1

MOLEKULINöS MOLEKULINöS

BIOLOGIJOS BIOLOGIJOS

METODAIMETODAI

Makromolekulių išskyrimas, išrūšiavimas ir

kiekio nustatymas. Blotingai. Proteomika.

Makromolekulių sud÷ties tyrimas. DNR

sekvenavimas, Genotipavimas, DNR

klonavimas, Genų inžinerija, PGR,

Mikrogardel÷s, Metabolomika, Masių

spektrometrija, etc.

1 1 dalisdalis

Makromolekulių Makromolekulių išskyrimas, išrūšiavimas ir išskyrimas, išrūšiavimas ir

kiekio nustatymas.kiekio nustatymas.Blottings. Proteomika

2

Paruošimasir

išskyrimas

Elektro-

forez÷

Išryškinimas, aptikimas ir

kiekio nustatymas

Rekombinacija Kita

DNR Šarmin÷ liz÷

Agaroz÷sAgaroz÷sgeliogelio(retai (retai ----PAGE)PAGE)

PGRPGR+

Southern Southern analiz÷analiz÷

Restrikcijos fermentai,

Plazmid÷s

SekvenavimasSekvenavimas((sekoskaitasekoskaita))

RNR Šarmin÷ liz÷

Agaroz÷sAgaroz÷sgeliogelio(retai (retai ----PAGE)PAGE)

NorthernNorthernanaliz÷analiz÷,

AtvAtv..trtr..--PGRPGR

Nereikia skaldyti Rnaz÷mis – RNR

pakankamai mažos .

Baltymai ChromatoChromato--grafijagrafija

NDSNDS--PAGEPAGE

WesternWesternanaliz÷analiz÷,

ImunopreciImunopreci--pitacijapitacija

.NeatliekamaNeatliekama .

Tiriama medžiaga

Sekvenavimas(sekoskaita)

Aminor. sekos nustatymas

+ MASIŲ SPEKTROMETRIJA+ MASIŲ SPEKTROMETRIJA

Biologinių makromolekulių išskyrimo metodai

I. CHROMATOGRAFIJAI. CHROMATOGRAFIJA

II. ELEKTROFOREZö (+GELIO ANALIZö)II. ELEKTROFOREZö (+GELIO ANALIZö)

1. Baltymų elektroforez÷1. Baltymų elektroforez÷

3. Nukleorūgščių elektroforez÷3. Nukleorūgščių elektroforez÷

2.2. WesternWestern gelių analiz÷gelių analiz÷

4. 4. Southern Southern ir ir NorthernNorthern gelių analiz÷sgelių analiz÷s

MöGINIO MöGINIO IIŠŠGAVIMASGAVIMAS

I.BALTYMŲ IŠSKYRIMAS

3

Chromatografijahttp://en.wikipedia.org/wiki/Ion_exchange_chromatography

http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC

http://en.wikipedia.org/wiki/Size_exclusion_chromatography

http://en.wikipedia.org/wiki/Affinity_chromatography

Pagrindinis baltymų išskyrimo metodasPagrindinis baltymų išskyrimo metodas..„Ir mokslas, ir menas“.„Ir mokslas, ir menas“.Išskiriant baltymus šiuo metodu, jų denatūruoti dažniausiai neprIšskiriant baltymus šiuo metodu, jų denatūruoti dažniausiai neprireikia.ireikia.

Pagr. chromatografijos rūšys (vamzdelin÷s chromatografijos rūšys):1. Jonų mainų2. Gelfiltracijos3. Afinin÷4. Hidrofobin÷s sąveikos

Procedūra/principasProcedūra/principasTirpalas, kuriame yra norimų tirti baltymų (anglangl. . targettarget proteinsproteins), leidžiamas pro vamzdelįvamzdelį, kuriame yra speciali matrica, sukurta baltymams „sugauti“ arba jų jud÷jimui sul÷tinti d÷l skirtingų baltymų savybių (dydžio, el.krūvio, sud÷ties).

