Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer ... · iii P293v Pastor, Tatiane de Pinho. Variantes de seqüência no gene MSH2 em pacientes selecionados para a Síndrome de

Ministério da Saúde

Instituto Nacional de Câncer

Coordenação de Pós-graduação

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

Pós-Graduação em Oncologia

Tatiane de Pinho Pastor

Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados

para a Síndrome de Lynch

Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira

Rio de Janeiro

Setembro 2014

ii









Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós Graduação em Oncologia do

Instituto Nacional de Câncer José de

Alencar Gomes da Silva como parte

dos requisitos para obtenção do grau

de Mestre em Oncologia


Rio de Janeiro

Setembro 2014

iii

P293v Pastor, Tatiane de Pinho.

Variantes de seqüência no gene MSH2 em pacientes

selecionados para a Síndrome de Lynch. / Tatiane de Pinho

Pastor. – Rio de Janeiro, 2014.

xviii, 94 f.: il. color.

Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional

de Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2014.

Orientador: Miguel Ângelo Martins Moreira.

1. Neoplasias Colorretais Hereditárias sem Polipose.

2. Gene MSH2. 3. Síndrome de Lynch. I. Moreira, Miguel

Ângelo Martins. II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar

Gomes da Silva. III. Título.

CDD 616.99435

iv










Aprovada em:

EXAMINADORES:

Dr. Marcelo Alex de Carvalho – Presidente

Drª. Tatiana de Almeida Simão

Drª. Cláudia Vitória de Moura Gallo

Drª. Cynthia Chester Cardoso – Suplente I

Dr. Fernando Regla Vargas – Suplente II

Rio de Janeiro

Setembro 2014

v





Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a

Síndrome de Lynch

RESUMO

Dissertação de Mestrado


A Síndrome de Lynch (SL) ou Câncer Colorretal Hereditário Não-Poliposo (HNPCC) é uma doença

autossômica dominante associada a mutações na linhagem germinativa nos genes do Sistema

Mismatch Repair (MMR) de reparo do DNA e é responsável por aproximadamente 5% de todos os

casos de câncer colorretal (CCR). A maioria das mutações ocorre nos genes MSH2 (50%) e MLH1

(40%), e gera uma proteína truncada e não funcional. Mais de 513 alterações diferentes nos genes

de reparo foram relatadas, sendo que 10% das encontradas no gene MSH2 envolvem a substituição

de um aminoácido. O sistema de reparo MMR corrige erros de pareamento base\base, além de

inserções e deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo

de replicação, além de estar envolvido nos processos de recombinação, na geração da diversidade

imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA. A inativação mutacional dos genes MMR

leva a um reparo insuficiente do DNA e ao desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos

níveis MSI. Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade

precoce, além de possuírem um risco aumentado de desenvolver tumores extracolônicos. O

principal objetivo desse estudo foi identificar variantes de sequência no gene MSH2 em pacientes

selecionados para Síndrome de Lynch de acordo com os critérios de Amsterdam ou Bethesda

modificados, avaliando a sensibilidade e especificidade dos mesmos para a presença de mutação. E

para isso, foram selecionados candidatos provenientes de quatro centros clínicos e desses pacientes

foram obtidos o sangue periférico para isolamento do DNA genômico. Os éxons do gene MSH2

foram amplificados e sequenciados através dos sequenciamentos automático de Sanger e

sequenciamento de nova geração (NGS), além do sequenciamento da região promotora, para a

identificação de mutações na linhagem germinativa. A partir da análise de variações de ponto no

gene MSH2, identificamos um total de 6 variantes patogênicas ou potencialmente patogênicas (c.

388_389delCA; c.1046C>G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G>A; c.2078G>A; c.2152C>T, sendo

essa última em quatro pacientes), representando 46.1% das variantes identificadas neste estudo em

9 pacientes, sendo que 6 preenchiam os critérios de Amsterdam e 3 preenchiam os critérios de

Bethesda, mostrando que os critérios de diagnóstico clínico são mais sensíveis e específicos para

identificar a presença mutações patogênicas no gene MSH2. Além disso, identificamos também 3

variantes novas, sendo que duas delas (c.1738_1741delGAAA; c.2078G>A) foram classificadas

como sendo patogênicas e uma não pode ser classificada (c.-185 C>A). Obtivemos uma frequência

total de variantes missense de 55.5%, seguido de 22.2% de mutações frameshift, 11.1% de mutações

nonsense e 11.1% de alterações sinônimas, além de alterações na região promotora e de íntron,

mostrando que o espectro de variantes do gene MSH2 é bastante heterogêneo, englobando diferentes tipos de alterações.

vi





Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a

Síndrome de Lynch

ABSTRACT

Dissertação de Mestrado


Lynch syndrome (SL) or Colorectal Cancer Hereditary nonpolyposis (HNPCC) is an autosomal

dominant disease associated with germline mutations in the MMR genes of the DNA repair system

and it is responsible for approximately 5% of all cases of colorectal cancer (CCR). Most of the

mutations occur in the MSH2 (50%) and MLH1 genes (40%), and generates a truncated,

nonfunctional protein. More than 513 different changes in repair genes have been reported, and

10% of those mutations can be found in the MSH2 gene causing substitution of one amino acid. The

repair system MMR corrects mismatched nucleotides, insertions and deletions that occur during

DNA synthesis, improving the fidelity of replication mechanism and it is also involved in the

process of recombination in the generation of immune diversity and specific cellular response to

DNA damage. Mutational inactivation of MMR genes leads to insufficient DNA repair and the

development of tumors characterized by high levels of MSI. SL patients often develop colorectal

cancer at an early age, and they also have an increased risk of developing extra colonic tumors. The

main objective of this study was to identify sequence variants in the MSH2 gene in selected patients

for Lynch syndrome according to the criteria of Amsterdam or modified Bethesda, assessing the

sensitivity and specificity for the presence of the mutation. And for that, candidates from four

clinical centers were selected, and genomic DNA were obtained from peripheral blood. The MSH2

exons and promoter region were amplified by PCR and sequenced by automatic DNA Sanger-

sequencing and by Next Generation Sequencing. From the analysis of variations in the extent of

MSH2 gene, we identified a total of 6 variants pathogenic or potentially pathogenic (c.

388_389delCA; c.1046C> G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G> A, c.2078G> A; c .2152C> T, the

latter being in four patients), representing 46.1% of the variants identified in this study in 9 patients,

6 fulfilled the Amsterdam criteria and three met the criteria of Bethesda, showing that the criteria

for clinical diagnosis are more sensitive and specific for the presence of pathogenic mutations in

the MSH2 gene. In addition, we identified three new variants, two of which

(c.1738_1741delGAAA; c.2078G> A) were classified as pathogenic and one could not be classified

(C-185 C> A). In the present study, we obtained an overall frequency of 55.5% missense variants,

followed by 22.2% frameshift mutations, 11.1% nonsense mutations of and 11.1% of silent changes,

and alterations in the promoter region and intron, showing that the spectrum of variants of the MSH2

gene is very heterogeneous, encompassing different types of changes.

vii

Este trabalho foi realizado na Divisão de Genética da

Coordenação de Pesquisa do Instituto Nacional de

Câncer José de Alencar Gomes da Silva, sob

Orientação do Dr. Miguel Ângelo, e contou com apoio

Financeiro da FAPERJ, CNPq e INCT-Câncer.

viii

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todas as pessoas que de alguma forma foram importantes para

o desenvolvimento deste trabalho.

Ao meu orientador Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira pelos ensinamentos e

direcionamentos que conduzem a minha formação profissional e que acrescentaram muito no

desenvolvimento deste projeto.

A toda minha família, em especial meus pais, minhas irmãs e meus sobrinhos, pelo

estímulo constante nessa jornada, sempre me incentivando a continuar os meus estudos.

Agradeço também por toda a orientação que me deram durante a vida, e por me ajudarem a

enfrentar os obstáculos e transformações que a vida impõe.

Ao Thiago, por sempre estar ao meu lado nos momentos alegres e por me incentivar nos

momentos difíceis.

A todos os centros participantes deste projeto, em especial a Dra. Patrícia Prolla, por

estar sempre disposta a ajudar e a colaborar com qualquer coisa.

Gostaria de agradecer aos companheiros do laboratório, pela grande ajuda no dia-a-dia

e, principalmente, pelos nossos momentos de descontração. Um agradecimento especial à Shay,

Ayslan, Carol, Karla e Albert por todo auxílio durante os experimentos.

As minhas amigas da faculdade, Kélvia e Bia, um muitíssimo obrigada. Mesmo nos

encontrando tão pouco, saibam que sempre serão minhas amigas e que podem contar comigo

quando quiser!

Aos pacientes participantes, sem os quais este trabalho não teria sido realizado, e aos

seus familiares, por entenderem a importância das investigações genéticas.

Por fim, um agradecimento às instituições de fomento: CNPq, FAPERJ e INCT-Cancer.

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A Adenina

ADP Difosfato de Adenosina

AP-1 Proteína Ativadora 1

ATP Trifosfato de Adenosina

APC Gene da Polipose Adenomatosa Familiar

APAF Polipose Adenomatosa Familiar Atenuada

ATR Gene da Ataxia Telangiectasia

BRAF V-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B

BER Reparo por excisão de bases

C Citosina

º C Grau Celsius

CIN Instabilidade Cromossômica

CIMP Fenótipo metilador de ilhas CpG

CpG Regiões do DNA onde os nucleotídeos citosina e guanina ocorrem um ao lado

do outro

CCR Câncer Colorretal

dNTP Desoxirribonucleotídeo Fosfatado

DAB Diaminobenzidina

dsSNP Banco de dados de polimorfismos de nucleotídeos únicos

EDTA Ácido Triacético Diamino Etileno

EPCAM Epithelial Cell Adhesion Molecule

EXO1 Gene da exonuclease 1

F Forward ou senso

FAP Polipose Adenomatosa Familiar

FCCTX Câncer colorretal familial tipo X

G Guanina

HCPA Hospital das Clínicas de Porto Alegre

HNPCC Câncer Colorretal Hereditário Não Poliposo

HR Reparo por recombinação homóloga

H3BO3 Ácido bórico

IHQ Imunohistoquímica

INCA Instituto Nacional de Câncer

x

InSiGHT International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumors

IDLs Loops de inserção/deleção

JPS Síndrome da Polipose Juvenil Familiar

K-ras Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

LBP-1 Proteína líder tipo B1

MLH Homólogo de MutL

MSH Homólogo de MutS

MMR Reparo de Erros de Pareamento

MLH1 Human MutL Homolog 1

MSH2 Human MutS Homolog 2



MSI Instabilidade de microssatélites

MSI-H Instabilidade de microssatélites de alto grau

MSI-L Instabilidade de microssatélites de baixo grau

MSS Ausência de instabilidade de microssatélitess

MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógenos

MYH MutY human homologue (E.coli)

MgCl2 Cloreto de Magnésio

NaOH Hidróxido de sódio

NGS Sequenciamento de nova geração

NER Reparo por excisão de nucleotídeos

NHEJ Reparo por recombinação não-homóloga

NF-1 Fator de transcrição, também conhecido como proteína de ligação ao

elemento TGGCA

NF-E4 Nuclear Factor Erythroid 4

pb Pares de Base

PMS2 Postmeiotic Segregation Increased 2

PMS1 Postmeiotic Segregation increased 1

PJS Síndrome de Peutz-Jeghers

PI3K Fosfatidilinositol-3-Cinase

PCNA Antígeno nuclear de células em proliferação

P Braço curto de um cromossomo

xi

q Braço longo de um cromossomo

R reverse ou anti-senso

RER Fenótipo de erro de replicação

RFC Human replication factor C

SL Síndrome de Lynch

STK11 Serine/threonine kinase 11

SP-1 Stimulating Protein 1

SUS Sistema Único de Saúde

T Timina

TP53 Proteína tumoral 53

TGF-β Transforming growth factor beta

UV Variante não classificada

UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Uvr DNA Helicase II

Wnt Wingless-type

xii

LISTA DE FIGURAS

1.1. A evolução do câncer ..................................................................................................... 2

1.2. Estimativa de incidência do câncer Colorretal para o ano de 2014 ............................... 3

1.3. Modelo Adenoma – Carcinoma ..................................................................................... 4

1.4. Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI ...................................... 5

1.5. Diagnósticos diferenciais para o CCR ............................................................................8

1.6. Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR ....................... 13

1.7. Espectro mutacional dos genes MMR .......................................................................... 14

1.8. Diferentes funções das proteínas de reparo MMR ....................................................... 16

1.9. MMR em eucariotos ..................................................................................................... 18

1.10. Localização do gene MSH2 no cromossomo 2 ............................................................ 18

1.11. Modelo estrutural do heterodímero MutSα .................................................................. 19

1.12. Região promotora do gene MSH2 ................................................................................ 20

3.1. Fragmento de 571 pb amplificado .............................................................................. 29

4.1. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do

éxon 1 A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração

c.23 C>T ..................................................................................................................... 38


éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração

c.573C>T...................................................................................................................... 39


éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com

a alteração c.388_389del CA ....................................................................................... 40


éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a

alteração c.1046 C>G .................................................................................................. 40

4.5. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR

no éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a

alteração c.965 G>A .................................................................................................... 41


do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com

a alteração c.2021 G>A ............................................................................................... 42


éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a

alteração c.2152 C>T .................................................................................................. 44

xiii



a alteração c.2078 G>A .............................................................................................. 44



a alteração c.1738_1741del GAAA .............................................................................. 45

4.10. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da

região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2.

B) Sequência com a alteração c.-118 T>C em heterozigose.

C) Sequência com a alteração c.-118 T>C em homozigose ........................................ 46

4.11. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da

região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2.

B) Alteração c.-185 C>A em heterozigose .................................................................. 47


no íntron 1. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com

a alteração a alteração c.211+9 C>G em heterozigose. C) Sequência

com a alteração c.211+9 C>G em homozigose ........................................................... 47

xiv

LISTA DE QUADROS

I.I. Critérios de Amsterdam I ..............................................................................................10

I.II. Critérios de Amsterdam II .............................................................................................11

I.III. Critérios de Bethesda modificados .............................................................................. 11

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1. Reagentes utilizados na reação de PCR e concentração utilizada para

cada reação ....................................................................................................... 26

Tabela 3.2. Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos éxons 1 a 16 do gene

MSH2 ............................................................................................................... 27

Tabela 3.3. Oligonucleotídeos utilizados para amplificar a região promotora do gene

MSH2 ............................................................................................................... 28

Tabela 3.4. Oligonucleotídeos e condições de ciclagem utilizados no sequenciamento de

nova geração para amplificar o éxon 5 do gene MSH2, para o paciente 3........ 33

Tabela 4.1. Variantes de sequência identificadas nos 53 pacientes selecionados para

Síndrome de Lynch .......................................................................................... 37

Tabela 4.2. Classificação da patogenicidade da variante T8M por análises in sílico .......... 39

Tabela 4.3. Classificação da patogenicidade da variante P349R por análises in sílico ....... 41

Tabela 4.4. Classificação da patogenicidade da variante G322D por análises in sílico ...... 42

Tabela 4.5. Classificação da patogenicidade da variante G674D por análises in sílico ...... 43

Tabela 4.6. Classificação da patogenicidade da variante C693Y por análises in sílico ....... 45

Tabela 4.7. Classificação da variante c.-118 T>C .............................................................. 46

Tabela 4.8. Classificação da variante c211+9 C>G ............................................................. 48

Tabela 4.9. Média de cobertura base-base dos 16 amplicons para os pacientes 3 e

GGC 1108 ......................................................................................................... 48

xv

Tabela 4.10. Resumo das alterações encontradas no Paciente 3 através do

Sequenciamento de nova geração ..................................................................... 49

Tabela 4.11. Resumo das alterações encontradas no Paciente GGC 1108 através do

Sequenciamento de nova geração ..................................................................... 50

Tabela 5.1. Resumo das variantes identificadas pelo sequenciamento de Sanger

e de nova geração no gene MSH2 e suas classificações de acordo

com o grupo InSiGHT e programas in sílico .................................................... 51

Tabela 5.2. Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com alteração

na região codificante do gene MSH2 ............................................................... 60

xvi

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1

1.1 Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento ..................................................... 1

1.2 Carcinogênese Colorretal ............................................................................................. 3

1.3 Padrões de CCR ............................................................................................................ 6

1.4 Síndrome de Lynch ....................................................................................................... 8

1.4.1 Características clínicas ................................................................................................. 9

1.4.2 Critérios de diagnóstico .............................................................................................. 10

1.4.3 Testes genéticos de rastreamento ............................................................................... 12

1.4.4 Bases genéticas de SL ................................................................................................... 14

1.5 Vias de reparo de DNA ................................................................................................ 15

1.5.1 Sistema MMR .............................................................................................................. 15

1.6 MSH2 ........................................................................................................................... 18

1.7 Estudos brasileiros sobre a SL .................................................................................. 21

OBJETIVOS .......................................................................................................................... 22

2.1 Geral ............................................................................................................................ 22

2.2 Específicos .................................................................................................................. 22

METODOLOGIA .................................................................................................................. 23

3.1 Pacientes ...................................................................................................................... 23

3.2 Testes de rastreamento .............................................................................................. 24

3.2.1 Teste de Instabilidade de microssatélites (MSI) ...................................................... 24

3.2.2 Teste de Imunohistoquímica (IHQ) .......................................................................... 24

3.3 Extração de DNA a partir de sangue periférico ....................................................... 25

3.4 Estimativas da concentração e da integridade do DNA .......................................... 25

3.5 Amplificação do gene MSH2 ..................................................................................... 25

3.5.1 Regiões codificantes do gene MSH2 .......................................................................... 26

xvii

3.5.2 Região promotora do gene MSH2 ............................................................................. 28

3.6 Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados

e do rendimento da reação ........................................................................................ 29

3.7 Purificação dos produtos da PCR ............................................................................ 30

3.8 Sequenciamento Automático de Sanger .................................................................. 30

3.9 Ferramentas eletrônicas ............................................................................................ 31

3.9.1 Análise das variantes missense ................................................................................. 31

3.9.2 Análise da região promotora .................................................................................... 32

3.10 Sequenciamento de Nova Geração – por síntese .................................................... 32

3.10.1 Preparação das bibliotecas ....................................................................................... 33

3.10.2 Geração dos clusters ................................................................................................. 34

3.10.3 Sequenciamento por síntese ..................................................................................... 34

3.10.4 Análise dos dados ...................................................................................................... 34

RESULTADOS ...................................................................................................................... 35

4.1 Caracterização dos pacientes incluídos ................................................................... 35

4.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento Automático de Sanger ....... 36

4.2.1 Variantes identificadas nas regiões codificantes do gene MSH2 .......................... 36

4.2.2 Características das variantes encontradas nas regiões codificantes ..................... 38

4.2.3 Variantes identificadas na região promotora do gene MSH2 ............................... 45

4.2.4 Características das variantes encontradas na região promotora ......................... 46

4.2.5 Variante identificada no íntron 1 do gene MSH2 .................................................. 47

4.3 Resultados do Sequenciamento de Nova Geração ................................................. 48

4.3.1 Média das coberturas dos amplicons ...................................................................... 48

4.3.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento de Nova Geração ............... 49

xviii

DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 51

5.1 Variantes de sequência patogênicas ou possivelmente patogênicas ...................... 52

5.2 Variantes de sequência não patogênicas .................................................................. 54

5.3 Variantes de sequência não patogênicas ou benignas ............................................ 57

CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 61

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 63

ANEXOS ................................................................................................................................ 75

Anexo 1 ................................................................................................................................... 75

Anexo 2 ................................................................................................................................... 79

Anexo 3 ................................................................................................................................... 81

Anexo 4 .................................................................................................................................... 82

Anexo 5 .................................................................................................................................... 83

Anexo 6 .................................................................................................................................... 84

Anexo 7 .................................................................................................................................... 85

Anexo 8 .................................................................................................................................... 86

Anexo 9 .................................................................................................................................... 87

Anexo 10 .................................................................................................................................. 88

Anexo 11 .................................................................................................................................. 89

Anexo 12 .................................................................................................................................. 90

Anexo 13 .................................................................................................................................. 91

1

INTRODUÇÃO:

1.1 Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento

O câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de doenças que

têm como característica comum o crescimento desordenado de células anormais com potencial

invasivo e metastático. Sua origem se dá por condições multifatoriais, envolvendo fatores

ambientais e hereditários, que podem agir em conjunto ou em sequência para promover o

desenvolvimento e/ou a progressão tumoral (INCA, 2014).

