8/12/2019 molecular biology report volume 2

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S e q u e n c e d e t e r m i n a t i o n o f t h e 3 e n d o f m o u s e m a m m a r y t u m o r v ir us R N AR . K l e m e n z * , M . R e i n h a r d t & H . D i g g e l m a n n * *Swiss Institute fo r Experimental Cancer Research 1066 Epalinges Switzerland

Abstract7 0 S R N A h a s be e n p r ep a r e d f ro m m o u s e m a m m a r y t u m o r v i ru s ( M M T V ) p r o d u c e d b y t h e G R t u m o r c ell

l in e . A f t e r d e n a t u r a t i o n f o r 3 m i n a t 6 0 ~ t h e R N A w a s a p p l i e d t o a s u c r o s e g r a d i e n t a n d m o l e c u l e ss e d i m e n t i n g b e t w e e n 1 0 - 1 6 S w e r e s e le c t ed a n d p a s s e d o v e r a n o l i g o - d T c e ll u l o se c o l u m n . T h e p o l y Ac o n t a i n i n g R N A f r a c t io n w a s u s e d a s a t e m p l a t e f o r t h e s y n th e s is o f c o m p l e m e n t a r y D N A w i t h r ev e rs et r a n s c r i p t a s e i n t h e p re s e n c e o f d i d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s . O l i g o - n u c l e o t i d e s p ( d T ) 7 r G , p ( d T ) 7 r A a n d( p ( d T ) 7 r C w e r e t e s te d f o r t h e i r p r i m e r a c t iv i t y . T w o o f t h e t h r e e p r i m e r s g a v e r e a d a b l e s e q u e n c e s . T h i s s u g g e s t sa h e t e r o g e n e i t y i n t h e 3 ' e n d o f t h e v i ra l R N A , a p h e n o m e n o n a l s o o b s e r v e d w i t h a v i a n r e t r o v i r u s e s .N u c l e o t i d e s 3 7 - 4 5 f r o m t h e 3 ' e n d a r e m a d e u p o f o n l y A 's a n d T ' s a n d r e s e m b l e a H o g n e s s b o x . T h i s f in d i n gc o u l d h a v e b i o l o g i c a l c o n s e q u e n c e s f o r t h e t r a n s c r i p t io n o f p ro v i r a l D N A i n th e u n i n t e g r a t e d a n d i n t eg r a t eds t at e . I n s t e a d o f t h e u s u al A A U A A A s e q u e n c e p r e s e n t in m R N A ' s c l o se a n d i n f r o n t o f t h e si te o fp o l y a d e n y l a t i o n w e f in d a s e q u e nc e A G U A A A .

IntroductionS e v e ra l v a r i an t s o f m o u s e m a m m a r y t u m o r

v i r us e s ( M M T V ) h a v e b e e n is o l a te d f r o m t h e m i l ko r f r o m m a m m a r y t u m o r s o f d i ff e re n t i n b re ds t r a i n s o f m i c e ( f o r r e v i e w s e e 1 ) . T h e s e s o - c a l l e de x o g e n o u s M M T V ' s a r e h o r iz o 'n t a ll y t r a n s m i t t e da n d g e n e ra l ly c a u s e e a r ly m a m m a r y c a r c i n o m a s ,s o m e o f w h i ch a r e h o r m o n e d e p e n d e n t .

I n a d d i t i o n i n t eg r a t e d M M T V p r o v i r a l D N A i sp r e s e n t i n a ll e x a m i n e d i n b r e d s t r a in s o f m i c e( e n d o g e n o u s f o r m o f M M T V ) a n d i s t r a n sm i t t e d t ot h e o f f s p r i n g a s a s t a b l e g e n e t i c e l e m e n t ( 2 - 7 ) .S o m e o f th e s e g e ne t ic a l ly t r a n s m i t t e d e n d o g e n o u sp r o v i r a l s e q u e n c e s s e e m t o b e b i o l o g i c a l l y i n a ct i v e,w h i l e s o m e o t h e r s s e e m t o b e r e s p o n s i b l e f o r s lo w l yg r o w i n g , h o r m o n e i n d e p e n d e n t t u m o r s a p p e a r i n g

