važan uzročnik morbiditeta i mortaliteta ljudi

širom sveta (procena je 517,000 smrtnih ishoda svake godine)

• U Evropi je prosečna godišnja stopa incidence invazivnih

bolesti izazvanih GAS 0,3 - 3/100.000 (StrepEURO, 2003-04.)

• U SAD je prosečna godišnja stopa incidence invazivnih

bolesti izazvanih GAS bila: 3,2 - 3,9/100.000 (CDC, 2008.)

Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes

Mortalitet

Evropa: 20% (50% STSS i 25% NF)

SAD: 10 - 15% (32% STSS i 25% NF)

• Najviša incidenca invazivnih oboljenja je među osobama ≥65

godina (9.4 slučaja na 100,000 ljudi) i kod dece <1 godine

starosti (5.3 slučaja na 100,000 ljudi)

• -laktamski antibtioci su lek izbora

• Vakcinacija - 26-valentna vakcina; u 2. fazi kliničkih ispitivanja

• Praćenje trendova u epidemiologiji oboljenja GAS preko tipizacije sojeva

Za epidemiološke studije, laboratorijska istraživanja i razvoj vakcije je od izuzetnog značaja tačna tipizacija izolata GAS

Strategije kontroleStrategije kontrole

Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes

Tipizacija M-proteina

Tipizacija T-proteina

OF-tipizacija

emm tipizacija

PFGE

Multilocus sequence typing (MLST)

Klasićna karakterizacija - Klasićna karakterizacija - fenotipske metode fenotipske metode

Molekularnemetode –genotipizacija

Dr. Rebecca Lancefield je 1928.god. napravila sistem za

tipizaciju grupe A streptokoka (GAS) koji bazira na varijabilnim

antigenskim karakteristikama

termostabilnog površnog proteina.

Tipizacija M proteina - M sTipizacija M proteina - M seroerotipizacijatipizacija

Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes

Metoda po Lancefield-ovoj bazira na tretmanu kulture GAS u Todd-Hewitt bujonu, ključalom HCl. Prečišćeni ekstrakt je korišćen u testu kapilarne precipitacije da bi se odredio tip M proteina GAS. Na osnovu ekspresije M antigena je napravljena klasifikacija GAS.

Rebecca Craighill Lancefield Rebecca Craighill Lancefield

(1895-1981(1895-1981) )

Sastoji se od 4 regiona: Hipervarijabilnog (N-terminus – A podjedinice)

određuju specifičnost serotipa Varijabilni (B-podjedinice) Konzervirani (C i D podjedinice )

Antigenske razlike u hipervarijabilnom

regionu predstavljaju osnovu za serološku

klasifikaciju GAS po Lancefield - ovoj

83 specifična i potvrđena M tipa,

označena brojevima 1 – 93

M tipovi 7, 10, 16, 20, 21, 35, 45 ne postoje Antitela specifična na jedan tip ne daju zaštitu

u odnosu na druge

Smatran “zlatnim standardom”

M protein – glavni faktor virulencije M protein – glavni faktor virulencije

Problemi vezani za M serotipizaciju:

a. ograničena dostupnost antiseruma za M tipizaciju

(komplikovana i skupa priprema)

b. pojava novih M tipova (visok stepen

“netipabilnosti”)

c. teškoće u interpretaciji

Samo nekoliko referentnih laboratorija u svetu radi M

serotipizaciju

Važna za potvrdu novih tipova

Bazira na reakciji aglutinacije suspenzije bakterija,

digestirane tripsinom, sa zečjim, tipski specifičnim

antiserumom za T protein

Antiserumi su komercijalno dostupni

Postoji oko 30 T tipova

Jedan soj GAS može imati više od jednog T tipa - T

pattern (T profil)