O câncer é resultado de um processo de múltiplas etapas, nas quais ocorrem alterações

genéticas e epigenéticas que levam ao surgimento de um clone de células com vantagens

proliferativas sobre as demais (HANAHAN; WEINBERG, 2000). Trata-se de uma doença

complexa e heterogênea tanto em nível celular quanto em molecular, como resultado de

profundas alterações metabólicas em programas genéticos que controlam a proliferação,

apoptose, diferenciação, interação célula-célula e interação célula-matriz extracelular.

As células tumorais podem apresentar múltiplas alterações genéticas, tais como

deleções, inserções e translocações (SALK; FOX; LOEB, 2010), perda de heterozigosidade e

instabilidade de microssatélites (FEARON, 2011). Estas alterações permitem que células

normais escapem da sua regulação e passem a obter um fenótipo maligno, através da ativação

de oncogenes e da inativação de genes supressores de tumor e genes de reparo do DNA (LIU;

BODMER, 2005).

Diversas mudanças fisiológicas podem ocorrer no processo de tumorigênese, tais como:

(i) autossuficiência em sinais de crescimento, levando a uma proliferação descontrolada; (ii)

evasão da morte celular programada; (iii) capacidade replicativa ilimitada, uma vez que as

células cancerosas possuem a enzima telomerase ativa, o que evita o encurtamento dos

telômeros; (iv) indução da angiogênese, promovendo a vascularização tumoral; e (v)

capacidade de invasão e metástase, possibilitando a formação de tumores secundários

(Fig.,1.1). (HANAHAN; WEINBERG, 2011).

2

Figura 1.1. A evolução do câncer. Os danos no DNA que não foram reparados desencadeiam diversas

modificações que levam à formação de tumores e metástase. Adaptado de SALK et al., 2010.

O câncer representa uma das principais causas de morte no mundo e constitui, assim,

um sério problema de saúde pública para países desenvolvidos e também para os em

desenvolvimento. Em 2030, estima-se que ocorrerão 21,4 milhões de casos novos de câncer e

13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do crescimento e do envelhecimento da

população (INCA, 2014).

O câncer colorretal (CCR), segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), é o terceiro

tipo de câncer mais comum no mundo em homens e o segundo mais comum nas mulheres. Mais

da metade dos casos são provenientes de regiões mais desenvolvidas, porém mais recentemente,

a incidência de CCR tem aumentado em áreas antes consideradas de baixo risco e acredita-se

que isso se deva ao envelhecimento da população, à adoção de estilos de vida mais sedentários

e ao consumo de dietas pouco saudáveis (FRANCO; FRANCO, 2005). Essa neoplasia é

considerada de bom prognóstico se a doença for diagnosticada em estágios iniciais e apresenta

uma sobrevida de aproximadamente 55%.

No Brasil, o CCR está entre as seis neoplasias malignas mais comuns sendo o terceiro

em mortalidade no sexo masculino e o segundo no sexo feminino (desconsiderando os tumores

de pele não-melanoma). Estimam-se, para 2014, 15.070 casos novos de câncer de cólon e reto

em homens e 17.530 em mulheres (INCA, 2014) (Fig., 1.2).

DANOS NO

DNA

ANGIOGÊNES

EVASÃO DA

APOPTOSE

INVASÃOMASSA

TUMORAL METÁSTASEAUTOSSUFICIÊNCIA

EM SINAIS DE

CRESCIMENTO

CAPACIDADE

REPLICATIVA

ILIMITADA

ANGIOGÊNESE

3

Figura 1.2. Estimativa de incidência do câncer colorretal para o ano de2014 (Fonte: Instituto Nacional

de Câncer, 2014).

Entre os fatores de risco conhecidos para esta neoplasia estão a dieta (rica em gordura e

com baixa ingestão de frutas, vegetais e cereais), o estilo de vida, a predisposição genética para

doenças inflamatórias intestinais, a história familiar e a idade, visto que tanto a incidência

quanto a mortalidade aumentam de maneira proporcional à idade (VAN DEN BRANDT;

GOLDBOHM, 2006; GIL; CASALI, 2011). E os fatores protetores mais importantes são a

atividade física (SAMAD et al., 2005) e o consumo de alimentos que contêm fibra, tais como:

frutas, hortaliças (legumes e verduras) e cereais integrais (INCA, 2014).

1.2 Carcinogênese Colorretal

A carcinogênese colorretal é a melhor compreendida dentre as neoplasias humanas e se

caracteriza pelo acúmulo de mutações e alterações epigenéticas em diversos genes associados

ao câncer: supressores de tumor, oncogenes e genes de reparo de erros de pareamento do DNA

(mismatch repair – MMR), resultando em expansão clonal e acarretando a formação de lesões

neoplásicas benignas ou malignas (FUJIWARA et al., 1998). Além destas mutações, acredita-

se que um fenótipo geneticamente instável seja necessário para o desenvolvimento do tumor

(MARKOWITZ, 1999).

O desenvolvimento de tumores colorretais se dá de forma progressiva e envolve

diferentes alterações que levam a uma transformação do epitélio colônico normal em

adenomatoso intermediário e posteriormente em adenocarcinoma (modelo adenoma –

carcinoma proposto por Fearon e Vogelstein) (GRADY; PRITCHARD, 2013) (Fig., 1.3).

4

Figura 1.3. Modelo Adenoma – Carcinoma. A carcinogênese colorretal está associada a três diferentes

vias de instabilidade. A via de instabilidade cromossômica (CIN) é caracterizada pela aquisição de

mutações no gene supressor tumoral APC, levando à sua “downregulação”, frequentes mutações de

ativação do oncogene K-RAS nos estágios iniciais da progressão tumoral, perda de heterozigosidade no

cromossomo 18q nos estágios mais avançados e mutação no gene supressor de tumor TP53. Em

contraste, tumores esporádicos com instasbilidade de microssatélites (MSI) frequentemente adquirem

mutações no oncogene BRAF, associadas com a metilação do promotor do gene de reparo MLH1 e

tumores associados com a Síndrome de Lynch, a MSI se dá por mutações em um dos genes do sistema

de reparo MMR. A via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) está associada com a hipermetilação

de promotores gênicos onde se encontram a maioria das ilhas CpG. Adaptado de GRADY;

PRITCHARD, 2013.

Três vias de instabilidade genômica e epigenética têm sido associadas com a

carcinogênese colorretal: a via da instabilidade cromossômica (CIN), da instabilidade de

microssatélites (MSI) e a via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) (GRADY;

PRITCHARD, 2013).

O fenótipo CIN é a forma mais comum de instabilidade genética, sendo associada a mais

de 85% dos casos de câncer colorretal (GRADY; CARETHERS, 2008; IMAI; YAMAMOTO,

2008). É caracterizada pela presença de alterações cromossômicas numéricas, múltiplas

alterações estruturais e o acúmulo de mutações somáticas em oncogenes como K-ras e genes

supressores de tumor como APC e TP53 (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Estudos mostram que

instabilidade cromossômica promove a progressão tumoral através do aumento da diversidade

clonal (GRADY, 2004) e é um marcador de pior prognóstico em CCR (POPAT et al., 2005;

WALTHER et al., 2008).

VIA CIN/MSS

VIA MSI

VIA CIMP

INATIVAÇÃO DOS

GENES MMR

EPITÉLIO

NORMAL

EPITÉLIO

DISPLÁSICO

ADENOMA

GRANDE

ADENOMA

PEQUENO CÂNCER

CÂNCER

METASTÁTICO

APC

K-RAS/

BRAF TP53

PERDA

DE 18q

5

A MSI ocorre em aproximadamente 15% dos casos de câncer colorretal e tumores com

essa instabilidade apresentam um cariótipo normal e um melhor prognóstico quando

comparados com tumores apresentando fenótipo CIN (POPAT et al., 2005; WALTHER et al.,

2008). Esse fenótipo está associado com pequenas inserções e deleções em sequências

repetitivas do genoma, conhecidas como microssatélites (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Os

mecanismos relacionados ao desenvolvimento deste fenótipo envolvem a inativação de genes

da família MMR tanto por metilação do DNA como por mutações somáticas (GRADY, 2004)

(Fig., 1.4). Indivíduos com câncer colorretal hereditário não-poliposo (HNPCC), também

conhecido como Síndrome de Lynch (SL), desenvolvem câncer colorretal MSI+ devido a

mutações na linhagem germinativa em um dos genes do sistema MMR. Em contraste, nos

tumores colorretais esporádicos a MSI se dá pelo silenciamento do gene MLH1- um dos genes

do sistema MMR - através da metilação do promotor (KANE et al., 1997).

Figura 1.4. Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI. Adaptado de BOLAND;

GOEL, 2010.

SÍNDROME DE LYNCH CRC ESPORÁDICO

(CIMP POSITIVO)

IINATIVAÇÃO DOS GENES MMR

SEGUNDO HIT (MUTAÇÃO,

DELEÇÃO E METILAÇÃO)

HIPERMETILAÇÃO DO

GENE MLH1 DO GENE

MLH1

MUTAÇÕES GERMITATIVAS E

EPIMUTAÇÕES NOS GENES MMR

MSI

MUTAÇÃO NO GENE K-ras

MUTAÇÕES FRAMESHIFT EM

GENES COM REPETIÇÕES

MICROSSATÉLITES

OUTRAS MUTAÇÕES

CÂNCER COLORRETAL

METILAÇÃO NO DNA

MUTAÇÃO NO GENE β-

CATENINA

MUTAÇÃO NO GENE BRAF

6

Alguns estudos mostram que estas duas vias (CIN e MSI) não são mutualmente

exclusivas, pois existem casos de CCR apresentando os dois fenótipos (CIN+/MSI+) (JONES

et al., 2005).

A instabilidade epigenética em CCR ocorre com a hipermetilação de promotores

gênicos, onde se encontram a maioria das ilhas CpG e a hipometilação global do genoma.

Aproximadamente 20% dos casos de CCR apresentam uma alta proporção de CpG com padrão

de metilação aberrante. Os mecanismos associados a CIMP ainda não são bem compreendidos,

mas alguns estudos sugerem uma associação entre a ativação do oncogene BRAF e a patogênese

de CCR CIMP+ (WEISENBERGER et al., 2006; BARAULT et al., 2008).

Além das vias de instabilidade, o acúmulo de mutações em genes específicos e a

consequente desregulação de vias de sinalização que controlam o desenvolvimento e a

progressão tumoral, também são fundamentais para o entendimento da patogênese do câncer

colorretal. As principais vias de sinalização associadas com o CCR são: a via Wnt/β-catenina,

a via do TGF- β, a via MAPK e a via PI3K (SIENA et al., 2009; WALTHER et al., 2009).

1.3 Padrões de CCR

O CCR é uma doença que atinge indiscriminadamente homens e mulheres e geralmente,

apresenta três padrões distintos: esporádico, hereditário e familial (Fig., 1.5).

A forma esporádica da doença, sem nenhuma predisposição hereditária ou familial,

representa cerca de 80% dos casos de CCR (DANTAS et al., 2009), e é comum em pessoas

com mais de 60 anos de idade. Nesses casos, os danos ao DNA são causados pela interação

com fatores ambientais (exposição a substâncias carcinogênicas e radiações) ou pelos efeitos

da idade, resultando numa instabilidade genômica através do acúmulo de múltiplas mutações

somáticas em uma célula.

O CCR hereditário decorre principalmente da existência de uma mutação na linhagem

germinativa em um gene de predisposição ao câncer. Os portadores herdam de um dos pais uma

mutação deletéria, geralmente em um gene supressor de tumor. As síndromes hereditárias

representam cerca de 10% de todos os casos de CCR, e nesse grupo, a síndrome mais comum

é a SL, sendo responsável por aproximadamente 5% de todos os diagnósticos de CCR (LYNCH

et al., 2005).

7

Outras síndromes hereditárias possuem um risco aumentado de desenvolver CCR, tais

como a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) e suas variantes (a FAP atenuada, a síndrome

de Gardner e síndrome de Turcot), a síndrome de Peutz-Jeghers, a polipose associada ao gene

MYH, o CCR tipo X, entre outras.

A Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) é uma síndrome com herança autossômica

dominante causada por mutações no gene supressor tumoral APC (Adenomatous Polyposis

Coli) em linhagens germinativas, tendo como principal característica clínica o surgimento de

múltiplos pólipos adenomatosos no cólon e/ou reto ainda na adolescência (LINDOR;

GREENE,1998) além de uma variedade de lesões extracolônicas. A FAP é uma síndrome rara,

sendo responsável por menos de 1% de todos os casos de CCR. Há ainda variantes da FAP, tais

como a síndrome de Gardner, que inclui a polipose colônica e duodeno-gástrica, além do

desenvolvimento de tumores desmóides e osteomas; a síndrome de Turcot, caracterizada pelo

desenvolvimento de tumores no SNC além do fenótipo típico da FAP e a FAP atenuada

(APAF), causada por mutações no gene APC em linhagens germinativas, sendo caracterizada

pela presença de menos de 100 pólipos adenomatosos com surgimento numa idade mais tardia,

aproximadamente 40 anos (SWATI; DENNIS, 2012).

A síndrome de Peutz-Jeghers (PJS) é causada por mutações no gene STK11 em

linhagens germinativas, que apresenta múltiplas funções incluindo a regulação do ciclo celular,

apoptose e polaridade celular. É caracterizada por lesões hipercrômicas palmares, plantares e

de mucosas que coexistem com os pólipos intestinais do tipo hamartoma, além de uma alta taxa

de tumores extracolônicos, incluindo tumores gástricos, de mama, pulmão, entre outros

(BEGGS et al., 2010).

Há também a polipose associada ao gene MYH (também chamado de MutYH), que está

envolvido no reparo de danos oxidativos no DNA. É uma síndrome autossômica recessiva,

caracterizada por múltiplos pólipos adenomatosos que são os precursores mais comuns do CCR

e também por pólipos serrilhados (SWATI; DENNIS, 2012). A síndrome da Polipose Juvenil

Familiar (JPS) que é uma doença rara, caracterizada pela presença de múltiplos pólipos

hamartomatosos juvenis localizados no cólon e reto, manifestando-se na infância

(WANDERLEY et al., 2009).

O termo CCR Familial tipo X (FCCTX) foi proposto por Lindor et al em 2005 para

descrever famílias que preenchiam o critério de Amsterdam I, mas apresentavam CCR com

estabilidade de microssatélites (MSS). Os membros da família que preenchiam os critérios

8

FCCTX apresentavam um risco aumentado de desenvolver CCR, porém o risco se tornava

menor quando comparados com famílias com CCR apresentando um fenótipo de alta

instabilidade de microssatélites (MSI-H). Famílias FCCTX apresentam um padrão de

transmissão autossômico dominante mas as bases genéticas dessa síndrome ainda não foram

estabelecidas (SWATI; DENNIS, 2012).

A terceira forma de CCR é o familial, que representa cerca de 10 a 20% de todos os

casos de câncer colorretal (VETTORE; CABALLERO, 2004). Nas famílias afetadas,

observam-se agregados de câncer que impedem a classificação desses casos como esporádicos,

mas a distribuição e características desses tumores não seguem o padrão observado nas

síndromes hereditárias. Nesse subgrupo de famílias, é encontrada uma associação entre fatores

ambientais e genéticos ainda pouco conhecidos, incluindo polimorfismos específicos e

mutações em genes de risco (ROCHA, 2005).

Figura 1.5. Diagnósticos diferenciais para o CCR. Adaptado de World Gastroenterology

Organisation (WGO), 2007.

1.4 Síndrome de Lynch

A Síndrome de Lynch é uma doença genética autossômica dominante com penetrância

de 80% causada por uma deficiência do sistema de reparo de malpareamento do DNA (Sistema

MMR). Nessa síndrome, os indivíduos afetados herdam uma mutação em um dos alelos destes

genes (mutação na linhagem germinativa), e uma mutação somática leva a inativação do outro

9

alelo (SANTOS et al., 2012), com consequente acúmulo de erros na replicação do DNA,

aumento da taxa de mutações e aceleração do processo carcinogênico.

Os primeiros relatos sobre a SL ocorreram em 1913, quando Warthin reportou pela

primeira vez o caso de uma família com predisposição para desenvolver câncer gastrointestinal

e ginecológico, sendo chamada de Família G e o seu pedigree foi usado como modelo para

identificar outras famílias com fenótipo similar. Em 1966, Henry Lynch descreveu duas

famílias (Família N e Família M) que apresentavam agregados tumorais similares, e atribuiu

essa característica a uma “síndrome de câncer familial” de origem autossômica dominante. O

termo Síndrome de Lynch foi criado em 1984 e foi subdividido em SL I e II para distinguir

famílias com predisposição somente ao CCR daquelas com predisposição a tumores adicionais,

respectivamente. (BOLAND; TRONCALE, 1984). Os primeiros dados moleculares da

síndrome começaram a surgir em 1993, onde foram identificados dois loci de suscetibilidade

ao câncer no cromossomo 2p, (PELTOMÄKI et al., 1993) e 3p (LINDBLOM et al., 1993).

Inicialmente a alteração molecular observada nos pacientes com a Síndrome de Lynch foi

chamada de fenótipo de erro de replicação (RER) e atualmente essa característica é chamada

de instabilidade de microssatélites (MSI) (THIBODEAU; BREN; SCHAID, 1993; DE LA

CHAPELLE et al.,2003). A associação entre a instabilidade de microssatélites em tumores

colorretais e defeitos no sistema MMR foi feita através de estudos genéticos feitos em bactérias

e leveduras (BOLAND, 2005).

1.4.1 Características clínicas

Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade

precoce (aproximadamente 45 anos), com predominância no cólon direito (proximal) (WEI et

al., 2011), além de possuírem um risco aumentado de desenvolver múltiplos tumores

sincrônicos (18% dos casos) ou metacrônicos (50% dos casos) e tumores extracolônicos, como,

por exemplo, tumores de endométrio e, com menores ricos, carcinoma de intestino delgado,

tumores no trato biliar, tumores urinários, câncer de ovário, tumores gástricos, câncer de

estômago, tumores cerebrais e tumores de glândulas sebáceas (LYNCH; DE LA CHAPELLE,

2003).

Os tumores na SL têm como características histopatológicas o excesso de muco

(carcinomas mucinosos), são pouco diferenciados, com células em anel de sinete e diploides.

Apresentam um comportamento menos agressivo, com menor potencial metastático e melhor

resposta à quimioterapia tendo assim melhor prognóstico do que os CCRs esporádicos e,

10

possivelmente, isso se deve ao excesso de infiltrado linfocitário envolvendo a lesão

(ALEXANDER et al., 2001; SMYRK et al., 2001).

Os indivíduos afetados não apresentam os múltiplos pólipos adenomatosos vistos na

FAP, o que dificulta a identificação clínica dos portadores da doença (ROSSI, 2009).

1.4.2 Critérios de diagnóstico

A história familiar foi um dos primeiros métodos para identificar pacientes em risco

(KASTRINOS; STOFFEL, 2014), já que estudos epidemiológicos mostraram que indivíduos

com familiares de primeiro grau com CCR têm um risco maior em desenvolver a doença

(COURA; ASHTON-PROLLA; PROLLA, 2005).

Em 1990, o International Collaborative Group on HNPCC (atualmente denominado

Intenational Society of Gastrointestinal Hereditary Tumors – InSiGHT) propôs a criação de

critérios para o diagnóstico clínico da síndrome (Critérios de Amsterdã I) (VASEN et al., 1991).

Os critérios de Amsterdã I (Quadro I.I) levam em consideração a história familiar do paciente

e a idade no diagnóstico, porém não incluem tumores extracolônicos, tornando-os

extremamente restritivos. Por esses motivos, os critérios de Amsterdã I foram reformulados em

1999 para a inclusão de outros tumores (Critérios de Amsterdã II) (Quadro I.II).

Como nem todos os pacientes com mutações em linhagens germinativas nos genes

MMR preenchem os critérios de Amsterdã, foram também estabelecidos critérios de suspeição

para a síndrome (Critérios de Bethesda I e II), que são muito mais sensíveis e servem para

identificar indivíduos candidatos a testes de rastreamento (SANTOS et al., 2012) (Quadro

I.III).

Quadro I.I. Critérios de Amsterdam I.

I. Famílias com 3 casos de CCR em que 2 dos indivíduos afetados são parentes de

1º grau do terceiro;

II. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações;

III. Famílias com 1 caso de CCR <50 anos de idade;

IV. Exclusão do diagnóstico de FAP.

11

Quadro I.II. Critérios de Amsterdam II

Quadro I.III. Critérios de Bethesda Modificados

I. Três ou mais familiares com neoplasia associada à SL (CCR ou câncer de endométrio,

intestino delgado, estômago, hepatobiliar, de pelve renal e ureter), sendo um parente de

1º grau dos outros dois;

II. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações;

III. Famílias com 1 ou mais casos de CCR diagnosticados antes dos 50 anos de idade.

Pelo menos um dos seguintes critérios:

I. CCR diagnosticado antes dos 50 anos de idade;

II. Presença de CCR sincrônico ou metacrônico, ou outro tumor do espectro Lynch

independentemente da idade;

III. CCR com histologia sugestiva de alta instabilidade de microssatélites antes dos 60

anos de idade;

IV. Probando com CCR e um ou mais familiares de 1º grau com tumor do espectro

Lynch sendo um dos tumores diagnosticado antes dos 50 anos;

V. Probando com CCR e dois ou mais familiares de 1º ou 2º grau com tumores do

espectro Lynch diagnosticados em qualquer idade.