1 – Jonų mainų chromatografija (baltymų atranka pagal el. krūvį)

Baltymo molekul÷s leidžiamos per priešingu el. krūviu pakrautą vamzdelį

(kationų/anionų mainų vamzdelį), kuris turi sulfonuotą (e.g. –SO3H, COOH,

PO4) ar amonio (e.g. NH4 – jei norima sudaryti teigiamą krūvį) liekaną.

Pagrindiniai jonų mainų chromatografijos etapai:

1. Vamzdelio paruošimas: reikiamo pH buferis. Tam reikia žinoti norimo

išskirti baltymo savybes (krūvį, izoelektrinį tašką).

2. Baltymų (arba peptidų, aminor.) tirpalo supylimas. Ne visos molekul÷s

išlieka vamzdelyje.

3. Išsūdymas: tirpalo druskų koncentracijos didinimas prie vamzdelio sienelių

prilipusių baltymų išplovimui. Druskingas tirpalas, leidžiamas vamzdeliu,

lemia baltymų „pakeitimą“ druskomis, kadangi vamzdelio sienel÷s labiau

linkusios jungtis su druskomis nei su baltymais. Geriausia yra laipsniškai

didinti druskų koncentraciją, kad skirtingo krūvio (taigi ir skirtingus) reikiamus

baltymus išgauti atskirai. Galiausiai druskų koncentracija padidinama staigiai

ir smarkiai, iki 2-3 mol/L. Taip išplaunami visi, jei dar buvo likę, baltymai.

4. Druskų pašalinimas (dializ÷).

Temperatūra neturi didel÷s įtakos jonų mainų chromatografijos etapų eigai,

tačiau geriau yra dirbti su nedidele temperatūra, kad baltymai būtų stabilesni.

2 – Gelfiltracijos chromatografija (baltymų atranka pagal dydį)

1.1. Vamzdelis pripildomas Vamzdelis pripildomas labai smulkias poras labai smulkias poras turinčių mažų turinčių mažų rutuliukųrutuliukų..Susidaro įrenginys, kurio Susidaro įrenginys, kurio veikimas panašus į veikimas panašus į koštuvo, koštuvo, tačiau...priešingas.tačiau...priešingas.

4

Supylus iš Supylus iš

viršaus į viršaus į

vamzdelį su vamzdelį su

rutuliukais rutuliukais

skirtingų baltymų skirtingų baltymų

tirpalą, mažos tirpalą, mažos

molekul÷s molekul÷s

patenka į patenka į

rutuliukų poras, rutuliukų poras,

o didel÷s netelpa o didel÷s netelpa

ir išplaunamos ir išplaunamos

pro tarpus tarp pro tarpus tarp

rutuliukų rutuliukų

greičiau.greičiau.

3 – Afinin÷ chromatografija

Pats efektyviausias baltymų atskyrimo metodas (vienu

„žingsniu“ mišinio grynumas padidinamas iki 1000 kartų),

pagrįstas dideliu biologinio tiriamo baltymo specifiškumu, pvz.:

fermento substratui, antikūno antigenui, receptoriaus ligandui.

Metodas remiasi tirpale esančių baltymų geb÷jimu jungtis prie

celiulioz÷j ar poliakrilamide „įmontuoto“ ligando – mažos

specifin÷s biomolekul÷s.

Taigi tik tiriamas baltymas išsilaiko vamzdelyje.

Paskui jo molekul÷s iškrapštomos praplaunant vamzdelį tirpalu,

kuriame yra didel÷ ligandoligando koncentracija.

Vide Vide ��������

4 – Hidrofobin÷s sąveikos chromatografija(baltymų atranka pagal hidrofobines jų savybes)

Hidrofobin÷s baltymų vietos jungiasi su tam tikromis

vamzdelio ar jo turinio vietomis.

Tirpale esanti didel÷ amonio sulfato [(NH4)2SO4] koncentracija

stabilizuoja baltymus, o taip pat padidina jų hidrofobin÷s

sąveikos su vamzdelio agaroz÷s matrikso fenilo (C6H5)

grup÷mis tikimybę.

