Mykobakteriální infekce

MUDr. Pavel Čermák, CSc.

Historie

Starověk Egyptské mumie - TBC změny,průkaz nukleových kys. M.tuberculosis

Středověk

Evropa - postupné promoření obyvatelstvašíření a likvidace obyvatelstva ostatníchkontinentůlepra

NovověkR. Koch - objevení M.tuberculosis /BK/BCG vakcínapandemické postižení obyvatelstva

Imunita a epidemiologie

• Buněčná imunita• BCG vakcína (Bacillus Calmette Guérin) =

oslabený kmen M.bovis - (očkovat?)• prevalence TBC 9,62/100 000 obyvatel v ČR• Státní dozor – 2 systémy hlášení

(klinický=registr TBC a ISBT=laboratorní)• Celosvětový problém (kombinace s AIDS)

Klasifikace /celkem >80 druhů/

Obligátnípatogeny

M.tuberculosis komplex:M.tuberculosis

M.bovis, M.bovic BCGM.afrikanum, M.microtii

M.leprae

Oportunnípatogeny

Pomalu rostoucí:M.avium

M.intracelulare

M.kansasii

M.malmonese

M.marinum

M.scrofulaceum

M.szulgai

M.xenopi

Rychle rostoucí:M.fortuitum

M.chelonae

M.gordonae - většinoukontaminace z prostředí

Mikroskopická diagnostika

• Ziehl-Neelsenovo barvení - oddolnost proti odbarvení kyselinami = acidorezistentní tyčky /ART/

• Fluorescenční barvení• Hodnocení

0 ART nenalezeny+ 10 - 20 ART++ 21 - 100 ART+++ více než 100 ART

Klasické kultivační techniky

Klasická kultivace: Loewenstein -Jensenova vaječná půda,Ogawowa vaječná půda, Šulova tekutá půda

3. 6. 9. 12.týden

Prodloužená kultivace

množení 1 cyklus 40 cyklůEnterobakterie 30 minut 20 hodinM.tuberculosis 1 den 40 dní

Dekontaminace vyšetřovaného vzorku !

Metabolické metody

Průkaz rostoucích mykobakterií v uzavřeném systému/rychlá kultivace/ - detekce metabolismu

• Průkaz CO2 - radioaktivní (Bactec 460TB), kolorimetrický (MB/BacT), fluorescenční Bactec 9240 TB

• Spotřeba O2 - MGIT 960

• Oxidoredukční potenciál - MB REDOX

Negativní vzorky - kultivace 42 dní !!!

BACTEC MGIT 960

• kultivace v tekutém Middlebrookověmediu

• detekce senzorem reagujícím na spotřebu O2 změnou fluorescence

• kontinuální měřenívyšetřovaných vzorků

Genetické metody

• Hybridizace - průkaz známých sekvencí DNA• PCR ,LCR amplifikace - průkaz spec. úseků DNA

sondy - rod mycobacterium, M.tbc komplex, jednotlivé druhy

• AMTD - průkaz rRNA M.tuberculosis (nejvyššícitlivost)

• RFLP - analýza restrikčních fragmentů DNA (poddruhové určení - epidemiologie)

• amplifikace + hybridizace – rozsah 32 druhů (HainLife science)

+ rychlost, vysoká specifita, sensitivita- cena, kapacitní možnosti, problematická interpretace

Chemické metody

Detekce mykolových kyselin - plynová chromatografie

Hmotová spektrometrie - „finger printing“ metody- spálení laserem- analýza hmotnostní spektrometrem- velmi rychlé- vysoká specifita

M. tuberculosis 2001

Celkem 62 nálezů

pozitivní negativní

Mikroskopie 23(39%) 36(61%)pevné půdy 61(91,4%) 1(1,6%) MGIT +MGIT 57(98,3%) 1(1,7%) pevné +

genetické m. 23(92%) 2(8%) MGIT, pevné +

Průměrná doba kultivace: pevné půdy 27,9 dneMGIT 960 12,4 dne

M. tuberculosis 2002

Celkem 50 nálezů

pozitivní negativní

Mikroskopie 18(38%) 32(62%)pevné půdy 33(67%) 17(33%) MGIT +MGIT 49(100%) 0

genetické m. 16(94%) 1(6%) MGIT, pevné +

Průměrná doba kultivace: pevné půdy 20 dníMGIT 960 12 dní

Citlivosti na antituberkulotika

1. Standardní metoda (Grassetti) - na pevných půdáchdoba inkubace min. 3 týdny, problematické výsledky

2. MIC - kvantitativní, v tekutých půdách, inkubace min. 3 týdnynáročné na provedení

3. Rychlé citlivosti - využití přístrojů pro metabolickou detekcirůstu mykobykterií

- komerční systémy pro stanovení citlivosti:Bactec 460 TBMB/BacTMGIT960

Stanovení citlivosti klasickou proporční metodou

• Pevné vaječné LW půdy s AT(a) a kontrolní bez AT(b)

• kultivace 21 dní• poměr počtu kolonií

x% = a x 100/b• citlivý kmen = x%

menší nebo rovno 1

a b

Metoda MGIT AST SIRE

• Kritické koncentrace streptomycin - 1,0 mg/l isoniazid - 0,1 mg/l rifampicin - 1,0 mg/l ethambutol - 5,0 mg/l PZA - 100 mg/l