* Present address: Department o f Biology,University of California San Diego,La Jolla, CA 92093, USA.** To whom reprint requests should be addressed.

l a t e i n l i f e ( 8 - 10 ) .D i f fe r en t M M T V R N A ' s a n d e n d o g e n o u s a n d

e x o g e n o u s p r o v i r a l D N A ' s h a v e b e en c o m p a r e d b yc r o s s - h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s ( 4 , 1 1 , 1 2 ) a n d b yr e s t r ic t i o n e n z y m e a n a l y s i s ( 1 3 - 1 5 ) a n d w e r e s h o w nt o b e v e r y s i m i l a r , b u t n o t i d e n t i c a l . O n l y s e q u e n c ea n a l y s i s o f t h e r e l e v a n t r e g i o n s o f t h e v a r i o u s v i r a lg e n o m e s w i l l a l l o w t o d e c i d e i f t h e d i f f e r e n t b i o l o g -i c al b e h a v i o u r c a n b e a c c o u n t e d f o r b y s u b t l es e q u e n c e d i f f e r e n c e s w i t h i n t h e v i r a l g e n o m e s o rh a s t o b e a t t r i b u t e d t o o t h e r p a r a m e t e r s a s e. g . t h es i te o f i n t e g r a t i o n o f v ir a l D N A ' s o r t h e n a t u r e a n db i o l o g i c a l s t a t e o f th e h o s t c e ll .

I n t h e e x p e r i m e n t s p r e s e n t e d i n t h i s r e p o r t w ed e t e r m i n e d t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e 3 ' e n d o fG R - M M T V - R N A .

Materials and methodsM M T V w a s c o ll e ct e d f r o m t h e c u l tu r e f lu i d o f

Molec. Biol. Rep . 7, 123-126 (1981). 0301 -4851/8 1/0072 0123 $0.80.9 Dr W . Junk Publishers, The Hag ue. Printed in The Netherlands.

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124G R - c e l l s, a m o u s e m a m m a r y t u m o r c e ll l in e o b -t ai ne d fr o m K. Y a m a m o t o . G R - M M T V R N A w a se s s e n t i a l l y p u r i f i e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 7 ) . 7 0 Sv i r a l R N A w a s f i r s t o b t a i n e d b y s u c r o s e g r a d i e n ts e d i m e n t a t io n o f to t a l v ir a l R N A . T h e 7 0 S R N Aw a s h e a t e d f o r 3 m i n a t 6 0 o C a n d r e a p p l i e d t o as u c r o s e g r a d i e n t . R N A s e d i m e n t i n g b e t w e e n 1 0 S -1 6 S w a s p o o l e d , p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l a n dp a s s e d o v e r a n o l i g o - ( d T ) c e l l u lo s e c o l u m n . P o l y -a d e n y l a t e d R N A w a s e lu t e d a n d u s e d a s a t e m p l a t ef o r th e s y n th e s is o f c o m p l e m e n t a r y D N A . A sp r i m e r s f o r t h e r e v e r s e t r a n s c r ip t a s e r e a c t i o n w eu s e d t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e o l i g o n u c l e o t i d e sp ( d T ) 7 r G , p ( d T ) 7 r A a n d p ( d T ) 7 r C f r o m P . L .B i o c h e m i c al s . T h e s y n th e s is o f r a d i o a c t iv e c D N Aw a s p e r f o r m e d i n t he p r e s e n c e o f d id e o x y n u c l e o -s id e t r i p h o s p h a t e s a s d e sc r i b e d b y S a n g e r e t a l (16)a n d u s i n g r e v e r se tr a n s c r i p t a s e , a s a p o l y m e r a s e . Ar e a c t i o n m i x t u r e g e n e r a l l y c o n t a i n e d 5 0 n g o ft e m p l a t e R N A , 3 0 ng o f o n e o f th e p r i m e r s , 2 .5u n i t s o f r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , 3 C i o f o n e 32 p_d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e ( 4 0 0 C i / m m o l e ) , u n -l a b e ll e d d e o x y n u c l e o s i d e tr i p h o s p h a t e s a t 5 - 1 0 Ma n d d i d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s a t 3 - 1 0 Mf i na l c o n c e n t r a t i o n . T h e r a t i o o f d d X T P ' s a n dd X T P ' s w a s a d j u s t e d f o r e a c h p a ir o f t r i p h o s p h a t e sa n d v a r i e d a c c o r d i n g t o t h e d e s ir e d l e n g t h o f th ec D N A f r a g m e n t s . A c t i n o m y c i n D ( 5 0 / ~ g / m l ) w a sa d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e t o p r e v e n t t h es yn th e .s is o f d o u b l e s t r a n d e d c D N A . T h e c D N Am o l e c u l e s t e r m i n a t e d b y th e f o u r d i d e o x y n u c l e o -s id e t r ip h o s p h a t e s w e r e s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e -s i s i n 0 . 5 m m t h i n p o l y a c r y l a m i d e s e q u e n c i n g g e l so f 4 0 c m l e n g t h .