12

1.4.3 Testes genéticos de rastreamento

Quando uma família preenche os critérios de Bethesda, existe indicação para realização

de testes genéticos do tecido tumoral, como a análise de instabilidade de microssatélites (MSI)

e o teste de imunohistoquímica (IHQ) (BURT et al., 2007). Se um ou ambos os testes derem

positivo é necessária a realização de análise de mutação genética nos genes MMR.

O teste de MSI apresenta uma sensibilidade de quase 100% e é positivo mesmo nos

casos em que a mutação nos genes MMR não é conhecida. No entanto, sua especificidade é

baixa, já que a MSI não é exclusiva da SL (LIVING, 2008).

O procedimento padrão para análise e identificação da instabilidade de microssatélites

proposto pelo InSiGHT, é o uso de cinco marcadores de microssatélites comparativamente entre

o tecido normal e tumoral. Dois destes são repetições mononucleotídicas (BAT25 e BAT26) e

os demais são repetições dinucleotídicas (D2S123, D5S346 e D17S250) (BOLAND et al.,

1998). Baseado no número de marcadores apresentando instabilidade, os tumores são

classificados em três grupos: alta instabilidade (MSI-H) para os que apresentam dois ou mais

marcadores instáveis (≥30-40%); baixa instabilidade (MSI-L), para os com apenas um

marcador instável (<30%); e estável (MSS) quando não apresenta nenhum marcador instável

(KASTRINOS; STOFFEL, 2014). De forma a aumentar a sensibilidade e especificidade do

teste, foram incluídos outros marcadores mononucleotídicos para detecção de MSI-H, como

NR-21, NR-24, e MONO-27 (BACHER et al., 2004).

O teste de IHC usa anticorpos monoclonais produzidos contra as proteínas codificadas

pelos vários genes do sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). A ausência de uma destas

proteínas no tecido tumoral pode ser indicadora de uma mutação na linhagem germinativa.

Porém, este teste pode gerar falsos positivo nos casos em que se têm proteínas truncadas e

inativas, sendo reconhecidas de forma errônea pelos anticorpos (COURA; ASHTON-

PROLLA; PROLLA, 2005).

A complementação da análise de genes MMR por sequenciamento completo das regiões

codificantes para identificação de mutações pontuais é atualmente a abordagem mais completa

para identificação de mutações e diagnóstico da SL (WAGNER et al., 2003; van der KLIFT et

al., 2005). Até recentemente, o sequenciamento de Sanger, ou de terminação de cadeia, foi o

método dominante e padrão ouro para o sequenciamento de DNA. Porém, o sequenciamento

de nova geração (Next Generation Sequencing - NGS) tem ganhado espaço, pois além

13

sequenciar milhões de fragmentos de DNA ao mesmo tempo, apresenta uma redução

impressionante no custo por megabase. Portanto, as tecnologias de sequenciamento de nova

geração, incluindo o sequenciamento total do genoma e o sequenciamento das regiões exônicas,

têm permitido a introdução de novas abordagens para facilitar a identificação de novos genes

responsáveis pela predisposição de doenças humanas, incluindo o câncer (JURADO et al.,

2014).

Uma combinação de abordagens de rastreamento para identificação do defeito MMR e

diagnóstico de mutações em linhagens germinativas tem sido utilizada por muitos

investigadores por ser considerada a abordagem mais custo-efetiva (PROLLA, 2010) (Fig.,

1.6).

Figura 1.6. Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR. Adaptado de

PROLLA, 2010.

AVALIAÇÃO DO HEREDOGRAMA:

SÍNDROME DE LYNCH

CRITÉRIOS DE AMSTERDAM

DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE

HNPCC

QUAL GENE MMR MUTADO?

SEQUENCIAMENTO GENE (S)

MMR SELECIONADO (S)

IHQ

IHQ

CRITÉRIOS DE BETHESDA

AUSÊNCIA PRESENÇA

MSI

POSITIVO NEGATIVO QUAL GENE

MMR

ALTERADO?

METILAÇÃO

NÃO METILADO METILADO

ENCERRAR

INVESTIGAÇÃO

14

1.4.5 Bases genéticas da SL

Apesar de sete genes terem sido associados com a SL (MSH2, MLH1, MSH6, PMS1,

PMS2, MLH3 e EXO1), a grande maioria dos pacientes com o fenótipo clínico apresenta

mutações em apenas quatro deles: MLH1 (mutL homolog 1) (40%), MSH2 (mutS homolog 2)

(50%), MSH6 (mutS homolog 6) (7%) e PMS2 (postmeiotic increased 2) (3-5%) (GROVER et

al., 2009).

A inativação mutacional dos genes MMR leva a um reparo insuficiente do DNA e ao

desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos níveis MSI, e esta é uma característica

encontrada em mais de 95% dos CCRs associados à SL (NAGASAKA et al., 2010).

Mais de 513 alterações diferentes em genes MMR já foram descritas, entretanto, muitas

vezes essas alterações são consideradas como variantes não classificadas (UV), pois suas

consequências funcionais e clínicas são desconhecidas, não podendo ser facilmente

classificadas como patogênicas ou neutras (BRYONY et al., 2012; STEINKE et al., 2013).

(Fig., 1.7). Segundo Santos e colaboradores (2012), a maioria das mutações nos genes de reparo

em pacientes com SL, gera uma proteína truncada e não funcional.

Figura 1.7. Espectro mutacional dos genes MMR. Adaptado de STEINKE et al., 2013.

MSH2

PATOGÊNICA

15

1.5 Vias de reparo de DNA

A manutenção da integridade genômica e a adaptação a estresses genotóxicos são

elementos fundamentais para garantir a sobrevivência de um organismo. O DNA pode sofrer

alterações por diferentes agentes, tanto endógenos, causados por alterações espontâneas

decorrentes da instabilidade das ligações químicas da molécula ou por alterações causadas por

produtos do metabolismo celular, quanto exógenos, associados a fatores ambientais. Frente a

estas lesões, uma complexa resposta celular é ativada com a finalidade de se preservar a

estabilidade genômica. A resposta ao dano no DNA envolve a detecção do sítio lesionado, a

amplificação do sinal através de uma cascata de proteína cinases e a ativação de uma série de

efetores que promovem uma resposta celular específica (apoptose, parada do ciclo celular,

senescência) (MÉNDEZ-ACUÑA et al., 2010)

As vias de reparo do DNA são responsáveis pelo processamento de diferentes tipos de

dano e são essenciais para evitar o acúmulo de mutações e garantir a transmissão acurada da

informação genética. Dependendo do tipo de lesão no DNA, diferentes proteínas são recrutadas

para reconhecer e processar o dano. Existem cinco vias principais de reparo do DNA: (i) reparo

por excisão de bases (ou BER, do inglês Base-Excision Repair) (ROBERTSON et al., 2009);

(ii) reparo por excisão de nucleotídeos (ou NER, do inglês Nucleotide-Excision Repair)

(NOUSPIKEL, 2009); (iii) reparo de erros de pareamento (ou MMR, do inglês Mismatch

Repair) (HSIEH; YAMANE, 2008); (iv) reparo por recombinação homóloga (ou HR, do inglês

Homologous Recombination) (NOWOSIELSKA, 2007) e (v) reparo por recombinação não-

homóloga (ou NHEJ, do inglês Non-Homologous End Joining) (MAHANEY; MEEK; LEES-

MILLER, 2009).

1.5.1 Sistema MMR

O sistema de reparo MMR é altamente conservado ao longo da evolução e é essencial

para a estabilização do genoma tanto em procariotos quanto em eucariotos (SUNG-HOON;

KIM; BAN, 2006). Este sistema corrige erros de pareamento base\base, além de inserções e

deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo de

replicação (OLLILA et al., 2008), além de estar envolvido nos processos de recombinação, na

geração da diversidade imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA, como, por

exemplo, danos causados por agentes alquilantes. (WARREN et al., 2007) (Fig., 1.8).

16

Figura 1.8. Diferentes funções das proteínas de reparo MMR. Adaptado de SUNG-HOON et al., 2006.

O reparo de erros de pareamento consiste no reconhecimento da base mal pareada,

causando distorção na dupla fita de DNA, excisão do segmento de DNA que contém o erro

através da ação de exonucleases específicas e a síntese da região removida utilizando a fita

parental como molde, através da ação das enzimas DNA polimerase e ligase (IYER et al.,

2006).

O sistema MMR reconhece com eficiência a maioria dos erros, retirando-os do genoma

recém-replicado. É necessário que haja uma coordenação entre o MMR e a replicação do DNA,

para que seja feito o direcionamento do reparo à fita recém sintetizada (BOWERS et al., 2001).

Os primeiros estudos com os genes mismatch foram desenvolvidos na bactéria

Escherichia coli (E. coli), onde os componentes essenciais do sistema MMR – MutS, MutL,

MutH e Uvr – foram identificados pela primeira vez através de estudos genéticos de mutantes

(COX; DEGNEN; SCHEPPE, 1972; WAGNER; MESELSON, 1976). O homodímero MutS

liga-se de forma inespecífica à molécula de DNA em busca do mismatch. Quando o erro é

reconhecido, a proteína perde afinidade pela molécula de ADP, sofre uma mudança

conformacional que permite sua ligação ao homodímero MutL formando um complexo ternário

dependente de ATP. A formação deste complexo estimula a atividade endonuclease do

homodímero MutH, que se liga ao sítio GATC hemi-metilado na fita recém sintetizada e quebra

a molécula de DNA tanto na posição 5´quanto na 3´do malpareamento. Além disso, há o

DIVERSIFICAÇÃO

DE ANTICORPOS

RESPOSTA A

DANOS NO DNA

REPARO DE

ERROS NA

REPLICAÇÃO

REGULAÇÃO DA

RECOMBINAÇÃO

PROMOÇÃO DO

CROSSING OVER

MEIÓTICO

PROTEÍNAS

MMR

17

recrutamento de helicases UvrD que se ligam na fita contendo a quebra e impedem que o DNA

duplex se enrole, enquanto o reparo não é feito. Isso permite a ação de diferentes exonucleases,

que digerem o DNA nas direções 5´- 3´ e 3´- 5´. A ação exonucleolítica acaba no momento em

que o erro é removido. O reparo é corrigido pela DNA polimerase III e o processo é finalizado

pela DNA ligase (JIRICNY, 2006).

A complexidade da via MMR nos organismos eucarióticos é maior que a encontrada em

procariotos, de modo que há ainda muitas dúvidas quanto aos detalhes do processo de reparo.

As poucas informações que se têm a respeito dos mecanismos MMR em eucariotos são

derivadas, principalmente, de estudos feitos com DNA circular heteroduplex de extratos de

células de mamíferos. Estes estudos indicam que a sequência de eventos que ocorrem durante

o processo de reparo é ditada por interações entre diferentes proteínas e o DNA heteroduplex

(MODRICH, 2006).

Todos os organismos eucarióticos, apresentam componentes homólogos dos complexos

MutS (MSHs) e MutL (MLHs), porém, em contraste com os encontrados nas bactérias, os

componentes eucarióticos funcionam como heterodímeros. Estudos feitos em levedura não

encontraram similares aos complexos MutH e Uvr, indicando que provavelmente não existem

homólogos para estas duas proteínas no genoma de eucariotos (HAFE; ROBERTSON, 2000).

Em eucariotos, os componentes do sistema MMR formam três subunidades proteicas

principais: MutSα (MSH2 + MSH6), que reconhece os erros base/base e pequenos loops de

inserção/deleção (IDLs) envolvendo um ou dois nucleotídeos, MutSβ (MSH2 + MSH3), que

reconhece grandes IDLs e MutLα (MLH1 + PMS2), que age como um mediador entre o

complexo MutS e as outras proteínas que participam do processo de reparo (PELTOMÄKI,

2003; EDELBROCK; KALIYAPERUMAL; WILLIAMS, 2012;) (Fig., 1.9).

As interações protéicas já documentadas nesse sistema incluem os seguintes pares de

moléculas: MutSα – MutLα, MutSα – PCNA, MutSβ – PCNA, MutLα – PCNA, MutSα – ExoI,

MutLα – ExoI, ExoI – PCNA e PCNA – polimerase δ. Com exceção das interações MutSα -

ExoI e entre PCNA – polimerase δ, o significado destas outras interações no reparo de erros de

pareamento ainda não foi estabelecido (MODRICH, 2006).

Em contraste com a E. coli, onde o reparo é direcionado pela ausência transitória de

metilação na adenina presente no sítio GATC da fita recém-sintetizada (hemi-metilação), os

18

sinais que direcionam o processo de reparo em eucariotos ainda não foram identificados (DA

SILVA et al., 2009).

Figura 1.9. MMR em eucariotos. (A) O complexo MutSα (MSH2-MSH6) reconhece erros base/base,

além de pequenas alças de inserção e deleção durante a síntese de DNA. Esse processo necessita de

mudança de ligação do ATP para o ADP pela proteína MSH2, seguido pelo recrutamento do complexo

MutLα (MLH1-PMS2). (B) Nas etapas seguintes de excisão e ressíntese, tem sido sugerida a

participação de diferentes proteínas como PCNA, DNA polimerase δ/ε, helicase I e exonuclease I para

remover o mismatch da fita recém-sintetizada. (C) Já o complexo MutSβ (MSH2-MSH3), reconhece

grandes alças de inserção e deleção (IDLs), seguido também, pelo recrutamento do complexo MutLα

(MLH1-PMS2) para remoção do mismatch. Adapatado de BOLAND; GOEL, 2010.

1.6 MSH2

O gene MSH2 está localizado no braço curto do cromossomo 2 na posição 2p22-p21

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4436; National Center for Biotechnology Information,

2012), mais precisamente entre os pares de bases 47.630.262 – 47.710.359, e possui 16 éxons

(http://www.med.mun.ca/MMRvariants/thegenes.aspx) (Fig., 1.10).

Figura 1.10. Localização do gene MSH2 no cromossomo 2

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4436

19

A proteína MSH2 apresenta 934 aminoácidos e 5 domínios estruturais conservados:

domínio 1 ou “mismatch binding” (1 – 124 resíduos de aminoácidos); domínio 2 ou “conector”

(125 – 297 resíduos de aminoácidos); domínio 3 ou “lever” (300 – 456 e 554 – 619 resíduos

de aminoácidos); domínio 4 ou “clamp” (457 – 553 resíduos de aminoácidos) e o domínio 5

ou ATPase (620 – 855 resíduos de aminoácidos) (WARREN et al., 2007; NEGUREANU;

SALSBURY, 2012) (Fig., 1.11). Esta proteína é estabilizada através da interação com as

proteínas MSH6 e MSH3, permitindo assim, que ela atue em substratos variados e vias diversas.

Figura 1.11. Modelo estrutural do heterodímero MutSα, mostrando o DNA (azul claro), domínio de

ligação (vermelho), domínio conector (amarelo), domínio lever (verde), domínio clamp (roxo) e

domínio ATPase (azul escuro). Adapatado de NEGUREANU; SALSBURY, 2012.

O gene MSH2 é responsável por aproximadamente 50% das mutações conhecidas,

associadas à SL. Dentro do espectro de mutações que são encontradas no gene: 10% são

mutações que envolvem a substituição de um aminoácido, em alguns casos gerando uma

proteína truncada e não funcional; 20% são grandes rearranjos gênicos, como deleções e

duplicações além de alterações nos sítios de splicing e mutações sinônimas (RUMILLA et al.,

2011). Alguns estudos mostram que o gene MSH2 também pode sofrer inativação através de

alterações epigenéticas (NAGASAKA et al., 2010; RUMILLA et al., 2011) e mutações

pontuais na região promotora (IWAHASHI et al., 1988).

20

Deleções na linhagem germinativa da região 3´ do gene EPCAM (Epithelial Cell

Adhesion Molecule), também conhecido como TACSTD1, localizado aproximadamente 16-Kb

acima do gene MSH2, tem sido associadas com a hipermetilação da região promotora desse

gene de reparo, com consequente ausência da sua proteína. Esse mecanismo ocorre em

aproximadamente 20% dos casos de CCR, em que há perda da proteína MSH2 sem que uma

mutação na linhagem germinativa seja identificada (RUMILLA et al., 2011; BANSIDHAR;

SILINSKY, 2012).

Segundo Iwahashi e colaboradores (1998), a região essencial para a atividade basal do

promotor de MSH2 é composta por um fragmento contendo 282 pb, abrangendo desde o

nucleotídeo -298 até o nucleotídeo -17. Esta região apresenta elementos de ativação em cis que

servem como sítios de ligação para diferentes fatores de transcrição (Fig., 1.12).

Figura 1.12. Região promotora do gene MSH2: contendo 282 pb (-298 nt até -17 nt). As sequencias

sublinhadas representam os sítios de ligação para os diferentes tipos de fatores de transcrição. Na posição

+1 está indicado o códon de início ATG.

Estudos genéticos e bioquímicos mostram que a proteína MSH2 é necessária para todos

os tipos de reparo de malpareamento do DNA (SUNG-HOON; KIM; BAN, 2006), portanto,

estudos sobre a incidência de mutações na linhagem germinativa nesse gene contribuirão para

um melhor entendimento do impacto do diagnóstico para os pacientes e familiares com SL.

21

1.7 Estudos brasileiros sobre a SL

A SL é a síndrome hereditária mais comum na espécie humana, com incidência entre

1:2.000 e 1:660 indivíduos (DE LA CHAPELLE, 2005). Portanto, é fundamental que os

pacientes em risco e seus familiares realizem programas de rastreamento.

São poucos os estudos no Brasil que descrevem o genótipo de indivíduos brasileiros

com a SL, seja aqueles com critérios diagnósticos (Amsterdam) ou de suspeição (Bethesda)

para a síndrome. A maioria dos estudos sobre a incidência e identificação de variantes genéticas

nos genes do sistema MMR é de origem europeia, americana e asiática. O espectro mutacional

desta síndrome é bastante variado, incluindo mutações “nonsense”, “frameshift” e

predominantemente mutações “missense”. Entretanto, grandes rearranjos gênicos e variantes

de sítios de splicing constituem <10% das alterações encontradas. Mutações fundadoras,

também têm sido identificadas em diferentes populações, contribuindo significantemente para

a predisposição da doença e direcionando os testes genéticos (DOMINGUEZ-VALENTIN et

al., 2013).

O primeiro estudo realizado no Brasil (ROSSI et al., 2002) com pacientes do Hospital

AC Camargo, descreveu a frequência de mutações na linhagem germinativa nos genes de reparo

MLH1 e MSH2 em 25 famílias brasileiras preenchendo os critérios de Amsterdam e de

Bethesda. O mesmo grupo publicou em 2004 um estudo que relatava que os tumores

extracolônicos mais frequentes em famílias brasileiras com SL eram o de endométrio em

mulheres e o câncer gástrico em homens.

Outros estudos foram publicados a partir de outras Instituições brasileiras (COSSIO et

al., 2010; DA SILVA et al., 2010), também relacionando genótipo – fenótipo em pacientes

brasileiros com SL. Porém, os dados disponíveis se limitam ao estudo de mutações e

características fenotípicas em pequenas séries de famílias com SL. A exata frequência de

deficiência do sistema MMR e a prevalência de mutações na linhagem germinativa nos genes

MMR não são conhecidas para famílias de diferentes regiões brasileiras (PROLLA, 2010).

22

OBJETIVOS

2.1 GERAL

Identificar variantes de sequência no gene MSH2 em pacientes selecionados para

Síndrome de Lynch de acordo com os critérios de Amsterdam ou Bethesda modificados,

avaliando a sensibilidade e especificidade dos mesmos para a presença de mutação.

2.2 ESPECÍFICOS

Relacionar as alterações do gene MSH2 encontradas na população brasileira com as

alterações já descritas na literatura para o gene;

Descrever o perfil de variações em MSH2 com respeito a sua associação com a

Síndrome de Lynch: mutações nonsense, mutações missense, mutações sinônimas,

polimorfismos e variações de valor diagnóstico desconhecido. Avaliar se as alterações

encontradas no gene MSH2 são polimorfismos comuns na população, comparando

com dados da literatura;

Avaliar a presença de diferentes mutações em diferentes centros de tratamento de

câncer: INCA, HCPA, AC.Camargo e HUJJB.

