MİKROBİYOLOJİDE

BİYOTEKNOLOJİ

Biyoteknoloji;

Genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan

manipulasyonlarla

yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler

elde etmektir

1920’li yıllar.....

1960 sonlarına doğru Arber ve Smith.... Restriksiyon endonukleazlar

3

Mikrobik biyoteknoloji,

yiyecek üretimi için daha kullanışlı enzim ve organizma eldesi, üretim

sistemlerinin kolaylaştırılması, ……

Tarımsal biyoteknoloji,

gıda üretiminde kullanılan ekinleri daha verimli kılacak ya da ürüne

istenilen özellikleri kazandıracak genetik değişiklikleri sağlayan

teknoloji

Hayvan biyoteknolojisi,

hayvanların genetik yapısının değiştirilerek daha yararlı özelliklere

sahip hayvan ve hayvan ürünlerinin elde edilmesi (özellikle antikor üretimi)

başka bir canlının genini taşıyan hayvanlar (transgenik hayvanlar)

Örneğin insanda kan pıhtılaşması için gerekli olan protein geni ineklere verilerek,

ineklerin bu proteini sütünde üretmesi sağlanabilmektedir.

Klonlama……

4

Adli Biyoteknoloji:

Parmak izi yöntemi,

1985’den itibaren …. DNA parmak izi yöntemi

Tıbbi biyoteknoloji

hastalıkların teşhisinde ve tedavisinde,

hastalıklı genlerin sağlam genlerle değiştirildiği gen terapisi

gelişince sinir, kas, kan hücreleri gibi insan vücudunun

çeşitli hücreleri olmak üzere özelleşen olgunlaşmamış

hücrelerin kullanıldığı stem hücresi teknolojisi,

Restriksiyon endonukleazlar:

Bakterilerde dışarıdan hücrelere giren,

bazı özel gen ya da markerlar taşıyan genetik materyalleri ayrıştırarak,

mutasyonlar meydana getirmesine mani olmak

ve böylece türlerin genetik karakterlerinin stabilitesini korumakla

görevli enzimlerdir

Bakterilerin büyük bir bölümü, bir ya da birkaç türde

restriksiyon enzimi sentezleyebilmektedirler.

E. coli RY 13 suşu EcoRI

RE’lerin aktivitelerini gösterebilmeleri için bazı

optimal koşulların sağlanması gereklidir. Ör: ısı, pH, buffer vs..

Modifikasyon enzimleri?

Gen Klonlaması (moleküler klonlama)

Önemli bir ürünün (ya da proteinin) sentezini kodlayan genin

ait olduğu hücre genomundan özel yöntemlerle kesilerek çıkartılması,

bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA’sı ile birleştirilerek

alıcı bir hücreye transfer edilmesi,

bu alıcı hücrede genin ekspresyonunun sağlanması

8

Nukleik asitlerin (DNA/RNA) invitro amplifikasyon yöntemleri

Çeşitli organ, doku ve sıvılardan izole edilen

genetik materyaller enzimatik olarak çoğaltılır

bu genetik ürünler

ya homolog problar kullanılarak hibridizasyon

ya da elektroforezis ve boyama sonrası direkt

görüntülenir

9

10

Polymerase Chain Reaction-PCR

Prensip:

Hedef genetik materyallerin (DNA/RNA*)

spesifik kısa zincirli oligonukleotid primerler yardımı ile

enzimatik olarak sayısal çoğaltılması

11

Hedef DNA sekansları

İki tür spesifik oligonukleotid primerleri

(15-30 bazlık, tek iplikcikli)

Termostabil DNA polimeraz (Taq polimeraz)

Dört tür dNTP

Tampon çözelti, MgCl2

PCR reaksiyon karışımı

12

Hedef DNA sekansları

varlığı aranan, amplifiye edilmek istenen hedef DNA

kan, serumu, plazma, gaita, doku parçaları, idrar, sperm, saç teli

gibi inceleme örneklerinden ekstrakte edilerek ve

saflaştırılarak karışıma eklenir

13

Primerler:

Replikasyonun başlama noktası

Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen,

bir çift kısa sentetik oligonukleotid

http://www.bio.davidson.edu

14

Nükleotidler (dNTP= deoksinükleotid trifosfat )

20-200 µM (her dört nükleotit de eşit oranda)

Karışım içindeki dNTP, Taq DNA polimerazın çalışması için gerekli MgCl2’u bağlar

konsantrasyonları birbirine paralel artmalı ya da azaltılmalı…

Enzim (Taq Polymerase)

Thermus aquaticus adlı termofilik bakteriden izole edilen ısıya dayanıklı

polimeraz enzimi

Tampon çözelti, Magnezyum

Primerlerin bağlanması ve reaksiyonların gerçekleşmesi için uygun ortam ve pH

sağlayan çözelti içerisinde Tris-HCl, KCl, MgCl2 bulunmaktadır.