Na osnovu poznavanja T tipa/T patterna je moguće

predvideti M tip

~50% sojeva S.pyogenes produkuje faktor zamućenja -

apoproteinazu – površni protein, koji funkcioniše kao

enzim i koji reaguje sa lipoproteinima u serumu sisara,

dovodi do povećanja zamućenja seruma

Soj GAS može biti ili OF pozitivan ili OF negativan i

korelira sa M tipom

OF enzimi su OF tipski specifični, jer svaki M tip koji

produkuje OF može indukovati tipski specifična antitela

koja se mogu koristiti u testu inhibicije OF

Iako nisu tako specifične metode kao M

tipizacija, T tipizacija i OF tipizacija predstavljaju

vredne tehnike zbog mogućnosti da se efikasno i

relativno jeftino predvidi M/emm tip

Ponovna pojava reumatske groznice i pojava teških

infekcija izazvanih GAS tokom 1980tih i 1990tih, sa

visokim procentom sojeva koje nije bilo moguće

tipizirati M serotipizacijom, je ukazala na potrebu za

preispitivanjem strategija tipizacije GAS

Pravljenje antiseruma za M tipizaciju je vrlo zahtevno

i skupo

Okretanje ka neserološkim sistemima tipizacije i

uvođenje tehnike sekvencioniranja gena koji

kodira sintezu M proteina (emm gena)

emmemm tipizacija tipizacija

mga fcrA emm scpAenn

velikiveliki virvir-regulon-regulon

mrp sph

Regulator Regulator Gen za M protein Gen za M protein (centralni gen)(centralni gen) C5a

peptidaza

Superfamilija emm gena – sastoji se od više od 20 gena koji kodiraju M i M-like proteine, koji imaju svojstvo vezivanja za Ig; Svaki soj GAS ne mora imati ceo set ovih gena. Na osnovu broja i organizacije emm subfamilije gena, postoji 5 glavnih emm hromozomskih profila (pattern-a) (A-E).

superfamilija superfamilija emmemm gena gena

emm sekvencioniranje se zasniva na određivanju

sekvence ~ 200 baznih parova na 5‘ kraju emm gena

(centralni gen u superfamiliji emm gena)

emm tipizacija se zasniva na upotrebi dva vrlo

konzervirana prajmera, kako

bi se umnožio veći deo

emm gena

Metoda je opisana 1990tih god.Kaufhold Kaufhold et al.et al. FEMS Microbiol Lett 1994;119:19-26FEMS Microbiol Lett 1994;119:19-26Whatmore Whatmore et al.et al. Mol Microbiol 1994;14:619-631 Mol Microbiol 1994;14:619-631Beall Beall et al.et al. J Clin Microbiol 1996;34:953-8 J Clin Microbiol 1996;34:953-8

Website koji održava CDC (Centres for Diseases and Control and Prevention)

Baza podataka, koja se može pretraživati i koja sadrži podatke o svim potvrđenim emm tipovima i podtipovima, kao i privremenim tipovima i podtipovima

Karaktersitike sajta: Određivanje tipa i subtipa posle sekvencioniranja u lab Pretraživanje tipova Protokoli Publikacije U bazu podataka se neprekidno dodaju sekvence gena

novih emm tipova (privremeni tipovi „st“)

Definicija tipa se zasniva na identifikaciji 90 baza koji kodiraju 30

aminokiselina smeštenih na N terminalnom delu M proteina

Određivanje Određivanje emmemm tipa/podtipa tipa/podtipa Poređenje sa bazom podataka CDC Poređenje dobijenih sekvenci sa

referentnim sekvencama korišćenjem baze podataka CDC

www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep

Princip

> 92% homologije sa 90bp – tip

bilo koja izmena u prvih 150bp – podtip

U ovom trenutku postoji više od 110 zvanično

definisanih emm tipova (emm-1 do emm-124)

emm tipovi se dalje dele na subtipove na osnovu

minornih varijacija u sekvencama 150 baza (kodiraju

50 AK) unutar tipski specifičnog hipervarijabilnog

regiona emm gena. Momentalno postoji preko 800

emm subtipova.

Postoji skoro uvek 1:1 odnos između

5‘ emm tipa sekvence i M serotipa, tj.

M tip korelira sa emm tipom

M tip emm tip OF gen za OF T tip/ T pattern

1 1 N Neg 1 (1/3/13/B3264)

2 2 P Poz 2 (2/28; 8/25/Imp19)

3 3 N Neg 3/13/B3264 (NT; 1)

4 4 P Poz 4 (NT; 8/25/Imp19; 4/28)

5 5 N Neg 5/27/44 (NT; 11/12)

6 6 N Neg 6 (NT)

7 Nije ustanovljeno

Nije ustanovljeno

Nije ustanovljeno

M – 7 ne postoji (pripada grupi C BHS)

8 8 P Poz 8/25/Imp19 (T14; NT)

9 9 P Poz 9 (14;5I9; 9/3/B3264; 11/12)

Primer je dat na prvih 9 M tipova

...koja je izvedena da bi se procenila karakterizacija GAS u 11 strep - EURO i 7 drugih streptokoknih referentnih centara

Sekvencioniranje emm gena se koristi u većini centara,

obezbeđujući visok stepen tipizacije sojeva i izuzetnu

podudarnost rezultata

Sekvencioniranje emm gena se pokazalo kao visoko

precizna i pouzdana metoda i idealna alternativa M tipizaciji.