Avaliar a utilização de sequenciamento de nova geração (NGS) como estratégia para

identificação de variações em MSH2.

23

METODOLOGIA

3.1 Pacientes

Neste estudo foram incluídos 53 pacientes diagnosticados com câncer colorretal, sendo

31 (58,5%) do sexo feminino e 22 (41,5%) do sexo masculino. Os candidatos ao estudo foram

selecionados a partir de quatro centros clínicos pertencentes a quatro regiões Brasileiras - todos

hospitais públicos universitários e/ou centros de atendimento de pacientes do SUS: Instituto

Nacional de Câncer (INCA) (Rio de Janeiro), Hospital AC Camargo (São Paulo), Hospital de

Clínicas de Porto Alegre (HCPA) (Rio Grande do Sul) e Hospital Universitário João de Barros

Barreto (HUJJB) (Belém do Pará).

Foram recrutados 25 pacientes preenchendo critérios de Amsterdam e 28 pacientes

preenchendo critérios de Bethesda modificados, todos não relacionados, e preenchendo os

seguintes critérios de inclusão: indivíduos de ambos os sexos, que tenham sido diagnosticados

com câncer colorretal, com história familial compatível com os critérios de Amsterdam I ou II

ou com os critérios de Bethesda modificados, com idade superior a 18 anos, e aceitaram

voluntariamente a participação no estudo e que assinaram o termo de consentimento livre e

esclarecido (TCLE) específico de participação no estudo (Anexo 1). De cada paciente incluído

foram obtidos os seguintes materiais: (a) bloco de parafina contendo tumor colorretal – a partir

de peça cirúrgica e, se possível tecido colônico normal adjacente; (b) DNA genômico extraído

de sangue periférico; (c) dados clínicos e (d) heredograma de no mínimo três gerações.

Todos os participantes da pesquisa foram recrutados a partir de consultas de

aconselhamento genético e foram identificados mediante análise do heredograma. As amostras

biológicas e cópia dos formulários foram remetidos ao centro coordenador do projeto

(Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS) para posterior distribuição das

informações aos demais centros participantes. O centro coordenador ficou responsável pela

organização dos dados clínicos e pelos testes genéticos de instabilidade de microssatélites e de

imunohistoquímica.

Este projeto faz parte de um projeto maior titulado: “Diagnóstico clínico e laboratorial

da Síndrome de Lynch: um estudo de custo-efetividade e de viabilidade de implantação no

SUS”, coordenado pela Drª Patrícia Ashton-Prolla da UFRGS.

24

3.2 Testes de Rastreamento

Os testes de MSI e IHQ foram realizados no centro organizador do projeto:

Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, coordenado pela Drª Patrícia Ashton-

Prolla.

3.2.1 Teste de Instabilidade de microssatélites (MSI):

O estudo de MSI foi feito pela análise comparativa de tecido normal e tumoral (obtido

por microdissecção) utilizando a técnica de PCR multiplex com oligonucleotídeos específicos

para um painel de cinco marcadores mononucleotídicos (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-

21, NR-24) contidos no kit MSI Analysis System, versão 1.1 (Promega, Madison, WI, USA),

segundo o protocolo de Suraweera et al (2002) e Bacher et al (2004). Os produtos de PCR fita-

simples (desnaturados) foram submetidos à eletroforese capilar no sequenciador ABI PRISM

3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems), e os resultados foram analisados com o

software GeneMapper ID 3.2 Analysis Sofware. Cada locus foi classificado como MSI (+)

(MSI-H) quando 2 ou mais marcadores demonstraram instabilidade/alteração; MSI-L quando

apenas 1 marcador demonstrar instabilidade e MSI (-) (MSS) quando nenhum marcador

demonstrar instabilidade.

3.2.2 Teste de Imunohistoquímica (IHQ)

A detecção dos produtos protéicos dos genes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS2 pela

técnica de imunohistoquímica foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Kim et al

(2003), utilizando os anticorpos monoclonais contra as proteínas MLH1(Mouse Anti-MLH1

Clone 14, Zymed), MSH2 (Mouse Anti-MSH2 Clone FE11, Zymed), MSH6 (MOUSE Anti-

MSH6 Clone 44, Zymed) e PMS2 (Mouse Anti-PMS2 Clone A16-4, BD Pharmingen). A

detecção dos produtos gênicos foi realizada pelo método indireto de avidina-biotina-peroxidase,

e a visualização da reação antígeno-anticorpo foi feita com o cromógeno PicTureTM –MAX

Polymer Detection Kit (Zymed) e DAB (diaminobenzidina), contra-colorado com hematoxilina.

O tecido normal adjacente ao tumor foi utilizado como controle positivo. Coloração nuclear

positiva foi definida como: (i) Padrão 1: <5% de coloração nuclear; (ii) Padrão 2: ≥5% ≤10%

de coloração nuclear; (iii) Padrão 3: >10% de coloração nuclear. Expressão negativa da proteína

foi definida pela completa ausência de coloração nuclear no tecido tumoral (Padrão 4,

denominado de “lost”). As lâminas de IHQ foram analisadas independentemente por dois

médicos patologistas, e sem conhecimento prévio dos resultados da técnica de MSI.

25

3.3 Extração de DNA a partir de sangue periférico:

A extração de DNA genômico a partir de uma amostra de 5 ml de sangue periférico de

cada paciente, coletado em EDTA foi realizada utilizando o kit Puregene – Blood Core Kit B,

de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (Qiagen).

3.4 Estimativas da concentração e da integridade do DNA

Após a extração, o DNA genômico total extraído foi submetido à eletroforese em gel de

agarose 0,8% (Invitrogen) em tampão de corrida NaOH 1X (NaOH 10mM; H3BO3 42,5mM)

para verificar a eficiência da extração e a integridade do DNA. No preparo das amostras, 3µl

da alíquota de DNA foi acrescentado a 1µl de corante de corrida “blue green” (LGC

Biotecnologia). A eletroforese foi realizada a 4 volts/cm durante 40 minutos em uma cuba

horizontal. Após a corrida, o gel foi visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta para

confirmação da integridade de cada amostra de DNA.

Posteriormente, a concentração e a pureza do DNA das amostras foram verificadas com

o auxílio do espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific). As amostras foram ajustadas

para uma concentração final em torno de 50ng/μL e armazenadas a -20C até a sua utilização.

3.5 Amplificação do gene MSH2

A análise de mutações no gene MSH2 foi realizada pela técnica de PCR (Polymerase

Chain Reaction) utilizando aproximadamente 100ng de DNA genômico das amostras

selecionadas. E as reações de amplificação foram feitas utilizando Taq Platinum Buffer®

(Tabela 3.1).

26

Tabela 3.1: Reagentes utilizados na reação de PCR e concentração utilizada para cada reação.

3.5.1 Regiões codificantes do gene MSH2

Para amplificar os fragmentos gênicos correspondentes aos éxons 1 a 16 foram

utilizados 16 pares de oligonucleotídeos (primers) descritos por Beck et al (1997) e por Zahary

et al (2012) (Tabela 3.2).

REAGENTES

Tampão de reação 10X(Taq Platinum Buffer®) 1X

dNTPs 250M

MgCl2 1,5 a 2,5 mM (específico para cada primer)

PRIMER Foward 20pmol/reação

PRIMER Reverso 20pmol/reação

Taq platinum DNA polimerase 1U

DNA 100ng

27

Tabela 3.2: Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos éxons 1 a 16 do gene MSH2. Os primers

dos éxons 2 e 5 foram descritos por Zahary e colaboradores (2012) e os demais por Beck e colaboradores

(1997).

ÉXONS OLIGONUCLEOTÍDEOS (PRIMERS)

TAMANHO DO

FRAGMENTO

(Pares de base – pb)

TEMPERATURA

DE

PAREMANTO

(ºC)

1 (FOWARD) 5` CTTCAACCAGGAGGTGAGGAGGT 3`

(REVERSO) 5` GAAAGGAGCCGCGCCACAAG 3` 301 pb 61

2 (FOWARD) 5` GTGGAACTATAACTGTACAGTAAGC3`

(REVERSO) 5` CAGCCAAACTGCAACTTTT 3` 457 pb 50

3 (FOWARD) 5` TGTTCAAGAGTTTGTTAAATTTTT 3`

(REVERSO) 5` TGGAATCTCCTCTATGACTAGACT 3` 359 pb 52

4 (FOWARD) 5`TCTTATTCCTTTTCTCATAGTAG 3`

(REVERSO) 5`TATTGTAATTCACATTTATAATCC 3` 224 pb 47

5 (FOWARD) 5`GAAGGAACACCAAGGAAAAT 3`

(REVERSO) 5` CTGAAAAAGGTTAAGGGCTCTG 3` 273 pb 50

6 (FOWARD) 5`ATTGAGCTTGCCATTCTTTCTA 3`

(REVERSO) 5` TGCAGGTTACATAAAACTAAC 3` 220 pb 52

7 (FOWARD) 5` AATATTTTACATTAATTCAAGTTAA 3`

(REVERSO) 5` ATATATTGTATGAGTTGAAGGAA 3` 284 pb 47

8 (FOWARD) 5` AATGAGATCTTTTTATTTGTTTGTT 3`

(REVERSO) 5` ACTGCTTAAATTAAAAAGTATATTG3` 182 pb 47

9 (FOWARD) 5` GGATTTTGTCAGTTTGTTCTGTTTG 3`

(REVERSO) 5` TTCCAACCTCCAATGACCCATTC 3` 179 pb 50

10 (FOWARD) 5` ATACTTTTTCTTTTCTTCTTGATTA 3`

(REVERSO) 5` GGTTAAAAATATAATAACGACTTG 3` 210 pb 47

11 (FOWARD) 5` TTAATAAAACTGTTATTTCGATTTG 3`

(REVERSO) 5`AGCCAGGTGACATTCAGAACATTAT3` 169 pb 47

12 (FOWARD) 5` TTTCTGTTTTTATTTTTATACACG 3`

(REVERSO) 5` AAACGTTACCCCCACAAAG 3` 309 pb 50

13 (FOWARD) 5` AAACTTGCTTTCTGATATAATTTGT 3`

(REVERSO) 5`CATTTCTATCTTCAAGGGACTAGGA 3` 273 pb 52

14 (FOWARD) 5` TTCAGGTAATTATGTGCTTCA 3`

(REVERSO) 5` TACTGAATTTAGAGTACTCCAATA 3` 302 pb 50

15 (FOWARD) 5` TCTCATGCTGCTCCCTCACG 3`

(REVERSO) 5` TAAGTTAAACTATGAAAACAAACTG 3` 247 pb 50

16 (FOWARD) 5` ATTTTAATTACTAATGGGACATT 3`

(REVERSO) 5` GCTTATCAATATTACCTTCATTC 3` 246 pb 47

28

Todas as reações de amplificação foram feitas em tubos 0,2mL no volume de 50µL e as

condições de ciclagem utilizadas foram as seguintes para todos os éxons, com exceção do éxon

2: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguindo-se de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC

por 30 segundos, temperatura de pareamento entre 47ºC a 61ºC (variando para cada par de

primers) por 30 segundos, extensão a 72ºC por 30 segundos; e extensão final de 72ºC por 15

minutos. As condições para o éxon 2 foram: desnaturação inicial a 96ºC por 5 minutos; 40

ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 minuto, temperatura de pareamento de 50ºC por 1 minuto,

extensão a 72ºC por 1 minuto; e extensão final de 72ºC por 7 minutos.

As reações de PCR foram conduzidas em um termociclador Veriti® Thermal Cycler

(Applied Biosystems) e após a amplificação, os produtos finais foram armazenados a -20ºC.

3.5.2 Região promotora do gene MSH2

Para amplificar o fragmento de 282pb correspondente a região promotora do gene

MSH2 foi utilizado um par de oligonucleotídeos (primers) descritos por Beck et al (1997) e por

Iwahashi et al(1998) (Tabela 3.3). Este par de primers amplifica não só a região promotora

mas também o éxon 1 e uma parte do íntron 1, gerando um fragmento de 571pb (Fig., 3.1).

Tabela 3.3: Oligonucleotídeos utilizados para amplificar a região promotora do gene MSH2. Primer

foward descrito por Iwahashi e colaboradores (1998) e primer reverso descrito por Beck e colaboradores

(1997)

OLIGONUCLEOTÍDEOS (PRIMERS)

TAMANHO DO

FRAGMENTO

(Pares de base – pb)

PROMOTOR (FOWARD) 5` GCTGAGTAAACACAGAAA 3`

(REVERSO) 5` GAAAGGAGCCGCGCCACAAG 3` 282 pb

29

GCTGAGTAAACACAGAAAGGAGCTCTACTAAGGATGCGCGTCTGCGGGTTTCCG

CGCGACCTAGGCGCAGGCATGCGCAGTAGCTAAAGTCACCAGCGTGCGCGGGAA

GCTGGGCCGCGTCTGCTTATGATTGGTTGCCGCGGCAGACTCCCACCCACCGAAA

CGCAGCCCTGGAAGCTGATTGGGTGTGGTCGCCGTGGCCGGACGCCGCTCGGGG

GACGTGGGAGGGGAGGCGGGAAACAGCTTAGTGGGTGTGGGGTCGCGCATTTTC

TTCAACCAGGAGGTGAGGAGGTTTCGACATGGCGGTGCAGCCGAAGGAGACGCT

GCAGTTGGAGAGCGCGGCCGAGGTCGGCTTCGTGCGCTTCTTTCAGGGCATGCCG

GAGAAGCCGACCACCACAGTGCGCCTTTTCGACCGGGGCGACTTCTATACGGCGC

ACGGCGAGGACGCGCTGCTGGCCGCCCGGGAGGTGTTCAAGACCCAGGGGGTGA

TCAAGTACATGGGGCCGGCAGGTGAGGGCCGGGACGGCGCGTGCTGGGGAGGGA

CCCGGGGCCTTGTGGCGCGGCTCCTTTC

Figura 3.1. Fragmento de 571 pb amplificado. Em negrito os primers senso e antisenso; em azul a

região correspondente ao promotor do gene MSH2 (282 pb); em amarelo a região correspondente ao

éxon 1 e em cinza o fragmento correspondente a uma parte do íntron 1; em vermelho o start codon

(ATG).

As condições de ciclagem utilizadas para amplificar a região promotora foram as

seguintes: desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos, seguindo-se de 5 ciclos a 94ºC por 1

minuto, 60ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e 25 ciclos a 94ºC por 1 minuto, 58ºC por 1

minuto e 72ºC por 1 minuto; e extensão final de 72ºC por 10 minutos.

As reações de PCR foram conduzidas em um termociclador Veriti® Thermal Cycler

(Applied Biosystems) e após a amplificação, os produtos finais foram armazenados a -20ºC.

3.6 Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do rendimento da reação

Para verificar a eficiência da reação de PCR, 5L dos produtos amplificados foram

submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% (Invitrogen), diluída em 100 ml de tampão

NaOH 1X (NaOH 10Mm; H3BO3 42,5mM) e corado com 1L do corante de corrida “blue

green” (LGC Biotecnologia). A eletroforese foi realizada a 4 volts/cm, por 40 minutos em cuba

horizontal, utilizando-se como tampão de corrida NaOH 1X. Após a corrida, o gel foi

visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta e para confirmação do tamanho do

“amplicon” foi utilizado o padrão de peso molecular de 100pb (Invitrogen).

30

3.7 Purificação dos produtos da PCR

Após a amplificação, aproximadamente 45L dos produtos amplificados foram

purificados utilizando-se os kits de purificação GFXTMPCR DNA e Gel Band Purifications Kit®

(GE – Healthcare), ou o kit da HiYieldTM GEL/PCR DNA Minikit® (RBC) de acordo com o

protocolo recomendado pelos fabricantes.

Uma alíquota de 3L de produto amplificado foi posteriormente corrida em gel de

agarose 1,5% (Invitrogen) em tampão NaOH 1X (NaOH 10Mm; H3BO3 42,5Mm) a 4 volts/cm

por 40 minutos para confirmar a presença do produto.

3.8 Sequenciamento Automático de Sanger

As reações de sequenciamento foram preparadas em um volume final de 10L,

utilizando-se o kit Big DyeTerminator version 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems),

contendo: 3,2 pmol de cada oligonucleotídeo (senso e antisenso), 4,0L do DNA purificado,

2,5L de tampão/big dye (Applied Biosystems) e 2,5L de água ultra pura. As reações foram

feitas em uma placa de 96 poços (Applied Biosystems) e conduzidas no termociclador Veriti®

Thermal Cycler (Applied Biosystems). A ciclagem da reação de sequenciamento compreendeu

40 ciclos de desnaturação a 94ºC por 10 segundos, anelamento a 50ºC por 5 segundos e extensão

a 60ºC por 4 minutos.

Após a reação de sequenciamento foi feita a precipitação das amostras para a retirada

de ddNTPs livres que podem interferir na leitura da sequência de DNA. A precipitação dos

produtos foi feita com a adição de 30µL de isopropanol 75% (MERCK), seguida de incubação

em temperatura ambiente por 15 minutos. Foi realizada uma centrifugação a 4.000 rpm por 45

minutos, e o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se mais 50µL de etanol 75% (MERCK)

em cada poço da placa e foi realizada outra centrifugação a 4.000 rpm por 15 minutos. O

sobrenadante foi novamente descartado, a placa foi colocada em um bloco aquecido

(termociclador) à 60C, por cerca de 10 minutos, para secagem do produto e posteriormente

mantida à -20ºC.

Após o processo de precipitação, os produtos de sequenciamento foram preparados para

serem submetidos à eletroforese no sequenciador. Para tal procedimento foi adicionado 10µL

de formamida (MERCK) em cada poço da placa, seguida de uma breve centrifugação.

Posteriormente a placa foi aquecida em um termociclador à 95ºC durante 3 minutos e,

imediatamente, incubada em gelo por aproximadamente 5 minutos. As amostras foram

31

sequenciadas com a plataforma de sequenciamento automático ABI Prism 3130XL (Applied

Biosystem).

As sequências obtidas foram analisadas utilizando o software Chromas Pro versão 1.41

e comparadas com as sequências de referência NM_000251.1 (sequência do mRNA) e

NG_007110.1 (sequência genômica), para identificação das mutações e polimorfismos

encontrados nas regiões codificantes e região promotora. A descrição das alterações foi feita de

acordo com a Human Genome Variation Society (http://www.hgvs.org/).

Para confirmação das alterações encontradas, dois bancos de dados foram acessados:

NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4436) e o LOVD

(http://chromium.liacs.nl/LOVD2/colon_cancer). Os indivíduos que apresentaram variação nas

sequências tiveram uma nova alíquota do DNA analisada para confirmação da variante

encontrada.

3.9 Ferramentas eletrônicas

3.9.1 Análise das variantes missense

A análise de predições dos efeitos das alterações que causam substituição de

aminoácidos na proteína foi realizada utilizando-se as ferramentas eletrônicas PolyPhen-2

(ADZHUBEI et al., 2010), Pmut (FERRER-COSTA et al., 2005) e SIFT (NG; HENIKOFF,

2003). Esses programas consideram determinados parâmetros (como a conservação do

aminoácido em proteínas ortólogas e as propriedades físico-químicas dos aminoácidos) para

classificarem uma substituição como patogênica ou neutra.

O programa PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) classifica a alteração

como provavelmente danosa (quando se supõem com alta probabilidade que a alteração afete a

estrutura e/ou a função da proteína), possivelmente danosa (quando se supõem que a alteração

afete a estrutura e/ou a função da proteína), benigna (quando a alteração provavelmente não

causa nenhum efeito na proteína) e não conhecida (quando a falta de dados não permite ao

programa fazer uma predição. O programa oferece dois modelos para predição: o HumDiv, que

é utilizado, preferencialmente, para a avaliação de alelos raros em loci potencialmente

envolvidos em fenótipos complexos, mapeamento de regiões identificadas por estudos de

associação de genomas completos e análise de seleção natural a partir de dados de sequência e

o HumVar, que é utilizado para o diagnóstico de doenças Mendelianas, em que se é necessário

a distinção entre mutações com efeito drástico das variações humanas restantes, incluindo alelos

http://www.hgvs.org/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4436

http://chromium.liacs.nl/LOVD2/colon_cancer

http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

32

levemente deletérios. O valor de score para classificação das alterações varia de 0 a 1. Quanto

mais próximo de 0 maior a chance da variante ser benigna e quanto mais próximo de 1 maior a

probabilidade de ser patogênica.