R e s u l t s

W h e n t h e t h r e e o l i g o n u c l e o t i d e s p ( d T ) 7 r G ,p ( d T ) 7 r A p ( d T ) 7 r C w e r e t e s te d f o r th e i r p r i m i n ga c t i v i t y w i t h p o l y A c o n t a i n i n g 3 ' v i r a l R N Af r a g m e n t s a s t e m p l a t e i t b e c a m e c l e a r t h a tp ( d T ) 7 r A a n d p ( d T ) 7 r G b o t h r e s u l t e d i n c D N Ap r o d u c t s w i t h r e a d a b l e s e q u e n c e s , w h i l e t h e c o u n t si n c o r p o r a t e d i n t h e p r e se n c e o f p ( d T ) 7 r C w e r es p r e a d o u t o v e r t h e w h o l e l e n g th o f t h e t r a c k o f th es e q u e n c i n g g e l w i t h o u t a v i s i b l e l a d d e r o f f r a g -m e n t s . I t s ee m e d t h e r e f o r e t h a t w i t h tw o p r i m e r se D N A s y n t h e s i s s t a r te d a t u n i q u e s i te s , c o n s i d e r i n gt h e n a t u r e o f t h e p r i m e r s , m o s t l ik e l y a t t h e 3 ' e n d o f

t h e v i r a l R N A , w h i l e t h e t h i r d p r i m e r l e d t o t h es y n th e s is o f e D N A f r a g m e n t s i n i ti a te d a t m u l t i p les i t e s . T h e t w o s e q u e n c i n g l a d d e r s o b t a i n e d w i t hp ( d T ) 7 r A a n d p ( d T ) 7 r G w e r e c l e a r l y r e l a t e d a n dd i s p l a c e d b y t h r e e n u c l e o t i d e s . T h i s r e s u l t c a n b em o s t e a s i l y e x p l a i n e d b y a h e t e r o g e n e i t y i n t h e 3 'e n d o f th e v i ra l R N A p r e p a r a t i o n u s ed f o r t h es ee x p e r i m e n t s . S u c h a h e t e r o g e n e i t y h a s f i r s t b e e nd e s c r i b e d f o r t h e 3 ' e n d o f a v i a n m y e l o b l a s t o s i sv i ru s R N A ( 17 ). T h i s p h e n o m e n o n c o u l d r e fl e c t ah e t e r o g e n e i t y i n t h e v i r a l g e n o m e p o p u l a t i o n o rc o u l d b e c r e a t e d d u r i n g t h e t r a n s c r i p ti o n o r p r o -c e ss in g o f vi r al R N A c o m i n g f r o m a u n i q u eg e n o m e . W e d i d n o t f o l l o w u p t h i s q u e s t i o n a n yf u r t h e r .

U s i n g t h r e e d if f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f d i d e -o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s , 8 0 n u c l e o t i d e s o fs e q u e n c e c o u l d b e d e t e r m i n e d a n d n u c l e o t i d e s G , Ca n d T w e r e r e a d a b l e o v e r t w i c e t h is l e n g th . H o w e v e rt h e f r a g m e n t s t e r m i n a t e d w i t h d d A T P r e s o lv e d i n t os h a r p b a n d s o n l y u p t o 7 0 - 8 0 b a s e s a n d t h e n s t a r t e dt o s m e a r . T h e r e a s o n f o r t hi s b e h a v i o u r w a s u n c l e a r .