Toks jungimasis vyksta tik esant didelei druskų koncentracijai,

tad skirtingų baltymų jungimasis kontroliuojamas keičiant pro

vamzdelį pilamo tirpalo druskų koncentraciją, arba pro

vamzdelį leidžiamą tirpalą praskiedžiant.

5

Kt. chromatografijos rūšys (smulkesn÷ms nei baltymai molekul÷ms tirti):

adsorbcijos (stationary phase – nonspecific absorbent, such as silica gel, porous polymers, or charcoal)dujų (sample, dissolved in a solvent, is vaporized and carried by the innert gas through a column packed with sorbent)didelio skysčio sl÷gio (kartu su adsorbcijos, gelfiltracijos, jonų mainų ar kt.)popieriausplono sluoksniosluoksnin÷ (skystis – skystis)

Kokybin÷s (nenustato kiekio).Naudoja kapiliarų principą

Dujų—skysčio (mažoms molekul÷ms, daugiausia – chemijoje, nes didel÷s degraduoja aukštoje T, kurios reikia šiam metodui)

1. Baltymų elektroforez÷ ir gelio 1. Baltymų elektroforez÷ ir gelio ((WesternWestern) analiz÷) analiz÷

II. Elektroforez÷ ir gelių analiz÷

NNDSDS--PAGEPAGENDS-PAGE (SDS-PAGE) tinkama mažesn÷ms nei DNR molekul÷s „sijoti“.

NDS-PAGE reiškia NNatrio DDodecyl (lauril) SSulfato-PPoliAAkrilamido GGelio EElelekktrotroforezforez÷÷.

NDS yra ploviklis (jo yra šampūne, muile, dantų pastoje, ...). Jis reikalingas baltymams

denatūruoti ir suteikti vienodą krūvį prieš leidimą per gelį. NDS turi hidrofobinę

„uodegą“, kuria ir jungiasi prie baltymo: kuo daugiau baltyme a.r., tuo daugiau NDS

molekulių prilips prie jo. Kadangi kiekviena NDS molekul÷ turi dvigubą neigiamą krūvį,

bet koks baltymas tampa labai neigiamas.

PAGE atskiria baltymo molekules pagal dydpagal dydįį. PAG yra panašus į daugiasluoksnį

tinklą, kuriame ir stringa link anodoanodo migruojančios molekul÷s.

Po kurio laiko pasiskirsčiusios molekul÷s užpilamos 25% acto rūgšties vandeninio

tirpalu: taip baltymai fiksuojami gelyje ir išlaikomi denatūruoti. Po to jie perkeliami,

dažomi, ryškinami, tiriama jų aminorūgščių seka, ir pan.

NDS-PAGE naudojama:

•Baltymo dydžiui nustatyti•Baltymui identifikuoti•M÷ginio grynumui (purity) įvertinti•Disulfidiniams ryšiams aptikti•Baltymų kiekiui įvertinti•Western blotting (Western analiz÷s) paruošimui

6

Pieno svarbaPieno svarba

Kadangi antikūnai taip pat yra baltymai, jie irgi linkę lipti prie popieriaus.... Tad prieš užpilant pirmo antikūno, reikia ją panardinti į Carnationliesą pieną.

Western blotting (Western analiz÷)Western analiz÷ išskiria vieną norimą baltymą iš baltymų mišinio

naudojant specifinį antigeną. Metodas leidžia nustatyti, kiek tiriamo

baltymo yra tam tikru momentu, tačiau neleidžia spręsti apie to baltymo

sintez÷s greitį, ir jis netinka, kai baltymas labai greitai suyra (abiem

atvejais reiktų atlikti imunoprecipitacijąimunoprecipitaciją).).

