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“I virus vegetali nellaformulazione di un
vaccinocontro il virus HIV-1”
Carla MarusicUTS BIOTEC-GEN
ENEA - Trisaia
"Molecular Farming:produzione di cibi funzionali,
di nutraceutici ebiofarmaceutici" ENEA - Casaccia4 Dicembre 2003
VsVs
Piante come “biofabbriche” per laproduzione di vaccini
Nature Reviews Genetics (2003) Vol.4; 794-805
Molecole a scopo vaccinale espresse in piante transgeniche
Vaccini in trial clinico
Nucleo
Gene inserito
Proteina estranea
2) Trasformazionetransiente mediata daVirus Vegetali (PVX) Cellula vegetale
DNA della pianta
Nucleo
Vettore virale
Trasformazione della cellula vegetale
Nucleo
Proteina estranea
Replicazionedel virus
1) Trasformazionestabile mediata da
Agrobacterium Cellula vegetale
DNA della pianta
Nucleo
Confronto tra due sistemi di espressione in pianta
Vaccine 19 (2001) 2735–2741
Strategie di clonaggio per l’espressione dimolecole vaccinali mediata da virus vegetali
Genoma virale WT
Replicasi Movimento Proteina di rivestimento
Gene estraneo
+
Genoma virale modificatoA)
B)
Particelle Virali Chimeriche
Patogeno Pianta Proteina Sistema diEspressione
Bibliografia
Virus di Norwalk Tabacco/Patata
Virus vegetaleAMT
Proteina dirivestimento delvirus di Norwalk
Influenza Tabacco Virus vegetale TMV
EmoagglutininaEngineering plants forcommercial products andapplications (eds. CollinsG.B. and Sheperd, R.J.) 1996
HIVTabacco/ Fagiolo
N. benthamiana
Virus vegetaleAMT/CPMV
HIV epitopo (gp120)
HIV epitopo (gp41)
Curr. Opin. Biotechnol.11, 199-204 (2000)
J.Virol. Vol 75, 8434-8439 (2001)
Virus vegetale PVX
TrendsBiotechnol. 15,441-444 (1997)
TabaccoVirus vegetaleAMT
proteina disuperficie SpaA
Microbes Infect. 1,777-783 (1999).Streptococcus
mutans(agente della carie)
Molecole a scopo vaccinale espresse mediante virus vegetali
Produzione di vaccini mediante esposizione suvirus vegetali, principali vantaggi :
•Facilità di manipolazione del genoma virale
•Elevati livelli di produzione di virus ricombinante per peso fresco di tessuto infetto
•Purificazione del virus rapida ed efficiente
•Molti virus vegetali sono stabili a temperatura ambiente
•Ciascuna particella virale può esporre molte copie del frammento proteico scelto (da 60 fino a 2,000 copie per virione)
•La produzione e validazione di un nuovo vaccino può essere ottenutain tempi molto brevi
Programma Nazionale di Ricerca sull’AIDSProgetto: Piante ingegnerizzate come
biofabbriche per la formulazione di vaccini.Sviluppo di un vaccino anti HIV-1
Vaccino contro HIV-1: una sfida
• Il virus HIV-1 muta molto velocemente
• Il virus deve essere bloccato in una fase precoce dell’infezione
• Scelta dell’antigene, punti cruciali:
• Variazioni nella conformazione delle proteine virali (isolatiprimari e ceppi di laboratorio).
Attivazione del sistema immunitario per indurre la produzionedi anticorpi neutralizzanti capaci di bloccare il virus nelleprimissime fasi dell’infezione.
•Induzione di una risposta immunitaria di tipo cellulare conproduzione di cellule del sistema immunitario specializzate ingrado di eliminare il virus ed eventuali cellule infettate.
Proteine coinvolte nel processo di penetrazione del virus HIV-1 all’interno della cellula bersaglio
‘Broadly Neutralizing Antibodies Targeted to the Membrane-Proximal External Region ofHuman Immunodeficiency Virus Type 1 Glycoprotein gp41’MICHAEL B. ZWICK et al. JOURNAL OF VIROLOGY, 2001, p. 10892–10905
Modello della struttura dellaglicoproteina gp41
HIV-1
gp 41 (2F5)
PVX-2F5
Particelle di virus X della patata (PVX) cheespongono sulla loro superficie unaporzione della proteina gp41 di HIV-1
Clonaggio della sequenza HIV-1 nel genoma del PVX
•Ogni Particella ViraleChimerica di PVX ècostituita da circa 1300molecole di CP.