T o d e t e r m i n e t h e l a s t f ew n u c l e o t i d e s o f t h e v i ra lR N A a t th e 3 ' e n d , e D N A s y n th e s is w a s p e r f o r m e du s i ng p ( d T ) 7 r A a s p r i m e r i n th e p r e s e n c e o f e a c h o ft h e p o s s i b l e r a d i o a c t i v e d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s -p h a t e s a n d e a c h d i d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e a tr a t h e r h i g h c o n c e n t r a t i o n t o a c c u m u l a t e s h o r tc h a i n s . K i n a s e l a b e l l e d p r i m e r w a s u s e d a s a s i z em a r k e r o n t h e ge l. T h e s h o r t e s t p o s s i b le f r a g m e n t o fe D N A t h a t w a s d e t e c t e d w a s l a b e l l e d w i t h 3 2 p _d G T P a n d t e r m i n a t e d w i t h d d T T P ( s e e F i g. 1 ). T h i sf r a g m e n t m i g r a t e d a s d e c a n u c l e o t i d e . A l l o t h e rr a d i o a c t i v e d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s l e d t ot h e s y n t h e s is o f lo n g e r f r a g m e n t s . F i g u r e I sh o w s t h er e s u l t o f th e s e q u e n c i n g e x p e r i m e n t s . S e v e r a li n t e r e s ti n g f e a t u r e s c a n b e r e c o g n i z e d :

N u c l e o t i d e s - 3 7 t o - 4 5 a r e m a d e u p o f o n l y T ' sa n d A ' s a n d r e s e m b l e t he s eq u e n ce T A T A A A T Aw h i c h i s g e n e r a l l y f o u n d a s s u c h o r i n s o m e v a r i e df o r m t o p r e c e d e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e s b ya b o u t ' 2 5 n u c l e o t id e s . T h i s s i te f o u n d a t t h e 3 ' e n d o ft h e v i r a l R N A i s d u p l i c a t e d d u r i n g r e s e r v e t r a n s -c r i p t i o n a n d is t h e r e f o r e p r e s e n t o n b o t h s i d e s o f t h ei n t e g r a t e d v i r a l g e n o m e ( F i g . 2 ) w i t h i n t h e l a r g et e r m i n a l r e p e a t ( L T R , s ee a r r o w s i n F i g . 2) . T h ep r e s e n c e o f a p o t e n t i a l p r o m o t o r s i t e i n t h e r i g h t -h a n d L T R o p e n s t h e p o s s i b i li t y f o r a t r a n s c r i p ts t a r t i n g w i t h 1 3 0 - 1 50 n u c l e o t i d e s o f v i r a l s e q u e n c e sa n d e x t e n d i n g i n t o h o s t c e ll s e q u e n c e s . I t i s e x -

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1257 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0

F INA ~ ,, ACUGUUAUGUAAAUGUUAUGUAAACAUAAUAUAAAAGAGUGCUGAUUUUUUGAGUAAAUUGAACAGAUAAAAAAAAA ,R N A ~ 'C D N A 3~'TAGGTT~AGAATACATTTACGAATACATTTGGTATTATATTTT~TCACGACTAAAAAACT~ATTTGAA~GTTGTCGTG~TTTTTT~5 1 , , , A TCCAAGT T'TGTA~ A GCTTATGTAAACCATAATATAAAAGAGTGCTGATTTTTTGAGTAAACTTGCAACAGCACT,,,3INTEGRATEDVIRA L DNA3~TAGG~TCA~AATA~A~TA~GAATA~ATTTGG~AT~ATATTT~CT~ACGACTAAAAAACTCAT~TGAA~G~G~GTGA~5~

a T7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 i 0w

A T R I C HS E Q U E N C E

C D N A 5

POSSIBLE TRANSCRIPTS

F i g 1. Nucleotide sequence of the 3 end of GR-M M TV viral RNA . The two top lines show the cDN A sequence determined an d the viralRN A sequence deduced from it. The b otto m two lines show the corresponding region on the double stranded DN A.

p e c t e d t h a t s u c h t r a n s c r i p t s c o u l d b e d e t e c te d u s i n ga s r a d i o a c t i v e p r o b e s o - c a l l e d s t ro n g s t o p v i r a lD N A c o m p l e m e n t a r y t o t h e 5 ~ 1 3 0 n u c l e o ti d e s o ft h e v ir a l R N A . E x p e r i m e n t s t o d e t e c t s u c h t ra n -s c r i p t s w il l b e a t t e m p t e d .

