Upload
lamkhanh
View
230
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
MMetody molekulární genetiky etody molekulární genetiky v mikrobiologiiv mikrobiologii
Pavel Dřevínek
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
PCR diagnostika
hledá se konkrétní patogen
hledá se patogen, předem není
stanoveno jaký
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
„Klasická“ mikrobiologie„Klasická“ mikrobiologie::
• přímý průkaz - kultivace, mikroskopie, antigeny
• nepřímý průkaz - protilátky
• zjišťování citlivosti na antibiotika
„Molekulární“ mikrobiologie„Molekulární“ mikrobiologie::
• přímý průkaz - DNA či RNA; proteiny
• detekce jednotlivých genů rezistence, popis genomu
• žádný nepřímý průkaz
Klasika MG
Princip detekce a identifikace
celý organismus, metabolicky aktivní
DNA či RNA
Kultivace vs. molekulární genetikaKultivace vs. molekulární genetika
Výhody MG:• vyšší rychlost provedení• záchyt organismů, které nelze kultivovat, jejichž kultivace je náročná• záchyt bez ohledu na způsob růstu (biofilm)• záchyt při podávané ATB léčbě
Nevýhody MG:• často chybí informace o tom, zda jsou bakterie živé • není k dispozici živý izolát, např. pro určení ATB citlivosti
Klasika MG
ATB citlivost komplexní jednotlivé geny rezistence
Kultivace vs. molekulární genetikaKultivace vs. molekulární genetika
Nevýhody MG:mecA: MRSAvanA: VRENevýhody MG:
• chybí komplexní obraz, MICvanA: VRE
karbapenemázy - KPC- NDM-1- IMP- VIM
Klasika MG
Sensitivita srovnatelná či vyšší u mol. gen. vyšetření
Kultivace vs. molekulární genetikaKultivace vs. molekulární genetika
Výhody MG:• záchyt malého počtu agens (infekce dříve diagnostikována)
Nevýhody MG:• riziko falešné pozitivity (kontaminace)
Klasika MG
Kvantifikace orientační absolutní
Kultivace vs. molekulární genetikaKultivace vs. molekulární genetika
Výhody MG:• určení infekční nálože• sledování dynamiky infekce
Výhody Úskalí
Rychlost vyšetření• Ale nebývá non-stop provoz laboratoří• Stačí PCR nález ke změně ATB léčby?
Vysoká specificita• Nelze detekovat ty mikroby, které nejsou součástí diagnostické soupravy
Často vyšší senzitivita • Riziko falešné pozitivity
Souhrn výhod molek. genetikySouhrn výhod molek. genetiky
Často vyšší senzitivita • Riziko falešné pozitivity
Kvantifikace
Záchyt při podávané ATB te• Nejedná se o záchyt DNA z rozpadlých buněk?
Záchyt pomalu rostoucích mikrobů
• Chybí izolát
• Nelze stanovit citlivost ke všem ATB
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR• kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
• Detekce zaměřena na nukleotidovou sekvenci
ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA
TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT
primer
primerJak vypadá výsledek výsledek
PCR
Jak vypadávýsledek
sekvenace
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR?
mikrob 1
mikrob 2
A
ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA
primery
ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA
varianta
mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA
mikrob 1
mikrob 2
B
ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA
primery
ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACGGCATT TATACAACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACGGCATT TATACA
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta
mikrob 3 ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACAACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA
C
ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA
primery
ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACTGCATT AATACAACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACTGCATT AATACAACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACTGCATT AATACA
mikrob 1
mikrob 2
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta
ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCAAA GATACAACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCAAA GATACAACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCAAA GATACAmikrob 3
D
ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA
primery
mikrob 1
mikrob 2
Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta
mikrob 3
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
Důvod použití patogen specifického PCR
Příklad
• pomalý (žádný) růst• složitá identifikace• vysoká citlivost• biohazard
Mycobacterium tuberculosisBordetella pertussisPneumocystis jiroveciPůvodci bakter. meningitid
Chlamydia trachomatisChlamydia trachomatisNeisseria gonorrhoeae
Clostridium difficileStaphyloccocus aureus (MRSA)
respirační viry (influenza)
Nemá náhodou pacient černý kašel?(potřeba detekovat bordetelu, ostatní mikroorganismy mě nezajímají)
bordetela
chlamydia
mycoplasma
A B C D
cílová sekvence pro primery musí být unikátní pro bordetelu
PCR
DETEKCE + IDENTIFIKACE bordetely
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
PCR diagnostika
hledá se patogen, předem není
stanoveno jaký
Broad range PCRBroad range PCRneboli panbakteriální PCR
Důvod použitíbroad range PCR
Příklad
rychlá detekcevysoká citlivostpomalý (žádný) růst
sepseendokarditidy
Horečka. Jedná se o infekční proces? Co je jeho příčinou?(potřeba detekovat kteroukoliv bakterii,
protože kterákoli bakterie může způsobit sepsi)
A B C D
S. aureus
S. epidermidis
E. faecalis
cílová sekvence pro primery je přítomna u všech bakterií
E. faecalis
A B C D
S. aureus
S. epidermidis
E. faecalis
PCR (16S rDNA )
DETEKCE IDENTIFIKACE
+ sekvenace
E. faecalis
ID materiál 16S / 18S sekvenace kultivace
1 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní
2 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní
3 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní
4 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní
5 mitrální chlopeň Streptococcus anginosus negativní
6 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
7 trikuspidální chlopeň negativní negativní
Výsledek broad range “16S PCR” – vzorky z kardiovaskulární chirurgie:
8 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní
9 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní
10 mitrální chlopeň Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis
11 aortální chlopeň Enterococcus faecium negativní
12 trikupidální chlopeň Enterococcus faecium negativní
13 mitrální chlopeň Candida glabrata Candida glabrata
14 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní
15 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus negativní
16 chlopeň Bartonella quintana negativní
datum materiál 16S sekvenace kultivace
Pacientka 65 let
OA: před 11 měsíci reimplantace TEP kyčleNO: bolest v místě kyčle trvající 4 dny
Fyzikální vyšetření: fluktuující ložisko 5x5 cm laboratoř: CRP 195
� klindamycin + levofloxacin po výsledku kultivace ampicilin/sulbaktam + levofloxacin
datum materiál 16S sekvenace kultivace
30.1.2015 punkce ložiska - hnis nezasláno k vyšetření E. coli
11 dní po operaci dimise; CRP 69
5.2.2015 tkáň během operační revize kloubu negativní S. epidermidis po pomnožení
5.2.2015 punktát během operační revize E. coli negativní
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA
TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT
primer sonda
• přístroje real time PCR (kvantitativní PCR)
TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT
primer
EBV detekce pomocí PCR
1.E+02
1.E+03
1.E+04
1.E+05
1.E+06
1.E+07
Log
of v
iral q
uant
ity in
100
000
GE
7
6
4
3
2
5
LPD
Log
viro
vé n
álož
e na
100
000
g.e
.
