Molekularno genetske preiskave pri AML

v Sloveniji

dr. Tadej Pajič, dr. Martina Fink, Marija Jedrt Mandelc Mazaj,

Špela Ţula, Nejc Lamovšek, Anica Mihajlović, prof. dr. Peter

Černelč

Specializirani hematološki laboratorij KO za hematologijo,

Interna klinika, UKC Ljubljana

Akutna mieloična levkemija

je bolezen v mieloično vrsto usmerjene krvotvorne celice (okvara mieloične multipotentne celice)

maligna klonska bolezen

razrast blastnih mieločnih celic, ki ne dozorevajo:

- v kostnem mozgu, krvi in drugih tkivih,

posledična odpoved KM anemija, trombocitopenija, nevtropenija

Molekularna patogeneza AML

Večstopenjska patogeneza

FLT3-ITD

FLT3-TKD

KIT

JAK2

RAS

PTPN11

RUNX1- RUNX1T1

CBFβ-MYH11

PML-RARA

preureditve gena MLL

CEBPA

NPM1

oslabljena (blokirana)

diferenciacija celic

AML

Proliferacija in/ali

preživetje

Aktivacija signalnih

poti v celici

Okvara transkripcijsko

ko-aktivatorskega kompleksa

Mutacije razreda I Mutacije razreda II

SZO razvrstitev AML

AML s ponavljajočimi genetskimi nenormalnostmi

AML z MDS sorodnimi spremembami

Mieloična neoplazija, posledica predhodnega zdravljenja (t-AML; t-MDS; t-MDS/MPS)

AML brez določene opredelitve (M0-2,M4-7,akutna panmieloza z mielofibrozo)

Mieloidni sarkom

AML pri Downovem sindromu

Novotvorba blastnih plazmacitoidnih dendritičnih celic

Swerdlow SH, Campo E, Lee Harris N, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW. WHO

Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, IARC Press, Lyon, 2008

AML s ponavljajočimi genetskimi

nenormalnostmi

- AML t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1

- AML inv(16)(p13.1q22) ali t(16;16)(p13.1q22);CBF-MYH11

- APL t(15;17)(q22;q12); PML-RARA

- AML t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL

- AML t(6,9)(p23;q34): DEK-NUP214

- AML inv(3)(q21q26.2) ali t(3;3)(q21q26.2); RPN1-EVI1

- AML t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1

Začasni entiteti:

- AML z mutacijo gena NPM1

- AML z mutacijo gena CEBPA

Citogenetske prognostične skupine AML

pri odraslih

Nizko tveganje

t(15;17)

t(8;21)

inv(16) ali t(16;16)

Visoko tveganje

del(5q)/-5

del(7q)/-7

inv(3)/t(3;3)

t(6;9)

t(v;11)(v;q23) – ne t(9;11)

t(9;22)

>3 citogenetske

nenormalnosti

Srednje tveganje

normalen kariotip

+ 8

t(9;11)

druge spremembe Prirejeno po NCCN Guidelines Version 2.2012 Acute Myeloid Leukemia

AML in citogenetske spremembe

Normalen

Inv16

t(8;21)

t(15;17) kompleksne

Visoko

tveganje

Druge

+8

Normalen

Inv16 t(8;21)

t(15;17)

kompleksne

Visoko

tveganje

Druge

+8

Bolniki < 60 let Bolniki > 60 let

~ 45 % AML z normalnim kariotipom (CN-AML) Heterogena skupina

AML z normalnim kariotipom

Mutacije Pojavnost

NPM1 45 do 62 %

FLT3-ITD 28 do 34 %

CEPBA 10 do 15 %

MLL-PTD 5 do 11 %

NRAS 9 %

FLT3-TKD 11 do 14 %

WT1 10 %

Genske ekspresije

- ERG

- BAALC

- MN1

Preiskave za opredelitev AML

Krvna slika

Citologija KM (histologija KM)

(citokemija)

Imunofenotipizacija

Citogenetika

Molekularna genetika: • postavitev bolezni,

• ocena prognoze,

• spremljanje minimalne preostale bolezni (MRD)

Molekularna genetski pristop pri postavitvi

diagnoze AML

Pomoč pri postavitvi diagnoze (v določenih primerih).

Opredelitev označevalca za spremljanje minimalne preostale

bolezni s kvantitativnim PCR.

