Nano gözenekler(Nano-pores)

KÜBRA KICIR12/05/2011

Nanopore

A nanopore is a small hole in an electrically insulating membrane, that can be used as a single-molecule detector.

• 1 – 100 nm

• amino asit, şeker ve nükleotitler 1nm

• DNA çift sarmal yapısı 2nm

• kan plazması 2-6nm

• ribozomlar 20nm

• virüsler 10 – 50nm

Nanoporlar genel olarak 2 gruba ayrılır;

Biyolojik nanoporlar: gramicidin A, alfa hemolyzn iyon kanalları (potasyım kanalları ve asetilkolin reseptörü) , mitakondri ve bakteri proteinleri

• Belli bir transmembran hücresel protein nanopor olarak hareket edebilir.

Sentetik nanoporlar ( katı-faz nanoporlar): filtrasyonda kullanılan nükleoporlar (50nm – 200nm), mika içerisine kazınmış nükleer parçalar, silikon nitrür içerisine açılmış porlar

• Nanoporlar bir silikon parçasının (silikon nitrür ) içinde aşındırma yöntemi ile daha büyük delikler halinde de yapılabilir ve daha sonra aşamalı olarak iyon demeti litografisiyle de istenilen şekilde doldurma yapılarak çapı daha küçük boyutlara indirilebilir.

Alfa Hemolisyn

Alfa hemoliysn, çapı 5nm den daha küçük gözenekler gerektiğinde en yaygın olarak kullanılan pordur. Bu por, aslında bir bakteri toksinidir.

Alfa hemolisyn hücre zarında delik açma özelliğine sahip organik bir enstrümandır. Bu bakteri doğal ortamında çevresindeki yabancı hücrelerin zarında delik açmak, bu delik yoluyla karşı hücredeki küçük organeller, iyonlar, çeşitli mineraller ve ATP gibi molekülleri kendisine geçirmek için kullanır.

Ucuz ve etkin olması avantajlarıdır.

alpha-hemolysin pore (made up of 7 identical subunits in 7 colors) and 12-mer single-stranded DNA (in white) on the same scale to illustrate DNA effects on conductance when moving through a nanopore.

Gramicidin A

• Gramisidin, 6 antibiyotikten oluşan bir antibiyotik karışımıdır.

• Toprakta bulunan Bacillus brevis bakterisinden elde edilir.

• 2-4nm iç çapına sahiptir.

• Iyonofor olarak kullanılabilir.

• Her biri 15 aminoasitten oluşan 2 gramisidin molekülü uç uca gelerek içi hidrofilik dışı hidrofobik olan sarmal bir yapı oluşturur. Iyonlar bu kanal içinden rahatlıkla geçebilirler.

A picture of the simplest ion channel known - antibacterial gramicidin A.  It conducts monovalent cations at near diffusion rates, causing collapse of the membrane potential and killing hapless bacteria.  Here Gramicidin A (helical dimer in red) is embedded in lipid bilayer (only the phosphate head groups in green are shown) and solvated with a KCl solution (K blue, Cl red and water is in the background).  Because of its simplicity, gramicidin offers an ideal channel structure for testing new methods and ideas.

Katı Faz Nanopor Fabrikasyonu ve Nanopor Dizilemesi

Düzgün nanoporlar üretmek ve SiN membranlarda nanopor dizilemesi yapabilmek için TEM de yüksek şiddetli elektron demeti kullanılır. Bu nanoporlar tek iplikçikli DNA moleküllerinin analizi için kullanılır.

Nanopore arrays are fabricated using a Scanning TEM, with a typical size distribution smaller than 0.5 nm

High resolution TEM images of nanopores fabricated in 20 nm thick SiN membranes.

Grafen

Grafen, ince ve esnek olması, elektriksel ve mekanik özelliklerinden dolayı nanopor olarak kullanılabilen bir maddedir.

Kimyasal buhar çöktürme (CVD) yöntemiyle geniş bir alanda grafen yetiştirilebilir ve bir silikon membran üzerine asılabilir. Daha sonra bu grafen TEM içerisinde odaklanmış bir elektron demetiyle delinir ve nano boşluklar açılabilir. Bir elektrolit çözeltisi içerisine yerleştirilmiş düzenekten DNA molekülünün geçişi sağlanarak dizileme işlemi gerçekleştirilir.

Molekül translokasyonu sırasında, iyon akışı bloklanır ve ölçülen akımda bu sinyallerin dedektasyonu yapılabilir.

Nanopor DNA Dizileme

Nanopor dizileme, DNA iplikçiği üzerindeki nükleotidlerin nasıl sıralandığını belirleyen ve 1995 yılından beri gelişmekte olan bir yöntemdir. Özellikle kalıtsal hastalıkların meydana gelme ve tedavi süreçleriyle ilgili mekanizmaların anlaşılması için, araştırma yapılan konuya etki eden gen bölgelerinin belirlenmesi gerekir. Bu bakımdan DNA analizlerinin yapılması, tedavi sürecinin başlangıcı ve devamında izlenecek yolu belirleyen en önemli faktördür.

DNA dizi analizi ile birçok organizmanın genlerinin yapısı ve organizasyonu hakkında önemli bilgiler elde edilebilir. Birçok canlı türünün tüm gen haritaları bu şekilde tanımlanabilir. 

DNA molekülü öncelikle belirli işlemler sonucu tek iplikli hale getirilir. Daha sonra bu tek iplikli DNA molekülünün yapıtaşları olan nükleik asit dizilerinin belirlenmesi gerekir. Bunun için molekülün yapıtaşlarına, belirlenen koşullar altında ayrılmasını sağlamak amacıyla, belli düzlemler hazırlanır ve aynı anda bu düzlemlerde meydana gelen biyolojik/kimyasal ve fiziksel reaksiyonların bilgisayar ortamına geçişi sağlanır.