N u c l e o t i d e s - 1 5 t o - 2 0 a r e m a d e u p o f t h es e q u e n ce A G U A A A , a v a r ia t i o n o f t h e us u a ls e q u e n c e A A U A A A w h i c h g e n e r a l l y p r e c e d e s t h es i t es o f p o l y a d e n y l a t i o n ( 1 8) b y a b o u t 2 0 n u c l e o -t id e s . A n o t h e r v a r i a t i o n o f t h is se q u e n c e A U U A A A

h a s r e c e n tl y b e e n f o u n d i n t h e m o u s e p a n c r e a t i ca l p h a - a m y l a s e m R N A (1 9) .

W i t h i n t h e s e q u e n c e p r e s e n t e d i n F i g u r e l te r -m i n a t i o n c o d o n s a r e p r e se n t i n a ll r e a d i n g f ra m e s ,I n o n e r e a d i n g f r a m e h o w e v e r t h e n u c l e o t i d e s - 7 9t o - 4 7 a r e o p e n f o r t h e s y n t h e s i s o f a p e p t i d e o f a tl e a s t l l a m i n o a c i d s . S i n c e n o s e q u e n c e i n f o r -m a t i o n i s a v a i l a b l e f u r t h e r u p s t r e a m o n t h e m R N A ,i t i s n o t c l e a r i f t h i s o l i g o p e p t i d e c o r r e s p o n d s t o t h eC - t e r m i n a l e n d o f a l a r g e r h y p o t h e t i c a l p e p t i d e .

L T RH O S T D N A

C:151

I N T E G R T E D M M T V D N L T R H O S T D N3 ' ~ 5 '

~ P O T E N T I A L V I R A L - H O S T5 ' T R A N S C R I P T

~ . v R N A3 ~c D N A i n v i t r o i n i t i a t e d

I } . . . . . rn R N A t o k b5 ' 3 ~. .. . m R N A 4 . 4 k bS ' 3 '

F i g 2 Schematic d iagram of the integrated M MTV genome. The pos ition of the AT-rich sequence close to poten tial initiation sites fortranscrip tion is marked with an arrow, Th e known viral transcripts are shown as solid lines (20).

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126R e c e n t l y w e w e r e a b l e t o c o m p a r e t h e s e q u e n c e

p r e s e n t e d h e r e w i th t h e D N A s e q u e n c e o f t h ec o r r e s p o n d in g re g io n o n th e L T R o f C 3 H M M T V( J o h n M a j o r s , p e r s o n a l c o m m u n i c a t io n ) . T h e t w ov i ru s e s sh o w a l m o s t c o m p l e t e h o m o l o g y w i th i n t h es e q u e n c e r e p o r t e d . I t i s p a r t i c u l a r l y n o t e w o r t h yt h a t J. M a j o r s a ls o f o u n d A G T A A A i n st e ad o f t h en o r m a l s e q u e n ce A A T A A A p r e c e d in g th e s it e o fp o l y a d e n y l a t i o n . ] h i s s e q u e n c e m i g h t b e c h a r a c -t er is ti c f o r M M T V m R N A .

S i n c e t h i s w o r k h a s b e e n c o m p l e t e d w e h a v ec l o n e d c i rc u l a r u n i n te g r a t e d G R - M M T V D N A i nb a c t e r i o p h a g e l a m b d a a n d w e a r e c u r r e n t l y p u r -s u i ng t h e s e q u e n c i n g st u d ie s o n c l o n e d D N A f r a g -m e n t s . T h e s e q u e n c e o f t h e v ir a l R N A d e t e r m i n e dh e r e w i l l h e l p u s t o a l i g n t h e s e q u e n c e o b t a i n e df r o m t h e c lo n e d D N A .

cknowledgementsW e t h a n k J . B e a r d f o r th e a v i a n m y e l o b l a s t o s i s

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