Pianta infettata con il PVX-2F5
0200400600800
100012001400
C- WT-PVX PVX-2F5E
OD
405
Gli estratti di pianta reagisconocon anticorpi umani anti HIV-1
CsC
l gra
dien
t
Purificazione del virus
Per via intraperitonealePer via intraperitoneale
PrelieviPrelievi
GiorniGiorni 0 14 28 42 56 70
ImmunizzazioniImmunizzazioni
Per via intranasalePer via intranasale
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Immunizzazione di topi con il virus PVX-2F5
0
500
1000
1500
14 28 42 56 70
0500
100015002000250030003500
0500
100015002000250030003500
WT-PVXWT-PVX
0500100015002000250030003500
PVX-2F5E
500
1000
1500
0 14 28 42 56 70
IgA (Somministrazione IN)
IgG (Somministrazione IN)
Risposta immunitaria indotta dal virus PVX-2F5
0 14 28 42 56 70Giorni
0500
100015002000250030003500
IgG (Somministrazione IP)
OD
405
Il PVX-2F5 induce la produzione di anticorpi umaniin un modello murino “umanizzato” SCID (Severe
Combined Immuno-Deficient Mice)
Prelievi edanalisi deisieri
1Giorni 1 2
Identificazione diAnticorpi umani anti-HIV
0 7 50
0.2 0.4 0.6
0.81.0
1.21.41.6
O.D
.405
nm
Topi trattatiTopi controlloTopi controllo
Purificazione di cellulemononucleate del sangue
periferico
Prelievo da un donatore sano
Gra
dien
te d
i den
sità
Cellule Dendriticheumane trattate con ilvirus PVX-2F5
Topo SCID ricostituito con celluleumane del donatore sano
Immunizzazionecon le cellule
dendritiche trattate
Inibizione della formazione disincizi indotta dal virus HIV-1
HIV-1IIIB
Siero topiSCID
Siero topiC57BL/10
Cellule in coltura
Saggio di Neutralizzazione del virus HIV-1in vitro
0102030405060708090100
20 40 80 160 320Diluizione del siero
M1M4H4M7H6
% D
i Neu
tral
izza
zion
e
Produzione di un vaccino mediante virus vegetali
2) Clonaggio nel vettore virale
3) Infezione della pianta e purificazione del virus
CsC
l gra
dien
t
1) Identificazione della sequenza di interesse
Gp41 epitopo 2F5
4) Esperimenti di immunizzazione in modelli animali
•Le Particelle Virali Chimeriche PVX-2F5 espongono un epitopo di HIV-1 altamente conservato.
Conclusioni
•Inducono una potente risposta immunitaria neutralizzante sia in topi normali che nel modello “umanizzato” SCID (Hu-PBL-SCID).
•L’immunizzazione per via intranasale induce la produzione di alti livelli di anticorpi associati alle mucose (IgA).
•La risposta immunitaria è stata ottenuta senza l’aggiunta di adiuvanti.
Brevetto Congiunto ENEA – ISSInventori: Benvenuto E., Marusic C., Belardelli F.
Rizza P., Capone I. 01.02.2002 EP 1 167 530 A3
Manipolazione del PVX, infezioni dipianta, purificazione del virus,analisi dei sieri. Immunizzazioni eprelievi.
Modello SCID e saggi di neutralizzazione in vitro.
Progetti futuri
•Valutare l’efficacia del sistema PVX nell’induzione di risposte immunitarie di tipo cellulare
• Capire l’effetto di PVX come adiuvante
•Valutare/verificare la sicurezza del sistema PVX in modelli animali e nell’uomo
•Costruire nuove Particelle Virali Chimeriche per la formulazione di un vaccino multicomponente
SIXTH FRAMEWORK PROGRAMMEPRIORITY [LSH-2002-1.2.5-2]RECOMBINANT PHARMACEUTICALS FROM PLANTFOR HUMAN HEALTH(PHARMA-PLANTA)
Selene BaschieriChiara LicoFloriana CapuanoCamillo Mancini
Eugenio BenvenutoResponsabile di progetto
Collaboratori esterni
Filippo BelardelliDirettore del Laboratorio di VirologiaIstituto Superiore di Sanita’,Roma