Ayrıca, jelatin, sığır albumini ve tween 20 gibi deterjanlarda Taq polimeraz

enzimini stabilitesi için katılabilir.

15

PCR’ın aşamaları

1- Hedef DNA’nın denatürasyonu

2- Primerlerin bağlanması

3- Sentez/Uzama

Hedef

sekans

Yeni

DNA

Yeni

DNA

16

PCR’ın aşamaları

1- Hedef DNA’nın denatürasyonu

Nükleotid baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının yüksek ısı

yardımı ile birbirinden ayrılması sonucu çift iplikli DNA’dan tek

iplikli DNA moleküllerinin oluşması aşamasını kapsar

Yüksek ısı: 94-96 °C

Ön denatürasyon; özellikle denatürasyonu zor olan kalıp DNA’lar için 3-5 dak. 94-96 °C

17

PCR’ın aşamaları

2- Primerlerin bağlanması

(Annealing/hibridizasyon)

Primer adı verilen tek iplikçi kısa oligonükotidlerin

uygun ısı (30-60 C) ve uygun sürede

kalıp DNA üzerindeki hedef bölgelere bağlandığı aşamadır.

Çoğaltılacak hedef bölgeye komplementer

öz. başlangıç ve bitiş noktalarını sınırlar

genellikle primerlerin erime ısısının 5º C altında, (54-65º C)

30sn-1dk

18

I. basamak

II. basamak

http://users.ugent.be/%7Eavierstr/principles/pcr.html

Primer sekansları 5’ ve 3’ olmak üzere iki uca sahip olup

amplifikasyon sürekli 5’ den 3’ yönüne doğru gerçekleşir

19

PCR’ın aşamaları

3-Sentez

(Polimerizasyon/Uzama/Extension)

Polimeraz enzimi yardımı ile tek iplikçikli

DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’—3’

yönde uzatılması

Sentez işlemi 72º C de 1-2 dakika sürede

gerçekleştirilir

20

3 basamaktan oluşan bu bir siklus yaklaşık 30 kez üst üste

tekrarlandığında hedef DNA’nın milyarlarca kopyası elde edilebilir.

21

Sonuçların değerlendirilmesi

Elektroforez

PCR amplifikasyon ürünleri (amplikon)agarose ya da poliakrilamid jele

bilinen işaret DNA lar (DNA marker) ve

kontrol PCR ürünleri ile birlikteyüklenerek elektrik akımına tabi tutulurlar.

ethidium bromür ile boyanır, U.V. ışığı kullanılarak incelenir.

22

Marker Pozitif kontrol Negatif kontrol Örnekler

23

M P N 1 2 3 4 5 6 M

M: Marker; P=Pozitif Kontrol; N= Negatif Kontrol;

1-7= İncelenen örnekler (2 numaralı örnek pozitif)

649 bp

24

Çabuk, güvenilir, duyarlı ve spesifik

Etkenin vücutta çok az sayıda olması durumlarından daha az

etkilenir

incelenen materyalin eski* ya da kontamine olmasından etkilenmez

izolasyon ve identifikasyonu zor olan bakteriyel ve viral ajanların

belirlenmesinde yararlı

Personel hatalarını, insan gücünü minimuma indirger

25

Pahalı ? ? ?

deneyimli personel

gelişmiş ekipmanlar

kontaminasyonlar

sonuçların yorumlanmasında güçlükler

26

PCR’ ın kullanım alanları

Hastalıkların tanısı

Özellikle zor üreyen bakterilerin tanısında, antibiyotik kullanmış hastalarda tanı…

Toksijenik, virulens suşların saptanmasında

Antibiyotik direncinin saptanmasında

Moleküler tiplendirme çalışmalarında

Epidemiyolojik çalışmalar

Defektlerin saptanmasında

Adli tıp…………………………………

27

Farklı PCR çeşitleri:

Multiplex (Çoklu) PCR:

Bir PCR ile birden fazla DNA segmentinin (hedefin),

birden fazla primer çifti kullanarak

aynı amplifikasyon reaksiyonunda çoğaltılmasını sağlar.

28

M pozitif kontroller örnekler Marker

29

Farklı PCR çeşitleri:

Nested PCR:

ardarda iki PCR yapılır.

