Mikrobiologickédiagnostické

metodyMUDr. Pavel Čermák, CSc.

Princip identifikacesoubor ZNAKŮ s rozdílnou separační hodnotou S

HODNOTA S: S 1

S 2

S 3

Základní problémy

• Minimum morfologických znaků• Podobná antigenní struktura• Extragenomový materiál - plasmidy,

transposomy• Systémově nejasné postavení

mikroorganismů

Rozdělení metod

• Detekce patogena - přímý průkaz (kultivace, antigeny, genetická detekce atd.)

• Detekce patofys. odpovědi - protilátky, enzymy (markery)

Detekce patogena

• Morfologie - barvení• Antigenní struktura• Chemická struktura, produkty

metabolismu• Genetická informace• Biochemické vlastnosti - klasická

mikrobiologická diagnostika

MIKROSKOPIEGRAM, ZIEHL-NEELSEN,GIEMSA

• VÝHODY • NEVÝHODY

- rychlost

- jednoduchost

- dostupnost

- cena

- zkušenosti

- interpretace

Elektronový mikroskop

• Přímá elektronoptická metoda50 000x prohlížení

100 000x foto

• Imunoelektronoptická metoda100x citlivější

Poxviridae

200 x 300 nm

Herpesviridae

150 nm

KLASICKÁ IDENTIFIKACE

1. MIKROSKOPIE2. OBECNÁ půda - krevní agar, MC agar3. SELEKTIVNÍ půdy - DC, Endův agar4. BIOCHEMICKÉ testy

zkvaš. cukrů, metab. bílkovin atd.= barevné reakceMATEMATICKÉ vyhodnocování

- identifikační seznamy- počítačové programy

komerční diagnostické sety:LACHEMAAPI

Disková difusní metodaPetriho miska s MH agarem

a testovaným mikrobem

Zóna inhibice růstu

ATB disk

Citlivý k ATB

Rezistentní k ATB

Diluční bujonová metoda MIC

128

64

32

16

8

4

2

1

32

16

8

4

2

1

0,5

0,2

ATB1 ATB2

Plastová destička8 x 12 jamek

MH bujon s dvojkovýmředěním ATB a testovaným

kmenem

Koncentrace ATB

E - test

128

32

2

Zóna inhibice růstu

Pertiho miska s testovaným kmenem

Proužek vytvářející koncetračnígradient

Izolace na tkáňové kultuře

• TKÁŇOVÁ KULTURA – lidské, opičíbuňky

• Cytopatický efekt = destrukce kultury• namnožení viru - v praxi jediná

možnost• vajíčka (embrya) se téměř

nepoužívají

Antigenní struktura

• Aglutinace• Vstřícná elektroforéza• Imunofluorescence• Latexová aglutinace, koaglutinace• EIA metody

Vstřícná imunoelektroforéza

Ig Ag+ -

Různé modifikace - Western blot

pohyb detekovaného materiálu v agrovém gelu

Imunofluorescence (IF)

1. PŘÍMÁ - detekce antigenu

Hledaný objekt

2. NEPŘÍMÁ - detekce protilátek

-

+

- subjektivní hodnocení- nespecifické reakce

- rychlost- jednoduchost- cena

Latexová aglutinace /koagl./

Ag

- vyšší citlivost- jednoduchost- cena

- různé modifikace (barva atd)

Diag + identifikační sety:

bakt. meningitisstreptokoky, rotaviry

Imunoassay

„Labeled“ „Nonlabeled“

homogenní x heterogenní turbidimetriekompetitivní x nekompetitivní nefelometrie

RIA EIAELISA = enzyme linked

imunosorbrnt assay- princip sendviče- vazba x promývání- různé modifikace (IgG,IgM capture, „one step“ atd.)

ELISA

Detekce protilátek

antigen

protil. proti lidské protilátce

hledaná protilátka enzym

substrát

peroxidázový sys.avidin-biotinový sys.

ELISA

Detekce antigenu

vázaná protilátka proti antigenu

značená protilátka proti antigenu

hledaný antigen

enzym substrát

ELISA

Provedení:

- „ ručně“

- poloautomat

- automat

KFR

• Inaktivované vyšetřované sérum

• Ag

• Morčecí komplement

• Hemolytický systém

Genetické metody

• Hybridizační - sondy DNA, RNA (nejčastějšív dtekci bakterií - bakteriální buňka obsahuje mnohonásobněvíce RNA než DNA)

• Amplifikační - PCR, LCR + další (základníprincip - syntéza části detekované NK, prodloužením primerůDNA, RNApolymerázou a basemi, geometrickou řadou do množství prokazatelného běžnými metodami)

specifita citlivost

MykobakterieNeis. gonorh.Chlamydie

citlivostriziko kontaminace

TBC, GO, Chlamydiehepatitida B + další

Hybridizace1. rozvláknění NK2. vazba známé sekvence

DNA, RNA3. detekce

- enzymaticky- fluorescenčně- elektroforeticky

Amplifikace - PCRPolymerase Chain Reaction

1. rozvláknění NK2. vazba primerů

primer 1primer 2

3. syntéza pomocí polymerázy a bazí

4. Rozvláknění, vazba primerů, polymerace

40x5. detekce

NK 105

Další modifikace genetických metod

Nested PCR - v principu dvojitá PCR reakceAMTD - průkaz rRNA M.tuberculosis (nejvyšší citlivost)RFLP - analýza restrikčních fragmentů DNA

(poddruhové určení - epidemiologie)

Real time PCR - ukončení amplifikacev okamžiku dostatečného množstvíamplifikovaného produktuKVANTIFIKACE !!!

DNA - STRIP technologie

1. izolace DNA2. Amplifikace DNA3. Hybridizace na komplementární probě

identifikaceněkolikadruhův jednomkroku

Chemické identifikační metodyPlynová chromatografie mastných kyselin

+ rychlostautomatizaceotevřený systém

-cena, náročnost

Chomatografie metabolitů (anaeroby)

Elektroforéza celotělových proteinů

Pyrolýzová hmotováspektrometrie

- tepelná degradace bakt. bb.- spektrometrická analýza

RYCHLOST

Vývojový trend - automatizace

Základ - klasické biochemické metody- ELISA- hybridizace, amplifikace

1. Počítač + fotometr

- velké množství firemních systémů pro serologii- vysoká citlivost fotometru = rychlost- nutnost manuální obsluhy

2. Automaty a poloautomaty

Serologie - zpracování komerčních diag. setů pro ELISA stanoveníantigenů a protilátek

Abbot IMXAbbot AXSYM - princip individuálního sekvenčního

zpracování materiáluMurex TECAN - dávkové zpracování „destička“

Bakteriologie 1. Přístroje pro kultivaci hemokultura mykobakterií.

2. Systémy pro identifikaci a stanoveníATB citlivosti

Poloautomaty - hemokultury

Stanovení CO2

Becton Dickinson - Bactec- Bactec TB 480

Organon Teknika - Bact/Alert- MB/Bact

Luminiscence

bio Mérieux – VITAL – vývoj zastaven

Automaty pro identifikace a ATB citlivosti

bio Mérieux - mini API- ATB expression- VITEK

Roche - COBAS microBAG - Merlin micronaut

MAST - Mastascan colour (princip digitalizace obrazu Petrihomisky - ATB citlivosti)

Výhled do budoucnostiAmplifikační genetické metody

„ČIP“

10 x 10 cm

V každém poli jiný primer= najednou se provede velkémnožství reakcí - pokryje

většinu běžně diagnostikovanýchbakterií.

Možnost stanovení ATB citlivosti -má rovněž genetický základ !