Za karakterizaciju sojeva su od velikog značaja i fenotipske metode – T tipizacija i OF tipizacija.

International Quality Assurance Study for Characterization of International Quality Assurance Study for Characterization of Streptococcus pyogenes. Streptococcus pyogenes. Members of the Strep-EURO Study Members of the Strep-EURO Study Group and International Streptococcus Reference Laboratories and Androulla Efstratiou; Journal of Clinical Microbiology, Group and International Streptococcus Reference Laboratories and Androulla Efstratiou; Journal of Clinical Microbiology, 2007, 45:1175–1179.2007, 45:1175–1179.

Molekularna tipizacija sojeva

Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) – elektroforeza u pulsnom polju

PFGE se zasniva na upoređivanju profila DNK fragmenata u agaroza gelu

Bacterial CellIntact bacterial cells embedded in agarose

Intact bacterial DNAsuspended in agarose

2. Lysis of cells

3. Restriction enzyme digestion of DNA

Fragments of bacterial DNAsuspended in agarose

1. Cell suspension

4. Electrophoresis

1. Suspenzija ćelija

Bakterijska ćelija

2. Liza ćelija

Intaktne bakterijske ćelije uronjene u agarozu

3. Digestija DNK, restrikcionim

enzimima

4. elektroforeza

Intaktna bakterijska DNK suspendovana u agarozi

Fragmenti bakterijske DNK suspendovani u agarozi

Molekularna tipizacija soja

Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE)

-291 kb-194-145.5

- 97

- 48.5

PFGE se zasniva na nekarakterističnim razlikama u genomu između izolata jedne bakteriijske vrste. Genetske varijacije koje se registruju ovom metodom se akumuliraju relativno brzo, te je vrlo pogodna za kratkoročne epidemijske studije.

Analiza razlika u 7 “housekeeping” enzima, tj. gena koji

kodiraju te enzime

“Housekeeping” geni su prisutni u svakom organizmu.

Visoko su konzervirani, a njihovi produkti su od vitalnog

značaja za svaki organizam

Mutacije u njima su selektivno neutralne

Variajacije u ovim genima se akumuliraju relativno sporo

– pogodno za dugoročne epidemiološke studije (analiza

evolucije klonova)Enright, M.C. et al. Infect. Immun. 69, 2416-27 (2001) www.mlst.net

Postoje dve metode:

MLEE - multilocus enzyme electrophoresis – analiza

razlika u elektroforetskoj pokretljivosti

“housekeeping” enzima

MLST – multilocus sequence typing – analiza razlika

sekvenci gena koji kodiraju 7 “housekeeping” enzima

MoleMolekularna tipizacija sojeva kularna tipizacija sojeva Multilocus Sequence Typing (MLST)Multilocus Sequence Typing (MLST)

Bacterial chromosomal DNA

PCR amplify - 450bp fragmentsof seven housekeeping genes

1. Sequence the seven gene fragments on both strands

2. Compare sequences of each gene fragment with the known alleles at the locus

3. Assign alleles at the seven loci to give the allelic profile

4. Compare the allelic profile with those of isolateswithin a central database via the internet

aroe gdh gki recP spi xpt ddl

•gkigki (glucose kinase) (glucose kinase)•gtrgtr (glutamine (glutamine transporter protein)transporter protein)•murmurI (glutamate I (glutamate racemase)racemase)•mutmutS (DNA mismatch S (DNA mismatch repair protein)repair protein)•recrecP (transketolase)P (transketolase)•xptxpt (xanthine (xanthine phosphoribosyl phosphoribosyl transferase)transferase)•yqiL (acetyl-CoA yqiL (acetyl-CoA acetyltransferaseacetyltransferase