Preiskave

• na osnovi kliničnih, morfoloških, imunofenotipskih podatkov

ciljano izvedemo preiskavo obratno prepisovanje in PCR (RT-PCR)

za prepise zlitih genov

PML-RARA, CBF -MYH11, RUNX1-RUNX1T1

• Presejalni in potrditveni multipleks RT-PCR:

Zaznamo več kot 80 specifičnih mRNA 28 najpomembnejših

kromosomskih sprememb pri levkemijah (mDx HemaVision).

• ? ? Določitev mutacij v genu NPM1 in CEBPA

Ocena prognoze AML

Mutacija FLT3 ITD

Mutacija v NPM1

Mutacije v CEBPA

Mutacije v KIT pri

AML s t(8;21)(q22;q22) in

AML s inv(16)(p13.1q22)/t(16;16)(p13.1q22)

Mutacija FLT3 ITD

Gen FLT3: fms-related tyrosine kinase 3

• kromosom 13q12.2;

• kodira zapis za transmembranski protein, ki ga uvrščamo v razred III družine tirozin-

kinaznih receptorjev; ima pomembno vlogo pri proliferaciji in preživetju zgodnjih,

nezrelih hematopoetskih celic

Mutacija FLT3 ITD (notranja tandemska podvojitev)

• Podvojitev ali tandemska insercija majhnega, različno velikega (3 do 400

nukleotidov) odseka gena FLT3.

• Povzroči konstitutivno aktivacijo receptorja; aktivacija je neodvisna od vezave

liganda na receptor

• Pojavi se v različnih citogenetskih podskupinah; pri CN-AML v ~ 30 %.

• Napovedni pomen pri CN-AML: NEUGODEN

• Identifikacija mutacije: PCR,

in gelska elektroforeza,

ki omogoča razlikovanje produktov

glede na velikost.

P P N N

Mutacija v NPM1

Gen NPM1: nukleofozmin - nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein

B23, numatrin)

• kromosom 5q35.1

• kodira zapis za fosfoprotein; predvsem v jedrcu celice, prehaja med jedrom in

citoplazmo

Večfunkcijski protein:

biogeneza ribosomov

odgovor na stresne dejavnike (hipoksija, UV)

ohranjanje genomske stabilnosti

regulacija aktivnosti in stabilnosti tumor supresorskih genov (npr. p53 in ARF)

regulacija transkripcije

Pomembna vloga v proliferaciji celic, v poteh zaviranja rasti celic in celični

diferenciaciji

Mutacija v NPM1

• večinoma insercija tetra/ali več nukleotidov v eksonu 12 gena NPM1.

• znanih več kot 40 mutacij; najpogostejše mutacije so tri: tip A (75-80%), B (~ 10 %)

in D (~ 5 %).

• povzroči nenormalno zadrževanje nukleofozmina v citoplazmi

• pojavi se v ~ 30 % novo odkritih AML; pri CN-AML v 50 do 60 %.

• 40 % bolnikov ima sočasno še mutacijo FLT3-ITD.

• napovedni pomen pri CN-AML: UGODEN, vendar če ni prisotne mutacije FLT3 ITD

• Identifikacija mutacije:

- presejalno: PCR in gelska elektroforeza,

ki omogoča razlikovanje produktov

glede na velikost.

- potrditev (za MRD): sekvenčna analiza

Mutacije v CEBPA

Gen CEBPA: CCAAT/pospeševalec vezavni protein alfa, CCAAT/enhancer binding

protein (C/EBP), alpha

• kromosom 19q13.1;

• kodira zapis za transkripcijski dejavnik; v hematopoezi ključen za regulacijo

granulopoeze; zaradi dodatnega notranjega startnega kodona se normalno sočasno se

izražata dve beljakovini (p42 in p30)

Utišanje gena CEBPA: rezultat visoke ravni metilacije otočkov CpG – Napovedni pomen

NEUGODEN ?

Mutacije v CEBPA

• duplikacije, insercije, delecije, točkovne mutacije (zamenjave nukleotidov)

• najdemo jih lahko v vsej kodirajoči regiji; glede na mesto notranjega startnega kodona

razlikujemo N- (nt od 1-360) in C- (nt od 361 do 1077; ref. Zap. NM_004364.2) terminalne

mutacije

• mutacije pri AML povzročijo izgubo funkcijske sposobnosti beljakovine CEBPA in

posledično blokado diferenciacije granulocitov; pojavi se v 5 do 9 % novo odkritih

AML; pri CN-AML v ~ 15 %.