İlk PCR ürünleri ikinci PCR için hedef olarak kullanılır.

İkinci PCR da ilk çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren

primerler kullanılarak asıl istenilen hedef bölge çoğaltılır ve daha özgün

ürünler elde edilir.

30

Farklı PCR çeşitleri:

Reverse-Transcriptase PCR (Geri Transkripsiyon PCR/ RT-PCR):

İki aşamalı olup RNA dan cDNA sentezi (geri transkripsiyon) +

komplementer DNA nın standart PCR ile çoğaltılması aşamalarını kapsar.

31

Moleküler tiplendirme yöntemleri

Benzer klinik bulgulara neden olan infeksiyöz

etkenlerin, antijeniteleri ve patojeniteleri farklı alt

tipleri görülebilmektedir.

Korunma ve sağaltımda

Epidemiyolojik verilerin oluşturulmasında

Serotiplendirme, biyotiplendirme, faj ile tiplendirme,

morfolojik, fizyolojik özelliklerine göre tiplendirme........

Moleküler tiplendirme

Lipopolisakkarid ve yağ asitlerin saptanması

Protein saptanması

Nukleik asitlerin saptanması

PCR a dayalı metodlar

34

Epidemiyolojik açıdan tiplendirme yöntemlerinin başlıca kullanım amaçları

•Salgınların kaynağı ve yayılma yolları hakkındaki hipotezlerin test edilmesi

•Hastalıkların epidemiyolojik olarak birbirleri ile ilişkisinin belirlenmesi

•Re-aktivasyon ile yeni infeksiyonların birbirinden ayırt edilmesi

•Hastane infeksiyonları ile toplumsal kaynaklı infeksiyonların belirlenmesi

•Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması

•Populasyondaki epidemi klonlarının belirlenmesi, buna göre kontrol

yöntemlerinin değerlendirilmesi

35

Tiplendirme yöntemlerinin yaygın kullanılabilmesi için sahip olması gereken kriterleri

• Tiplendirebilirlik

•Ayrım gücü

•Tekrarlanabilirlik ve Stabilite

•Kullanım kolaylığı, maliyeti, testin süresi, kullanım spektrumu

•Sonuçların kolayca yorumlanabilir olması

•Sonuçların laboratuvarlar arasında paylaşılabilir olması

36

Moleküler tiplendirmede kullanılan bazı önemli terimler

Klon:

Ortak bir atadan gelen, genetik olarak aynı bir ya da daha fazla

organizmadır

Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar:

Belli bir bölgeden ya da belli bir zaman diliminde hastalardan toplanan

örneklerden izole edilen ve ortak bir kaynaktan geldikleri düşünülen

izolatlardır

Genetik olarak ilişkili izolatlar (klonlar):

Genetik tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da

ortak bir atadan köken aldıklarını düşündürecek kadar yakın olan

izolatlar

37

Salgın suşu:

Aynı türün hem epidemiyolojik (zamna, yer, ortak kaynak) hem de

genetik olarak ilişkili aynı genetik profile sahip izolatlar

Endemik suş:

Belli bir populasyonda infekte hastalardan sıklıkla izole edilen,

tiplendirme yöntemleri ile birbirinden ayırt edilemeyen ya da yakın

ilişkili bulunan ancak direkt epidemiyolojik bir bağlantı gösterilemeyen

izolatlar

38

Yakın ilişkili izolatlar:

Salgın suşundan yalnızca bir genetik olay bakımından farklı olan

izolatlar

Olası ilişkili izolatlar:

Salgın suşundan iki genetik olay bakımından farklı olan izolatlardır. Bu

izolatlar salgın suşu ile aynı genetik soydan olabilir ancak genetik olarak

yakın ilişkili değildir

İlişkisiz izolatlar:

Salgın suşundan üç genetik olay bakımından farklı olan izolatlar

39

Pulsed-Field Gel Electrophoresis

(PFGE)

40

Moleküler tiplendirme yöntemleri içerisinde altın standart

Düz elektroforez yöntemlerinde 30-50 kb’dan daha büyük

DNA molekülleri büyüklükleri farketmeksizin aynı hızla aynı

miktarda hareket ederler, jel içerisinde göç ederler. Bu da

jel üzerinde tek bir bant olarak gözlemlenir.

Eğer DNA elektoforez işlemi sırasında yön değiştirmeye

zorlanırsa, birbirlerinden ayrımı yapılabilecek şekilde farklı

bantlar oluşur. Bu da tiplendirmeyi olanaklı hale getirir.