DNK bakterijskog hromozoma

PCR umnožavanje – fragmenti vel.450 bp 7 housekeeping gena

1. Sekvencioniranje 7 genskih fragmenata sa oba lanca

2. Upoređivanje sekvenci svakog genskog fragmenta sa poznatim alelima u lokusu

3. Označavanje alelela u 7 lokusa da bi se dobio alelni profil

4. Upoređivanje alelnih profila sa profilima izolata u centralnoi bazi podataka putem interneta

Multilocus Sequence Typing Multilocus Sequence Typing (MLST)(MLST)

>aroeGAAGCGAGTGACTTGGCAGAAACAGTGGCCAATATTCGTCGCTACCAGATGTTTGGCATCAATCTGTCCATGCCCTATAAGGAGCAGGTGATTCCTTATTTGGATGAGCTGAGCGATGAAGCGCGCTTGATTGGTGCGGTTAATACGGTTGTCAATGAGAATGGCAATTTAATTGGATATAATACAGATGGCAAGGGATTTTTTAAGTGCTTGCCTTCTTTTACAATTTCAGGTAAAAAGATGACCCTGCTGGGTGCAGGTGGTGCGGCTAAATCAATCTTGGCACAGGCTATTTTGGATGGCGTCAGTCAGATTTCGGTCTTTGTTCGTTCCGTTTCTATGGAAAAAACAAGACCTTACCTAGACAAGTTACAGGAGCAGACAGGCTTTAAAGTGGATTTGTGT

>gdhAGAACACTTTATCCGTGGACAATACCGCTCTGGTAAGATTGATGGCATGAAATACATCTCTTATCGTAGCGAACCAAATGTGAATCCAGAATCAACAACTGAAACCTTTACATCTGGTGCCTTCTTTGTAGACAGCGATCGATTCCGTGGTGTTCCTTTCTTTTTCCGTACAGGTAAACGACTGACTGAAAAAGGAACTCATGTCAACATCGTCTTTAAACAAATGGATTCTATCTTTGGAGAACCACTTGCTCCAAATATTTTGACCATCTATATTCAACCAACAGAAGGCTTCTCTCTTAGCCTAAATGGGAAGCAAGTAGGAGAAGAATTTAACTTGGCTCCTAACTCACTTGATTATCGTACAGACGCGACTGCAACTGGTGCTTCTCCAGAACCATACGAGAAATTGATTTATGATGTCCTAAATAACAACTCAACTAACTTTAGCCACTGGGAT Primer:

Alelni profil: aroe_8 gdh_13 gki_13 recP_4 spi_17 xpt_4 ddl_14

Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae – – Po završenom sekvencioniranju svih 7 gena se šalje zahtev na sajt http://www.mlst.net/databases . Dobijeni alelni profiil je

Sequence Type

aroe gdh_ gki_ recP spi_ xpt_ ddl_

Query 8 13 14 4 17 4 14

1.

4.

Za svaki od 7 gena se svaka različita sekvenca označava određenim alelnim brojem i svaki izolat se definiše kao serija 7 brojeva - alelni profil, koji definiše tip sekvence - sequence type (ST)

Izolati sa identičnim alelnim profilom imaju isti sequence type (ST)

Za ovaj soj je Za ovaj soj je sequence type sequence type (ST) (ST) 199199

0

5

10

15

20

25

30

Prop

orci

ja iz

olat

a(%

)

Distribucija M/emm tipova u periodu 1991 -2007

1991-93

1994-96

1997-99

2000-07

Zamena M/Zamena M/emmemm tipova – M11/M18 su zamenjeni tipovima M/ tipova – M11/M18 su zamenjeni tipovima M/emmemm1 i M/1 i M/emmemm 3 3Pojava novih Pojava novih emmemm tipova (M/ tipova (M/emmemm 28, M/ 28, M/emm emm 50 i M/50 i M/emm emm 58)58)

Faringealni izolati – 93% izolata pripada Faringealni izolati – 93% izolata pripada najčešćim 8 najčešćim 8 emmemm tipovima tipovima

Infekcije kože – 63% izolata pripada 10 Infekcije kože – 63% izolata pripada 10 emmemm tipovima; 37% izolata pripada 21 tipovima; 37% izolata pripada 21 emmemm tipu tipu

Tokom 17-godišnjeg perioda je došlo do zamene nekih

M/emm

Postoji heterogenost tipova GAS u Srbiji (posebno kožnih

izolata)

Postoje značajne razlike u distribuciji emm tipova

faringealnih i kožnih izolata

Uopšteno, ukupna distribucija najčešćih faringealnih

emm tipova u Srbiji odgovara podacima iz drugih zemalja