A ferramenta eletrônica Pmut (http://mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/) possui uma taxa de

sucesso de 80% e classifica uma alteração como patogênica ou neutra. Para tal classificação, o

programa fornece valores de NN output (neural networks) e de confiança. Se o valor de NN

output for maior que 0,5, a alteração é predita como patogênica. O valor de confiança permite

verificar se a predição é muito ou pouco confiável, variando de 0 (pouco confiável) a 9 (muito

confiável).

O programa SIFT (http://sift.jcvi.org/www/SIFT_enst_submit.html) fornece um score

que prediz se a alteração é deletéria ou tolerável. A substituição de aminoácidos é predita como

danosa se o valor de score for ≤ 0,05 e considerada tolerável para valores > 0,05.

Além disso, a classificação das variantes foi acessada de acordo com grupo Intenational Society

of Gastrointestinal Hereditary Tumors (InSiGHT), o qual criou diferentes critérios para

classificar as alterações encontradas nos genes do sistema MMR (www.insight-

group.org/variants/classifications/). De acordo com o grupo, as variantes são divididas em cinco

diferentes categorias: classe 5, que se refere as variantes patogênicas; classe 4, que engloba as

possivelmente patogênicas (likely pathogenic); classe 3, que inclui as variantes com

patogenicidade incerta (variantes não classificadas); classe 2, são variantes possivelmente não

patogênicas ou com pouca significância clínica (likely not pathogenic/little clinical

significance) e a classe 1, que inclui as variantes não patogênicas. O grupo InSiGHT utiliza o

banco de dados LOVD como referência para classificar as variantes.

3.9.2 Análise da região promotora

A identificação de possíveis sítios de ligação para fatores de transcrição na região

regulatória do gene MSH2 foi feita utilizando o banco de dados TRANSFAC (http://www.gene-

regulation.com/pub/databases.html), através dos parâmetros default do algoritmo.

3.10 Sequenciamento de Nova Geração – por síntese

O sequenciamento em larga escala utilizando a plataforma HiSeq™ 2500 (Illumina) foi

feito em apenas dois pacientes, escolhidos de forma aleatória, identificados como "3" e " GGC

1108". Para o sequenciamento foram utilizados todos os 16 éxons amplificados (utilizando os

primers da Tabela 3.2, sessão 3.5.1) e purificados (sessão 3.7) de cada paciente, com exceção

http://mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/

http://sift.jcvi.org/www/SIFT_enst_submit.html

http://www.insight-group.org/variants/classifications/

http://www.insight-group.org/variants/classifications/

http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html

http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html

33

do éxon 5 para o paciente 3, em que foi utilizado o par de primers e as condições da reação

descritos na Tabela 3.4. Posteriormente, as amostras foram quantificadas e misturadas e, deste

“pool” de amostras, foram utilizados 50ng para a preparação de biblioteca para clusterização

emflow Cells e sequenciamento na plataforma Illumina (3,5ng de cada éxon totalizando, 56ng).

Tabela 3.4: Oligonucleotídeos e condições de ciclagem utilizados no sequenciamento de nova geração para

amplificar o éxon 5 do gene MSH2, para o paciente 3.

O sequenciamento por síntese foi feito em 4 etapas principais: (i) Preparação da

biblioteca; (ii) Geração dos clusters; (iii) Sequenciamento e (iv) Análise.

3.10.1 Preparação das bibliotecas

O kit utilizado para a preparação das bibliotecas de DNA foi o Nextera DNA Sample

Preparation, que envolveas seguintes etapas: (i) fragmentação do DNA alvo em pontos

aleatórios, utilizando uma transposase; (ii) a adição de adaptadores nos pontos de clivagem do

DNA e (iii) a amplificação dos fragmentos na presença de primers com caudas contendo

sequências identificadoras (indexes).

Após sua preparação, as bibliotecas foram validadas utilizando-se o chip High

Sensitivity DNA e o equipamento Bioanalyzer (Agilent), seguindo o protocolo do fabricante,

para verificar o tamanho e a qualidade da biblioteca gerada. Posteriormente, foi feita uma PCR

em Tempo Real (Illumina) utilizando o kit “KAPA Library Quantification Kits” para

quantificar a biblioteca através da construção de uma curva padrão com amostras de

concentração conhecida.

Após a quantificação, as bibliotecas foram diluídas a uma mesma concentração (2nM),

misturadas e adicionadas de maneira equimolar a outras 30 bibliotecas. Posteriormente, foram

desnaturadas com 0,1M de NaOH e diluídas a uma concentração de 12 pM, para a geração dos

clusters.

OLIGONUCLEOTÍDESOS (PRIMERS)

TAMANHO DO

FRAGMENTO (PARES

DE BASE – pb)

CONDIÇÕES DE

CICLAGEM

ÉXON 5 (FOWARD) 5` CAGTGGTATAGAAATCTTCG 3`

(REVERSO) 5` ACCATTCAACATTTTTAACCC 3` 242 pb

94ºC – 5 minutos

94ºC – 30 segundos

50ºC – 30segundos 35x

72ºC – 30 segundos

72ºC – 15 minutos

34

3.10.2 Geração dos clusters

A geração dos clusters ocorreu no equipamento cBot (Illumina), utilizando o TruSeq PE

Cluster kit v3-cBot-HS (Illumina). Este processo ocorre, de forma simplificada, em 4 etapas:

(i) hibridização dos fragmentos contendo os adaptadores a superfície sólida (flow cell); (ii)

amplificação das amostras (amplificação por ponte); (iii) linearização dos fragmentos e (iv)

hibridização dos fragmentos amplificados com os primers de sequenciamento.

3.10.3 Sequenciamento por síntese

O sequenciamento das bibliotecas clusterizadas na flow Cell foi feito no sequenciador

HiSeq 2500 (Illumina), utilizando o TruSeq SBS kit v3-HS (Illumina), no modo paired end,

com a leitura de 2 reads de 99 bases para cada extremidade e 16 leituras para os indexes.

3.10.4 Análise dos dados

Os dados obtidos foram convertidos de BCL (base calling) para a formato FastQ

utilizando o programa Casava (Illumina). Posteriormente, a qualidade das “reads” foi filtrada

utilizando o programa PrinSeq, de acordo com os seguintes critérios: (i) filtrar sequências com

tamanho inferior a 30 nucleotídeos; (ii) selecionar “reads” com uma média de qualidade de no

mínimo 20 e (iii) filtrar sequências com mais de 60 bases ambíguas. A seguir, utilizando o

programa Bowtie-2, as “reads” selecionadas foram alinhadas com a sequência de referência do

gene MSH2 (NG_007110.1), utilizando parâmetros padrão do programa. Com o auxílio dos

programas GATK e Samtools, os índices de cobertura para cada posição de base foram

avaliados e, por fim, foram estimadas as variantes e frequências correspondentes de cada região

amplificada do gene com o programa CLC Genomics Workbench 7 (Qiagen).

35

RESULTADOS

4.1 Caracterização dos pacientes incluídos

As informações clínicas dos 53 pacientes estudados, incluindo os resultados dos testes

de instabilidade de microssatélites e imunohistoquímica, estão resumidos e apresentados em

forma de tabela, no Anexo 2.

A idade ao diagnóstico variou de 19 a 81 anos. A média de idade foi 40,6 anos (±11,9)

e a mediana foi de 39 anos. A histologia do adenocarcinoma de 48 pacientes foi avaliada e 4

pacientes apresentaram histologia bem diferenciada, 29 moderadamente diferenciada, 4 pouco

diferenciada e os 11 restantes tiveram sua histologia inconclusiva.

Dos cinquenta e três pacientes avaliados, 36 apresentam histórico familial de câncer,

com número de familiares de 1º grau afetados variando de 1 a 10 indivíduos. Os demais 17

pacientes não possuem casos de câncer nos familiares de primeiro grau.

Dos 49 pacientes avaliados para o teste de imunohistoquímica, 39 apresentaram

imunohistoquímica positiva para MSH2 e 10 apresentaram perda da proteína. Para o teste de

instabilidade de microssatélites, 20 pacientes foram avaliados e, destes, 10 apresentaram alta

instabilidade de microssatélites (MSI-H), 8 apresentaram microssatélites estáveis (MSS) e 2

apresentaram resultado inconclusivo, devido à má qualidade do material.

A localização tumoral foi predominantemente do cólon (39/53), seguida do reto (7/53),

retossigmóide (5/53) e outras localizações (2/53). Três pacientes apresentaram tumor primário

em mais de uma localização.

36

4.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento Automático de Sanger

4.2.1 Variantes identificadas nas regiões codificantes do gene MSH2

Conduzimos a triagem de alterações nas regiões codificantes do gene MSH2 através do

sequenciamento automático, nos 53 pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch. Em 52

pacientes foram analisadas as sequências dos 16 éxons e em apenas um paciente (MRV) foram

analisadas as sequências referentes aos éxons 3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 15, devido à falta de

material disponível para análise.

Nesses pacientes foram identificadas 9 variantes de sequência: (i) 5 variantes missense,

em que há troca de aminoácido; (ii) 1 variante sinônima, que mantém o mesmo aminoácido;

(iii) 1 variante nonsense, que gera um stop códon prematuro e (iv) 2 variantes frameshift, que

alteram a sequência de leitura do RNAm. Na Tabela 4.1 estão listadas as variantes identificadas

e sua localização nos domínios protéicos.

37

Tabela 4.1: Variantes de sequência identificadas nos 53 pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch.

Variação no

cDNA

Variação na

Proteína

Éxon do

Gene Pacientes

Tipo de

variante

Domínio

protéico

c.23C>T

p.T8M

ÉXON 1

GGC 1094 / SL009

Missense

Mismatch

Binding

c.573C>T

p.L191L

ÉXON 3

SL001

Sinônima

Conector

c. 388_389del CA

p.Q130Vfs

ÉXON 3

SL009

Frameshift

Conector

c.1046C>G

p.P349R

ÉXON 6

GGC 1109

Missense

Lever

c.965G>A

p.G322D

ÉXON 6

3 / 10 / GGC 1107

Missense

Lever

c.1738_1741del

GAAA

-

ÉXON 11

GGC 2114

Frameshift

Lever

c.2021G>A

p.G674D

ÉXON 13

8

Missense

ATPase

c.2078G>A

p.C693Y

ÉXON 13

GGC 1108

Missense

ATPase

c.2152C>T

p.Q718X

ÉXON 13

GGC 1112 /

GGC 2106/ GGC 871/

GGC 874

Nonsense

ATPase

38

4.2.2 Características das variantes encontradas nas regiões codificantes

A alteração c.23C>T (Fig., 4.1) resulta na troca de uma treonina por uma metionina na

posição 8 da proteína MSH2, no domínio “mismatch binding”. As análises in sílico relativas

ao efeito da substituição do aminoácido na função da proteína, utilizando–se os programas SIFT

e Pmut, mostraram que essa alteração é benigna, porém de acordo com o programa PolyPhen-

2 esta alteração pode ser benigna (modelo HumVar) ou possivelmente danosa (modelo

HumDiv). E de acordo com o grupo InSiGHT esta variante também é benigna (Tabela 4.2).

Esta alteração foi identificada em dois pacientes em heterozigose (GGC 1094 e SL009).

O paciente GGC 1094 foi diagnosticado com adenocarcinoma retal aos 31 anos de idade,

preenche os critérios de Bethesda, apresenta perda das proteínas MSH2 e MSH6 e não possui

instabilidade de microssatélites. Já o paciente SL009 apresenta história familiar de SL (critérios

de Amsterdam – Anexo 3), com quatro parentes de 1º grau afetados (2 com CCR, 1 com câncer

de ovário e 1 com câncer de endométrio) e uma manifestação precoce da doença – aos 46 anos

de idade. Apresenta adenocarcinoma de cólon ascendente diferenciado e perda, somente, da

proteína MSH6. O status de instabilidade de microssatélites para este paciente não foi avaliado.

Figura 4.1. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 1. A) Sequência

selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.23C>T.

A B

39

Tabela 4.2: Classificação da patogenicidade da variante T8M por análises in sílico.

A variante c.573C>T no éxon 3 (Fig., 4.2) resulta em uma mutação sinônima, p.L191L,

no domínio “conector” da proteína MSH2. Isso sugere que se trata de uma variante não

patogênica e foi encontrada em apenas um paciente em heterozigose (SL001). Este paciente foi

diagnosticado com adenocarcinoma de cólon aos 30 anos de idade e não possui história familiar

de SL. Ainda não foram realizados os testes de imunohistoquímica e instabilidade de

microssatélites para este paciente.


selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.573C>T.

ALTERAÇÃO PROGRAMA SCORE CLASSIFICAÇÃO

C.23 C>T

(T8M)

PolyPhen-2 HumVar = 0,226

HumDiv = 0,832

Benigna/

Possivelmente danosa

SIFT 0,1 Tolerável

Pmut NN output = 0,1301

Confiança = 7 Neutra

InSiGHT Classe 1 Não Patogênica

A B

40

A variante c.388_389delCA (Fig., 4.3), localizada no éxon 3, resulta em uma mutação

frameshift. Esta alteração é considerada patogênica pois altera a sequência de leitura do RNAm.

Foi encontrada em apenas um paciente – SL009, que também é portador da alteração p.T8M

no éxon 1.

Figura 4.3. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 3.

A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.388_389delCA.

A alteração c.1046C>G (Fig., 4.4) foi identificada em um paciente (GGC 1109) e resulta

na troca de uma prolina por uma arginina na posição 349 da proteína. Segundo as análises in

sílico através dos programas SIFT e PolyPhen-2, esta alteração foi classificada como

patogênica, porém de acordo com o programa Pmut, esta variante é neutra. E, de acordo com a

classificação proposta pelo grupo InSiGHT, é considerada uma variante possivelmente

patogênica (Tabela 4.3). O paciente GGC 1109 foi diagnosticado com adenocarcinoma

retossigmóide aos 30 anos de idade, apresenta história familiar de SL (Anexo 4) com três

parentes de 1º grau afetados (2 com CCR e 1 com câncer de estômago) e possui

imunohistoquímica positiva para todas as proteína estudadas. O status de instabilidade de

microssatélite não foi avaliado.


selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.1046C>G.

A B

A B

41

Tabela 4.3: Classificação da patogenicidade da variante P349R por análises in sílico.

A variante c.965G>A (p.G322D) (Fig., 4.5) no éxon 6, resulta na troca de uma glicina

por um ácido aspártico na posição 322 no domínio “lever” da proteína MSH2. Ela foi

identificada em três pacientes em heterozigose. De acordo com os programas de predição

PolyPhen-2 e Pmut, esta variante é considerada benigna, porém de acordo com o programa

SIFT, esta alteração é predita como danosa. E de acordo com o InSiGHT, é uma variante não

patogênica (Tabela 4.4). Os pacientes 3 e 10 não possuem história familiar de SL e foram

diagnosticados aos 60 e 35 anos de idade, respectivamente. Apresentam adenocarcinoma de

cólon moderadamente diferenciado e imunohistoquímica positiva para todas as proteínas

estudadas. O status de instabilidade de microssatélites para estes pacientes não foi avaliado. Já

o paciente GGC 1107, apresenta história familiar para SL com 3 parentes de 1º grau afetados –

todos com CCR. Foi diagnosticado com adenocarcinoma de cólon transverso moderadamente

diferenciado aos 38 anos de idade e apresenta imunohistoquímica positiva para todas as

proteínas e alta instabilidade de microssatélites, com 5 marcadores apresentando alteração.

Figura 4.5. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR no éxon 6. A) Sequência

selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.965G>A.


C.1046 C>G

(P349R)

PolyPhen-2 HumVar = 1.000

HumDiv = 1.000 Possivelmente danosa

SIFT 0 Danosa



InSiGHT Classe 4 Possivelmente

Patogênica

A B

42

Tabela 4.4: Classificação da patogenicidade da variante G322D por análises in sílico.

A variante c.2021G>A (p.G674D), localizada no éxon 13 (Fig., 4.6), resulta na troca de

uma glicina por um ácido aspártico na posição 674 no domínio ATPase da proteína. Esta

alteração foi identificada em apenas um paciente (paciente 8), preenchendo os critérios de

Bethesda (Anexo 5), que manifestou a doença precocemente – aos 44 anos de idade. Apresenta

adenocarcinoma de cólon sigmóide moderadamente diferenciado, com perda, somente, da

proteína MSH2 e o status de instabilidade de microssatélites não foi avaliado. As análises in

sílico relativas ao efeito da substituição do aminoácido na função e/ou estrutura da proteína e

de acordo com o grupo InSiGHT, mostraram que esta alteração é patogênica (Tabela 4.5).


A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2021G>A.


C.965 G>A

(G322D)


HumDiv = 0,434 Benigna

SIFT 0,05 Danosa



InSiGHT Classe 1 Não Patogênica

A B

43

Tabela 4.5: Classificação da patogenicidade da variante G674D por análises in sílico.

A alteração c.2152C>T (Fig., 4.7) resulta na troca de uma glutamina por um stop códon

(p.Q718X) no domínio ATPase da proteína. Esta foi identificada em quatro pacientes em

heterozigose e é considerada uma variante patogênica, uma vez que gera uma proteína truncada

e não funcional. O paciente GGC 1112 foi diagnosticado com adenocarcinoma retal pouco

diferenciado aos 34 anos de idade e preenche os critérios de Amsterdam (Anexo 6) com um

parente de 1º grau afetado (com CCR). Apresenta perda das proteínas MLH1, MSH2 e MSH6,

e alta instabilidade de microssatélites com 5 marcadores alterados. O paciente GGC 2106 foi

diagnosticado aos 50 anos de idade com adenocarcinoma retossigmóide moderadamente

diferenciado. Também possui história familiar para SL (Anexo 7) com cinco parentes de 1º

grau afetados (CCR, língua, renal, fígado e bexiga) e apresenta perda das proteínas MSH2 e

MSH6 por imunohistoquímica. O status de instabilidade de microssatélites, para este paciente,

não foi avaliado. Já o paciente GGC 871 foi diagnosticado com adenocarcinoma de cólon

ascendente aos 30 anos e possui história familiar para SL (Anexo 8) com dois parentes de 1º

grau afetados com CCR. Apresenta perda das proteínas MSH2 e MSH6 e o resultado do teste

de instabilidade de microssatélites foi inconclusivo. E o paciente GGC 874 foi diagnosticado

com adenocarcinoma de cólon sigmóide em idade precoce aos 29 anos de idade e preenche os

critérios de Amsterdam (Anexo 9) com um parente de 1º grau apresentando dois tumores CCR

e um tumor de próstata. Possui alta instabilidade de microssatélites com 4 marcadores

apresentando alteração e o teste de imunohistoquímica foi positiva para todas as proteínas

avaliadas.


C.2021 G>A

(G674D)


HumDiv = 1.000 Possivelmente danosa

SIFT 0 Danosa


Confiança = 6 Patogênica

InSiGHT Classe 4 Possivelmente

Patogênica

44

Figura 4.7. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A)

Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2152C>T.

Duas alterações identificadas neste estudo, e apresentadas a seguir, nunca foram

descritas: c.2078G>A (p.C693Y) e c.1738_1741delGAAA.

A variante nova c.2078G>A (Fig., 4.8) foi encontrada em apenas um paciente (GGC

1108), que preenche os critérios de Bethesda (Anexo 10) e manifestou a doença aos 42 anos de

idade. Este paciente apresenta adenocarcinoma de cólon ascendente moderadamente

diferenciado, com perda da proteína MSH6 e com alta instabilidade de microssatélites, com 4

marcadores alterados. Esta substituição leva à troca de uma cisteína por uma tirosina na posição

693 no domínio ATPase da proteína MSH2. Com o objetivo de verificar se a alteração C693Y

afeta a estrutura e/ou função protéica, os programas de predição PolyPhen-2, SIFT e Pmut

foram utilizados e todos a classificaram como sendo provavelmente patogênica (Tabela 4.6).

Figura 4.8. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A)

Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2078G>A.

A B

A B

45

Tabela 4.6: Classificação da patogenicidade da variante C693Y por análises in sílico.

A alteração c.1738_1741delGAAA (Fig., 4.9), localizada no éxon 11, resulta em uma

mutação frameshift, sendo considerada patogênica, pois altera a sequência de leitura do RNAm.

Esta variante foi encontrada em heterozigose em apenas um paciente (GGC 2114) sem parentes

de 1º grau afetados (Anexo 11) e que manifestou a doença precocemente – aos 29 anos de idade.

Apresenta adenocarcinoma de cólon diferenciado e perda da proteína MSH2. O status de

instabilidade de microssatélites ainda não foi avaliado.


A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.1738_1741delGAAA.

4.2.3 Variantes identificadas na região promotora do gene MSH2

Conduzimos a triagem de alterações na região promotora do gene MSH2 através do

sequenciamento automático, em 52 pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch. O

paciente MRV não teve sua sequência promotora analisada por falta de material disponível para

a análise.