41

Lizis aşamasında DNA nın parçalanmaması gerekir,

Büyük DNA molekülleri ise kolay kırılabilir özelliktedir +

pipetleme gibi işlemleri yapmak çok zordur

Sıvı ya da katı besiyerinde üretilen bakteriler düşük erime ısılı

agarozda karıştırılıp kalıplara dökülürler. Lizis işlemleri bu agar

blokları içerisinde yapılır.

Lizis aşaması sonucunda agar bloklarının içerisinde bulunanan

çıplak DNA molekülleri uygun restriksiyon enzimleri aracılığı ile

kesilir,

özel elektroforez işlemi başlatılır.

42

Yöntemin ayrım gücü çok yüksek

Zaman alıcı ve kompleks bir yöntem

Laboratuvarlar arasında standardizasyon problemi

43

44

Blotlama,

Elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan

proteinlerin veya nükleik asitlerin

bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmesi

Southern Blotlama

E.M. Southern adlı bilim adamı 1975

Herhangi bir kaynaktan elde edilen DNA’ nın analizi için kullanılan membran blotlama ve görüntüleme tekniği

45

1- DNA izolasyonu:

Genomik ya da plazmid DNA’sı değişik yöntemlerle ekstrakte edilir.

2- Restriksiyon endonükleazlar (RE) ile kesim:

Bir önceki aşamada saf olarak elde edilen DNA süspansiyon ve RE’lar

birlikte inkube edilir. Bu süre içerisinde RE’lar DNA üzerinde

spesifik bölgeleri keser ve böylece farklı büyüklüklerde DNA

segmentleri oluşur.

3- Elektroforez:

Fragmentlere ayrılmış DNA’lar, büyüklüklerine göre elektriksel bir

ortamda jelde büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar

oluştururlar.

46

4- Membrana transfer

Jel üzerindeki DNA’ların, nitrosellüloz ya da naylon membranlaraaktarılma aşaması

Kapiller transfer, elektroforetik transfer, vakumla transfer

Prensibi;sıvı bir akımda jeldeki DNA’nın destek tabakaya geçmesidir.

Transfer oranı DNA parçalarının büyüklüklerine,

jeldeki kalıntılara,

sıvının pH sı gibi özelliklerine bağlıdır

47

48

49

50

51

52

5- Denatürasyon ve Fikzasyon:

Membran üzerine transfer edilen DNA bantları 0.5 N NaOH ilemuamele edilerek denatüre edilir

= çift iplikçikli DNA, bazlar arası bağlar koparak, tek iplikçikli halegelir.

Naylon membran 80º C ye ısıtılarak iplikçiklerin membran üzerine fikzeedilmesi (yapışması) sağlanır.

53

6- Hibridizasyon:

3 temel adımda gerçekleşir;

a) prehibiridizasyon: özgül olmayan bağlanmaları en aza indirmek içinblotlanması tamamlanan membranın bloklanması

b) hibridizasyon: hedef DNA ile probun birleştiği aşama

c) hibridize olmayan probların yıkanması ve görüntülenme aşaması

54

55

6- sonuçların gözle görülmesi

Kullanılan probun özelliğine göre otoradiografi, ya da özel boyamayöntemleri ile oluşan hibrib bantlar gözle görülür hale getirilir.

5656

Northern Blotlama

J.Alwine ve G. Stark, 1979

Herhangi bir kaynaktan elde edilen RNA’ nın analizi

RNA nın izolasyonu

Elektroforez

Membrana aktarma

Blotting

RNA nın saptanması

Bu teknikten, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya

organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA ları saptamada yararlanılır

575757

Dot/Slot Blotlama

DNA /RNA’nın elektroforez yapılamadan membrana damlatılması ve bu membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesi

Klinik materyalden DNA izolasyonu,İki ya da beş katlı seri dilüsyon,Her dilüsyondan naylon membran üzerine damlatma,Denatürasyon ve fikzasyon,Hibridizasyon,Otoradiografi ile görüntüleme.

Çalışılan örnekteki DNA miktarı önemli, genellikle fazla miktarda DNA ile çalışılması gerekmektedir

585858

In situ Hibridizasyon

Doku, organ ve hücrelerdeki özgül nükleik asitlerin belirlenmesi

Hücre ve doku içindeki hedef nükleik asidin lokalizasyonunu belirleme imkanı sağlar

5 temel adımda gerçekleşir;

•Dokuların işlenmesi(fikze edilme ve kesilme)

•Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi

•Hibridizasyon

•Yıkama

•Görüntüleme