• Růstová kontrola 1% suspenze kmene

• Délka testu 4 - 13 dní

Terapie TBC

• Antituberkulotika základní: izoniazid (INH), rifampicin (RIF), pyrazinamid (PZA), streptomycin (STM), etambutol (EMB)

• Antibiotika - chinolony, aminoglykosidy, makrolidy

• Cytostatika a další léky• Dlouhodobá terapie, dvou až čtyřlékové

kombinace• Riziko iatrogenního poškození velmi vysoké

MDR – multidrug resistant TBC

• Kmeny Being – Čína, Rusko• rezistentní na 3 a více základních

antituberkulotik• šíření v zemích bývalého SSSR• výskyt i v západní Evropě• systém sledování MDR TBC• problematická terapie

Systémy hlášení TBC

• Registr TBC = povinnost každého lékaře hlásit každý výskyt TBC – krajský ftizeolog – hygienická služba

• ISBT = informační systém bacilární TBC. Povinnost každélaboratoře provádějící detekci TBC hlásit pozitivní nálezy. Elektronická forma.

• Provázání obou registrů.• Cíl – kontrola nad výskytem TBC.

ISBT laboratoř kraj. laboratoř ministerstvo zdrav.

hyg. služba

Registr TBC kraj. ftizeolog

dohledávání kontaktů

Co říkají mikrobiologické metody

Pozitivní mikroskopie – pacient vylučuje ART, TBC???mykobakterie = rozvinuté onemocnění

Pozitivní klasická kultivace – pacient vylučuje živémykobykterie

Pozitivní rychlá kultivace (metab. metody) – pacientvylučuje živé mykobykterie, kvantitanepřímo úměrná detekčnímu času

Co říkají genetické metody

Nakultivovaný kmen – 100% spolehlivost.

Z odebraného klinického vzorku

pozitivní - detekce živé bakterie, dg onemocnění- detekce NK mrtvé buňky- falešně pozitivní (chybně nastavenáreakce „home made“)

negativní - nejedná se o mykobakteriální infekci- falešně negativní (inhibitory amplifikace,jiné příčiny)

Interpretace v praxi

Žena 38 letLaborantka (TBC laboratoř), osobní problémy,Podzim 2003 – pneumonie, prokázány chlamydie

při kontrole na základě RTG nálezu stanovenadg TBC plic.

Všechny mikrobiologické nálezy negativní. včetně PCR.6 měsíců terapie, uznána nemoc z povolání.

Problematické pracovní zařazení.Ochrana osobních údajů.Konflikt s pneumologem (nález M.kansasi).

Interpretace v praxi

Žena 75 letVelmi zachovalá, štíhlá, bez závažných zdrav. problémů.Déletrvající kašel, odebráno sputum, kultivačně negativ.PCR M.tbc komplex pozitivní – uzavřeno jako TBC.

Všechny další mikrobiologické výsledky negativní.

Terapie v léčebně.Po terapi v pořádku.

6 měsíců v léčebněpsychické trauma i pro manžela…TBC nejspíše nikdy neměla…

záhadasputum A sputum B

Datum zpracování 3.5.2002 3.5.2002Mikroskopie neg. neg.Pevné půdy neg. neg.MGIT 960 pozitivní pozitivníGenetika - -

M.TBC M.TBCINH R RSTM R RRIF R RPZA R REMB R R

Pacient A (V.J.)80 let, muž, HKpolymorbidní (ICHS,OCHPN…)opakované hospitalizaceinterny, GMKopakovaně vyš.na TBCvždy negat.hrudní výpotek

Pacient B (J.J.)51 let, muž, vesniceopakovaně vyš.TRN Jičínopakovaně vyš.na TBCvždy negat,...v minulosti TBC...

…v dalším průběhu oba pacienti opakovaně negat.včetněPCR, z hlediska TBC onem. evidentně zdrávi…..

možnosti

Laboratorní chybaKontaminace materiálů- obou jiným materiálem vyloučena- jeden materiál druhým téměř vyloučena- obou jiným primárněrezistentním atyp.mykob. vyloučena

Chybně určená citlivost opakovaně potvrzena

Pacienti byli v kontaktuPacienti byli v kontaktu s třetí osobou

možné řešení

Oba pacienti se pravděpodobně v jeden den podrobilirozdílným vyšetřením ve FN...

Vyšetřovací komplexy

Vyšetřovací komplexy

společná chodba+čekárnaA B

NEZNÁMÝšiřitelmultirezist.TBC

Bohouš a pivní parta

Muž 48 let- „homeles“, denní abusus- úmrtí na základě prochlazení + alkohol- pitva – rozvinutá plicní TBC

Infikoval své kamarády? ANOOnemocní jeho kamarádi? NE...naštěstí nebyl nikdo vyšetřován moderními kultivačnímimetodami ani geneticky…místo po Bohoušovi obsazeno !!!

KONSTRUKCEVedro – dám si pivo – dostanu kašel – sputum na BK +genetika – a je to v…….

Závěr

• jednoduchá problematika …když ji známe

• edukace pregraduální, postgraduální, semináře atd.

• SPOLEČNÁ interpretace kultivačních a genetických metod

• úzká spolupráce mikrobiologa s klinikem