Nesses pacientes foram identificadas 2 variantes de sequência: (i) 1 variante na posição

c.-118T>C e (ii) 1 variante na posição c.-185C>A.


C.2078 G>A

(C693Y)

PolyPhen-2 HumVar = 0,994

HumDiv = 0,980 Possivelmente danosa

SIFT 0 Danosa


Confiança = 8 Danosa

A B

46

4.2.4 Características das variantes encontradas na região promotora

A alteração na região c.-118T>C (Fig., 4.10) foi identificada em 7 pacientes em

heterozigose e em 1 paciente em homozigose (Tabela 4.7). De acordo com a classificação

proposta pelo grupo InSiGHT esta variante é considerada não patogênica. De acordo com o

banco de dados TRANSFAC, a sequência contendo o alelo selvagem T é um possível sítio de

ligação para diferentes fatores de transcrição, como por exemplo: CCAAT-binding protein. Já

a sequência contendo o alelo variante C também é um possível sítio de ligação para os fatores

de transcrição NF-1 e LBP-1.

Figura 4.10. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da região promotora

de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.-118T>C em

heterozigose. C) Sequência com a alteração c.-118T>C em homozigose.

Tabela 4.7: Classificação da variante c.-118 T>C.

A variante c.-185C>A foi identificada em apenas um paciente em heterozigose (GGC

865) (Fig., 4.11), que preenche os critérios de Amsterdam (Anexo 12), com dois parentes de

primeiro grau afetados (1 CCR e 1 Adenocarcinoma de reto e mama) e manifestou a doença

aos 52 anos de idade. Este paciente apresenta adenocarcinoma de cólon ascendente

moderadamente diferenciado, com imunohistoquímica positiva para todas as proteínas

avaliadas e microssatélites estáveis. Esta alteração não foi classificada pelo grupo InSiGHT,

portanto, sua relação com a carcinogênese colorretal permanece desconhecida. De acordo com

o banco de dados TRANSFAC, a sequência contendo o alelo selvagem C é um possível sítio

ALTERAÇÃO PACIENTES EM

HETEROZIGOSE

PACIENTES EM

HOMOZIGOSE

CLASSIFICAÇÃO

INSIGHT

C.-118 T>C

GGC 1107/ GGC 2113/ AP/

GGC 1109/ GGC 872/

GGC 874/ GGC 896

GGC 864 Não Patogênica

(Classe 1)

A B

C

47

de ligação para os fatores de transcrição SP1 e NF-E4. Já a sequência contendo o alelo variante

A não é sítio de ligação para nenhum fator de transcrição conhecido.

Figura 4.11. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da região promotora

de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Alteração c.-185C>A em heterozigose.

4.2.5 Variante identificada no íntron 1 do gene MSH2

Foi identificada uma variante de sequência no íntron 1 (c.211+9C>G ou IVS1+9C>G)

do gene MSH2 (Fig., 4.12). Esta alteração foi encontrada em 21 pacientes em heterozigose e

em 9 pacientes em homozigose. De acordo com a classificação dada pelo grupo InSiGHT esta

variante é considerada não patogênica (Tabela 4.8).

Figura 4.12.Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR no íntron 1. A)

Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração a alteração c.211+9C>G em

heterozigose. C) Sequência com a alteração c.211+9C>G em homozigose.

A B

A B

B

B

B

C

48

Tabela 4.8: Classificação da variante c211+9C>G.

4.3 Resultados do Sequenciamento de Nova Geração

4.3.1 Média das coberturas dos amplicons

A média de cobertura base-base de cada amplicon para os pacientes 3 e GGC 1108 está

resumida na Tabela 4.9.

Tabela 4.9: Média de cobertura base-base dos 16 amplicons para os pacientes 3 e GGC 1108.

AMPLICON MÉDIA (Nº DE READS)

PACIENTE 3

MÉDIA (Nº DE READS)

PACIENTE GGC 1108

1 152527 347848

2 28506 65360

3 93183 70338

4 19813 4725

5 20616 83930

6 46703 39199

7 17426 21205

8 10235 82567

9 29348 72368

10 25487 54935

11 1898 24345

12 35617 56057

13 384100 11819

14 59888 306216

15 52963 11152

16 20664 46630

ALTERAÇÃO PACIENTES EM

HETEROZIGOSE

PACIENTES EM

HOMOZIGOSE

CLASSIFICAÇÃO

INSIGHT

C.211+9 C>G

GGC 865/ GGC 1094/ AP/ UCC/

GGC 1108/ GGC 872/ GGC 874/

GGC 896/ GGC 867/ GGC 871/

GGC 893/ GGC 1083/ GGC 1085/

SL001/ SL009/ 1/ 4/ 8/ 9/ 16/ SDL

GGC 1107/ GGC 2113/

GGC 864/ GGC 1109/

SL005/ JPR/ 3/ 10/ 13

Não Patogênica

(Classe 1)

49

Os gráficos de cobertura para cada um dos 16 amplicons de cada paciente estão no

Anexo 13.

4.3.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento de Nova Geração

No paciente 3 foram identificadas 3 variantes de sequência: (i) na posição 345 (ii) na

posição 5319 e (iii) na posição 13252 (Tabela 4.10).

A variante na posição genômica 345 foi a mesma encontrada pelo sequenciamento

automático de Sanger e resulta na troca do nucleotídeo citosina (C) para o nucleotídeo guanina

(G) (c.211+9 C>G) em homozigose com frequência de 98,03% e uma alta cobertura (82491

reads). Esta alteração ocorre no amplicon 1, correspondente a região do intron 1 sendo,

portanto, confirmada para este paciente.

A variante na posição 5319 do gene MSH2 ocorre no amplicon 2, na região

correspondente ao intron 1 e resulta na deleção do nucleotídeo timina (T) (c.212-16delT ou

IVS1-16delT) em heterozigose, com frequência de 36,43% e alta cobertura (13071 reads). Esta

alteração não foi classificada pelo grupo InSiGHT, portanto, sua relação com a carcinogênese

colorretal permanece desconhecida. Esta alteração não foi identificada pelo sequenciamento de

Sanger.

A variante na posição 13252 do gene MSH2 ocorre no amplicon 6, dentro da região

codificante e resulta na troca de uma guanina (G) por uma adenina (A) em heterozigose, com

uma frequência de 54,31% e alta cobertura (18369 reads). Esta alteração foi a mesma

encontrada pelo sequenciamento de Sanger (c.965G>A) sendo, portando, confirmada para este

paciente.

Tabela 4.10: Resumo das alterações encontradas no paciente 3 através do sequenciamento de nova geração.

Posição Tipo Referência Alelo Zigose

Cobertura da

variante

(Nº de reads)

Cobertura total

da região

(Nº de reads)

Frequência

da Variante

345 SNV C G Homozigoto 82491 84145 98.03%

5319 Deleção T - Heterozigoto 13071 35875 36.43%

13252 SNV G A Heterozigoto 18369 33823 54.31%

50

No paciente GGC 1108 também foram identificadas 3 variantes de sequência: (i) na

posição 345, (ii) na posição 5319 e (iii) na posição 73373 (Tabela 4.11).

A variante na posição 345 do gene MSH2 foi a mesma encontrada pelo sequenciamento

automático de Sanger e resulta na troca do nucleotídeo citosina (C) para o nucleotídeo guanina

(G) (c.211+9C>G) em heterozigose com frequência de 53,37% e uma alta cobertura de 118511

reads. Esta alteração ocorre no amplicon 1, correspondente a região do intron 1 sendo, portanto,

confirmada para este paciente.

A variante na posição 5319 do gene MSH2 ocorre no amplicon 2, na região

correspondente ao intron e resulta na deleção do nucleotídeo timina (T) (c.212-16delT ou IVS1-

16delT) em heterozigose, com frequência de 29,52% e alta cobertura (23464 reads). Esta

alteração não foi classificada pelo grupo InSiGHT, portanto, sua relação com a carcinogênese

colorretal permanece desconhecida. Esta alteração não foi identificada pelo sequenciamento de

Sanger.

A alteração na posição genômica 73373 ocorre no amplicon 13, dentro da região

codificante e resulta na troca do nucleotídeo guanina (G) pelo nucleotídeo adenina (A) em

heterozigose, com uma frequência de 46,79% e uma alta cobertura (4818 reads). Esta alteração

foi a mesma encontrada pelo sequenciamento de Sanger (c.2078G>A) sendo, portando,

confirmada para este paciente.

Tabela 4.11: Resumo das alterações encontradas no paciente GGC1108 através do sequenciamento de nova

geração.

Posição Tipo Referência Alelo Zigose

Cobertura da

variante

(Nº de reads)

Cobertura total da

região

(Nº de reads)

Frequência

da Variante

345 SNV C G Heterozigoto 118511 222068 53.37%

5319 Deleção T - Heterozigoto 23464 79498 29.52%

73373 SNV G A Heterozigoto 4818 10298 46.79%

51

DISCUSSÃO

A partir da análise de variações de ponto, através do sequenciamento automático de

Sanger e do sequenciamento de nova geração no gene MSH2, foram identificadas13 variantes

em uma amostra de 53 pacientes brasileiros com Síndrome de Lynch (Tabela 5.1). Deste total,

9 variantes já haviam sido publicadas anteriormente e 4 são variantes novas, sendo que duas

delas (c.-185C>A; c.212-16delT) foram reportadas no banco de dados dbSNP Short Genetic

Variations (NCBI) porém não foram publicadas e nem validadas quanto á sua associação com

a síndrome.

Utilizando a classificação proposta pelo grupo InSiGHT (banco de dados LOVD) e

pelos programas de predição in sílico, identificamos um total de 6 variantes patogênicas ou

potencialmente patogênicas e 5 variantes benignas. Duas variantes não foram classificadas.

Além disso, 9 alterações foram encontradas em regiões codificantes, 2 em regiões intrônicas e

2 alterações na região promotora do gene MSH2.

Tabela 5.1: Resumo das variantes identificadas pelo sequenciamento de Sanger e de nova geração no

gene MSH2 e suas classificações de acordo com o grupo InSiGHT e programas in sílico.

Variação Posição Classificação

c.-185 C>A Promotor Não classificada (Variante nova)

c.-118T>C Promotor Benigna

c.23C>T Éxon 1 Benigna

c.573C>T Éxon 3 Benigna

c. 388_389del CA Éxon 3 Patogênica

c.1046C>G Éxon 6 Patogênica

c. 965G>A Éxon 6 Benigna

c.1738_1741delGAAA Éxon 11 Patogênica (Variante nova)

c.2021G>A Éxon 13 Patogênica

c.2078G>A Éxon 13 Patogênica (Variante nova)

c.2152C>T Éxon 13 Patogênica

c.212-16delT Íntron1 Não classificada (Variante nova)

c.211+9C>G Íntron 1 Benigna

52

5.1 Variantes de sequência patogênicas ou possivelmente patogênicas

Identificamos a mutação c.388_389delCA em heterozigose no éxon 3 do gene MSH2

em um paciente. Trata-se de uma variante patogênica conhecida, anteriormente descrita em

outros estudos em diferentes populações mundiais (MANGOLD et al., 2005; BARNETSON et

al., 2006; PINHEIRO et al., 2012). Pinheiro e colaboradores (2012) identificaram esta variante

em 16 famílias portuguesas não relacionadas (16/103) e todas compartilhavam de um mesmo

haplótipo de microssatélites e concluíram que esta variante apresenta um efeito fundador em

Portugal, com origem relativamente recente. Por outro lado, esta mutação na linhagem

germinativa ocorre com diferentes haplótipos, sugerindo sua origem de novo, em diferentes

populações como a Alemanha, Escócia, Inglaterra, Argentina, França, América do Norte e

Austrália, sugerindo que esta região genômica pode ser um hot-spot mutacional dentro do gene

MSH2 (PINHEIRO et al., 2012). Esta mutação está localizada no domínio conector, que é

responsável pelas interações intramoleculares e sinalização alostérica entre os diferentes

domínios da proteína (WARREN et al., 2007), conecta a subunidade DNA-binding ao resto do

heterodímero MutSα, além de ser essencial para mediar a interação entre os heterodímeros

MutS e MutL, sendo, portanto, fundamental para o reparo in vivo (MENDILLO et al., 2009).

Devido a isso, mutações patogênicas pontuais neste domínio são responsáveis pela instabilidade

da proteína MSH2 e perda da atividade de reparo. Esta variante é uma mutação frameshift, que

altera a sequência de aminoácidos, gerando um stop códon prematuro e uma proteína truncada

e não funcional. O paciente portador desta variante identificado nesse estudo – SL009, não

apresenta perda da proteína MSH2 por imunohistoquímica, porém a proteína é inativa e não

funcional. Apresenta, no entanto, perda da proteína MSH6, mostrando que não há formação do

heterodímero MutSα, impedindo o reconhecimento do mismatch e consequentemente, a

atividade de reparo do sistema MMR.

A variante c.1046C>G (p.P349R) foi identificada em apenas um paciente (GGC 1109)

com história familiar para SL (critérios de Amsterdam). As análises in sílico para esta variante

foram contraditórias, pois apenas um programa (Pmut) a classificou como sendo neutra, todos

os outros a classificaram como sendo possivelmente patogênica. Esta variante já havia sido

descrita por Thompson e colaboradores (2012) e Chao e colaboradores (2008), porém ambos

os autores só fizeram testes in sílico e não confirmaram sua patogenicidade através de ensaios

funcionais e/ou em amostras controle, com indivíduos não afetados e sem história familiar para

SL. Um estudo caso-controle (PASTRELLO et al., 2011) identificou esta variante em dois

indivíduos não relacionados, todos preenchendo os critérios de Amsterdam, e não encontrou

em nenhum individuo controle (0/100). Esta variante está localizada no domínio lever da

53

proteína, que é responsável por conectar a subunidade ATP-binding ao domínio clamp e fazer

contatos inespecíficos com o DNA. Portanto mutações patogênicas neste domínio causam

diminuição da estabilidade protéica e defeitos no reparo MMR (OLLILA et al., 2008). Estudos

funcionais são necessários para avaliar o real impacto desta variante na função da proteína, uma

vez que, apesar da maioria dos programas in sílico a classificarem como patogênica, o paciente

portador desta variante identificado nesse estudo não apresentou perda das proteínas que

formam o heterodímero MutSα (MSH2 e MSH6).

Outra mutação patogênica no gene MSH2, c.1738_1741delGAAA, foi identificada em

apenas um paciente – GGC 2114. Esta variante é uma mutação frameshift, que altera a

sequência de leitura do RNAm e foi identificada pela primeira vez nesse estudo. Ela ocorre no

domínio lever da proteína, gerando instabilidade da mesma e isso se confirma no resultado de

imunohistoquímica, onde houve a perda da proteína MSH2 neste paciente.

A variante c.2021G>A (p.G674D) foi identificada em um paciente em heterozigose

(paciente 8) no éxon 13 do gene MSH2. Trata-se de uma variante patogênica conhecida, descrita

em outros estudos (GAMMIE et al., 2007; BRIEGER et al., 2011). Em um estudo descritivo,

Brieger e colaboradores (2011) identificaram esta variante em uma família da Alemanha (1/23),

que preenchia os critérios de Amsterdam, mas que desenvolveram tumores não associados a SL

– tumor de pâncreas e mama. Os autores não discutiram a patogenicidade da variante. Em um

outro estudo, Gammie e colaboradores (2007) introduziram 54 mutações missense, incluindo a

variante G674D, no gene MSH2 de levedura através do ensaio de mutagênese sítio-dirigida.

Eles observaram através de ensaios qualitativos e quantitativos de reparo de mismatch que a

variante não afetava a estabilidade da proteína, porém causava perda da atividade de reparo.

Este dado é contraditório aos nossos resultados, já que o paciente portador da variante apresenta

perda da proteína MSH2, mostrando que provavelmente, esta alteração gera instabilidade na

mesma. A variante G674D está localizada no domínio ATPase da proteína, que é crucial para a

funcionalidade do heterodímero MutSα. Este domínio modula a conformação da proteína pela

ligação das moléculas de ADP e ATP. Estudos funcionais mostram que o heterodímero MutSα

se liga ao ADP quando está interagindo com o mismatch na molécula de DNA, e perde afinidade

pelo mismatch quando se liga ao ATP (OLLILA et al., 2008). Portanto, mutações patogênicas

neste domínio influenciam na atividade do complexo ATPase de reconhecimento do mismatch.

54

A transição c.2078G>A é uma alteração nova identificada pela primeira vez por nós em

apenas um paciente – GGC 1108, através dos sequenciamentos de Sanger e de nova geração.

Esta substituição leva à troca de uma cisteína por uma tirosina na posição 693 no domínio

ATPase da proteína MSH2, que é fundamental para a ativação do complexo MutSα e

consequentemente, um regulador essencial do reparo MMR (OLLILA et al., 2008). O paciente

GGC 1108 não apresenta história familiar para a SL (preenche os critérios de Bethesda),

apresenta perda da proteína MSH6, além de alta instabilidade de microssatélites, mostrando que

a atividade de reparo foi perdida. Embora todas as predições in sílico tenham classificado esta

variante como patogênica, estudos funcionais e de caso-controle ajudariam a esclarecer se esta

variante é causal ou um fator de risco para o desenvolvimento da SL.

Outra mutação patogênica no gene MSH2, c.2152C>T, foi identificada em quatro (GGC

1112, GGC 2106, GGC 871 e GGC 874) pacientes, ambos com história familiar para SL e

apenas três com perda da proteína MSH2. Esta mutação resulta na troca de uma glutamina por

um stop códon (p.Q718X) no domínio ATPase, fundamental para a atividade de reparo do

complexo MutSα, e já havia sido descrita na literatura como um hot-spot, devido a sua alta

frequência de ocorrência de novo em diferentes populações mundiais. (ISIDRO et al., 1999;

LAGE et al., 2004; SANTOS et al., 2012; DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2013). Em dois

estudos desenvolvido no Brasil (SANTOS et al., 2012; DOMINGUEZ-VALENTIN et

al.,2013), esta variante foi considerada a mais frequente dentre as alterações encontradas no

gene MSH2, e isto pode ser explicado pela influência da ancestralidade portuguesa na população

brasileira, uma vez que esta variante foi identificada pela primeira vez em famílias portuguesas

associadas à SL e apresenta uma frequência de ocorrência muito alta, podendo sugerir um efeito

fundador desta variante em Portugal.

5.2 Variantes de sequência não patogênicas

De acordo com as análises in sílico e com a classificação proposta pelo grupo InSiGHT,

das variantes de ponto encontradas no gene MSH2, verificamos que 5 são alterações não

patogênicas, uma vez que não comprometem a função de reparo da proteína.

Identificamos a variante c.23C>T (p.T8M) em heterozigose em dois pacientes – GGC

1094 e SL009. Esta variante já foi previamente descrita por diversos estudos em diferentes

populações mundiais (MANGOLD et al., 2005; WANG et al., 2005; SPAEPEN et al., 2006),

porém não foram realizados estudos funcionais e nem a utilização de amostras controles para

definir a patogenicidade da variante. As análises in sílico relativas ao efeito da substituição do

55

aminoácido na função da proteína, utilizando-se os programas SIFT e Pmut, e de acordo com o

grupo InSiGHT classificaram esta variante como sendo benigna. Porém, de acordo com o

programa PolyPhen-2, os resultados foram contraditórios: o modelo de predição HumDiv a

classificou como sendo possivelmente danosa, enquanto o modelo HumVar a classificou como

benigna. Sabendo-se que o modelo de predição HumVar é utilizado preferencialmente para o

diagnóstico de doenças Mendelianas, utilizamos a classificação proposta por este modelo, uma

vez que a Síndrome de Lynch se encaixa nesta descrição de doença. Embora as predições in

sílico tenham classificado esta variante como benigna, esta avaliação deve ser realizada com

cautela, uma vez que a alteração encontra-se em um domínio importante da proteína (mismatch

binding), que é responsável pela interação inespecífica da proteína MSH2 com a fita de DNA

(WARREN et al., 2007). Além disso, o paciente GGC 1094 apresenta perda das proteínas

MSH2 e MSH6 e o paciente SL009 apresenta perda de MSH6, mostrando que algum fenômeno

está regulando a estabilidade destas proteínas e consequentemente, afetando a atividade de

reparo das mesmas. Portanto, análises funcionais, estudos de caso-controle e de co-segragação

ajudariam a esclarecer se a variante p.T8M é realmente benigna ou um fator causal para a

Síndrome de Lynch.

A variante sinônima (p.L191L) foi identificada no éxon 3 do gene MSH2 em apenas um

paciente – SL001. Esta alteração ocorre no domínio conector da proteína MSH2 e foi descrita

anteriormente na literatura como polimorfismo não patogênico (FERRINGTON et al., 1998).