1. Baltymų išskyrimas pagal dydį 1. Baltymų išskyrimas pagal dydį –– NDSNDS––PAGE.PAGE.

2. Ant PAG užd÷jus 2. Ant PAG užd÷jus nitroceliulioz÷snitroceliulioz÷s membraną, baltymai ant jos membraną, baltymai ant jos perkeliami naudojant elektroforezę. Nitroceliulioz÷s membranos perkeliami naudojant elektroforezę. Nitroceliulioz÷s membranos pus÷je turi būti teigiamas krūvis, o gelyje yra neigiamas, tad pus÷je turi būti teigiamas krūvis, o gelyje yra neigiamas, tad neigiamai įkrauti baltymai migruoja ant membranos.neigiamai įkrauti baltymai migruoja ant membranos.pH turi būti mažas, tarp nitroceliulioz÷s ir gelio neturi susidaryti oro burbuliukų.

3. Užpilti pirminio antikūno ant membranos (susidaro baltymo3. Užpilti pirminio antikūno ant membranos (susidaro baltymo––antikūno kompleksas).antikūno kompleksas).

4. Užpilti antrinio (pirminiam) antikūno. Šis antikūnas turi būt4. Užpilti antrinio (pirminiam) antikūno. Šis antikūnas turi būti i prisijungęs fermentą, kuris padeda išryškinti visą kompleksą.prisijungęs fermentą, kuris padeda išryškinti visą kompleksą.

5. Tam, kad pamatytume, kiek fermentų yra ant membranos, ant 5. Tam, kad pamatytume, kiek fermentų yra ant membranos, ant jos dar reikia užpilti tam fermentui veikti būtino mišinio su jojos dar reikia užpilti tam fermentui veikti būtino mišinio su jospecifiniu substratu.specifiniu substratu.

6. Rentgenografiškai (uždedant specialią pl÷velę) išryškinama 6. Rentgenografiškai (uždedant specialią pl÷velę) išryškinama reakcija. Ji vyksta apie valandą, matoma kaip šviesa.reakcija. Ji vyksta apie valandą, matoma kaip šviesa.

7. Atliekama nuotraukos densitometrija.7. Atliekama nuotraukos densitometrija.

Antrinis antikūnas gali būti žymimas ne fermentu, bet švytinčia medžiaga.

Kartais, kai reikia didelio jautrumo, pvz., tiriant labai mažas baltymų koncentracijas, naudojamas tretinis antikūnas, turintis fermentą, atskeliantį Pi nuo H3PO4 šarmin÷je terp÷je.

7

8

AKF I/D PGR

Magistrantų molekulin÷s biologijos laboratoriniai darbaiMagistrantų molekulin÷s biologijos laboratoriniai darbai

I dalis I dalis –– Organų ir audinių preparavimas, išsaugojimas ir paruošimas tyriOrganų ir audinių preparavimas, išsaugojimas ir paruošimas tyrimui (2 val.) mui (2 val.)

Eutanazija natrio pentobarbitaliu, raumenų disekcija, stimuliavimas spec. vonel÷je registruojant j÷gą, galingumą ir pan., užšaldymas skystame azote.

II dalis II dalis –– Baltymų ekstrakcija ir išgryninimas, baltymų tirpalo paruošimasBaltymų ekstrakcija ir išgryninimas, baltymų tirpalo paruošimas (4 val.)(4 val.)

Ultrahomogenizavimas, ekstrakcija tirpalais, centrifugavimas, baltymų kiekio matavimas spektrofotometru, denatūravimas NDS

III dalis III dalis –– Konkrečių baltymų kiekio matavimasKonkrečių baltymų kiekio matavimas Western blot Western blot analize (2 x 4 val.)analize (2 x 4 val.)

a} Gelių pagaminimas, elektroforez÷s aparato ir elektroforez÷s tirpalo paruošimas, elektroforez÷s atlikimas, baltymų pernaša ant membranos, membranos blokavimas pieno tirpalo milteliais, membranos įmerkimas į tirpalą su pirminiu antikūnu bent pernakt.

b} Membranos įmerkimas į tirpalą su antriniu antikūnu su fermentu, membrana peršviečiama Rentgeno spinduliais, išryškinama juosta, aptariami gauti skirtingų baltymų kiekio (koncentracijos) tyrimo rezultatai.