Mutacije v CEBPA

• napovedni pomen pri CN-AML: UGODEN, če ni mutacije FLT3 ITD in sta prisotni dve

mutaciji v CEBPA (običajno N- in C-terminalni mutaciji in na različnem alelu-bialelni)

• Identifikacija mutacije: sekvenčna analiza DNA (po Bentahaus T. et al. BJH 2008;143:230-239.)

Naši preliminarni izsledki (ob vpeljavi metode): Dg. AML

Bolnik Starost/sp

ol

Mutacija CEBPA Genotip

NPM1/FLT3

BP 68 let/M Tiha T230 (c. 690G>T;

rs34529039), ni spr. AK

+/-

GV 58 let/M Mutacija c.649A>T

(p.217T>S), čaka na

potrditev

-/-

VRN 40 let/Ž NI -/-

JM 56 let/M Mutacija; čaka na

potrditev

+/+

GR 46 let/Ž NI +/+

ŠK 41let /M Tiha T230 (c. 690G>T;

rs34529039), ni spr. AK

-/+

KM 77 let/Ž Tiha T230 (c. 690G>T;

rs34529039), ni spr. AK

+/+

Bolnik JM; 56 let/M, Mutacija; katera?

Tiha mutacija rs34529039: frekv. minor alela 15,2%

v globalni populaciji (dbSNP) in 22% pri bolnikih s

AML (Green et al. JCO 2012; 28:2739-47).

Mutacije v KIT pri AML s t(8;21)(q22;q22) in AML

s inv(16)(p13.1q22)/t(16;16)(p13.1q22)

Gen KIT: v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog

• kromosom 4q12;

• kodira zapis za transmembranski protein, ki ga uvrščamo v razred III družine tirozin-

kinaznih receptorjev; po vezavi liganda se spremeni in aktivirajo se signalne poti v

celici, ki so vključene v proliferacijo, diferenciacijo in preživetje celice.

Mutacije v KIT pri AML s t(8;21)(q22;q22) in AML s inv(16)(p13.1q22) ali

t(16;16)(p13.1q22)

• večinoma v eksonu 17 (najpogosteje kodon D816) in eksonu 8

• ugotovimo v 20 do 40 %,

• Napovedni pomen: NEUGODEN, večje tveganje za relaps

• Identifikacija mutacije:

- mutacija D816V s alelno specifičnim PCR,

- sekvenčna analiza – v vpeljavi v redno delo

90 bp

184 bp

M S01wS01mS02wS02mKw+Km+Kw-Km-NTCmNTCwM

Citogenetske in molekularno genetske

prognostične skupine AML pri odraslih

Tveganje Citogenetika Molekularne nepravilnosti

Nizko inv(16) ali t(16;16)

t(8;21)

t(15;17)

CN-AML: mutacija NPM1 ali mutaciji v CEBPA brez sočasno prisotne mutacije FLT3 ITD

Srednje normalen kariotip

+ 8

t(9;11)

druge spremembe

t(8;21), inv(16), t(16;16): z mutacijo v KIT

Visoko >3 citogenetične nenormaln.

del(5q)/-5, del(7q)/-7,

t(v;11)(v;q23) – ne t(9;11),

inv(3), t(3;3), t(6;9), t(9;22)

CN-AML: z mutacijo FLT3-ITD

Prirejeno po NCCN Guidelines Version 2.2012 Acute Myeloid Leukemia

Spremljanje minimalne preostale bolezni

Molekularna genetika o Kvalitativna preiskava RT-PCR za določitev prepisa PML-RARA

o Obratno prepisovanje RNA (cDNA) in kvantitativni PCR (RT-qPCR) za

prepise zlitih genov :

PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1, CBF -MYH11

o RT-qPCR za določitev ravni izražanje (cDNA) gena Wilms Tumour 1 (WT1)

o RT-qPCR za določitev ravni celic z mutacijo v genu NPM1 (cDNA;

mutacija tip A, B in D) – NOVO!

Pretočna citometrija

– določanje z levkemijo povezanih aberantnih imunofenotipov na

levkemičnih celicah

HVALA ZA POZORNOST!