A transição c.965G>A (G322D) foi identificada em três pacientes em heterozigose (3,

10, GGC 1107), através dos sequenciamentos de Sanger e de nova geração, e é um

polimorfismo não patogênico já conhecido, descrito em diversos estudos (SPAEPEN et al.,

2006; OLLILA et al., 2008; DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2011; PASTRELLO et al.,

2011; THOMPSON et al., 2012). Em um estudo funcional desenvolvido na Suíça (OLLILA et

al.,2008), os autores demonstraram que a variante G322D consegue se coexpressar com a

proteína MSH6 e mantem sua afinidade de ligação pelo mismatch de forma similar à proteína

MSH2 selvagem (WT), porém apresenta uma pequena redução na liberação do mismatch após

interação com a molécula de ATP. As análises in sílico realizadas foram contraditórias, pois o

programa SIFT a classificou como patogênica e todos os outros, inclusive o InSiGHT, a

classificaram como benigna. Mesmo assim, esta variante é considerada benigna, uma vez que

mantém sua atividade de reparo intacta e sozinha não é suficiente para causar defeitos no

sistema de reparo MMR (OLLILA et al., 2008). Em todos os três pacientes portadores da

variante, as quatro proteínas estudadas estavam presentes.

56

A alteração c.-118T>C foi identificada na região promotora do gene MSH2 em 7

pacientes em heterozigose e em 1 paciente em homozigose. É um polimorfismo conhecido, já

descrito na literatura e considerado não patogênico por vários autores (SHIN et al., 2002; JUNG

et al., 2006; CHRISTENSEN et al., 2008). De acordo com o banco de dados TRANSFAC, as

sequências contendo os alelos selvagem (T) e variante (C) são possíveis sítios de ligação para

diversos fatores de transcrição em diferentes organismos vertebrados. A sequência contendo o

alelo T serve como sítio de ligação para diferentes fatores, como por exemplo, o mais estudado

- CCAAT-binding, já a sequência contendo o alelo variante C é possível sítio de ligação para

os fatores NF-1 e LBP-1. Em um estudo realizado no Canadá (MRKONJIC et al.,2007), os

autores observaram que esta variante está associada com uma forte história familiar de CCR

em pacientes mulheres, e isto pode ser explicado pelo fato de esse polimorfismo estar localizado

em um sítio de ligação ao fator de transcrição CAAT- binding (também conhecido como NF-Y

ou CBF), que é um conhecido elemento responsivo ao estrogênio, que além de regular

positivamente a transcrição do gene MSH2 e aumentar a atividade de reparo do sistema MMR

em células endometriais (MIYAMOTO et al., 2006), apresenta um efeito protetivo em CCR,

uma vez reduz o risco de desenvolvimento de tumores MSI-H (SLATTERY et al., 2001). Além

disso, a substituição T>C leva a mudança de um sítio de NF-Y para um sítio de ligação ao fator

de transcrição AP-1. Iwahashi e colaboradores (1998) observaram através do ensaio do gene

repórter da luciferase que existe uma pequena diferença na atividade transcricional entre estes

dois alelos, sugerindo que os elementos AP-1 e CCAAT-binding, não estão associados com a

regulação da expressão do gene MSH2. Porém, um estudo realizado por Humbert e

colaboradores (2003) mostrou que o fator AP-1 regula positivamente a expressão de MSH2, e

desempenha um papel crucial na resposta celular à agentes genotóxicos. Em relação aos outros

fatores de transcrição, não há nenhum dado na literatura mostrando a associação destes com a

expressão do gene MSH2.

Outra variante identificada nesse estudo foi c.211+9C>G no íntron 1 do gene MSH2.

Ela foi encontrada em 21 pacientes em heterozigose e em 9 pacientes em homozigose. Trata-se

de um polimorfismo já descrito na literatura (KIM et al., 2004; WANG et al., 2005), porém sua

patogenicidade é contraditória, pois, apesar de o grupo InSiGHT (banco de dado LOVD)

classifica-la como benigna, em alguns estudos, ela foi associada ao risco de desenvolvimento

de várias neoplasias (SANGUANSIN et al., 2006). Em um estudo realizado na Índia

(SRIVASTAVA et al., 2010), os autores observaram que indivíduos homozigotos para o alelo

IVS1+9C apresentavam um risco maior em desenvolver carcinoma de vesícula biliar. Já em

outro estudo desenvolvido por Marra e colaboradores (2001), demonstrou que células

57

linfoblásticas carregando a variante MSH2 IVS1+9C>G eram significantemente mais tolerantes

a agentes metilantes em comparação com células MSH2 selvagens e, consequentemente,

apresentavam uma diminuição na eficiência de reparo. Por ser um polimorfismo que ocorre no

íntron e não altera a estrutura da proteína, acreditamos se tratar de uma variante que

possivelmente pode contribuir para a pré-disposição de apenas alguns tipos tumorais, porém,

mais estudos de associação devem ser realizados em diferentes populações para confirmar a

classificação desta variante.

5.3 Variantes de sequência não patogênicas ou benignas

Duas variantes identificadas nesse estudos não foram classificadas (c.-185C>A e c.212-

16delT), pois além de serem variantes novas, ou seja, não identificadas nos bancos de dados

utilizados no presente trabalho (NCBI e LOVD), também não puderam ser classificadas

utilizando os programas in sílico, uma vez que estes programas predizem alterações que

ocorrem nas regiões codificantes do gene e não alterações que ocorrem no íntron ou no

promotor.

A alteração encontrada no promotor, c.-185C>A, foi identificada em apenas um

paciente em heterozigose – GGC 865, que não apresenta perda de nenhuma das quatro proteínas

estudadas e possui microssatélites estáveis. Esta variante foi identificada pela primeira vez em

nosso estudo e de acordo com o banco de dados TRANSFAC, a sequência contendo o alelo

variante (A) não é sítio de ligação para nenhum fator de transcrição, indicando que esta

alteração não apresenta nenhum efeito funcional. Portanto, sua relação com a carcinogênese

colorretal permanece desconhecida, sendo necessário fazer ensaios funcionais e estudos de

caso-controle para confirmar sua patogenicidade e frequência alélica na população.

A variante não classificada c.212-16delT foi identificada nesse estudo através da técnica

de sequenciamento de nova geração nos dois pacientes avaliados (3 e GGC 1118). Esta

alteração se encontra na região de íntron 1 do gene MSH2, e em ambos os pacientes, ela ocorreu

em heterozigose. No paciente 3, a variante c.212-16delT ocorreu com uma frequência de

36,43% e uma alta cobertura com 13071 reads contendo essa variante. Já no paciente GGC

1108, a variante ocorreu com uma frequência de 29,52% e alta cobertura com 23464 reads

contendo o alelo variante. Esta variante não foi identificada pelo sequenciamento automático

de Sanger, pois os eletroferogramas não apresentavam boa qualidade de leitura na região, uma

vez que esta alteração ocorreu em uma região repetitiva, impossibilitando determinar se a

alteração estava ou não presente, portanto, a variante só poderia ser detectada pelo

58

sequenciamento de nova geração. Porém, a alteração ocorreu com uma baixa frequência

(29.52% e 36.43%, referente a heterozigose) em ambos os pacientes, dificultando sua

interpretação como variante de sequência ou artefato. Portanto, por ser uma deleção que ocorre

em região repetitiva, acreditamos tratar-se de um artefato da técnica PCR, uma vez que a Taq

polimerase não possui sistema de correção, porém são necessárias análises adicionais para

confirmação de sua classificação.

Desde que dados iniciais sobre mutações com predisposição a doenças nos genes de

reparo MLH1, MSH2 MSH6 e PMS2 foram reportadas, um grande número de estudos tem

contribuído para estabelecer o espectro mutacional da Síndrome de Lynch, com mais de 3.072

variantes genéticas únicas identificadas. Porém, estes dados, são predominantemente baseados

em estudos realizados na América do Norte, Europa e Ásia (DOMINGUEZ-VALENTIN et al.,

2013). Mutações nonsense, frameshift e missense são as mais frequentes, enquanto que grandes

rearranjos gênicos e variantes de sítios de splincing constituem menos de 10% das alterações

(DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2013; PLAZZER et al., 2013). Estudos recentes mostram

que a epimutação constitucional (metilação do promotor) e mutações na região promotora, que

resultam no silenciamento transcricional dos genes MMR, também contribuem para a

inativação do sistema de reparo em alguns casos de SL (IWAHASHI et al., 1998; LIU et al.,

2014).

Enquanto que grandes deleções, stop códons prematuros e mutações frameshift afetam

a função gênica e são consideradas patológicas, mutações missense que afetam um único

aminoácido são mais difíceis de interpretar. Dada a frequência com que estas mutações ocorrem

nos genes MMR, são necessários métodos para determinar as implicações funcionais destas

variantes no gene e consequentemente na proteína (WIELDERS et al., 2011). Estudos de caso-

controle e ensaios funcionais são ferramentas importantes para se identificar possíveis variantes

candidatas, confirmando assim, qual efeito que esta apresenta na proteína e qual seu

envolvimento na doença (JURADO-ESTEBAN et al., 2014). Além disso, em casos de famílias

pequenas e com penetrância incompleta, a análise de co-segregação do alelo variante com a

doença é dificultada, e por isso, muitas vezes essas alterações são consideradas como variantes

não classificadas (UV) (WIELDERS et al., 2011). Devido à isto, ensaios funcionais, análise da

frequência da variante, história familiar e programas de predição têm sido utilizados para

determinar a patogenicidade destas variantes.

Observamos nesse estudo uma frequência total de variantes patogênicas ou

potencialmente patogênicas, ou seja que altera a estrutura ou função da proteína, de 46.1%

59

(6/13) e uma frequência de 38.4% (5/13) de alterações classificadas como benignas. Estes

resultados estão de acordo com os dados da literatura (SANTOS et al., 2012), que mostram que

a maioria das mutações nos genes MMR em pacientes com SL causa perda de função da

proteína afetada. As variantes patogênicas encontradas neste estudo foram identificadas em 9

pacientes, porém apenas 5 apresentaram perda da proteína MSH2 por imunohistoquímica, e isto

pode ser explicado devido a três possíveis hipóteses: (i) problema funcional do anticorpo

utilizado na técnica; (ii) o segundo “hit” mutacional inativou a proteína, porém a manteve

estável; (iii) alteração em outro gene MMR, sendo esta a responsável pelo desenvolvimento

tumoral. Duas variantes não puderam ser classificadas, portanto estudos funcionais e também

de caso-controle são fundamentais para avaliar o impacto destas alterações no desenvolvimento

tumoral, avaliar suas frequências alélicas na população e determinar os padrões de co-

segregação do alelo variante com a doença. Além disso, a maioria das alterações encontradas

nas regiões codificantes do gene MSH2 são variantes missense (55.5%), seguida por mutações

frameshift (22.2%), nonsense (11.1%) e alterações sinônimas (11.1%), e estes resultados são

contraditórios ao de outros estudos (PELTOMÄKI; VASEN, 1997; APESSOS et al., 2005;

SPAEPEN et al., 2005; DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2011; SANTOS et al., 2012), em

que mutações nonsense e frameshif foram observadas como as mais frequentes. Dentre as

alterações encontradas, a mais frequente foi a variante c.2152C>T (p.Q718X) no éxon 13 do

gene MSH2, identificada em 4 pacientes, todos de Porto Alegre. Este resultado está de acordo

com outros estudos feitos no Brasil (SANTOS et al., 2012; DOMINGUEZ-VALENTIN et al.,

2013), em que esta variante também foi considerada a alteração mais frequente, confirmando-

a como um hot-spot.

Observamos também a presença de uma mutação com efeito fundador em Portugal no

gene MSH2: c.388_389delCA, identificada em apenas 1 paciente (SL009), e isto pode ser

explicado pela influência da migração portuguesa no Brasil (ISIDRO et al., 1999; PINHEIRO

et al., 2012). A variante c.388_389delCA não foi identificada na população brasileira, apenas

em outras populações mundiais.

Foram identificadas variantes nas regiões codificantes do gene MSH2 em 14 pacientes,

sendo que, a maioria ocorreu em pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre

(HCPA) no Rio Grande do Sul (9/14), seguido do Hospital AC Camargo em São Paulo (3/14)

e Hospital Universitário João de Barros Barreto (Belém do Pará) (2/14). Nenhum paciente do

Instituto Nacional de Câncer (INCA) do Rio de Janeiro apresentou mutações na linhagem

germinativa em regiões exônicas. Na Tabela 5.2 estão resumidas as características clínico-

epidemiológicas dos 14 pacientes com mutações nas regiões codificantes do gene MSH2.

60

Tabela 5.2: Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com alteração na região codificante do gene

MSH2.

Legenda: N = normal; L = perda (lost); MSS = microssatélite estável; MSI-H = alta instabilidade de microssatélite;

F = feminino; M = masculino; NA = não avaliado; I = incolclusivo.

A ausência de variantes de sequência no gene MSH2 em nossa coorte é consistente com

a de outros estudos (FARRINGTON et al., 1998; KÁMORY et al., 2003, ROMERO et al.,

2013) uma vez que este gene é responsável por aproximadamente 50% das mutações

identificadas em famílias com SL. Portanto, a identificação de mutações na linhagem

germinativa nos outros genes MMR (MLH1, MSH6 e PMS2) é de grande relevância para

estabelecer as bases genéticas da síndrome e assim, determinar com precisão quem são os

pacientes e familiares que estão ou não em risco para a doença, possibilitando uma maior

eficiência no diagnóstico e tratamento de indivíduos em risco. Além disso, é fundamental a

busca por grandes rearranjos gênicos e também por alterações epigenéticas e na região

promotora, embora estas representem apenas uma pequena parcela do espectro mutacional da

SL.

Paciente Local de

origem

Critério de

inclusão Sexo

Idade ao

diagnóstico

Diferenciação

tumoral Alteração

IHQ

MSH2 MSI

GGC 1094 Porto Alegre Bethesda M 31 Não indicado c.23C>T L MSS

SL009 Belém Amsterdam F 46 Diferenciado c.23C>T/

c.388_389delCA N NA

SL001 Belém Bethesda F 30 Não indicado c.573C>T NA NA

GGC 1109 PortoAlegre Amsterdam F 30 NA c.1046C>G N NA

3 Ac.Camargo Bethesda F 60 Moderadamente c.965G>A N NA

10 Ac.Camargo Bethesda M 35 Moderadamente c.965G>A N NA

GGC 1107 Porto Alegre Amsterdam M 38 Moderadamente c.965G>A N MSI-H

GGC 2114 Porto Alegre Bethesda M 29 Diferenciado c.1738_1741del

GAAA L NA

8 Belém Bethesda M 44 Moderadamente c.2021G>A L NA

GGC 1108 Porto Alegre Bethesda F 42 Moderadamente c.2078G>A N MSI-H

GGC 1112 Porto Alegre Amsterdam F 34 Pouco c.2152C>T L MSI-H

GGC 2106 Porto Alegre Amsterdam F 50 Moderadamente c.2152C>T L NA

GGC 871 Porto Alegre Amsterdam F 30 NA c.2152C>T L I

GGC 874 Porto Alegre Amsterdam M 29 Não indicado c.2152C>T N MSI-H

61

CONCLUSÕES

A partir da investigação de mutações pontuais no gene MSH2 em 53 pacientes com

Síndrome de Lynch, identificamos 6 variantes patogênicas ou potencialmente

patogênicas (c. 388_389delCA; c.1046C>G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G>A;

c.2078G>A; c.2152C>T), representando 46.1% das variantes identificadas neste estudo.

Identificamos 9 pacientes apresentando mutações patogênicas ou possivelmente

patogênicas nas regiões codificantes do gene MSH2, sendo que 6 preenchiam os

critérios de Amsterdam e 3 preenchiam os critérios de Bethesda, mostrando que os

critérios de diagnóstico clínico são mais sensíveis e específicos para identificar a

presença de mutações patogênicas no gene MSH2.

Obtivemos uma frequência total de variantes missense de 55.5%, seguido de 22.2% de

mutações frameshift, 11.1% de mutações nonsense e 11.1% de alterações sinônimas,

além de alterações na região promotora e de íntron, mostrando que o espectro

mutacional do gene MSH2 é bastante heterogêneo, englobando diferentes tipos de

alterações.

Identificamos 4 variantes novas, sendo que duas delas (c.1738_1741delGAAA;

c.2078G>A) foram classificadas como sendo patogênicas, através de programas de

predição in sílico, e duas não puderam ser classificadas (c.-185 C>A; c.212-16delT),

mostrando a importância da utilização métodos como: análise funcional, estudo de caso-

controle e de co-segregação para determinar as implicações funcionais destas variantes

no gene e na proteína.

Identificamos quatro polimorfismos comuns na população (c.965G>A; c.-118T>C;

c.211+9C>G; c.573C>T).

Obtivemos como a variante mais frequente a alteração p.Q718X, identificada em 4

pacientes de Porto Alegre, sugerindo um possível efeito fundador da variante, porém,

são necessárias análises de haplótipos para confirmação.

62

Identificamos uma mutação com efeito fundador em Portugal (c.388_389delCA) no

gene MSH2 em um paciente. Esta variante não foi relatada previamente na população

brasileira, apenas em outras populações mundiais.

Observamos uma frequência maior de mutações nas regiões codificantes do gene MSH2

em pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) no Rio Grande

do Sul (64.2%). E nenhum paciente do Instituto Nacional de Câncer do Rio de Janeiro

apresentou variantes nestas regiões.

A metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) utilizada nesse estudo

apresentou mesma eficiência que o método tradicional de Sanger na identificação de

variantes no gene MSH2, confirmando os resultados encontrados pelo último. Porém,

a técnica NGS têm sua importância, pois além de fornecer dados quantitativos, sendo

portanto mais precisa, permite o sequenciamento de milhões de fragmentos de DNA ao

mesmo tempo (aumentando o número de pacientes e genes sequenciados na mesma

corrida) e apresenta uma redução no custo por megabase.

Esse estudo contribuiu para uma melhor caracterização da SL no Brasil, através da

identificação de regiões genéticas de hot-spot, mutações fundadoras reconhecidas

internacionalmente e mutações de pré-disposição à SL, o que é de grande relevância

para o aconselhamento genético, diagnóstico e prevenção do câncer em diversas

famílias com a síndrome.

63

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75

ANEXOS

ANEXO 1: Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) específico de participação no

estudo.

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

PROJETO: DIAGNÓSTICO CLÍNICO E LABORATORIAL DA SÍNDROME DE

LYNCH: UM PROJETO DE CUSTO-EFETIVIDADE E DE VIABILIDADE DE

IMPLANTAÇÃO NO SUS

Nome do Voluntário: ________________________________________________

Você está sendo convidado(a) a participar de um projeto para avaliar o custo de execução de testes

genéticos que permitem detectar alterações no DNA associadas ao desenvolvimento de câncer

colorretal. Para realização desse projeto estruturou-se um consórcio de pesquisadores e Hospitais

brasileiros para avaliar a eficácia, o custo e o impacto do diagnóstico de câncer de cólon (intestino) em

indivíduos brasileiros. Serão convidados a participar alguns pacientes com câncer colorretal atendidos

nos seguintes hospitais: Hospital de Clínicas de Porto Alegre, INCA no Rio de Janeiro, Hospital

AC Camargo em São Paulo, Hospital Universitário João de Barros Barreto em Belém do Pará, e

Hospital do Câncer de Barretos. O projeto pretende também avaliar as características pessoais e

familiares da pessoa e sua relação com as alterações observadas em diferentes testes laboratoriais, que

poderão indicar se o câncer de intestino em uma determinada pessoa tem origem hereditária, ou seja, a

predisposição para o desenvolvimento desse tumor é transmitida de uma geração anterior para a

geração seguinte em uma família.

Serão estudadas algumas características genéticas dos tumores de intestino (a partir de um

pequeno pedaço do tumor que foi retirado na sua cirurgia e conservado em um bloco de parafina)

que incluem os assim chamados exames de rastreamento do câncer genético de intestino. Além disso,

serão realizados testes para verificar se há alterações genéticas (mutações) que podem causar o câncer

de intestino (rearranjos genômicos, mutações em genes de reparo e mutações em outros genes que

causam o câncer de intestino) a partir do DNA retirado das células do sangue de cada paciente. Os

resultados deste projeto poderão trazer mais informações sobre a influência de fatores

hereditários no tratamento de tumores de intestino.

Para que você possa decidir se quer participar ou não deste projeto, precisa conhecer seus

benefícios, riscos e implicações.