2. Nukleorūgščių (DNR ir RNR) 2. Nukleorūgščių (DNR ir RNR) išskyrimas irišskyrimas ir elektroforez÷elektroforez÷

II. Elektroforez÷ ir gelių analiz÷

9

Distiliuotas vanduo, įvairūs buferiniai tirpalai, NaOHNaOH

Įvairus maišymas, centrifugavimas

Fermentai (lizocimas,...)

Temperatūra (karštis, šaltis (+liquid nitrogen))

Detergentai, denatūratoriai (NDSNDS, etanolis, ...)

Nukleorūgščių (DNR ir RNR) išskyrimasNukleorūgščių (DNR ir RNR) išskyrimas

Labai įvairiai atliekama Labai įvairiai atliekama

procedūra: priklauso nuo procedūra: priklauso nuo

organizmo, jo audinio, organizmo, jo audinio,

reikiamo NR kiekio, ,

norimo išskyrimo greičio, norimo išskyrimo greičio,

laboratorijos, tyr÷jolaboratorijos, tyr÷jo

Automatizuoti DNR ekstrakcijos metodai

NR gryninimo automatin÷ sistema QiuckGene-81.

10

NR gryninimo su QiuckGene-810 schema.

NR gryninimo, amplifikacijos ir nukleotidų sekos analiz÷s automatin÷ sistema COBAS COBAS AmpliPrepAmpliPrep

Southern ir Northern analiz÷

II. Elektroforez÷ ir gelių analiz÷

11

Šio dažo molekul÷ įsiterpia tarp dvigrand÷s DNR bazių, DNR spiral÷ išsiveja d÷l prisijungusio dažo sukeliamos įtampos. Žiedin÷ DNR, kuri negali taip smarkiai deformuotis, prijungia mažiauetidium-bromido ir nusidažo ne taip ryškiai.

Etidium-bromidas gali lengvai patekti į žmogaus ląsteles, ir kadangi žmogaus DNR yra linijin÷, ji smarkiai išsivynioja jungdamasi su šiuo dažu. Tod÷l su šia medžiaga reikia dirbti labai atsargiai.

Agaroz÷s gelio elektroforez÷

DNR molekulę sukarpius RE į fragmentus, jie atskiriami pagal dydį agaroz÷s gelio

elektroforeze. RNR skaidyti nereikia.

Agaroz÷sAgaroz÷s gelis yra polisacharidų gelis yra polisacharidų matriksasmatriksas, sugaunantis juo d÷l elektrinio lauko

veikimo link anodo migruojančias molekules (poli- ar oligo-nukleotidus),

DNR fosfato molekul÷s turi stiprų neigiamą krūvį, tad migruoja link anodo. Paskui DNR

fragmentai išryškinami, pvz, Etidium-bromidu ir paskui sekančia xx--RayRay...

Edward M. Southern,Edinburgh Universitetas,1970-1980 m.

Southern analiz÷ skirta nustatyti tam tikrą DNR seką mišinyje, pvz., surasti tam tikrą geną (pvz., sukeliantį ligą, klonuotą) genome.Optimaliomis sąlygomis galima aptikti ir tokį maža kiekį kaip 0,1 pg ieškomos DNR.

Southern analiz÷ (Southern blotting)

ATPATP žym÷jimasžym÷jimas 3232PPPaveik us dsDNR, kur ią norime p adaryt i žyminčiąja, n edideliu kiek iu DNaz÷s, iške rpam i dvigra nd÷s DN R fragm enta i.

Įdedama 32P, dATP ir kit ų dNTP, taip pat DN R po lim eraz÷s I, tu rinčios 5’� 3’ p olimerazinio ir 5 ’ �3 ’egzonuk leazin io aktyv umo.

Įsegus

Nick translation occurs a nd as the nick is tra nslate d down the DN A stra nd, th e po lymer ase activity co ntinues to nick wh ile th e exo nucle ase activity cont inues to fil l in t he nick. As this ha ppe ns, 32P becomes inco rpo rated into, a nd thus labe ls, the DN A. Heat th e DNA t o mak e it sing le stra nde d, the n imm ediately place it on ice to keep the two stra nds from re annealing to each ot her. (If the DN A is o n ice, th e DNA p asses through the anne aling tem per atur e too quickly fo r the DN A to rehy bridize int o do uble-stra nde d DNA.)