DNA from whole blood
1.E-01
1.E+00
1.E+01
1.E+02
0 20 40 60 80 100 120
Days after HSCT
Log
of v
iral q
uant
ity in
100
000
GE
2
1
ND
0
Log
viro
vé n
álož
e na
100
000
g.e
.
Dny po HSCT
DNA z plné krve
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
Nový fenomén v klinické mikrobiologii:Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie
Identifikace přes proteiny
MALDI-TOF
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight
- identifikace narostlé bakteriální kultury
- rychlost identifikace v minutách- zrychlení diagnostiky o desítky hodin- zrychlení diagnostiky o desítky hodin
- široká škála mikroorganismů (2150 rodů)- přesnost, reprodukovatelnost nálezu- v ČR 35 přístrojů
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
Epidemiologie infekcíEpidemiologie infekcí::
• Odhalení epidemie• Odhalení přenosného (epidemického) kmene
??
• sekvence je jedinečná pro daný kmen
Identifikace kmeneIdentifikace kmene
A B C D
kmen 1
• genotypizace
kmen 2
kmen 3
Analýza bakteriálních genů
(genomu)
Princip genotypizacePrincip genotypizace
Odhad příbuznosti mezi izoláty téhož druhu
Geneticky Klinicky + = Epidemický Geneticky blízké izoláty
Klinicky blízké izoláty
+ = Epidemický kmen
Metody genotypizaceMetody genotypizace
• „Gel (image)-based“
- Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)- PCR metody
- Random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD)
- rep-PCR (repetitive elements: ERIC, REP, BOX)- Amplified fragment length polymorphism analysis (AFLP)
- Ribotypizace
Plán semináře:
• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu
• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření
- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens
• jak funguje identifikace přes MALDI TOF
• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života
Centrum cystické fibrózy(300 pacientů)
2001 - zavedena PCR diagnostika bakterií Burkholderia cepacia- 30 % pacientů s pozitivním nálezem
1998 - kultivační diagnostika odhalila
infikovaných pacientů
1998 - kultivační diagnostika odhalila cca 15 % pozitivních pacientů
- vyčleněna samostatná ambulance jen pro „cepaciové“ pacienty
do 1999 - pořádání letních táborů pro nemocné CF
30%30%
ID atpD gltB gyrB recA lepA phaC trpB ST
1 16 11 10 14 11 6 79 32
2 16 11 10 14 11 6 79 32
MLST
2 16 11 10 14 11 6 79 32
3 16 11 10 14 11 6 79 32
Princip izolačního režimu v centrech CF:
• Žádný pacient s CF by se neměl setkat s druhým pacientem s CF.
• Zvláště rizikové je setkání dvou pacientů s odlišným mikrobiologickým nálezem.
1. pacienti bez infekce (nekolonizovaní)2. pacienti s infekcí Pseudomonas aeruginosa3. pacienti s infekcí Burkholderia cepacia
Epidemie P. aeruginosa
Hematoonkologie (Itálie), oddělení otevřeno v březnu 2006
červen 2007: 2 zemřelí v jednom týdnu
- kmen PA, shodný ATBgram � uzavření jednotky- kmen PA, shodný ATBgram � uzavření jednotky� epidemiologické šetření
- retrospektivní studie- prospektivní studie - identifikace asymptomatických případů- HCW- audit hygienických pravidel- kontrola prostředí
Retrospektivní analýzabřezen 2006 - červen 200778 pts10 případů
hetegenní profil 3 izoláty stejný profil
Prostředí: 29 vzorků (desinfekce, odpady, umyvadla, sprchy …)
P. aeruginosa
P. mendocina P. aeruginosa
P. aeruginosa
P. stutzeri
Epidemie E. coli
• E. coli O104:H4 ~ (EHEC, EAEC), STEC
květen 2011 Německo
3,842 případů- 2,987 GI 18 úmrtí- 855 HUS 35 úmrtí
STEC O104:H4
příčina: klíčky/výhonky ? (nikoli maso x EHEC 0157:H7)časem zaznamenán i interhumánní přenos
sekvenovaný genom:• původ v EAEC,
ovšem zde navíc gen stxovšem zde navíc gen stx
• horizontální transfer - kombinace faktorů virulence EHEC (profág) a EAEC (plazmid)
• specifické PCR