76

OBJETIVO DO PROJETO

Avaliar o impacto e a viabilidade do diagnóstico de síndrome de Lynch, a forma mais comum de

câncer colorretal hereditário, no Sistema Único de Saúde mediante investigação clínica e laboratorial de

indivíduos com a doença e provenientes de quatro regiões brasileiras.

PROCEDIMENTOS DO PROJETO

Se você concordar em participar desse projeto serão coletados cerca de 10 mL (o equivalente a

uma colher de chá) de seu sangue para isolamento e análise de DNA (seu material genético), você

também responderá a alguns questionários. Uma parte de seu DNA será utilizada no Instituto

Nacional de Câncer e outras alíquotas serão enviadas a outras instituições que participam desse

projeto (Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Hospital AC Camargo em São Paulo, Hospital

Universitário João de Barros Barreto em Belém do Pará, e Hospital do Câncer de Barretos) onde

serão utilizadas para diferentes análises, e onde ficarão armazenadas até a conclusão do projeto.

Além disso, você autorizará estudar uma amostra de seu tumor de intestino, que será retirada de blocos

de parafina contendo amostras do tumor retiradas durante a cirurgia. Esses blocos também serão

utilizados no Instituto Nacional de Câncer (INCA) e também serão enviados às instituições que

participam do projeto exclusivamente para o presente projeto, e a seguir serão devolvidos ao

INCA. Se porventura os resultados deste projeto mostrarem um risco maior para câncer hereditário de

intestino, você e seus familiares serão convidados para uma nova consulta de aconselhamento genético

em que os resultados da pesquisa lhe serão fornecidos e lhe serão transmitidas informações sobre

recomendações de cuidados médicos e de prevenção. Você terá a sua disposição uma equipe de vários

profissionais que estarão disponíveis para esclarecer suas dúvidas em qualquer fase do estudo.

O seu tratamento será exatamente o mesmo caso você participe ou não deste projeto. A

coleta de sangue para o projeto será uma punção venosa adicional que não é necessária para o seu

tratamento.

MÉTODOS ALTERNATIVOS

Sua participação nesse projeto é voluntária. Caso você não deseje participar deste projeto de

pesquisa, basta que você não assine este Termo de Consentimento, e nenhuma amostra de sangue ou de

seu tumor será coletada. Não existem métodos alternativos para sua participação nesse projeto de

pesquisa, se você não concordar com os procedimentos que serão realizados para a execução desse

projeto você é totalmente livre para não participar do mesmo.

RISCOS

O seu tratamento será exatamente o mesmo caso você participe ou não deste projeto. A coleta de

sangue para o projeto será uma punção venosa adicional que não é necessária para o seu tratamento.

Essa retirada de sangue pode resultar em dor no local da punção e/ou manchas roxas transitórias,

chamadas de equimoses, que irão logo desaparecer.

77

BENEFÍCIOS

Os resultados desse projeto de pesquisa não trarão benefícios para o seu tratamento. Mas os

resultados obtidos poderão informar se você tem ou não maior risco de desenvolver outros tumores e se

esse risco pode ser compartilhado por outros familiares seus.

Os resultados desse projeto também serão importantes para que possamos entender melhor

como se comportam os tumores de intestino hereditários. Essas informações poderão nos ajudar

acompanhar e tratar melhor as pessoas em risco para este tipo de câncer.

CARÁTER CONFIDENCIAL DOS REGISTROS

Além da equipe de saúde que cuidará de você, seus registros médicos poderão ser consultados

pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer (CEP-INCA) e equipe de

pesquisadores envolvidos. Seu nome não será revelado ainda que informações de seu registro médico

sejam utilizadas para propósitos educativos ou de publicação, que ocorrerão independentemente dos

resultados obtidos.

TRATAMENTO MÉDICO EM CASO DE DANOS

Todo e qualquer dano decorrente do desenvolvimento deste projeto de pesquisa, e que necessite

de atendimento médico, ficará a cargo da instituição. Seu tratamento e acompanhamento médico

independem de sua participação neste projeto.

CUSTOS

Não haverá qualquer custo ou forma de pagamento para o paciente pela sua participação no

projeto.

BASES DA PARTICIPAÇÃO

É importante que você saiba que a sua participação neste projeto é totalmente voluntária e que

você pode recusar-se a participar ou interromper sua participação a qualquer momento sem

penalidades ou perda de benefícios aos quais você tem direito. Caso você decida interromper sua

participação no projeto, a equipe assistente deve ser comunicada e a coleta de amostras para os

exames relativos ao projeto será imediatamente interrompida, e os resultados obtidos não serão

utilizados na execução desse projeto.

O médico responsável por sua internação pode interromper sua participação no projeto a

qualquer momento, mesmo sem a sua autorização. Nesse caso o motivo dessa interrupção será

discutido com você.

GARANTIA DE ESCLARECIMENTOS

Nós estimulamos a você ou seus familiares a fazerem perguntas a qualquer momento do projeto.

Neste caso, por favor, ligue para o Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira no telefone 21-3207 6586, ou

para o Doutor Fernando Regla Vargas no telefone 21 3207 6584. Se você tiver perguntas com relação a

seus direitos como participante do projeto clínico, também pode contar com um terceiro contato

78

imparcial, o Comitê de Ética em Pesquisa do INCA, Rua André Cavalcanti, N° 37, telefones 21 – 3207-

6551 ou 21-3207-6565. ou também pelo e-mail: [email protected] .

CONSENTIMENTO E ASSINATURA

Li as informações acima e entendi o propósito deste projeto assim como os benefícios e riscos

potenciais da participação no mesmo. Tive a oportunidade de fazer perguntas e todas foram respondidas.

Eu, por intermédio deste, dou livremente meu consentimento para participar neste projeto.

Entendo que poderei ser submetido a exames adicionais aos necessários a meu tratamento e não

receberei compensação monetária por minha participação neste projeto.

Eu recebi uma cópia assinada deste formulário de consentimento.

__________________________________ ____ / _____ / _____

(Assinatura do Paciente) dia mês ano

_______________________________________________________

(Nome do Paciente – letra de forma )

__________________________________ ____ / ____ / _____

(Assinatura de Testemunha, se necessário) dia mês ano

Eu, abaixo assinado, expliquei completamente os detalhes relevantes deste projeto ao paciente

indicado acima e/ou pessoa autorizada para consentir pelo paciente.

__________________________________________ ____ / ____ / ____

(Assinatura da pessoa que obteve o consentimento) dia mês ano

mailto:[email protected]

79

ANEXO 2: Informações clínico-epidemiológicas dos 53 pacientes analisados para alterações no gene MSH2.

Legenda: L = perda; N = normal; NA = não avaliado; F = feminino; M = masculino; MSI-H = alta instabilidade de microssatélites; MSS = microssatélites estáveis;

( ) = quantidade de marcador alterado

Centro Paciente Idade ao

Diagnóstico Sexo Critério

Diferenciação

Tumoral

Localização

Tumoral

IHQ

MLH1

IHQ

MSH2

IHQ

MSH6

IHQ

PMS2 MSI

HCPA GGC 864 51 F Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente e

íleo N N N N MSI-H (5)

HCPA GGC 865 52 M Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N N MSS

HCPA GGC 867 48 M Amsterdam Pouco Cólon transverso L N L L MSI-H (5)

HCPA GGC 1085 42 F Amsterdam Moderadamente Cólon transverso N N N N MSI-H (5)

HCPA GGC 875 37 M Amsterdam Não indicado Cólon ascendente N N N L Inconclusivo

HCPA GGC 874 29 M Amsterdam Não indicado Cólon sigmóide N N N N MSI-H (4)

HCPA GGC 885 52 M Bethesda Não indicado Reto N N N N MSS

HCPA GGC 896 44 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N N L MSI-H (5)

HCPA GGC 1108 42 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N L N MSI-H (4)

HCPA GGC 903 48 F Bethesda Moderadamente Retossigmóide L N N N MSS

HCPA GGC 1094 31 M Bethesda Não indicado Reto N L L N MSS

HCPA GGC 893 35 F Bethesda Moderadamente Cólon sigmóide N N N N MSS

HCPA GGC 1107 38 M Amsterdam Moderadamente Cólon transverso N N N N MSI-H (5)

HCPA GGC 1985 30 F Amsterdam Moderadamente Cólon transverso e

descendente N N N N NA

HCPA GGC 872 46 F Amsterdam Moderadamente Ceco N N N L MSI-H (5)

HCPA GGC 1112 34 F Amsterdam Pouco Reto L L L N MSI-H (5)

HCPA GGC 2113 36 F Amsterdam Moderadamente Retossigmóide L N N N NA

HCPA GGC 2106 50 F Amsterdam Moderadamente Retossigmóide N L L N NA

HCPA GGC 1109 30 F Amsterdam NA Retossigmóide N N N N NA

HCPA GGC 871 30 F Amsterdam NA Cólon ascendente N L L N Inconclusivo

HCPA GGC 898 42 F Bethesda NA Intestino N L N N MSS

HCPA GGC 1083 33 F Bethesda NA Retossigmóide N L N N MSS

HCPA GGC 2114 29 M Bethesda Diferenciado Cólon N L N N NA

HCPA GGC 891 40 M Bethesda NA Cólon descendente L L L L MSI-H(5)

INCA SDL 28 F Bethesda Moderadamente Cólon sigmóide N N N NA NA

INCA ADR 42 F Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA

80

ANEXO 2: Informações clínico-epidemiológicas dos 53 pacientes analisados para alterações no gene MSH2 (continuação).

Legenda: L = perda; N = normal; NA = não avaliado; F = feminino; M = masculino; MSI-H = alta instabilidade de microssatélites; MSS = microssatélites estáveis;

( ) = quantidade de marcador alterado

Centro Paciente Idade ao

Diagnóstico Sexo Critério

Diferenciação

Tumoral

Localização

Tumoral

IHQ

MLH1

IHQ

MSH2

IHQ

MSH6

IHQ

PMS2 MSI

INCA FCG 39 M Bethesda Moderadamente Cólon transverso N N N N NA

INCA CPB 46 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA

INCA MOG 39 M Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N L NA

INCA UCC 19 M Bethesda Pouco Reto N N N N NA

INCA AP 70 M Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N NA N N NA

INCA S 32 M Amsterdam Moderadamente Cólon transverso NA NA NA NA NA

Ac.Cam 1 24 F Bethesda Moderadamente Reto N N N N NA

Ac.Cam 3 60 F Bethesda Moderadamente Cólon N N N N NA

Ac.Cam 4 56 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente L N N L NA

Ac.Cam 5 46 M Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA

Ac.Cam 6 29 F Bethesda Não indicado Cólon ascendente N N N N MSS

Ac.Cam 7 45 M Amsterdam Não indicado Cólon ascendente L N N L NA

Ac.Cam 8 44 M Bethesda Moderadamente Cólon sigmóide N L N N NA

Ac.Cam 9 34 F Amsterdam Moderadamente Cólon direito NA N N N NA

Ac.Cam 10 35 M Bethesda Moderadamente Cólon N N N N NA

Ac.Cam 14 61 M Amsterdam Não indicado Cólon N N L N NA

Ac.Cam 16 53 F Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA

Ac.Cam MT-4A 39 M Amsterdam Diferenciado Cólon e intestino

delgado N L L N NA

Ac.Cam 13 81 F Bethesda Pouco Cólon ascendente L N N N NA

Ac.Cam MRV 21 M Amsterdam Moderadamente Cólon esquerdo N N N N NA

HUJBB SL009 46 F Amsterdam Diferenciado Cólon ascendente N N L N NA

HUJBB SL007 35 F Bethesda Moderadamente Sigmoide Inconclusivo N Inconclusivo N NA

HUJBB SL004 34 M Bethesda Diferenciado Reto N N N Inconclusivo NA

HUJBB SL005 28 F Bethesda Não indicado Cólon ascendente N N N N NA

HUJBB SL001 30 F Bethesda Não indicado Cólon NA NA NA NA NA

HUJBB SL006 52 F Bethesda Não indicado Cólon NA NA NA NA NA

HUJBB SL003 38 F Bethesda Não indicado Reto N N N N NA

81

ANEXO 3: Heredograma da família do paciente SL009.

Ca Gástrico

dx ~ 50

CCR

dx 54 CCR

dx 50 CCR

dx 46/51

(52)

Ca Ovário

dx 36 CCR

dx 32

(48)

Ca Útero

dx 35

(44)

Ca Fígado dx ~ 72

CCR

dx 40/62 CCR dx 40

+ Garganta

CCR

dx ? CCR

dx 45 Ca mama

dx 42

CCR dx ?

+ Útero

CCR

dx 70

+ Leucemia

CCR dx 65

Ca Ossos

dx ~ 75

7 4

I

II

III

IV

Legenda:

Indivíduo afetado

Indivíduo falecido

Indivíduo sem sexo

Casamento

Gêmeos dizigóticos

Probando

4 3 Número de filhos do sexo indicado

Ausência de progênie

Acasalamento consanguíneo

dx Idade ao diagnóstico

82

ANEXO 4: Heredograma da família do paciente GGC 1109.

Câncer Mama dx 48

Câncer Estômago

ou Intestino dx ?

Câncer

Estômago dx 43

Câncer Intestino + Endométrio

dx ?

Câncer

Intestino dx 30

CCR dx 30 Endométrio

dx 45

Carcinoma

Gástrico dx 40

Câncer

Mama dx ?

Câncer

Intestino dx 30

Câncer Intestino

dx ?

Ca ? dx 60

Leucemia dx 13

Ca ? dx ~ 50

Ca ? dx ?

Ca ? dx 38

I

III

II

V

IV

VI

83

ANEXO 5: Heredograma da família do paciente 8.

Adenoma dx 70 (71)

Adenoma dx 46 (46)

Colon dx 44 (45)

Adenoma dx 37 (45)

Linfoma dx 35

Leucemia dx 18

3 3

2

I

II

III

IV

84


Ca

Pulmão dx ?

CCR dx 58

Óbito 63

CCR dx ~50

CCR Óbito < 50

CCR dx 34 (34)

Carcinossarcoma de corpo uterino

dx 45

Tumor Renal dx 52

CCR dx 30

Óbito 60 Ca ?

CCR dx 57

Óbito 60

II

III

IV

V

I

85


CCR dx < 40 Óbito 80

CCR dx 50

Câncer Útero dx 75

Câncer base

língua dx 45

Câncer

Mama dx 46

Câncer Renal dx 60 Câncer

Fígado dx 40

Câncer Bexiga

dx ?

Ca ? dx 40

Ca ? dx ?

I

II

III

IV

86


Ca ? dx 35

CCR (39)

Ca Útero? dx ~ 47

CCR Óbito 39

CCR dx ~ 60

Ca ? dx ?

CCR dx 30 (38)

I

II

III

IV

V

87


I

II

III

IV

V

CCR dx > 50

13 CCR dx 54

CCR dx 41/55

+ Próstata dx ~ 60

(60)

CCR dx 29 (30)

88


Adenoma dx 73

Adenoma

Estômago dx 50

Estômago Óbito 62

Estômago dx 55

Estômago dx 50

Estômago dx 40

Estômago dx 50

CCR dx 42 (46)

Pólipo dx 40

13

I

III

II

89


CCR dx 62

Óbito 92 90 anos

AVC Óbito 92

Óbito 52

Óbito 98 AVC

3

14

CCR dx 29

I

II

III

IV

V

90


CCR

dx 52

CCR

dx ?

CCR

dx 61

(62)

CCR

dx 60

CCR

dx 15 (22)

CCR

dx 57

+ Mama

Ca Esôfago

dx 65

SNC

dx 43

(47)

3

I

II

III

IV

IV

91

ANEXO 13: Gráficos da média de cobertura base-base dos 16 amplicons, gerados pelo

Sequenciamento de Nova Geração.

PACIENTE 3

0

50000

100000

150000

200000

250000

1

14

27

40

53

66

79

92

10

5

11

8

13

1

14

4

15

7

17

0

18

3

19

6

20

9

22

2

23

5

24

8

Cobertura base-base AMPLICON 1

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

123

45

67

89

11

113

315

517

719

922

124

326

528

730

933

135

337

539

7


0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

1

17

33

49

65

81

97

11

3

12

9

14

5

16

1

17

7

19

3

20

9

22

5

24

1

25

7

27

3

28

9

30

5Cobertura base-base AMPLICON 3

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

1

12

23

34

45

56

67

78

89

10

0

11

1

12

2

13

3

14

4

15

5

16

6

17

7

18

8

19

9


0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

1

11

21

31

41

51

61

71

81

91

10

1

11

1

12

1

13

1

14

1

15

1

16

1

17

1


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

1

13

25

37

49

61

73

85

97

10

9

12

1

13

3

14

5

15

7

16

9

18

1

19

3

20

5

21

7

22

9


0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

1 815

22

29

36

43

50

57

64

71

78

85

92

99

10

611

312

012

7


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

1

11

21

31

41

51

61

71

81

91

10

1

11

1

12

1

13

1

14

1

15

1

16

1

17

1


92



PACIENTE 3 (continuação)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

1 8

15

22

29

36

43

50

57

64

71

78

85

92

99

10

6

11

3

12

0

12

7


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

1

10

19

28

37

46

55

64

73

82

91

10

0

10

9

11

8

12

7

13

6

14

5

15

4


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1 7

13

19

25

31

37

43

49

55

61

67

73

79

85

91

97

10

3

10

9

11


0

10000

20000

30000

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50000

60000

1

16

31

46

61

76

91

10

6

12

1

13

6

15

1

16

6

18

1

19

6

21

1

22

6

24

1

25

6


0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

1

13

25

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49

61

73

85

97

10

9

12

1

13

3

14

5

15

7

16

9

18

1

19

3

20

5

21

7

Cobertua base-base AMPLICON 13

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

1

16

31

46

61

76

91

10

6

12

1

13

6

15

1

16

6

18

1

19

6

21

1

22

6

24

1


0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

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100000

1

12

23

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45

56

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78

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10

0

11

1

12

2

13

3

14

4

15

5

16

6

17

7

18

8

19

9

Cobertura bse-base AMPLICON 15

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

1

12

23

34

45

56

67

78

89

10

0

11

1

12

2

13

3

14

4

15

5

16

6

17

7

18

8

19

9


93



PACIENTE GGC 1108

0

100000

200000

300000

400000

500000

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1

15

29

43

57

71

85

99

11

3

12

7

14

1

15

5

16

9

18

3

19

7

21

1

22

5

23

9


0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

1

24

47

70

93

11

6

13

9

16

2

18

5

20

8

23

1

25

4

27

7

30

0

32

3

34

6

36

9

39

2


0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

1

18

35

52

69

86

10

3

12

0

13

7

15

4

17

1

18

8

20

5

22

2

23

9

25

6

27

3

29

0

30


0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1

11

21

31

41

51

61

71

81

91

10

1

11

1

12

1

13

1

14

1

15

1

16

1

17

1


0

20000

40000

60000

80000

100000

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160000

112

23

34

45

56

67

78

89

10

011

112

213

314

415

516

617

718

819

921

022

1


0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

1

11

21

31

41

51

61

71

81

91

10

1

11

1

12

1

13

1

14

1

15

1

16

1

17

1


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

1

13

25

37

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61

73

85

97

10

9

12

1

13

3

14

5

15

7

16

9

18

1

19

3

20

5

21

7

22

9


0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

1 9

17

25

33

41

49

57

65

73

81

89

97

10

5

11

3

12

1

12

9


94



PACIENTE GGC 1108 (continuação)

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

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15

22

29

36

43

50

57

64

71

78

85

92

99

10

6

11

3

12

0

12

7


0

20000

40000

60000

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100000

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19

28

37

46

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64

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91

10

010

911

812

713

614

515

4


0

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10000

15000

20000

25000

30000

35000

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13

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31

37

43

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55

61

67

73

79

85

91

97

10

3

10

9

11


0

10000

20000

30000

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70000

80000

90000

100000

1

16

31

46

61

76

91

10

6

12

1

13

6

15

1

16

6

18

1

19

6

21

1

22

6

24

1

25

6


0

2000

4000

6000

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10000

12000

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16000

18000

20000

1

13

25

37

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73

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97

10

9

12

1

13

3

14

5

15

7

16

9

18

1

19

3

20

5

21

7


0

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500000

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1

16

31

46

61

76

91

10

6

12

1

13

6

15

1

16

6

18

1

19

6

21

1

22

6

24

1


0

2000

4000

6000

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10000

12000

14000

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18000

20000

1

12

23

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10

0

11

1

12

2

13

3

14

4

15

5

16

6

17

7

18

8

19

9


0

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20000

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50000

60000

70000

1

13

25

37

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61

73

85

97

10

9

12

1

13

3

14

5

15

7

16

9

18

1

19

3


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Documents

Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer ... · iii P293v Pastor, Tatiane de Pinho. Variantes de seqüência no gene MSH2 em pacientes selecionados para a Síndrome de