1. DNR sukarpoma specialiomis RE. 2. DNR fragmentai leidžiami per agaroz÷s gelį.3. a) DNR denatūruojama (būdama vis dar ant gelioant gelio), pvz., 0,5 mol/L NaOH, kuris

suskaido dsDNR iki ssDNR: tik ssDNR gali būti pernešama ant membranos.b) Neprivalomas purino šalinimo etapas. Atliekamas, jei DNR fragmentai yra didesni kaip 15 kb(p). 0,2 mol/L HCl per 15 min pašalina purinus (A ir G). Tačiau HCl reikia naudoti atsargiai, nes per maži fragmentai taip pat nepernešami.Po šio etapo neužmiršti normalizuoti tirpalo pH.

4. ssDNR pernaša ant nitroceliulioz÷s ar nailonin÷s (dar smarkiau rišančios ssDNR) membranos. Pernaša užtikrinama kapiliarų (kempin÷s) poveikiu, buferiui keliaujant per gelį ant membranos, kuri suriša ssDNR. Procesas trunka kelias valandas. Kartais vietoj kapiliarinio poveikio pritaikomas greitesnis (procedūra trunka apie 1 val.) vakuuminis. Po ssDNR pernašos ant membranos ji paveikiama UV, kad ssDNR kovalentiškai susijungtų su membrana. Taip pat galima nitroceliuliozę kaitinti 80°C temperatūroje kelias valandas, tačiau reikia būti atsargiems – ji labai degi (kitaip dar vadinama piropiroksilinu).

5. Membranos paveikimas žym÷ta ssDNR – hibridizacija. Žym÷ta ssDNR komplementariai jungiasi su tiriama ssDNR. Žymima dažniausiai 32P pažym÷tu ATP, biotinu/streptavidinu, arba bioluminescencine žyme. Prieš hibridizaciją reikia atlikti priešhibridizaciją – įd÷ti nespecifin÷s ssDNR (dažniausiai tam naudojama lašišų spermatozoidų DNR), kad būtų užblokuojamos nespecifin÷s membranos vietos ir žym÷ta ssDNR nepriliptų bet kurioj membranos vietoj. Hibridizuojant naudojamas tas pats buferis, tačiau į jį dar pridedama žym÷tos ssDNR.

6. Žym÷tos ssDNR išryškinimas. Jei buvo naudota 32P žym÷ (dažniausiai), išryškinama atliekant rentgenografiją; jei žym÷ta buvo biotinu/streptavidinu, atpažinimui taikoma kolorimetrija; o bioluminescencija matoma kaip švyt÷jimas.

Southern analiz÷

12

SouthernSouthern blotting’ublotting’u

nustatomas tam tikrų nukleotidų sekų (genų) buvimas ir kiekis.

13

Northern analiz÷ (Northern blotting)

E. Southern sukurtą DNR sekos radimo metodą pavadinus jo vardu.

Tie, kurie tyr÷ RNR seką, ironizuodami pavadino ją Northern analize

(kartais gal šiek tiek sunkiai suprantamo mokslininkų jumoras...).

Metodas taip pat vadinamas Northern hibridizacija arba RNR

hibridizacija.Metodo esm÷ ta pati kaip Southern analiz÷s, tik tiriama ne DNR, o RNR.

Agaroz÷s gelis RNR ištiesina (padaro linijinę).

RNR (transkripto) buvimas ir jos kiekis parodo, kaip intensyviai tuo tuo

metu ir toje vietojemetu ir toje vietoje nurašoma tiriama genetin÷ informacija.

Nukleorūgščių (ypač – DNR) tyrimo metodais plačiai naudojamasi

ne tik mokslin÷se, bet ir teismo medicinos laboratorijose.

Pakrautos nailono membranos panaudojimas Northern analiz÷s metu

14

15