Tespit edilmesi gereken gen bölgelerini tanıma, DNA molelüküne bağlanma ve floresan ışık yayma yeteneği olan yapay diziler (prob) hazırlanır ve ortama eklenir. Çünkü bilgisayar ortamına aktarılması gereken nükleik asit bilgisinin,cihazlar tarafından algılanması için, belli bir dalga boyunda ışığın bu dizilerden cihazlara ulaşması gerekir. Cihazlar gelen ışık demetlerini kaydeder ve bilgisayar programında veriler değerlendirilir.

Varolan birçok DNA dizileme teknolojisi, DNA içeriğindeki bazları tanımlayabilmek için, floresan boya işaretlemesinin kullanımına ve optik bilgisayar donanımlarına ihtiyaç duyar.

Çoğu dizileme metodunda, dizileme yapmadan önce DNA’nın büyütülmesi/genişletilmesi gerekir. Bu süreç zaman ve maliyeti artırır ve hatalı DNA dizilimlerinin oluşmasına yol açabilir.  Nanoporlar elektriksel alanda oluşturulan ve DNA molekülüne verilen direkt elektrik sinyalleri aracılığıyla büyütme ve işaretleme gerekliliğini ortadan kaldırır.

Nanopor dizileme daha hızlı, pahalı olmayan, kesin bir yöntemdir. 100 milyon bazın dizilemesi bu teknolojiyle yaklaşık bir günde yapılabilmektedir.

• Bir lipid membran üzerinde hemolizyn kanal bulunmaktadır. Buraya 120 milivoltluk bir voltaj uygulandığında, por içerisinden 120 piko amperlik bir akım geçer. Bu şekilde 1M lık KCl çözeltisi içerisinde bulunan bu porlardan potasyum ve klor iyonlarının taşınımı sağlanır.

• DNA sarmalı nanopora yaklaştığı zaman, buradaki iyonik akımı kısmen engeller.

• Bir kaç milisaniye sonra DNA sarmalı kendiliğinden açılarak hemolizynin açıklığından içeri çekilir. Bu sırada akımda %10luk bir geçici düşüş meydana gelir.

Herhangi bir zamanda nanopordan geçebilecek akım miktarı porun A, G, C ve T ile engellenmiş olup olmamasına baglı olarak değişir.

DNA nın pordan geçişi sırasında pordaki akım değişimi, DNA sekansının direk okunmasıyla gösterilir.

Nanopor, içinden düzgün sırayla geçen DNA daki bazları tek tek tanımlamak için de kullanılabilir.

Nanoporlar bir çözeltideki analiti tanımlamak için kullanılabilir.

Oxford Üniversitesinde yapılan bir araştırmada, protein nanoporlar kullanarak küçük moleküllerin enantiyomerleri arasındaki farklılıklar (ibuprofen ve thalidomide gibi) iyon kanalları ve spesifik biyobelirteçlerle tanımlanabilmiştir.

Bu da kliniktıp ve ilaç gelişiminde geniş bir uygulama alanı oluşturabilir.

Kanser Teşhisinde Nanoporlar

Biyolojik membranları taklit eden nano gözenekler, kanser gibi bazı hastalıkların erken evrede teşhisinde kullanılabilir. Hücre zarında bulunan delikler ve gözenekler hücrenin içi ile dışı arasındaki bağlantıyı sağlarlar. Bu boşlukları taklit edebilen nano gözenekler geliştirilmiştir. Buradaki amaç, bu porlar ultra hassas biyosensör olarak kullanılarak, hastalığa neden olan proteinleri tespit etmektir.

Bu sensörler, proteinlerin varlığında membrandan geçen akımdaki değişimi tespit ederek hastalığın tanısını koyar. Proteinler porların uçlarına bağlanarak içerden geçen akımı bloke ederler. Burada kullanılan nano gözenekler diğerlerinin aksine silindirik değil koni şeklindedir. Bu da algılama için çok daha uygundur. Çünkü iyon akım nedeniyle gerilim düşümü nanopor ucunda odaklanmıştır.

Hastalıkların Tedavisinde Nanoporlar

Akıllı cihazlar ile hastalıktan etkilenen bölgeye kontrollü ilaç salınımı lokalize edilebiliyor. Nano – membranların içlerine biyofarmostatik ilaçlar depo ediliyor ve belli bir zamanda ilacın gözeneklerden difüzyonu sağlanıyor.

İmmün sistemden gelebilecek saldırılara karsı teröpatik maddeleri korumak için 6nm civarında porlara sahip membranlar ilaç taşıyıcı sistemleri olarak kullanılır.

Silikon tabakalara yapay olarak inşa edilmiş nanoporlar oksijen, glikoz ve insülin gibi küçük moleküllerin geçmesine izin verirken, immünoglobinler gibi büyük immün sistem moleküllerinin geçişini engeller.

Bu yolla yapılan bir deneyde, fare pankreas hücreleri mikro kapsüllenmiştir. Bunların çevre hücrelerden tamamen izole olarak, nanoporlar yardımıyla besinleri ve serbest insülini içlerine aldıkları gözlenmiştir. Böylelikle nano porların, işlevini yapamayan pankreas hücrelerini, özellikle insülin üretiminden sorumlu hücreleri değiştirmek ve vücut fonksiyonlarını düzeltmek için kullanılabileceği görülmüştür.